Sunteți pe pagina 1din 30

Universitatea din Bucureti

Facultatea de Chimie
coala Doctoral n Chimie
Departamentul de Chimie Analitic

STUDII ASUPRA INJECIEI VOLUMELOR


MARI DE PROB N CROMATOGRAFIA DE
LICHIDE N FAZ INVERS
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Doctorand,

Conductor tiinific,

tefan Udrescu

Profesor Dr. Victor David

Comisia de evaluare:
Preedinte: Prof. Dr. Dumitru Oancea, Membru Corespondent al Academiei Romne,
Decanul Facultii de Chimie, Universitatea din Bucureti
Prof. Dr. Andrei Medvedovici - Universitatea din Bucureti
Conf. Dr. Costel Srbu - Universitatea Babe-Bolyai, Cluj-Napoca
C.P. I Dr. Dan Florin Anghel - Institutul de Chimie-Fizic Ilie Murgulescu al
Academiei Romane

2012

CUPRINS
(numerotarea paginilor este cea corespunztoare tezei de doctorat)
CAPITOLUL 1 ASPECTE TEORETICE I INSTRUMENTALE PRIVIND INJECIA
PROBELOR N CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE NALT PERFORMAN
1.1.

Generalitti privind sistemele de injecie

1.2.

Valva de injecie (principii constructive)

1.3.

Modaliti de injectare; calificarea operaional a injectoarelor

1.4.

ncrcarea coloanei

10

1.5.

Cromatografia de lichide: mecanismul de retenie n faz normal

16

1.6.

Cromatografia de lichide: mecanismul de retenie n faz invers

24

1.7.

Modelul adsorbiei aplicat n cromatografia de lichide n faz invers


la injectarea de solveni hidrofobi

1.8.
1.9.

30

Fenomene generale de retenie la injectarea probelor n cromatografia


de lichide n faz invers

37

Influena volumului de injecie asupra funciei de calibrare

47

CAPITOLUL 2 STUDII ASUPRA INJECIEI VOLUMELOR MARI DE PROB N


CROMATOGRAFIA DE LICHIDE N FAZ INVERS
2.1.

Scopul cercetrii asupra volumului de injecie n cromatografia de lichide

51

2.2.

Injectare de volume mari de solveni organici miscibili cu faza mobil

53

2.3.

Injectare de volume mari de probe apoase

58

2.4.

Injectare de volume mari de solventi organici nemiscibili cu faza mobil n


cazul analiilor cu o hidrofobicitate mai mic dect a solventului de injecie

2.5.

74

Injectare de volume mari de solventi nemiscibili cu faza mobil n cazul


analiilor cu o hidrofobicitate egal sau mai mare dect a solventului de injecie

2.6.

Aplicaii practice ale injeciei de volum mare pentru analii cu o hidrofobicitate mai
pronunat dect a solventului de injecie

2.7.

90

Aplicarea injeciilor de volum mare de solvent organic nemiscibil cu faza mobil


la determinarea indapamidului din snge prin HPLC-MS/MS

2.8.

86

102

Aplicarea injeciilor de volum mare de solvent organic nemiscibil cu faza mobil


la determinarea fenspiridei din plasm prin HPLC-MS/MS

118

Concluzii finale

130

Bibliografie

134

PRIVIRE DE ANSAMBLU
Lucrarea intitulat Studii asupra injeciei volumelor mari de prob n cromatografia de
lichide n faz inversa fost structurat n dou capitole, primul capitol reprezentnd partea
teoretic a lucrrii iar al doilea capitol reprezentnd partea experimental:
Capitolul 1 cuprinde informaii de literatur referitoare la aspectele teoretice i
experimentale privind injecia probelor n cromatografia de lichide de nalt performan.
Capitolul 2 cuprinde contribuiile originale, experimentale i teoretice, n ceea ce privete
injecia volumelor mari de prob n cromatografia de lichide n faz invers.
Volumul de injecie n cromatografia de lichide este un parametru care influeneaz
sensibilitatea i limita de detecie. Asupra acestui parametru exist un numr mare de restricii, n
special atunci cnd solventul probei injectate nu este identic sau compatibil cu faza mobil utilizat
n procesul de retenie cromatografic.
innd cont de importana acestui parametru n analiza prin cromatografia de lichide n faz
invers (RP-LC) a probelor multicomponent, n lucrarea de fa s-au studiat att influena volumului
de injecie asupra parametrilor cromatografici obinui, ct i natura solventului i influena sa
asupra procesului de retenie cromatografic.
Au fost selectate trei categorii de solveni de prob pentru studiat: solveni organici miscibili
cu faza mobil, solventi aposi (amestec de solvent organic cu ap sau ap n care este dizolvat
un aditiv anorganic oarecare, fie el o sare sau un agent de reglare a pH-ului) respectiv solveni
organici hidrofobi, nemiscibili cu faza mobil (hidrocarburi alifatice inferioare, alcooli alifatici
superiori). Solveni nemiscibili cu faza mobil pot fi mprii n 3 categorii n funcie de
hidrofobicitatea pe care o pot avea analiii de interes comparativ cu solventul de injecie (mai mic,
mai mare respectiv aproximativ egal). Aceast clasificare a solvenilor este foarte important
pentru c diferena de hidrofobicitate ntre solventul de injecie i analitul de interes poate fi critic
pentru succesul unei astfel de abordri.
n cele ce urmeaz vor fi prezentate principalele rezultate experimentale i cele mai
importante aspecte teoretice, cu meniunea c numerotarea figurilor, tabelelor i trimiterilor
bibliografice rmne aceeai cu cea din tez.

