Sunteți pe pagina 1din 28

NOI METODE P. C. R.

Coordonator:
Profesor doctor

Candidat:

................................

Pintilescu (Budal) Mirela

2015
Reacia de polimerizare n lan , prescurtat( PCR ) a fost numit de Lederberg ,,
instrumental pentru democratizarea biologiei molecular . Reacia PCR ((Polymerase
Chain Reaction = Reacie de Polimerizare n Lan) d posibilitatea ca dintr-o mixture de ADN
1

s poat fi extras o singur molecul de ADN, care apoi poate fi amplificat enzimatic, cu
mijloace tehnice aparent simple, are loc in vitro. n vederea aplicabilitii pe diferite domenii
(criminalistic, studii ecologice ,arheologie, tiine medicale , industria alimentar
,epidemiologie , biologie molecular ) a fost dezvoltat o adevrat tehnologie PCR, care din
punct de vedere chimic , este construit din cicluri succesive de replicare ADN in vitro , Din
punct de vedere chimic, reacia PCR este constituit din cicluri succesive de replicare ADN in
vitro, folosind 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizeaz cu cele 2 catene ale secvenei
originale (folosit ca matri n replicare).Replicarea ADN in vivo difer de replicarea ADN in
vitro doar prin faptul c , n reacia PCR etapa de desfacere a dublului helix mari i
respectiv, cea de ataare a primerilor , nu sunt realizate enzimatic , ea parcurgnd unele trepte
de temperatur , iar singura enzim folosit n reacie este o ADN polimeraz , ADNdependent ( cu funcie de replicaz ) .
PCR este o metod cu un spectru larg de aplicabilitate datorit avantajelor .
Pentru ceretare nu este nevoie de o cantitate mare de ADN . Prin ,, agarea unei
molecule de ADN se pot diagnostifica boli genetice , identifica criminali i putem gsi
rspunsuri la ntrbrile care nu ne dau pace ,, Cine suntem noi , de unde venim noi ? .
Polimerase chain reaction ( PCR) este o reacie care are la baz o tehnologie in vivo care
imit capacitatea natural de replicare a ADN i care const n generarea rapid a unor copii
multiple a unei secvene nucleotidice int ( ADN sau ARN )dintr-o gen de interes sau un
patogen specifi.. Copia rezultat este numit amplicon .Amplificarea se realizeaz ntr-un
analizator special ( thermal cycler). Amperaza este enzima care promoveaz amplificarea
selectiv a intei i distrugerea produilor de contaminare din cursul reaciilor de amplificare
anterioare. Reacia PCR are loc n trei etape :
1. Denaturarea : amestecul se nclzete la 94 grade iar ADN se desface n dou
catene.
2. Hibridizarea primerilor: temperatura va fi sczut la 55-70 grade Celsius ,
primerii se vor ataa complementar la capetele 3 ale celor dou catene.
3. Elongaia are loc la o temperatur de 72 de grade i va extinde primerii
ataai n lungul matriei int i va produce un amplicon ADN. Analizatorul va repeta
automat acest proces pentru un numr stabilit de cicluri (de obicei 30-35).
I. Aplicabilitatea practic a PCR-ului.
n anii 1980 , se folosea ADN polimeraza Klenow (fragment de ADN polimeraza
termostabil , izolat de la bacteria Termus acquaticus. Astzi tehnologia PCR a fost
2

revoluionat prin dezvoltarea metodelor de detecie n faza exponenial numit detecie n


timp real ( real-time PCR). Aceast reacie are ca i avantaj acurateea rezultatelor obinute.
Comparativ cu tehnica PCR convenional ,detecia are loc n faza de platou, dup ce a
fost stopat iar produii au nceput s se degradeze. Domeniul de linearitate este mult extins
folosind mai puine diluii ale probelor. Limita inferioar de detecie este mult mbuntit
(se pot detecta cantiti mai mici de ADN-ului int).
Produsele ADN obinute prin PCR sunt separate electoforetic n funcie de dimensiuni,
sub form de benzi, n gelul de electoforez, iar apoi benzile sunt fcute vizibile n lumina UV
prin tratarea prealabil a gelului cu etidiumbromid. Se realizeaz hibridizarea ADN-ului cu
sonde genetice specifice prin metoda Souther Blotting. Reacia de polimerizare n lan poate
fi aplicat n foarte multe domenii de interes cu ar fi: medicin, ecologie, arheologie. n
diagnosticul medical reacia PCR este utilizat n diagnostificarea bolilor ereditare(fibroza
chistic, anemia Cooley, distrofia muscular Duchenne, fenilcetonuria).
Aceste boli pot fi depistate prenatal, graie metodei PCR, prin determinarea ADN-ului din
celulele trofoblastice. Se mai poate determina sexul copilului, dar i o boal genetic
II. Variante tehnice ale reaciei PCR
Multiplex PCR const n introducerea PCR a mai multor seturi de primeri, specifici
pentru secvene diferite de ADN, care vor produce ampliconi de dimensiuni diferite.
Metoda este foarte util datorit faptului c furnizeaz informaii multiple, care prin
PCR clasic ar fi posibile doar prin amplificri, cu consum de tipi i reactivi. Problematica
ridicat de multiplex PCR const n alegerea setului de primeri care trebuie s se hibridizeze
eficient la o singur temperatur. Acest inconvenient duce la limitarea numrului de secvene
amplificate. A doua situaie dificil este sortarea pentru amplificat a unor secvene de
dimensiuni diferite care prin migrare electroforetic s nu produc suprapunerea benzilor.
Metodele de laborator convenionale, bazate pe cultivarea i identificarea agentului
etiologic prezent n produsul patologic, poate necesita cteva zile pentru obinerea unui
rezultat cert. n plus introducerea precoce a tratamentului cu antibiotice, naintea recoltrii
probelor biologice, a diminuat numrul cazurilor de meningit confirmate prin metode de
laborator tradiionale. Acest impas poate fi depit prin identificarea microorganismului direct
n produsul patologic, utiliznd n principal tehnica PCR. Este folosit o reacie PCR
multiplex care permite detectarea simultan a celor trei microorganisme care cauzeaz
majoritatea meningitelor bacteriene : Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae i
Haemophilus influenzae.
3

Aceast metod intete trei gene specifice speciilor menionate: ctrA codific o protein
de membran implicat n transportul capsulei la N. Meningitidis; ply- codific pneumolizina
la S. pneumoniae; bexA codific o protein implicat n exportul capsulei polizaharidice la
H. Influenzae. Studiile efectuate pe probe biologice n diferite laboratoare, au evideniat
sporirea numrului de rezultate pozitive nregistrate n diagnosticul etiologic al meningitelor
acute bacteriene obinute prin utilizarea unei reacii PCR multiplex i sunt unanim de acord
asupra utilitii includerii unor reacii de acest tip de acest tip n diagnosticul molecular de
rutin.
Identificarea serogrupului / serotipului reprezint primul pas n caracterizarea tulpinilor
de meningococ i cel mai important pentru managementul prompt al contraciilor. Pentru
acest motiv au fost dezvoltate metode PCR de amplificare a acizilor nucleici, pentru
identificarea serogrupului la nivel molecular ( genogrup), care sunt sau trebuie s devin o
parte important ntr-un laborator. Pentru determinarea sensibilitii la ageni antimicrobieni
n absena unor culturi bacteriene, s-a experimentat detectarea mutaiilor n secvena genelor
implicate n rezistena principalilor ageni cauzali ai MBA la substane antimicrobiene prin
amplificarea PCR urmat de secveniere.

https://www.google.ro/search?q=migrare+electroforetic%C4%83&biw
NESTED PCR este o variant modificat a amplificrii PCR folosit pentru a reduce
formarea de produi nespecifici sau pentru a amplifica un produs a crui matri este n
cantitate foarte redus. Metoda const n amplificarea n dou etape (reacii PCR) a unui
fragment, utiliznd dou seturi de primeri (un set de primeri externi i un set de primeri
4

interni). n prima reacie PCR se amplific un fragment de dimensiuni mai mari prin utilizarea
primerilor externi, iar n a doua reacie PCR se utilizeaz primerii interni, rezultnd un
fragment de dimensiuni mai mici dar ntr-o cantitate mai mare.
https://www.google.ro/search?q=migrare+electroforetic&biw

Hot start PCR o reacie PCR proiectat pentru a evita apariia de produi nespecifici
determinai de activitatea defectuas a polimerazei la temperaturi reduse (sub Tm a
primerilor) n timpul manipulrii reactivilor i realizarea mixului PCR. Se folosete o
polimeraz care necesit o etap de activare la temperatur ridicat. Sunt descrise mai multe
metode de inactivare a polimerazei care includ: modificare chimic(anhidride sau
formaldehide), modificri fizice(includerea n bile de parafin), legare cu anticorpi.

https://www.google.ro/search?q=v&biw=1600&bih=799&source
Touchdown PCR(step-down PCR) reprezint o variaie a reaciei PCR menite s
limiteze formarea de legturi nespecifice ale primerilor la matria ADN. Temperatura de
hibridizare este definitorie pentru ligarea specific a primerilor. Metoda const utilizarea n
primul ciclu de amplificare a unei temperaturi de hibridizare crescute, pentru ca n
urmtoarele cicluri, primerii se vor fixa foarte specific i vor aduce un avantaj(este amplificat
exponenial) pentru apliconul de interes.

https://www.google.ro/search?q=migrare+electroforetic&biw
Reverse transcrption polymerase chain reaction (RT-PCR) este o variant a PCRului utilizat pentru identificarea calitativ sau semicantitativ a expresiei genice (transcripia
n ARNm). ARNm este n prima etap reverstranscris n ADN complementar (ADNc)

utilizndu-se o polimeraz invers(reverstrancriptaza) de origine viral. ADNc rezultat este


ulterior amplificat folosind reacia PCR clasic.
Real time o variant a tehnicii PCR n care se poate vizualiza n timp real producerea
de apliconi, cu ajutorul unor fluorocromi. Tehnica poate fi utilizat pornind de la dou tipuri
de matrie: ADNg, ADNc n cazul n care se utilizeaz ca matri ADNg se urmrete
identificarea variaiilor numrului de copiii pentru o anumit gen sau se identific ncrcrile
virale. Deci n prima situaie(cea a variaiilor numrului de copiii) se utilizeaz ca referin o
gen (preferabil mai multe gene care nu prezint deleii sau amplificrii n patologia
respectiv. n situaia viremiilor realizeaz de obicei doar o cuantificare absolut. Real time
RT-PCR este o variant PCR n care amplificarea (creterea umrului de apliconi) poate fi
vizualizat n timp real utilizndu-se fluorescena.
Exist dou mari categorii de obinere a fluorescenei proporionale cu creterea
numrului de apliconi din reacie: metod specific i metod nespecific.
Real time PCR a fost dezvoltat pentru a obine rezultate ct mai curate. Un avantaj
suplimentar al acestei metode este uurina de a compara rezultatele obinute din experimente
diferite.
Metode de identificare a mutaiilor prin biologie molecular.
1. High resolution melting = tehnic ce const n analizarea post-amplificare PCR a
curbelor de topire a fragmentelor de interes(apliconi) este o metod atractiv simpl (doar un
set de primeri) i rapid de realizat. Impune realizarea unor etape consistente de optimizare,
utilizarea unor fluorocromi cu sensibilitate foarte mare i de asemenea utilizarea unei
aparaturi(real-time PCR) care s permit nregistrarea unui numr mare de date cu o varia ie
constant uniform i precis a temperaturii. Metoda se bazeaz pe utilizarea curbelor de
disociere(melting sau topire) a produilor de interes fiind disponibil datorit mbuntirii
coloranilor care emit fluorescen la legarea de ADN-ul dublu catenar, i evoluiei aparaturii
de real-time PCR(cu rotor, care asigur o omogenitate a temperaturii de topire) i a
programelor de analiz asociat fiecrui aparat n parte. Permite detecia rapid a mutaiilor
genice(SNP) permind identificarea unor noi variante(fr posibilitatea de a le caracteriza).
HRM ncepe cu amplificare PCR a regiunii de interes, n prezena coloranilor care se
leag de dublu helix i emit fluorescena. Fluorescena este mai intens cnd sunt legai de
ADN dublu catenar(dsADN) i o fluorescen foarte slab cnd sunt legai de dsADN.
Amplificarea este urmat de o curb de topire la o rezoluie foarte nalt(HRM)
alctuit din pai mici(0,10 Celsius) i cu o citire a unui numr foarte mare de evenimente
7

fluorescente pentru fiecare pas cu o precizie foarte mare. Cnd dsADN se denatureaz n
catenele componente fluorocromul este eliberat ducnd la o scdere a fluorescenei generale
din tub. Rezultatul const n obinerea unei curbe de melting caracteristic fiecrui aplicon.
Reacia HRM poate avea loc ntr-o singur etap (PCR+MELT) sau poate fi realizat
reacia PCR ntr-un termociclor standard, i doar HRM ntr-un Real Time PCR. Produsul
PCR obinut prin realizarea curbei de melting nu este unul nou, el utilizndu-se de rutin n
Real-Time PCR nespecific. Acest procedeu se numete astzi Lou Resoltion Melting(LRM).
Curba de topire n LRM este realizat prin creterea temperaturii cu un pas mai mare de
temperatur de 0,5o Celsius. Cea mai mare rat de scdere a fluorescenei n procesul de topire
este la temperatura caracteristic a ampliconului obinut.
1.

Amplification Refractory Mutation System(ARMS) denumit i Alelele specific

PCR(ASP) este o metod care se bazeaz pe amplificarea PCR-ului standard folosit n


detecia STR-urilor (Newton et. al., 1989). ARMS utilizat pentru analiza unei palete largi de
polimorfisme, mutaii germinale i somatice. Tehnica poate identifica nivele sczute ale alelei
mutante.(Billadeau et. al., 1991). Tehnica poate identifica probe corespunztore WT, MT, HZ,
doar pentru mutaia vizat. Mai poate identifica mutaii punctiforme sau SNP germinale
(motenite) la care raportul dintre cele dou alele(n cazul unui heterozigot), cu excepia
indivizilor cu mozaic cromozomial, este unu.
Tehnica PCR poate fi adaptat n mai multe variante pentru a putea rspunde unor
ntrebri foarte precise legate de matria care trebuie amplificat putnd fi realizate ntr-o
singur amplificare sau n amplificri separate, calitativ sau cantitativ.
2.

Restriction fragment length polymorphism este o tehnic ce utilizeaz capacitatea

enzimelor de restricie de a tia foarte specific anumite modele de secvene de ADN. Tehnica
RFLP are la baz o amplificare PCR, n urma creia se obine un amplicon care conine
polimorfismul sau mutaia punctiform vizat. Se cunosc dou variante RFLP: cnd
polimorfismul studiat transform secvena ampliconului ntr-un situs de recunoatere i cnd
acesta anuleaz situsul de recunoatere a enzimei. Cel mai important n aceast tehnic este
distincia dintre o reacie de digestie complet i una incomplet. Fragmentele rezultate n
urma digerrii polimorfismului vizat s aib dimensiuni diferite, pentru a putea fi difereniate
n gelul de agaroz i s fie destul de lungi pentru a nu se suprapune peste eventualii dimeri
deprimeri formai n reacia PCR.
Etapele tehnicii RFLP: n prima etap se realizeaz amplificarea PCR cu primeri
specifici care ncadreaz polimorfismul vizat. n cea de a doua etap se realizeaz o migrare
electroforetic pentru verificarea amplificrii. Se migreaz o cantitate de aproximativ 4 l, iar
8

restul se pstreaz pentru digestie i controlul nedigerat. Cantitatea de produs de amplificare