2.1.

Injectare de volume mari de solveni organici miscibili cu faza mobil

Problematica studiului
Pentru a studia efectele ce apar la injectarea de volume cresctoare de probe dizolvate n
solveni organici miscibili cu faza mobil a fost ales un grup de compui de hidrofobicitate medie a
cror structur i log KOW calculat prin metoda fragmentelor moleculare [folosind programul EPI
Suite - KOWWIN versiunea 1.67, al Environmental Protection Agency, SUA] sunt prezentate n
tabelul de mai jos. Ca solveni de probe au fost folosii metanol ( 25
0

= 0,544 cP), acetonitril

( 25 C =0,343 cP) i izopropanol ( 25 C =1,96 cP). Tria elutropic a acestor solveni creste n
ordinea metanol-acetonitril-izopropanol.
Tabel 2.1. Structura i valoarea log KOW pentru compuii studiai
Compus
Structur
O

log KOW calculat

CH3

1,96

Metil paraben
OH

OH
OH

Acid salicilic
O
N

Piroxicam

N
H

2,25

OH

2,58
S O
O

CH3

Propil paraben

2,98
OH
O

Meloxicam

N
H

OH

3,50
S O
O

OH

Cl

Fenofibrat Impuritate A

3,31
O

Condiii experimentale
Sistemul cromatografic utilizat a fost de tip Agilent 1100 (produs de Agilent Tehnologies) i a
fost compus din: cabinet de solveni, degazor (G1379A), pomp cuaternar (G1311A); injector
automat (G1329A), termostat pentru coloan(G1316A), detector DAD (G1315B).
Separarea cromatografic a fost efectuat folosind o coloan Zorbax Eclipse XDB-C18, 15
cm x 4,6 mm i.d. x 5 m d.p., termostatat la 25oC. Studiul a fost efectuat n condiii izocratice (35%
acetonitril i 65% soluie apoas 0,2% H3PO4) folosind un debit al fazei mobile de 2,0 mL/min.
Detecia a fost fcut la lungimea de und de 237 nm.
Concentraiile analiilor de interes n probele injectate au fost variate n aa fel nct
cantitatea absolut de analit injectat n coloana cromatografic s ramn constant (250 ng)
pentru cele 4 volume de injecie investigate: 5, 10, 20 i 25 L.
Rezultate experimentale
Cromatogramele obinute n condiiile descrise mai sus sunt prezentate pentru cazurile
extreme (volumele de injecie 5 respectiv 25 L) i discutate n cele ce urmeaz. Dup cum se
poate observa compoziia fazei mobile a fost aleas n aa fel nct s permit obinerea unei
separri bune a compuilor studiai. Ordinea de eluie este: 1- metil paraben; 2- acid salicilic; 3-

piroxicam; 4- propil paraben; 5- meloxicam; 6- fenofibrat impuritate A.


O

OH

mAU
160

OH

140
O

120

N
CH3

N
H

OH

100

CH3

S O
O

N
OH

N
H

OH

80

OH

Cl

S O

OH

Izopropanol

60
40

Acetonitril

20
0

Metanol
0

10

min

12

Fig. 2.1 Cromatogramele rezultate pentru Vinjecie = 5 L


mAU

80

Izopropanol

60

40

Acetonitril
20

Metanol
0
0

10

12

min

Fig. 2.4 Cromatogramele rezultate pentru Vinjecie = 25 L


Din datele teoretice existente ar fi de ateptat ca n cazul izopropanolului distorsiunile de
form de pic s apar la volume mai mici de injecie dect n cazul folosirii acetonitrilului sau
metanolului ca solvent de injecie (att tria elutropic ct i vscozitatea solventului sunt cele mai
mari din seria de solveni de prob aleas) i ca distorsiunile de form de pic s fie mai pronunate
pentru compuii cu factori de retenie mai mici, n timp ce pentru cei cu factori de retenie mai mari
efectele ar trebui s fie mai puin sesizabile.
Dup cum se poate constata din figura 2.2 distorsiunile de form de pic ncep s apar n
cazul injeciei de 10 L doar pentru injecia de analii dizolvai n izopropanol. Deformarea picului
este abia sesizabil pentru metil paraben care este primul compus n ordinea de eluie (factor de
retenie 1,8), i mai pronunat pentru piroxicam (al 3-lea compus n ordinea de eluie, factor de
retenie 3,8) i meloxicam (al 5-lea compus n ordinea de eluie, factor de retenie 12,1), n timp ce
pentru ceilali compui nu se poate sesiza deformarea picurilor cromatografice.
n momentul n care cretem volumul de injecie la 20 L deformarea formei de pic ncepe
s apar i la injeciile de soluii n acetonitril respectiv metanol (n cazul izopropanolului deja putem
vorbi chiar de splitare a picului). Deformrile formei de pic sunt mai pronunate pentru acetonitril
dect pentru metanol; prin simpla examinare a figurii 2.3 n cazul injeciei de metanol am putea
spune chiar c aceste deformri sunt nesemnificative i ca analiii notrii ramn practic neafectai,
de aceea suntem nevoii sa examinm i valorile numerice calculate pentru simetria picurilor
cromatografice din tabelul de mai jos:
Tabel 2.2. Simetria picurilor analiilor de interes
Solvent de prob/volum
injecie
metanol/ 5 L
acetonitril/ 5 L