se mparte n dou seciuni: controlul nedigerat i produsul care va fi supus digestiei cu
enzima de restricie.
n ultima etap cele dou seciuni migreaz n paralel pentru a se identifica diferenele
3. TaqMan SNP Genotyping
TaqManassays(Applied Byositem, Life Tehnologies, Pleasanton, CA, USA) se bazeaz
pe discriminarea alelic prin Real Time PCR n sistem TaqMan tehnic asemntoare cu
ARMS cu diferena c n loc de primeri sunt utilizate sonde de hidrolize.
Pentru genotiparea prin sistem TaqMan assay se realizeaz designul de primeri astfel
nct acestea ncadreaz polimorfismul, iar cele dou sonde s fie situate pe zona de interes
(STR), una pe varianta slbatic i una pe varianta polimorfic. Pentru cele dou sonde se
folosesc ca reporter clorocromi a cror emisie s nu se suprapun i s poat fi captat corect
pe canale diferite.
Prin suprapunerea fluorescenelor sau Ct-urilor obinute pe cele dou canale, ntr-un
grafic bidimensional se pot identifica uor cele patru categorii: dublu negativ(NTC i tuburile
unde amplificarea a euat), simplu-pozitiv pe una sau cealalt fluorescen(homozigot slbatic
ntr-un cadran i homozigot mutant n alt cadran) i dublu pozitiv(heterozigot).
n urma utilizrii unor controale cu diferite procentaje alela MT, poate da informaii de
raportul dintre cele dou alele.
Aceast tehnic este cea mai utilizat pentru identificarea SNP-urilor , deoarece are o
rezoluie foarte bun, de pn la 0,01%. Se mai utilizeaz la identificarea majoritii
polimorfismelor, i mutaiilor.
Tehnica poate fi utilizat pentru identificarea mai multor inte n acelai timp folosind
sonde de hidroliz cu fluorescene de referin diferite .
Odat cu introducerea sondelor de hidroliz cuplate cu MinorGoveBinder (MGB) s-a
reuit creterea sensibilitii i specificitii metodei, deoarece nepotrivirile la nivelul
secvenei de hibridare a sondei se fac practic fac practic imposibila cuplare a acesteia i
implicit obinerea unui semnal fals de amplificare.
4.

Secvenierea Snger reprezint tehnica prin care sunt identificate bazele azotate

n ordinea nlnuirii lor ntr-o secven oligonucleotidic de ADN.


De-a lungul timpului s-au dezvoltat mai multe metode de identificare a secvenei
nucleotidice, metode care difer att prin chimia reaciei, ct i prin modul de migrare a
produilor obinui .n prezent cele mai utilizate metode sunt secvenierea Snger Dye
Terminator(Snger et al. , 1975) i metoda pirosecvenierii.
9

Tehnica Snger se bazeaz pe utilizarea unor nucleotide modificate, numite


ddNTP( dideoxinucleotide trifosfat ).Aceste nucleotide nu prezint n poziia 3'gruparea-OH,
necesar[ polimerazei pentru a face leg[tura diester cu nucleotidul urmtor . Acest fenomen
duce la ntreruperea brusc a amplificrii. Utiliznd ddNTP fluorescente, fiecare fragment
format se va termina cu o anumit fluorescen caracteristic.
Etape de lucru:
amplificarea fragmentului de interes cu primeri specifici prin reacia PCR;
vizualizarea produsului din gelul de agaroz ( folosit cnd n setul de primeri duce la
obinerea unui numr mare de ampliconi) sau din produsul PCRrmas. Aceast etap
este strict necesar pentru a ndeprta primerii neutilizai n reacia PCR i a
celorlali compui ai mixului de reacie( dNTP, enzima, buffer , etc.) ;
migrarea electoforetic de siguran , pentru a verifica prezena produsului purificat.
Se pot identifica probele corespunztoare fiecrei categorii WT, MT, HZ , pentru toate
mutaiile existente n ampliconul secveniat. Mai poate identifica deleii, adiii, duplicaii,
inversii, etc. , existente n fragmentul amplificat.
MAAP techniques (Multiple Arbitrary Amplicon Profiling)
Din categoria tehnicilor MAAP (Multiple Arbitrary Amplicon Profiling) face
parte tehnica RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), alturi de tehnicile DAF
(Amplification Fingerprinting ) i AP-PCR (Arbitrary Primed PCR).
DAF technique (DNA Amplification Fingerprint) - Caetano-Anolles i colab. (1991), au
introdus o metod numit DNA
Amplification Fingerprinting (DAF). Ei au folosit primeri scuri, cel mai adesea de
lungime ntre 5 8 nucleotide. De asemenea, ei au modificat anumii parametrii PCR,
folosind pai att de joas ct i de nalt stringen, precum i un program al ciclurilor cu
numai dou temperaturi n loc de standardul cu trei. Produii de amplificare au fost
separai prin electroforez n gel de poliacrilamid i vizualizai prin colorare cu argint.
Nivelul complexitii profilului benzilor poate fi predeterminat prin manipularea
condiiilor de reacie. Ca urmare a apariiei mai multor variante de amprentare a
ntregului genom, bazate pe PCR cu primeri arbitrari, Caetano-Anolles i colab., au
propus n (1994), denumirea acestor metode nrudite cu numele generic de Multiple
Arbitrary Amplicon Profiling (MAAP).
Totui, datorit simplitii i utilitii, numele i metoda original RAPD, cunoate

10

cea mai larg rspndire. Aceast tehnic permite amplificarea unui numr mai mare de
fragmente de dimensiuni foarte mici, care ulterior vor fi separate ntr-un gel de poliacrilamid.
7. Identificarea alterrii numrului de copii genice- metoda MLPA( Multiplex
Ligation- dependent Probe Amplification) . Este o metod de PCR multiplex ce detecteaz
existena unui numr anormal de copii, pn la cincizeci de secvene de doar un nucleotid.
( Schouten JP et al. 2002) Poate fi folosit n mai multe laboratoare deoarece , nu necesit
dect un termociclor i un echipament de electroforez prin capilar. Prin aceast tehnic pot fi
procesate pn la 96 de probe simultan. Cnd comparm MLPA cu FISH, MLPA-ul nu are
numai avantajul multiplex , dar de asemenea este una n care secvene foarte mici devin
inta( 50-70 nt) ceea ce permite MLPA-ului identificarea aberaiilor frecvente ale unei gene ce
sunt prea mici pentru a fi detectate prin FISH . De asemenea , MLPA poate fi folosit pe ADN
purificat . Comparat cu array CGH, MLPA este o metod ieftin i uor de realizat. Tipic
pentru MLPA este faptul c inta nu este reprezentat de secvenele ce sunt amplificate ci de
sondele MLPA care hibridizeaz cu secvenele int , n contrast cu un PCR standard de tip
multiplex .
Reacia MLPA poate fi mprit n 4 pai principali:
denaturarea ADN- ului i hibridizarea sondelor MLPA;
reacia de ligare;
reacia PCR;
separarea produilor de amplificare prin electoforez i analiza datelor.
Tipuri de MLPA: RT- MLPA - Un tip special de MLPA creat pentru caracterizarea
expresiei genice i n consecin a ARNm.( Elding , e. , et al . 2003 ) . Schimbarea
expresiei genice joac un rol important n dezvoltarea celulei i n procesele de
difereniere i patologie . RT- MLPA este disponibil pentru detectarea ARNm a
numeroase gene implicate n inflamaie i apoptoz. Ofer numeroase avantaje n
comparaie cu alte tehnici de caracterizare a expresiei genice cum ar fi Northern
blotting , Real time PCR i microarray. Permite procesarea rapid a numeroase probe
ntr-un format standard de PCR de 96 godeuri. Al doilea tip special de MLPA este
Metylation Specific MLPA ( MS- MLPA) folosit pentru caracterizarea att a
cuantificrii ct i a metilrii numrului de copii.( Nygren AO , et al.2005) . Metoda
MS-MLPA s-a dovedit a fi o mre genic ( Bittel , D.C . ,et al. 2007. Dikow , N. , et al.
2007. Procter , M , et al . 2006 ) i mai ales pentru analiza aberaiilor de metilare a
probelor de tumori ( Jeuken , J., et al.2006. Hess, C.J. , et al. 2008) .

11

ARMS PCR technique (Amplification Refractory Mutation System PCR)


O modificare a metodei PCR, care permite detecia mutaiilor punctiforme
cunoscute, prin amplificare cu primeri specifici de alel, este metoda ARMS-PCR.
Aceasta este o metod care nu implic utilizarea izotopilor radioactivi, iar
genotipizarea este posibil prin simpla examinare a migrrii produsului PCR prin elecroforez
n gel de agaroz. Tehnica este cunoscut ca detectarea mutaiilor prin amplificare refractar,
descris pentru prima dat de Newton C.R. i colab., 1989.
Metoda const n utilizarea a doi primeri care prezint aceeai secven de
nucleotide cu excepia nucleotidei terminale 3 unul complementar cu alela normal, iar
cellat cu alela mutant. Pentru amplificarea enzimatic se folosete Taq-polimeraza,
enzim care nu are activitate exonucleazic 35, ceea ce implic necesitatea unei
perfecte complementariti a primerului cu capatul 3 al matriei ADN. Rezultatul se
obine n urma electroforezei n gel de agaroz prin prezena sau absena produsului de
amplificare respectiv.
Specificitatea este obinut dac primerul oligonucleotidic este complementar cu
secvena alelei dorite, dar nu este complementar cu cealalt alel la captul 3, sau n
imediata vecintate a captului 3' al primerului specific de alel. Neamplificarea este
rezultatul nepotrivirii dintre ADN matri i oligonucleotidul din primer. Pentru c
Taqpolimeraza nu are activitate exonucleoazic n direcia 3'5', aceast nepotrivire
mpiedic eficient elongarea la capatul 3' cu ajutorul Taq polimerazei. Metoda este
aplicabil, n general, n detecia mutaiilor punctiforme cunoscute, mici deleii i inserii,
polimorfisme i alte variaii n secvena ADN. De aceea, o mutaie (sau un polimorfism) poate
fi detectat prin utilizarea unui construct oligonucleotidic adecvat, care permite o elongare
eficient, n cazul unui cromozom mutant i o elongare ineficient, n cazul unui cromozom
normal.
SSCP TECHNIQUE (SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM)
Aceast tehnic este util n detectarea polimorfismului determinat de cel puin o
nucleotid. Evidenierea polimorfismului se face n timpul electroforezei n gel de
poliacrilamid. Acest polimorfism se bazeaz pe diferenele de conformaie ale unei
singure catene (mutant) ce difer de cealalt ntr-un singur punct, datorit unei
substituii, deleii sau inserii (Barroso , A. i colab., 1998). n anumite condiii, acizii
nucleici dintr-o caten de ADN formeaz n soluie o structur secundar. Structura
secundar depinde de compoziia n baze, structur care poate fi alterat i de substituia
unei singure nucleotide. Aceast diferen va determina o mobilitate electroforetic
12

diferit n condiiile unui gel nedenaturat (gel de poliacrilamid nedenaturat).


Vizualizarea fragmentelor ce urmeaz a fi detectate se face dup o prealabil colorare
cu argint sau dup marcarea radioactiv.(Abba , M.C. i colab.,2001).
STS technique (Sequence Tagged Site)
Aceast tehnic bazat pe PCR, detecteaz o secven unic ntr-un punct definit
din genom. Pe baza acestei tehnici pot fi convertii markerii genetici RAPD n markeri
STS, pentru acelai locus. Tehnica nu necesit clonare dac exist informaii anterioare
despre secven, pentru definirea primerilor. Designul primerilor de 18 20 pb, poate fi
conceput dup secvena fragmentelor RAPD excizate din gel, pentru a amplifica ulterior
fragmente de ADN unice (de exemplu poate fi secvena unui produs PCR - RAPD sau a
sondelor RFLP).
Polimorfismul este n general detectat ca o diferen de mrime n produsul de
amplificare STS fa de produsul RAPD, de la acelai locus. Dac nu exist nici o
diferen de mrime, se apeleaz la restricia enzimatic pentru a tia produii de
amplificare i pentru identificarea polimorfismului lor. Poate fi astfel detectat un
polimorfism de cteva nucleotide. Din moment ce primerii STS sunt mai lungi dect
primerii RAPD i bazai pe o secven specific, aceast metod detecteaz
polimorfismul de la acelai locus, fiind potrivit pentru studii de cartare genic.
Dezavantajul metodei este c proiectarea i crearea primerilor poate implica o investiie
important ( Roach J. C. i colab., 2000).

Aplicabilitatea tehnicilor n laboratoarele din ara noastr


Tehnica real-time PCR mai este folosit n determinarea cantitativ a viremiei la
pacienii infectai cu virusurile hepatice B i C ; analiza mutaiei factorului V Leiden i a
mutaiei protrombinei. De curnd s-a trecut de la tehnologia convenional PCRla tehnologia
real-time PCR Taqman cu prelucrare automat a probelor.Diferena const n metoda de
detecie a produsului PCR, care este cuantificat n cursul desfurrii reaciei prin
monitorizarea fluorescenei emise la fiecare ciclu de amplificare , spre deosebire de detecia
colorimetric care avea loc la sfritul reaciei .
Determinarea cantitativ a viremiei ( VHB) se bazeaz pe dou procese majore:
- pregtirea probei pentru a izola ADN-VHB;
- amplificarea PCR a ADN-ului int cu detecia simultan a sondei oligonucleotidice dublu
marcate clivate specifice intei.

13

Cuantificarea viremiei se realizeaz cu ajutorul unei secvene ADN neinfecioase


denumit Quantitation Standard (QS). ADN QS cu un numr cunoscut de copii este adugat
n fiecare prob i parcurge aceleai etape de preparare a probei, amplificarea PCR si detecie,
ca i secvena int. QS conine secvene VHB cu zone identice de legare a primerilor ca i
ADN-ul int, dar cu o zon unic de legare a sondei de detecie care permite diferenierea
ampliconului QS de ampliconul intei. Analizorul calculeaz concentraia ADN-VHB prin
comparararea semnalului intei cu semnalul QS din fiecare prob i controale.
Extracia acizilor nucleici se face automat printr-o tehnic de captur la suprafaa unor
bilue magnetice de sticl. Particulele virale sunt lizate prin incubarea la temperatur ridicat
cu o proteaz i un tampon care elibereaz acizii nucleici i i protejeaz de aciunea DNAzelor din plasm. n fiecare prob este introdus ADN QS ntr-o concentraie cunoscut,
mpreun cu proteaza, agentul lizant i biluele de sticl. Dup ce are loc incubarea
amestecului, ADN VHB si ADN VHB QS vor fi captai la suprafaa biluelor de sticl, n timp
ce substanele nelegate vor fi ndeprtate printr-un proces de splare. Dup ncheierea etapei
de splare, acizii nucleici adsorbii vor fi diluai cu o soluie apoas la temperatur nalt.
Proba procesat, ce include biluele de sticl mpreun cu ADN VHB si ADN VHB QS, va fi
adugat amestecului de amplificare si transferat n analizorul n care vor avea loc
amplificarea i detecia. n cazul tehnologiei real-time PCR, amplificarea se face n prezena
unui sistem raportor care emite fluorescen. Detecia se realizeaz cu ajutorul sondelor de tip
5 nucleaz-sonde TaqMan, dublu marcate: la un capt cu o substan fluorofora (reporter
dye R) i la cellat capt cu o molecul blocant (quencher dye Q). Ct timp sonda este
intact, fluorescena sistemului R va fi inhibat de molecula Q. In cazul n care amplificarea
este eficient, moleculele de ADN nou formate vor fixa prin hibridizare sonda TaqMan; n
cursul etapei de elongaie, ADN polimeraza Taq va degrada sonda prin activitatea sa
enzimatic de 5 endonucleaz i va elibera astfel fluoroforul.
Analiza mutatiei factorului V Leiden
Metoda permite detectarea si genotiparea unei mutaii punctiforme a genei umane care
codific factorul V. Prin intermediul unor primeri specifici se asigur amplificarea unui
fragment ADN int din gena factorului V, izolat printr-o tehnic automat dintr-o prob de
snge integral.
Pentru efectuarea testului se utilizeaz sistemul PCR LightCycler care folosete o
detecie n timp real prin fluorescena produsului amplificat diferit de cea obinut cu
ajutorul sondei TaqMan. Astfel, pentru detecia ampliconului se folosesc 2 sonde care
14