Simetria picului corespunztor


metil
paraben

acid
salicilic

piroxicam

propil
paraben

meloxicam

fenofibrat
impuritate A

0,93
0,93

0,72
0,75

0,96
0,96

0,98
0,97

0,97
1,00

1,00
1,00

Solvent de prob/volum
injecie
izopropanol/ 5 L
metanol/ 10 L
acetonitril/ 10 L
izopropanol/ 10 L
metanol/ 20 L
acetonitril/ 20 L
izopropanol/ 20 L
metanol/ 25 L
acetonitril/ 25 L
izopropanol/ 25 L

Simetria picului corespunztor


metil
paraben

acid
salicilic

piroxicam

propil
paraben

meloxicam

fenofibrat
impuritate A

0,92
0,93
0,95
1,20
1,44
1,72
3,21
2,04
1,99
3,68

0,77
0,70
0,75
0,82
0,89
1,33
1,86
1,21
1,60
2,34

0,96
0,95
0,97
1,53
1,11
1,14
3,56
1,53
1,40
4,26

0,98
0,99
1,00
1,12
1,30
1,57
2,72
1,93
2,15
3,57

0,95
0,99
0,97
1,33
1,30
1,29
2,92
1,86
1,71
3,20

1,01
0,98
1,00
1,03
1,15
1,41
2,57
1,63
1,81
2,94

n cazul probelor dizolvate n metanol picurile cel mai puin afectate sunt cele de acid
salicilic, piroxicam i fenofibrat impuritate A (al doilea, al treilea respectiv ultimul n ordinea de
eluie) iar cele mai afectate sunt metil parabenul, propil parabenul i meloxicamul (primul, al
patrulea respectiv penultimul n ordinea de eluie). Pentru probele dizolvate n acetonitril singurul
pic cromatografic care poate fi considerat ca neafectat este cel de piroxicam.
Dup cum se poate observa din figura 2.4 pentru injeciile de 25 L toate cromatogramele
au un aspect nesatisfctor n privina majoritii analiilor (se poate vedea un nceput de splitare i
pentru injeciile de metanol sau acetonitril). n cazul folosirii acetonitrilului ca solvent de prob forma
de pic cea mai bun se obine pentru piroxicam iar n cazul folosirii metanolului pentru acid salicilic
i piroxicam.
Concluzii asupra studiului
Pentru grupul de compui investigai (cu factori de retenie cuprini ntre 1,8 i 15,6) efectul
triei elutropice a solventului de prob asupra formei de pic a analiilor este mai seminficativ dect
efectul vscozitii solventului, solventul care duce la cele mai bune forme de pic fiind metanolul.
Cea mai important concluzie care poate fi formulat este c teoria empiric cu primii
compui n ordinea de eluie sunt cei mai afectai, cei cu factori de retenie mai mari sunt afectai
ntr-o mai mic msur sau chiar neafectai nu se confirm. n plus compuii care sunt cel mai
puin afectai difer i n funcie de natura solventului organic. Ca o consecin nu se poate
prevedea comportarea unui compus oarecare dizolvat ntr-un solvent organic pe baza vscozitii
sau triei elutropice a solventului de prob, succesul sau insuccesul experimentului depinznd i de
ali factori experimentali nedecelati.

2.2.

Injectare de volume mari de probe apoase

Problematica studiului
Pentru a studia efectele ce apar la injectarea de volume mari de probe apoase a fost folosit
acelai grup de compui de hidrofobicitate medie investigat n capitolul precedent. Probele
denumite generic probe apoase sunt n fapt probe dizolvate ntr-un amestec binar de solvent
organic i o component apoas (care este de fapt componenta majoritar a solventului de prob).
Solventul organic selectat pentru efectuarea experimentelor a fost metanolul (n conformitate cu
concluziile capitolului precedent fiind solventul care genereaz cele mai bune forme de pic). Studiul
a pornit ca urmare a altui studiu anterior [61], bazat pe efectul salting-out datorat triei ionice a
solventului probei.
Condiii experimentale
Separarea cromatografic a fost efectuat n condiiile prezentate n capitolul precedent.
Componentele apoase ale amestecului binar folosit ca solvent de injecie au fost: ap, soluie
apoas 0,2% H3PO4, soluie apoas 25% NaCl, respectiv soluie apoas 25% NaCl i 0,2% H3PO4.
Pentru toi cei 4 solveni apoi menionai mai sus am preparat probe n urmtoarele rapoarte de
combinare (v/v) cu metanol:
- 20% metanol/80% solvent apos;
- 30% metanol/70% solvent apos;
- 35% metanol/65% solvent apos (n cazul solvenilor de probe ce conineau NaCl s-a

observat o precipitare parial a acesteia).