hibridizeaz la o secven intern a fragmentului amplificat, n cursul fazei de hibridizare a


primerilor. Sondele sunt reprezentate de 2 secvene oligonucleotidice specifice, marcate cu
fluorofori diferii:
- sonda 1, marcat la captul 3 cu fluoresceina (fluoroforul donator D);
- sonda 2, marcat la captul 5 cu substana LightCycler Red 640 (fluoroforul
acceptor A). Secvenele celor 2 sonde sunt astfel selectate nct s hibridizeze la secvenele
intei ntr-un aranjament de tip cap-coad, facilitnd apropierea celor 2 fluorofori.
Fluoresceina este excitat de lumina albastr emis de o surs a LightCycler-ului i emite o
lumin fluorescent verde. Ca urmare a apropierii celor 2 fluorofori in cursul fazei de
hibridizare, energia emis excit la rndul su fluoroforul Red 640, printr-un transfer de
energie a rezonanei fluorescente (FRET: fluorescence resonance energy transfer); acesta va
emite o lumin fluorescent roie, a crei intensitate va fi msurat n unitatea optic a
LightCycler-ului. Cantitatea de fluorescen emis va fi proporional cu nivelul intei.
Metoda de detectie a fluorescentei light cycler
Sondele de hibridizare sunt de asemenea folosite pentru stabilirea genotipului mutaiei,
prin analiza curbei de topire efectuat dup ncheierea ciclurilor de amplificare, cnd
ampliconul este prezent n concentraii crescute.
Sonda marcat cu Red 640 hibridizeaz la o secven a intei care nu conine situsul
mutaiei (sonda ancora); sonda marcata cu fluoresceina hibridizeaza la o secventa care include
situsul respectiv (sond a mutaiei). n cursul analizei curbei de topire, creterea
semnificativ a temperaturii induce scderea fluorescenei emise, deoarece sonda cu o
secven mai scurt (sonda mutaiei) este prima care disociaz i cei 2 fluorofori nu mai sunt
in apropiere. Dac este prezent mutaia factorului V, nepotrivirea sondei mutaiei cu int va
destabiliza hibridul, astfel c scderea fluorescenei se va nregistra la temperaturi mai joase.
n prezenta genotipului slbatic (fr mutaie), heteroduplexul ADN este stabil i va
avea o temperatur de topire mai mare. Genotipul heterozigot prezint o combinaie distinct
de proprieti.
Rezultatul pentru ADN-ul unei probe trebuie s prezinte ntotdeauna un profil al curbei
de topire pentru unul din cele 3 genotipuri: tipul homozigot slbatic (mutaie absent), mutant
homozigot sau genotip heterozigot. Dac nu se produce acest lucru, testul va fi considerat
invalid i vor trebui repetate toate etapele.

15

n plus, pentru validarea rezultatelor se folosesc 2 controale, negativ si pozitiv, cu


meniunea c, pentru acesta din urm trebuie s se obtin obligatoriu un profil de genotip
heterozigot.
Detecia tipurilor oncogene HPV .
Testul include 4 procese majore:
- pregatirea probei;
- amplificarea ADN-ului tinta cu ajutorul unor primeri complementari specifici HPV;
- hibridizarea produsilor de amplificare la sonde oligonucleotidice specifice tintei;
- detecia acestora printr-o metoda colorimetrica.
Etapa de pregatire a probei consta in extractia ADN HPV din celule cervicale
recoltate in mediu lichid, printr-o tehnica manuala. Amplificarea se realizeaza intr-un
termocycler, iar detecia pe un analizor ELISA automat. Pentru monitorizarea acuratetii
acestor 4 procese, se foloseste un control celular reprezentat de ADN-ul -globinei umane
care se va amplifica simultan cu ADN-ul tinta. Amestecul de reactie contine perechi de
primeri specifici atat pentru ADN-ul provenit de la 13 tipuri HPV cu risc inalt, cat si pentru
ADN-ul -globinei. Detecia ampliconului este efectuata cu ajutorul unor sonde
oligonucleotidice specifice care permit identificarea separata a ampliconului HPV si a celui
corespunzator -globinei.
Un rezultat negativ pentru o proba este validat numai daca se obtine un rezultat pozitiv
pentru ADN-ul -globinei.mbinei se folosete o metod similar.
Genotiparea HPV
In cazul acestui test amestecul de reactie contine primeri pentru amplificarea ADN a 37
genotipuri HPV precum si a genei -globinei. Pentru detectie si genotipare se utilizeaza un
ADN amplificat denaturat si stripuri care includ sonde oligonucleotidice dispuse liniar (sub
forma de benzi) care permit identificarea independenta a genotipurilor HPV individuale.
Tehnica Dynal SSP pentru tipizarea HLA
Este aplicata in laboratorul Synevo pentru determinarea HLA-B27, marker pentru
spondilita ankilopoietica.
Dynal SSP este o tehnica PCR ce utilizeaza primeri cu secventa specifica pentru
tipizarea HLA. Produsul Dynal SSP consta in amestecuri de primeri, fiecare continand una
sau mai multe perechi de primeri specifici, precum si o pereche de primeri de control
(specifici pentru o secventa nonalelica din proba, care functioneaza ca un control intern al
PCR, verificand eficiena procesului). Dynal SSP este bazat pe principiul ca un set de primeri
16

cu o complementaritate perfecta cu proba poate fi utilizat mult mai frecvent si mai eficient
decat seturile de primeri cu una sau mai multe nucleotide necomplementare la capatul 3.
Specificitatea sistemului de tipizare este parte a procesului de amplificare, iar
procesarea post-amplificare este redusa la maximum. In cazul in care are loc amplificarea,
identificarea alelelor tinta se face prin electroforeza in gel de agaroza.
Interpretarea rezultatelor obtinute poate fi facuta rapid cu ajutorul unui program de
interpretare - Dynal SSP Tool, care furnizeaza o a doua opinie dupa interpretarea manuala,
reducnd astfel riscul unor erori umane.
Chlamydia pneumoniae PCR Kit
Acest kit este conceput pentru detectarea Chlamydia pneumoniae prin Reactia Real
Time in lan a polimerazei. Detectarea C. pneumoniae se bazeaza pe amplificarea unei
secvene ADN specifice unei singure copii a genei ompA si pe masurarea concentratiei
produsului de amplificare in cursul procesului PCR, prin intermediul unei sonde marcate
fluorescent.
Prezenta C. pneumoniae este indicata de cresterea fluorescentei fluoroforului FAM.
Un standard intern (IS) este inclus in amestecul de reactie, controland posibila inhibare a
reaciei PCR sau eficiena procesului de izolare a ADN-ului. Amplificarea pozitiva a IS-ului
este detectat in canalul fluorescent pentru fluoroforul JOE. Kit-ul de detectare prezinta
avantajul tehnologiei "hot start", minimizand reaciile non-specifice si asigurand o
sensibilitate maxima. Acesta contine uracil-ADN-glycosylase (UDG), eliminand posibila
contaminare a reaciei PCR cu produsi de amplificare.
Kit de diagnostic de o foarte mare sensibilitate folosind o singura copie a genomului in
reactia PCR. Acest lucru asigura ridicata sensibilitate in detectarea C. pneumoniae in laborator
din material clinic. Kit-ul este conceput pentru diagnostic in vitro si ofera detectarea
calitativ.
Legionella pneumophila PCR Kit
Kit-ul este conceput pentru detectarea ADN-ului genomic Legionella pneumophila
avand la baza amplificarea secvenei specifice L. pneumophila a genei care codifica
subunitatea 16S ARN ribozomal prin reactie de polimerizare in lan (PCR) si prin masurarea
cresterii concentratiei produsului de amplificare in cursul PCR cu sonda marcata fluorescent
(Real time PCR).

17

Prezenta ADN-ului de Legionella in porba este indicata de cresterea fluorescentei


fluoroforului FAM. Un standard intern (IS) este inclus in amestecul de reactie, controland
posibila inhibare a reaciei PCR sau eficiena procesului de izolare a ADN-ului. Amplificarea
pozitiva a IS-ului este detectat in canalul fluorescent pentru fluoroforul JOE.
Kit-ul de detectare prezinta avantajul tehnologiei "hot start", minimizand reaciile nonspecifice si asigurand o sensibilitate maxima. Acesta contine uracil-ADN-glycosylase (UDG),
eliminand posibila contaminare a reaciei PCR cu produsi de amplificare. Acest lucru asigura
ridicata sensibilitate in detectarea Legionella in laborator din material clinic. Kit-ul este
conceput pentru diagnostic in vitro si ofera detectarea calitativ.
Mycoplasma pneumoniae PCR Kit
Acest kit PCR este conceput pentru detecia Mycoplasma pneumoniae prin
metoda PCR. Detecia se bazeaza pe principiul amplificarii secvenei ADN specifica pentru
M. Pneumoniae, a genei M181 care codeaza toxina CARDS si masurarea cersterii
concentratiei produsului amplificat pe durata reaciei PCR cu ajutorul unei sonde marcate
fluorescent (real-time PCR).
Prezenta Mycoplasma este indicata de cresterea fluorescentei floroforului FAM. In
mixul de reactie este inclus un Standard Intern (IS) care controleaza posibila inhibare a
reaciei PCR sau eficiena procesului de izolare a ADN-ului. Amplificarea pozitiva a IS-ului
este detectata pe canalul fluorescent pentru fluoroforul JOE.
Kit-ul de detecie prezinta avantajul tehnologiei "hot start", minimizand reaciile nonspecifice si asigurand o sensibilitate maxima. Acesta contine uracil-ADN-glycosylase (UDG),
eliminand posibila contaminare a reaciei PCR cu produsi de amplificare.
Acest kit de diagnostic asigura sensiblitatea foarte ridicata a a detectiei Mycoplasma in
laborator pornind de la materialul clinic. Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si
asigura detecia calitativ.
Borrelia burgdoferi PCR Kit
Kit-ul este este conceput pentru detecia speciilor clinice importante din grupul
"Borrelia burgdoferi sensu lato" (B. burgdoferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii, B.
valasiana, B. lusitaniae, B. andersonii, B. bissettii, B. japonica, B. tanukii, B. turdi, B. sinica).
Kitul se bazeaza pe principiul detectiei secvenei specifice a unei gene cromozomiale, care
codeaza proteina flagelata si a unei gene care codeaza 16S ARN bacterial, specific pentru
grupul B. Burgdoferi sensu lato grup.
18

Metoda a fost testata pe o gama larga de bacterii europene de tipul Borrelia si


Spirochete. Sensibilitatea kitului de detectie PCR urca pn la detectarea unei singure copii a
genomului borrelia intr-o reactie, asigurand sensibilitate maxima in detecia in laborator din
fluide organice (fluid sinovial, fluid cerebrospinal, urina) sau snge. Kitul este destinat pentru
diagnosticarea in vitro si asigura detecia calitativ.
Neisseria gonorrhoeae PCR Kit
Kit-ul este conceput pentru detectarea ADN-ului genomic Neisseria gonorrhoeae prin
reactia de polimerizare in lan (PCR). Aceasta detectie este concentrata asupra secvenei
multicopii a genei care codifica ARN-ul 16S bacterial, specific pentru Neisseria gonorrhoeae.
Sensibilitatea kitului de detectie PCR urca pn la o singura copie a ADN-ului
genomic gonococcus intr-o reactie, asigurnd sensibilitatea maxima a deteciei in laborator
din tampoane uretale sau vaginale.
Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigura detecia calitativ.
Cytomegalovirus (CMV) PCR Kit
Acest kit PCR este conceput pentru diagnosticul cantitativ si sensibil al infectiilor cu
cytomegalovirus. Detecia este bazata pe amplificarea unei secvene conservative ADN
specifice a unei singure gene pentru exon 4 IE antigen prin PCR.
Sensibilitatea deteciei cu ajutorul acestui kit const in identificarea unui singur genom
al virusului aprut ntr-o reacie. Acest lucru asigura laboratoarelor de diagnostic sensibilitatea
de 1 la 10 in cazul probelor de tesut (biopsii) si de sute per ml in probele de fluide biologice
(spalatur bronhoalveolara, ser, saliva) sau probe de snge (10 - 50 copii ale genomului viral
pentru 2 x 10E5 leucocite).
Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro i asigura detecia calitativ sau
cantitativ; de aceea, este recomandat pentru identificarea infeciilor active/latente i pentru
monitorizarea eficientei terapiei sau a evoluiei unei boli.
Neisseria gonorrhoeae PCR Kit
Kit-ul este conceput pentru detectarea ADN-ului genomic Neisseria gonorrhoeae prin
reactia de polimerizare in lan (PCR). Aceasta detectie este concentrata asupra secvenei
multicopii a genei care codifica ARN-ul 16S bacterial, specific pentru Neisseria gonorrhoeae.
Sensibilitatea kitului de detectie PCR urca pn la o singura copie a ADN-ului genomic
gonococcus intr-o reacie, asigurnd sensibilitatea maxima a deteciei in laborator din
tampoane uretale sau vaginale.
19

Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigura detecia calitativ.


Cytomegalovirus (CMV) PCR Kit
Acest kit PCR este conceput pentru diagnosticul cantitativ si sensibil al infectiilor cu
cytomegalovirus. Detecia este bazata pe amplificarea unei secvene conservative ADN
specifice a unei singure gene pentru exon 4 IE antigen prin PCR.
Sensibilitatea deteciei cu ajutorul acestui kit consta in identificarea unui singur genom
al virusului aparut intr-o reacie. Acest lucru asigura laboratoarelor de diagnostic sensibilitatea
de 1 la 10 in cazul probelor de tesut (biopsii) si de sute per ml in probele de fluide biologice
(spltura bronhoalveolara, ser, saliva) sau probe de snge (10 - 50 copii ale genomului viral
pentru 2 x 10E5 leucocite).
Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigura detecia calitativ sau
cantitativ; de aceea, este recomandat pentru identificarea infeciilor active/latente si pentru
monitorizarea eficientei terapiei sau a evoluiei unei boli.
Epstein-Barr virus (EBV) PCR Kit
Acest kit este destinat pentru diagnosticul cantitativ si sensibil al infectiilor cu
Epstein-Barr virus. Detecia este bazata pe amplificarea unei singure copii a genei EBNA1
nuclear prin metoda reaciei de amplificare in lan sub actiunea polimerazei (PCR).
Sensibilitatea de detecie a kitului ajunge pn la o singura copie a genomului viral
/reactie. Acest lucru asigur laboratoarelor de diagnostic sensibilitatea de 1 la 10 in cazul
probelor de tesut (biopsii) i de sute per ml. in probele de fluide biologice (spltura
bronhoalveolara, ser, saliv) sau probe de snge (10 - 50 copii ale genomului viral pentru 2 x
10E5 leucocite).
Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigur detecia calitativ sau
cantitativ; de aceea, este recomandat pentru identificarea infeciilor active/latente i pentru
monitorizarea eficienei terapiei sau a evoluiei unei boli.