Concentraiile analiilor de interes au fost variate n aa fel nct cantitatea absolut de analit
injectat n coloana cromatografic s ramn constant (250 ng) pentru cele 5 volume de injecie
investigate: 50, 100, 200, 400 respectiv 500 L.
Rezultate experimentale
Cromatogramele obinute pentru injeciile de 500 L sunt prezentate pentru exemplificare
suprapuse cu o cromatograma corespunztoare unei injecii de 5 L de analii dizolvai n metanol
n figura 2.5. Pentru cromatograma notat cu (A) solventul de injecie este 20% metanol/80% ap,
pentru cromatograma notat cu (B) solventul de injecie este 20% metanol/80% soluie apoas 25%
NaCl, pentru cromatograma notat cu (C) solventul de injecie este 20% metanol/80% soluie
apoas 0,2% H3PO4 iar pentru pentru cromatograma notat cu (D) solventul de injecie este 20%
metanol/80% soluie apoas 25% NaCl i 0,2% H3PO4.
O

CH 3

OH
OH

mAU

OH

O
O
N

350

N
H

CH 3

OH

S O
O

OH

(D)

300
250

N
H

OH

Cl

S O
O

OH

(C)

200

(B)

150

(A)

100
50

5 L MeOH

0
0

10

min

Fig. 2.5 Cromatogramele obinute pentru injeciile de volum maxim prezentate comparativ cu
injecia de 5 L n metanol
Se poate observa c n cazul tuturor cromatogramelor (cu excepia cromatogramei (A)
forma de pic pentru toi compuii investigai este excelent. n cromatograma (A) doar picul
corespunztor acidului salicilic are o form nesatisfctoare, celelalte picuri avnd o form
acceptabil. Acidul salicilic are un tailing pronunat i picul este mai lat comparativ cu celelate
variante de solvent de probe investigate, fapt ce poate fi pus pe seama diferenei de pH ntre
solventul de injecie i faza mobil.
Pe baza timpilor de retenie obinuti experimental au fost calculai factorii de retenie pentru
fiecare compus studiat. Au fost determinate dependenele funcionale ntre volumul de injecie (Vinj
exprimat n L) i factorul de retenie (k) al compuilor studiai pentru fiecare solvent de prob n
parte. n cazul tuturor compuilor i a tuturor solvenilor de proba investigai dependena ntre
factorul de retenie i volumul de injecie este liniar i cresctoare.
Ordonata la origine a ecuaiei liniare reprezint factorul de retenie obinut pentru cazul
ipotetic al unui volum de injecie nul. Este evident c acest factor de retenie trebuie s fie
dependent doar de natura analitului i s nu fie influenat de natura solventului de prob, fapt
demonstrat experimental prin calcularea deviaiei relative standard a ordonatei la origine in cazul
fiecrui compus considernd toate experimentele efectuate (deviaia relativ standard maxima
acceptat este de 2%):
Tabel 2.3. Deviaia relativ standard a valorii lui A
Analit
Metil paraben
Acid salicilic
Piroxicam
Propil paraben
Meloxicam
Fenofibrat impuritate A

RSD (%)
0,14
0,28
0,43
0,11
0,08
0,10

Pentru valorile pantelor ecuaiilor liniare deviaiile relative standard calculate sunt prezentate
n tabelul de mai jos; valorile mai mari obinute pentru fiecare analit n parte pot fi justificate prin
valorile absolute foarte mici ale lui B (prin medierea tuturor valorilor individuale se obine valoarea
de 9,75 10-4).
Tabel 2.4. Deviaia relativ standard a valorii lui B
Analit
Metil paraben
Acid salicilic
Piroxicam
Propil paraben
Meloxicam
Fenofibrat impuritate A