HSV/VZV PCR Kit

20

Acest kit este destinat pentru detecia simultana a virusului Herpes simplex (HSV) si
virusului Varicella-Zoster (VZV) prin metoda reaciei de amplificare in lan sub aciunea
polimerazei (PCR).
Detecia VZV este bazata pe pe amplificarea unei secvene ADN conservative a unei
singure copii a genei pentru ORF62 (IE62 transactivator). Detecia ambelor tipuri de HSV
(HSV-1, HSV-2) este bazat pe amplificarea PCR a unei secvene ADN conservative a unei
gene single-copy a glicoproteinei B (g.
Sensibilitatea de detecie a kitului ajunge pn la o singura copie a genomului viral
/reactie. Aceasta asigura o sensibilitate inalta pentru detecia in laborator a sute de virusi/ml in
probe de fluide biologice (ser, alte fluide) sau snge.
Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigur detecia calitativ.
Herpes Simplex Virus (HSV-1/2) PCR Kit
Acest kit este destinat pentru detecia Herpes Simplex Virus de tip 1 (HSV-1) i
Herpes Simplex Virus de tip 2 (HSV-2) prin metoda reaciei de amplificare in lan sub
aciunea polimerazei (PCR). Detecia HSV este bazata pe pe amplificarea unei secvene ADN
conservative a unei singure copii a genei pentru glicoproteina B (g i msurarea concentraiei
produsului de amplificare pe durata procesului PCR prin intermediul unei sonde marcate
fluorescent, de EX cu colorant FAM pentru HSV-1 i Cy5 pentru HSV-2.
Mixul de reacie include un Standard Intern (IS) care regleaz posibila inhibare a
reaciei PCR i eficiena procesului de izolare a ADN-ului. Amplificarea IS rezult intr-un
semnal pozitiv pe canalul JOE.
Kitul de detecie este superior tehnologiei "hot start" reducnd la minim reaciile
nespecifice i asigurnd maximul de sensibilitate. De asemenea, coninutul de uracil-ADNglicozilaza (UDG) controleaz posibila contaminare a reaciei PCR de ctre produsele de
amplificare. Aceasta asigur detecia foarte sensibila in laborator a HSV-1 si HSV-2 in probele
de fluide biologice si snge.
Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro i asigur detecia calitativ i
cantitativ.
Herpes Simplex Virus (HSV-1) PCR Kit

Acest kit PCR este destinat pentru detecia Herpes Simplex Virus de tip 1 (HSV-1) prin
metoda reaciei de amplificare in lan sub actiunea polimerazei (PCR).

21

Detecia HSV este bazat pe amplificarea unei secvene ADN conservative, a unei
singure copii a genei pentru glicoproteina B (g si msurarea concentraiei produsului de
amplificare pe durata procesului PCR prin intermediul unei sonde marcate fluorescent (Realtime PCR). Probele pozitive HSV-1 duc la creterea fluorescentei colorantului FAM. Mixul de
reacie include un Standard Intern (IS) care regleaz posibila inhibare a reaciei PCR i
eficiena procesului de izolare a ADN-ului. Amplificarea IS rezult intr-un semnal pozitiv pe
canalul JOE.
Kitul de detecie este superior tehnologiei "hot start" reducnd la minim reaciile
nespecifice i asigurnd maximul de sensibilitate. De asemenea, coninutul de uracil-ADNglicozilaza (UDG) controleaz posibila contaminare a reaciei PCR de ctre produsele de
amplificare.
Aceast metod asigura detecia foarte sensibil in laborator a HSV-1 in probele de
fluide biologice si snge. Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigura detecia
calitativ i cantitativ.
Herpes Simplex Virus (HSV-2) PCR Kit
Acest kit PCR este destinat pentru detecia Herpes Simplex Virus de tip 2 (HSV-2)
prin metoda reaciei de amplificare in lan sub aciunea polimerazei (PCR).
Detecia VZV este bazat pe amplificarea unei secvene ADN conservative a unei
singure copii a genei pentru glicoproteina B (g si msurarea concentraiei produsului de
amplificare pe durata procesului PCR prin intermediul unei sonde marcate fluorescent (Realtime PCR). Probele pozitive HSV-2 duc la cresterea fluorescentei colorantului FAM. Mixul de
reactie include un Standard Intern (IS) care regleaz posibila inhibare a reaciei PCR i
eficiena procesului de izolare a ADN-ului. Amplificarea IS rezult intr-un semnal pozitiv pe
canalul JOE.
Kitul de detecie este superior tehnologiei "hot start" reducnd la minim reaciile
nespecifice si asigurnd maximul de sensibilitate. De asemenea, coninutul de uracil-ADNglicozilaza (UDG) controleaz posibila contaminare a reaciei PCR de catre produsele de
amplificare.
Aceasta metoda asigura detecia foarte sensibil in laborator a HSV-2 in probele de
fluide biologice si snge.
Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigura detecia calitativ si
cantitativ.

22

Varicella - Zoster Virus (VZV) PCR Kit


Acest kit PCR este destinat pentru detecia Varicella-Zoster Virus (VZV) prin metoda
reaciei de amplificare in lan sub actiunea polimerazei in timp real (Real-time PCR).
Detecia VZV este bazata pe pe amplificarea unei secvene ADN conservative a unei singure
copii a genei ORF62 si masurarea concentratiei produsului de amplificare pe durata
procesului PCR prin intermediul unei sonde marcate cu colorantul fluorescent FAM. Mixul de
reactie include un Standard Intern (IS) care regleaz posibila inhibare a reaciei PCR si
eficiena procesului de izolare a ADN-ului (varianta ISEX). Amplificarea IS rezulta intr-un
semnal pozitiv pe canalul JOE.
Kitul de detectie este superior tehnologiei "hot start" reducnd la minim reaciile
nespecifice si asigurnd maximul de sensibilitate. De asemenea, coninutul de uracil-ADNglicozilaza (UDG) controleaza posibila contaminare a reaciei PCR de catre produsele de
amplificare. Aceasta asigura detecia foarte sensibila in laborator a VZV in probele de fluide
biologice si snge.
Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigura detecia calitativ si
cantitativ.
Hepatitis B Virus (HBV) PCR Kit
Acest kit este destinat pentru detecia Hepatitis B Virus (HBV) prin metoda reaciei de
amplificare in lan sub actiunea polimerazei in timp real (Real-time PCR).
Detecia HBV este bazat pe amplificarea unei secvene ADN conservative a unei
singure copii a ORFx si msurarea concentraiei produsului de amplificare pe durata
procesului PCR prin intermediul unei sonde marcate fluorescent. Prezenta HBV duc la
cresterea fluorescentei colorantului FAM. Mixul de reactie include un Standard Intern (IS)
care regleaz posibila inhibare a reaciei PCR si eficiena procesului de izolare a ADN-ului.
Amplificarea pozitiva a IS este detectat pe canalul de fluorescenta al fluoroflorului HEX.
Kitul de detectie este superior tehnologiei "hot start" reducnd la minim reaciile
nespecifice si asigurand maximul de sensibilitate. De asemenea, continutul de uracil-ADNglicozilaza (UDG) controleaza posibila contaminare a reaciei PCR de catre produsele de
amplificare.
Sensibilitatea kitului de diagnostic coboara pn la o singura copie a virusului intr-o
reactie PCR. Aceasta asigura detecia foarte sensibila in laborator a HBV in probele de fluide
biologice (plasma, ser).

23

Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigura detecia calitativ si


cantitativ.
Hepatitis C Virus (HCV) PCR Kit
Acest kit este destinat pentru detecia RNA Hepatitis C Virus (HBV) bazat pe
amplificarea unei singure copii a secvenei 5 URT prin intermediul unei reactii de reverstranscriptie urmata de amplificarea in lan (RT-PCR) si msurarea creterii concentraiei
produsului de amplificare pe durata PCR prin intermediul unei sonde marcate fluorescent
"real-time PCR".
Sonda destinat deteciei patogene este marcat cu fluoroforul FAM. Mixul de reactie
"gata de utilizare" include toate componentele necesare pentru amplificarea ARN-ului
microorganismelor detectate.
Kitul de detectie este superior tehnologiei "hot start" reducnd la minim reaciile
nespecifice si asigurand maximul de sensibilitate. De asemenea, continutul de uracil-ADNglicozilaza (UDG) controleaz posibila contaminare a reaciei PCR de ctre produsele de
amplificare.
Kitul contine de asemenea un Standard Intern (IS) care regleaz posibila inhibare a
reaciei PCR si eficiena procesului de izolare a ADN-ului (sonda destinat detectiei IS este
marcata cu fluorofor HEX).
MTHFR A1298C PCR Kit
Acest kit este conceput pentru detecia mutaiei A1298C in gena pentru reductaza
methylentetrahydropholate (MTHFR) prin intermediul metodei Real-time PCR.
Aceast metod se bazeaz pe amplificarea secvenei ADN a genei MTHFR purttoare
de mutatie A1298C si hibridizarea secvenei amplificate cu sonde marcate fluorescent pentru
alela standard C1298C si pentru alela mutanta A1298A a genei MTHFR.
Evaluare: homozigota standard, heterozigota mutanta, homozigota mutanta.
Factor II Prothrombin PCR Kit
Acest kit este conceput pentru detecia mutaiei G20210A in gena protrombinei (factor
II) prin metoda Real-time PCR.
Aceasta metoda este bazata pe amplificare unei secvene ADN de protrombina cu
mutatie G20210A si pe hibridizarea secvenei amplificate cu sonde marcate fluoroform pentru
alela G20210A si pentru alela mutanta A20210A a genei umane factor II.
24

Evaluare: homozigota standard, heterozigota mutanta, homozigota mutant.