RSD (%)
4,50
4,44
9,69
4,19
4,36
5,56

Pasul urmtor a fost ncercarea de a stabili dac exist o dependen funcional ntre
volumul de injecie i eficiena picurilor cromatografice ale compuilor studiai pentru fiecare solvent
de prob n parte.
n marea majoritate a condiiilor experimentale studiate se poate constata un efect pozitiv al
creterii volumului de injecie asupra eficienei picurilor analiilor (pentru propil paraben i Fenofibrat
impuritate A eficiena crete cu creterea volumului de injecie n toate cazurile studiate ). n cazul
acidului salicilic n prezena unui aditiv acid n solventul de prob eficiena crete cu creterea
volumului de injecie iar n absena acestuia eficiena scade cu creterea volumului de injecie (fapt
explicabil prin diferena de pH ntre solventul de injecie i faza mobil, diferen cu att mai
important cu ct volumul de injecie este mai mare).n cazul metil parabenului ceea ce influeneaz
comportarea eficienei cu creterea volumului de injecie este procentul de component organic n
solventul de injecie (pentru 20% metanol n solventul de injecie eficiena crete cu creterea
volumului de injecie n timp ce pentru 35% metanol eficiena scade cu creterea volumului de
injecie).
Concluzii asupra studiului
Injectarea de volume mari de probe apoase altele dect faza mobil (de fapt chiar i
solventul organic coninut n aceste probe este diferit de cel coninut n faza mobil) poate fi facut
fr influene majore negative asupra comportamentului reteniei analiilor pentru toate categoriile
de probe apoase investigate de la cea mai simpl (un ameste de ap cu solvent organic) pn la
cea mai complex (un amestec coninnd pe lng apa i un solvent organic o sare i un agent care
s regleze pH-ul). Influena volumului de injecie asupra factorului de retenie nu numai c este
nesemnificativ dar este prefect predictibil i explicabil pentru un interval de volume de injecie
de cinci ori mai mare dect intervalul de volume de injecie permis de sistemele de injecie folosite
n mod curent n practica de rutin.
n cazul unora din analiii de interes pentru o parte din probele apoase considerate se poate
observa o scdere moderat a eficienei cu creterea volumului de injecie, scderea fiind
observat n special pentru primii analii n ordinea de eluie sau pentru analiii uor disociabili n
condiiile unei diferene ntre pH-ul solventului de injecie i cel al fazei mobile. Aceast posibil
scdere trebuie avut n vedere n momentul dezvoltrii unei metode analitice, mici ajustri ale
metodei cromatografice propriu-zise (n sensul folosirii unei componente apoase a fazei mobile cu o
capacitate mai bun de tamponare sau a creterii moderate a factorului de retenie a analitului int)
sau ale compoziiei probei injectate (spre exemplu aditivarea cu un volum mic de acid sau baz a
probei, aditivul ales fiind n funcie de proprietile acido-bazice ale analitului de interes) pot permite
injectarea fr pierderi semnificative de eficien a unui volum de prob cu cteva ordine de mrime
mai mare. Un exemplu de injecii de volum mare de astfel de probe este determinarea simultan a
furosemidei, spironolactonei i canrenonei din probe de plasm unde volumul de injecie folosit a
fost de 400 L [62].

2.3. Injectare de volume mari de solventi organici nemiscibili cu faza mobil


n cazul analiilor cu o hidrofobicitate mai mic dect a solventului de
injecie
Problematica studiului
Pentru a studia efectele ce apar la injectarea de volume cresctoare de probe dizolvate n
solveni organici nemiscibili cu faza mobil n cazul compuilor mai puin hidrofobi dect solventul
de injecie a fost ales un set de compui care ndeplinesc aceast condiie de hidrofobicitate i un
set de solveni organici nemiscibili cu faza mobil.
Tabel 2.5. Structura i valoarea log KOW pentru compuii studiai
Compus
Structur
log KOW calculat
Isosorbid 2 - nitrat

-0,40

Isosorbid 5 - nitrat

-0,15
O

Pentoxifilin
O

0,56

CH3

1,96

Metil paraben
OH
OH
N

Tropicamid

1,19

Condiii experimentale
Experimentele au fost efectuate pe sistemul cromatografic descris n capitolul precedent
folosind dou tipuri de faz staionar (C8 i C18).
Separrile cromatografice pe coloan de tip C8 au fost efectuate folosind o coloan Zorbax
Eclipse XDB-C8, 15 cm x 4,6 mm i.d. x 3,5 m d.p., termostatat la 30oC. Studiile au fost efectuate
n condiii izocratice folosind un debit al fazei mobile de 1,0 mL/min.
Separrile cromatografice pe coloan de tip C18 au fost efectuate folosind o coloan Zorbax
Eclipse XDB-C18, 15 cm x 4,6 mm i.d. x 5 m d.p., termostatat la 30oC. Studiile au fost efectuate
n condiii izocratice folosind un debit al fazei mobile de 1,0 mL/min. Concentraiile analiilor de
interes au fost variate n aa fel nct cantitatea absolut de analit injectat n coloana
cromatografic s ramn constant (500 ng) pentru volumele de injecie investigate: 5, 10, 25, 50,
100, 200, 300, 400 i 500 L. Parametrii separrii cromatografice sunt prezentai detaliat n tez.
Rezultate experimentale
Posibilitatea de a face injecii de volum mare de compui dizolvai ntr-un solvent hidrofob se
bazeaz pe afinitatea mai mare a fazei staionare pentru moleculele de solvent de injecie dect
pentru moleculele de compui dizolvai n acesta. Modelul bazat pe adsorpie este singurul model
care poate explica fenomenele de retenie ce apar la injectarea de volume mari de solveni
hidrofobi nemiscibili cu faza mobil.
Cum solventul de injecie este mai hidrofob dect analitul nti va avea loc adsorpia
solventului i abia apoi va fi adsorbit analitul de interes. Ca o consecin logic cantitatea de faz
staionar care poate interaciona cu analiii de interes scade liniar cu creterea volumului de
solvent de prob injectat n coloan. Factorul de retenie al analitului A va depinde liniar de volumul
de solvent hidrofob injectat n coloana cromatografic:

(2.1)

k A = A A VS

Volumul de injecie pentru care factorul de retenie al analitului A este 0 ( VSk = 0 ) este volumul
de solvent care blocheaz complet toate lanurile hidrocarbonate existente n faza staionar. Noul
strat hidrofob astfel format nu are nici o afinitate cu analitul A prin urmare analitul nu poate fi reinut
n coloan.

VSk =0 =

A
A

(2.2)

Pentru toi analiii de interes au fost studiati 3 solveni hidrofobi: n-hexan, n-heptan i ioctan. Parametrii cromatografici interpretai (k i N) au fost luai n calcul sub forma valorii medii a 3
injecii consecutive pentru fiecare volum de injecie investigat.

mAU
140
120

50 L

100

100 L
80

200 L

60

300 L

40

400 L

20

500 L

0
0

12 min

10

Fig. 2.30 Cromatogramele obinute pentru injeciile de volum cresctor de soluii n n-hexan de
isosorbid 2-nitrat i isosorbid 5-nitrat pe o faz staionar de tip C8
O
O

mAU

250

50 L

200

100 L

150
100
50

CH3

300

OH

200 L
300 L
400 L
500 L

0
0

10

min

Fig. 2.33 Cromatogramele obinute pentru injeciile de volum cresctor de soluii n n-hexan de
pentoxifilin i metil paraben pe o faz staionar de tip C18
Au fost determinate dependenele funcionale ntre volumul de injecie i factorul de retenie
al compuilor studiai pentru fiecare solvent de prob i pentru fiecare faz staionar n parte, n
figurile de mai jos sunt prezentate rezultatele obinute pentru hexan:

10

Isosorbid5nitrat
Metilparaben
Tropicamid
Isosorbid2nitrat
Pentoxifilin

0
0

100

200

300

400

500

Volum injectie (L)

Fig. 2.36 Dependena factorului de retenie de volumul probei injectate pentru solvent de
probe n-hexan i faz staionar de tip C8
Isosorbid5nitrat
Metilparaben
Tropicamid
Isosorbid2nitrat
Pentoxifilin

0
0

100

200

300

400

500

Volum injectie (L)

Fig. 2.39 Dependena factorului de retenie de volumul probei injectate pentru solvent de
probe n-hexan i faz staionar de tip C18
Dependene liniare ntre factorii de retenie i volumul de injecie au fost obinute pentru toi
analiii i toi solvenii de injecie investigai, pentru ambele tipuri de faze staionare utilizate pentru
separrile cromatografice (C8 i C18).
Parametrii de regresie pentru dependenele ntre volumele de injecie i factorii de
capacitate, VSk = 0 , precum si coeficienii de corelaie (att pentru factorul de capacitate ct i pentru
eficien) sunt redate n tabelele urmtoare.
Tabel 2.6. Parametrii de regresie pentru dependentele dintre factorul de retenie respectiv eficien
i volumul de injecie pentru coloana de tip C8
R ( k = f Vinj )
R ( N = f Vinj )
VSk = 0 (L)
Analit de interes
A
B

( )

Isosorbid 2 - nitrat
Isosorbid 5 - nitrat
Pentoxifilin
Metil paraben
Tropicamid

4,067
6,181
2,701
7,111
7,376

-0,00619
-0,00931
-0,00372
-0,01057
-0,01088

Isosorbid 2 - nitrat
Isosorbid 5 - nitrat
Pentoxifilin
Metil paraben
Tropicamid

4,237
6,314
2,715
7,143
7,350

-0,00605
-0,00913
-0,00376
-0,01041
-0,01107

n-hexan
658
662
726
673
678
n-heptan
700
692
715
687
663

( )

0,9973
0,9955
0,9951
0,9997
0,9994

0,9731
0,9922
0,9318*
0,9685*
0,9032*

0,9988
0,9990
0,9980
0,9995
0,9900

0,9965
0,9963
0,9813
0,9960
0,9765*

11

Analit de interes

Isosorbid 2 - nitrat
Isosorbid 5 - nitrat
Pentoxifilin
Metil paraben
Tropicamid

4,133
6,127
2,633
6,917
7,434

-0,00581
-0,00896
-0,00355
-0,00991
-0,01246

VSk = 0 (L)
i-octan
711
684
742
697
597

( )

( )

R ( k = f Vinj )

R ( N = f Vinj )

0,9969
0,9988
0,9991
0,9995
0,9993

0,9973
0,9988
0,9982
0,9907
0,9364*

Tabel 2.7. Parametrii de regresie pentru dependentele dintre factorul de retenie respectiv eficien
i volumul de injecie pentru coloana de tip C18
R ( k = f Vinj )
R ( N = f Vinj )
VSk = 0 (L)
Analit de interes
A
B

( )

Isosorbid 2 - nitrat
Isosorbid 5 - nitrat
Pentoxifilin
Metil paraben
Tropicamid

4,630
6,592
2,939
7,260
7,121

-0,00818
-0,01166
-0,00492
-0,0125
-0,01229

Isosorbid 2 - nitrat
Isosorbid 5 - nitrat
Pentoxifilin
Metil paraben
Tropicamid

4,794
6,931
2,961
7,318
7,159

-0,00832
-0,01206
-0,00485
-0,01227
-0,01253

Isosorbid 2 - nitrat
Isosorbid 5 - nitrat
Pentoxifilin
Metil paraben
Tropicamid

4,626
6,590
2,959
7,417
7,128

-0,00779
-0,01114
-0,00481
-0,01228
-0,01227

n-hexan
566
565
597
581
579
n-heptan
576
575
611
596
571
i-octan
594
592
615
604
581

( )

0,9994
0,9994
0,9990
0,9994
0,9998

0,9612
0,9844
0,9067*
0,9288*
0,9368

0,9997
0,9996
0,9985
0,9994
0,9997

0,9540
0,9837
0,9229*
0,9267*
0,9261*

0,9997
0,9998
0,9981
0,9992
0,9997

0,9877
0,9900
0,9080*
0,9696*
0,9848

Notaia * semnifica apariia unor efecte de fronting sau chiar splitare de pic la volume de injecie mari