Factor II Prothrombin PCR Kit
Acest kit este conceput pentru detecia mutaiei G20210A in gena protrombinei (factor
II) prin metoda Real-time PCR.
Aceasta metoda este bazata pe amplificare unei secvene ADN de protrombina cu
mutatie G20210A si pe hibridizarea secvenei amplificate cu sonde marcate fluoroform pentru
alela G20210A si pentru alela mutanta A20210A a genei umane factor II.
Evaluare: homozigota standard, heterozigota mutanta, homozigota mutant.
Lawsonia intracellularis PCR Kit
Acest kit este conceput pentru detecia agentului ce cauzeaza boala intestinala porcina,
bacteria patogena Lawsonia intracellularis.
Metoda este bazata pe amplificare unei secvene specifice de codificare antigen LsaA.
Sensibilitatea kitului coboara pn la apariia unui singur genom bacterial intr-o reactie.
Aceasta ofer n laboratorul de diagnostic o sensibilitate de unu la zece in frotiuri sau in
excremente si probe de tesut.
Aceasta metoda este conceput pentru detectarea calitativ.
Porcine circovirus (PCV) PCR Kit
Acest kit este conceput pentru detecia circovirusului porcin, agentul ce cauzeaza boala
porcina "PMWS".
Metoda este bazata pe amplificare unei secvene specifice de ORF1. Sensibilitatea kitului
coboara pn la apariia unei singure secvene intr-o reactie. Aceasta ofer in laboratorul de
diagnostic o sensibilitate de unu la zece in probele de ser, in frotiuri, excremente si probe de
tesut, precum si sensibilitate de sute in 1 ml snge.
Aceasta metoda este conceput pentru detectarea calitativ si semi-calitativ si prevede
stabilirea concentratiilor particulelor virusului in probele. Metoda poate detecta tipurile
veterinare patogene PCV-2 si PCV-1 ce contamineaza culturile de tesut provenite de la rinichii
porcilor (EX: PK-15).
O identificare ulterioara a tipurilor PCV-1 si PCV-2 pote fi efectuata prin metoda PCRRFLP, utilizand fragmentarea specifica a enzimei de restrictie Ncol, a carei secventa tinta este
gasita numai in produsul de amplificare al versiunii PCV2.

25

Porcine circovirus (PCV) PCR Kit


Kit-ul este conceput pentru detecia universala a virusurilor ARN de Pestivirus sp. (in
special pentru detectarea virusului viral diareic bovin / BVDV-1a, BVDV-1b, BVDV-1c,
BVDV-1d, BVDV-2 /; virusul bolii de granita (BDV); virusul pestei porcine clasice (CSFV))
prin reactie in lan a revers polimerazei (RT-PCR).
Metoda se bazeaza pe amplificarea unei secvene specifice a genei care codifica virusul
poliprotein. Diagnosticarea prevede o detectare de o mare sensibilitate a pestivirusurilor ce
contamineaza culturile de celule si soluiile utilizate pentru culturile de tesuturi (de EX:
virusul culturi, BSA), precum i controlul contaminarii cu produse preparate din culturi de
celule (de ex: vaccinuri).
Aceasta metoda este unic adaptata pentru detectarea inhibarii reaciei si, datorita
simplicitatii procesului de detectare, ofera rezultate standard, chiar si pentru analiza
materialelor cu continut ridicat de inhibitori PCR.
PathogenFree DNA Isolation Kit
Acest kit pentru izolarea ADN-ul este conceput pentru a fi utilizat in diagnosticare si
laboratoare de cercetare care se ocupa cu diagnosticarea prin PCR de rutina a
microorganismelor patogene (bacterii, candida si fungi, virusuri si protozoare) sau in
diagnostic genetic uman.
Datorit designului cu coloane kitul asigura o operare simpla, eficient si rapidpentru
izolarea ADN-ului din materiale clinice fr contaminare cu ADN microbian. Kit-ul este
conceput n principal pentru izolarea ADN-ului din snge, fluide biologice si alte probe
clinice.
Mycoplasma species PCR Kit
Kit-ul este conceput pentru detectarea ADN-ului genomic in speciile de Micoplasma
prin reactia in lan a polimerazei (PCR). Aceasta detectare este focusata pe o secventa multicopie a genei bacteriei codificate 16S ARN, specifica pentru speciile de Micoplasma.
Sensibilitatea kitului coboara pn la aparitia unui singur genom bacterial intr-o reactie.
Kitul asigura detectie universala a tuturor micoplasme umane semnificative din punct de
vedere clinic si ureaplasme, inclusiv M. pneumoniae, M. hominis, M. genitalium, U. urealitica
i M. fermentans.

26

Acesta ofera in laboratorul de diagnostic o sensibilitate de unu la zece micoplasme in 1


ml fluid biologic fara celule (urina, lavaj bronhoalveolar, sputa) sau pn la sute de
micoplasme in 1 ml snge sau sperm.
Kit-ul este proiectat si certificat pentru diagnostic in vitro si ofera detectie calitativ.
Kit-ul este conceput, de asemenea, pentru o detectie sensibila a tuturor tulpinilor Micoplasma
ce contamineaza culturile de tesuturi si solutii pentru culturile de celule (de exemplu: culturi
virusuri, BSA), precum i pentru controlul contaminarii cu produse preparate din culturi de
celule (de exemplu, vaccinuri). Acesta ofera in laboratorul de diagnostic o sensibilitate de unu
la zece micoplasme in 1 ml de TK sau solutie BSA. Aceasta metoda este unic adaptat pentru
detectarea inhibarii reaciei si datorita simplicitatii procesului de detectare, ofera rezultate
standard, chiar si pentru analiza materialelor cu coninut ridicat de inhibitori PCR.
Aceasta metoda este capabila s detecteze toate tulpinile Micoplasma cunoscute (Centrul
National pentru Biotehnologie Informaii SUA; 2006) si este ajustat pentru a detecta cel puin
urmtoarele tulpini de industrial sau veterinare Mycoplasma specii semnificative:
Acholeplasma axanthum, Mycoplasma alvi, M. arginini, M. buccale, M. cavipharyngis,
M.cloacale, M. Fastidiosum, M. fermentans, M. genitalium, M. hominis, M. salivarium, M.
pulmonis, M. Orale, M. penetrans, M.pirum, M. pneumoniae, Ureaplasma urealyticum,
U.diversum , U. parvum , Acholeplasma sp., etc.

Concluzii :
Tehnicile PCR au un impact puternic n foarte multe domenii , cea ce ne las de neles
c sunt metode uor de folosit, permisive din punct de vedere financiar, i care ar trebui s se
gseasc n mai multe laboratoare din ara noastr . Utilizarea lor ar putea ajuta foarte mult
sistemul medical prin diagnostificarea precoce a anumitor boli ceea ce ar duce la economisire
datorat acestui diagnostic . O boal depistat devreme implic un cost mai mic pentru sistem.
Studiile de cercetare din acest domeniu ar putea ct de curnd s ne ajute la
personalizarea tratamentelor ceea ce ar duce la rezultate ct mai bune, sau chiar spre
vindecare a unor boli care momentan nu au rspuns .

Bibliografie:
1. Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de
laborator ;

27

2. CHUNG, H.Y., M.E. DAVIS, AND H.C. HINES, 2001, Relationship of two PCRRFLP in
the bovine calpastatin gene with calpastatin activity, meat tenderness, and carcass traits.
Ohio State University Research and Reviews: Beef and Sheep 2001.Circ. 181-01;
3. Florin Zugun-Eloae, Iuliu Cristian Ivanov - Tehnici de amplificative (PCR) i
nonamplificative(hibridizare in situ) de analiz a acizilor nucleici n diagnosticul
molecular, Editura ,,Grigore T. Popa, 2013

28