O observaie interesant este faptul c pentru ambele faze staionare investigate VSk = 0 nu a
variat n mod semnificativ de la un analit la altul. Mai mult, aceast valoare nu depinde n mod
semnificativ nici de natura solventului de prob. Valoarea medie calculat pentru faza staionar de
tip C8 (cu un RSD acceptabil de 5,09%) este de 686 L. n cazul fazei staionare de tip C18
valoarea medie calculat pentru toi analiii i solvenii investigai este n mod surprinztor mai mic,
de 587 L dar cu o deviaie relativ standard mai bun (RSD=2,68%). n mod evident ar fi de
ateptat ca valoarea VSk = 0 s fie mai mare pentru faza de tip C18 din cauza lungimii mai mari a
lanului hidrocarbonat L, care ar putea s interacioneze cu un numr mai mare de molecule de
solvent. Aceast uoar contradicie poate fi explicat considernd granulometria fazelor staionare
(3,5 m pentru faza C8 respectiv 5 m pentru faza C18). O dimensiune mai mic de particul a
fazei staionare echivaleaz cu o suprafa de contact mai mare care poate favoriza interaciunile
ntre faza staionar i solventul de injecie.
Pe de alt parte forma picurilor poate fi distorsionat n cazul injeciilor de volum mare de
solveni hidrofobi. De exemplu n cazul injeciilor de pentoxifilin i metil paraben dizolvate n hexan
au aprut efecte de fronting pentru volume de injecie mai mari de 200 L, efecte care nu au aprut
n cazul heptanului sau hexanului. Cu ct volumul de injecie se apropie de valoarea critic VSk = 0 cu
ct efectele negative asupra formei de pic sunt mai evidente (fronting sau chiar splitare de pic, cum
este cazul tropicamidei dizolvate n hexan). Aceste fenomene pot fi explicate prin posibilitatea
adsorpiei att a solventului ct i a analitului de interes pe acelai sit de adsorpie pe suprafaa fazei
staionare rezultnd o acoperire neomogen a sitului de adsorpie conform echilibrului:
L + (m n) S + nA L S m n An , unde n mod evident n < m
n cazul experimentelor efectuate pe faz staionar de tip C18 linia de baz devine drastic
afectat pentru volume de injecie mai mari sau egale cu 500 L ca o consecin a fenomenului de
emulsificare. Acest fenomen este evident pentru faze mobile cu un coninut mai bogat de ACN
(peste 20%). Fenomenul de emulsificare este datorat antrenrii moleculelor de solvent desorbite

12

din faza staionar de ctre faza mobil. n cadrul experimentelor efectuate pe faza staionar de tip
C8 acest fenomen nu a fost observat, n cazul n care volumul de injecie a fost de 500 L. O
explicaie a acestui rezultat experimental poate fi urmtoarea: la ncrcarea coloanei C18 cu 500 L
solvent organic ne situm mult mai aproape de condiia de saturare complet a fazei staionare (
VSk = 0 = 587 L) dect n cazul in care se folosete o coloan de tip C8, caracterizat printr-un VSk = 0 =
686L.
Concluzii asupra studiului
Din studiul de fa se poate trage concluzia ca se pot injecta volume mari de analii dizolvai
n solveni organici nemiscibili cu faza mobil i obine rezultate foarte bune dac hidrofobicitatea
analiilor e mai mic dect a solventului de injecie. Efectul creterii volumului de injecie este
scderea liniar a reteniei analiilor de interes cu creterea volumului de injecie i o uoar
diminuare a eficienei picurilor cromatografice. n cazul injeciilor cu un volum mai mare de 200 L
pot apare n unele cazuri deformri ale formei de pic (n special pentru procente mai mari de
solvent organic n compoziia fazei mobile care pot duce la o miscibilizare parial a solventului de
injecie cu faza mobil). n cazurile cele mai favorabile volumul de injecie poate fi crescut pn la
500 L cu obinerea unor forme acceptabile de pic [63]. Singurul impediment major la injectarea
unor volume mari dintr-un analit dizolvat ntr-un solvent mai hidrofob dect el este solubilitatea
analitului n solventul respectiv.

2.4. Injectare de volume mari de solventi nemiscibili cu faza mobil n cazul


analiilor cu o hidrofobicitate egal sau mai mare dect a solventului de
injecie
Problematica studiului
Pentru a studia efectele ce apar la injectarea de volume cresctoare de probe dizolvate n
solveni organici nemiscibili cu faza mobil au fost alese dou hidrocarburi aromatice polinucleare
al cror log KOW calculat are o valoare apropiat de a solventului de injecie respectiv mai mare
dect a solventului de injecie, solventul de injecie folosit fiind i-octanul (log KOW =4,09)
Tabelul 2.8. Structura i valoarea log KOW pentru compuii studiai
Compus
Structur
log KOW calculat
Fluoren

4,15

Fluoranten

4,93

Condiii experimentale
Separarea cromatografic a fost efectuat folosind o coloan Zorbax Eclipse XDB-C8, 15
cm x 4,6 mm i.d. x 3,5 m d.p., termostatat la 25oC. Studiul a fost efectuat n condiii izocratice
(60% acetonitril i 40% ap de uz cromatografic) folosind un debit al fazei mobile de 1,0 mL/min.
Detecia a fost fcut la lungimea de und de 254 nm. Concentraiile analiilor de interes au fost
variate n aa fel nct cantitatea absolut de analit injectat n coloana cromatografic s ramn
constant (250 ng) pentru cele 4 volume de injecie investigate: 5, 50, 100 respectiv 200 L.
Rezultate experimentale
Se poate observa c pentru volume de injecie mai mari de 50 L forma de pic se
deterioreaz pentru ambii compui. n cazul injeciei de 50 L se poate observa o diferen ntre
formele de pic ale celor 2 compui, i anume faptul c forma de pic a fluorenului este net inferioar
fluorantenului. n tabelul de mai jos sunt prezentate comparativ valorile calculate pentru eficien i
simetrie n cazul volumelor de injecie studiate:
Cromatogramele obinute sunt prezentate n figura urmtoare:

13

mAU
100
5L
80
60

50L

40

100L

20

200L

0
0

10

min

Fig. 2.42 Cromatogramele obinute pentru injeciile de analii cu hidrofobicitate egal sau mai mare
cu a solventului de injecie
Tabel 2.9. Eficiena i simetria pentru picurile analiilor de interes
Volum de injecie (L )
N fluoren
N fluoranten
Simetrie fluoren
5
17332
18228
0,83
50
3695
8197
0,84
100
854
2250
0,39
200
159
402
0,20

Simetrie fluoranten
0,86
0,89
0,60
0,25

Din calcul rezult c VSk = 0 este de 795 L n cazul fluorenului respectiv de 748 L n cazul
fluorantenului (concordana cu rezultatele obinute pentru analiii cu hidrofobicitate mai mic dect
solventul de injecie este mai bun pentru analitul mai hidrofob).
Concluzii asupra studiului
Injectarea de volume mari de probe ce conin analii avnd o hidrofobicitate egal sau mai
mare dect a solventului de injecie are efecte negative asupra formei de pic a analiilor de interes
suficient de pronunate pentru a nu avea aplicabilitate practic. Acest insucces are dou cauze, cea
mai evident fiind necesitatea folosirii unei compoziii de faz mobil bogat n modificator organic;
o astfel de compoziie asigur o miscibilitate parial a solventului organic cu faza mobil ceea ce
duce n mod evident la distorsiuni ale formei de pic. A doua cauz a insuccesului este legat de
diferena mic de hidrofobicitate ntre analiii de interes si solventul de injecie ceea ce duce la o
competiie ntre analiii de interes i solventul de injecie pentru centrii de absorpie, competiie care
este cu totul defavorabil compuilor minoritari.
Chiar i n aceste condiii complet defavorabile modelul de adsorpie ramne n continuare
valabil, fapt dovedit de observaia c numrul de molecule care satureaz un sit de adsorpie este
n perfect concordan cu cel obinut n cazul unor analii cu o hidrofobicitate mai mic dect a
solventului de injecie.

2.5. Aplicaii practice ale injeciei de volum mare pentru analii cu o


hidrofobicitate mai pronunat dect a solventului de injecie
Problematica studiului
Studiul de fa a constat n dezvoltarea i validarea unei metode care s permit injecia de
volum mare de soluii dizolvate n hexan pentru a permite creterea sensibilitii dozrii acizilor
ginkgolici n extractele standardizate de Ginkgko biloba. Aceti compui mpreun cu alchilfenolii
nrudii structural cu ei (cardanoli i cardoli) sunt constitueni ai extractelor de Ginkgko biloba [64,
65]. Dei este cunoscut faptul c aceti compui au proprieti antitumorale i antimicrobiale [66]
este demonstrat i faptul c au proprieti alergenice, citotoxice, neurotoxice i mutagene [67-70].
Prin urmare prezena unor astfel de compui n produsele derivate din Ginkgko biloba este
considerat ca indezirabil [71, 72] iar limita stabilit de Farmacopeea European pentru extractul
standardizat de Ginkgko biloba este de 5 ppm [73]. Metoda analitic compendial are dezavantajul
unei sensibiliti sczute, sensibilitate care poate fi mbuntit prin extracia acizilor ginkgkolici

14

ntr-un solvent organic nemiscibil cu faza mobil i injecia direct n coloana cromatografic.
Analiii de interes au un caracter hidrofob mai pronunat dect solventul de injecie (hexanul are log
KOW =3,29).
Tabelul 2.10. Structura i valoarea log KOW pentru compuii studiai
Compus
Structur
OH

O
OH

Acid ginkgolic C13:0

OH

Acid ginkgolic C17:1

8,69

O
OH

Acid ginkgolic C15:1

OH

log KOW calculat

9,45

O
OH

10,43

Condiii experimentale
Separarea cromatografic a fost efectuat folosind o coloan Zorbax Eclipse XDB-C8, 15cm
x 4,6 mm i.d. x 3,5 m d.p. termostatat la 35oC. Studiul a fost efectuat n condiii de gradient de
compoziie al fazei mobile, faza mobil fiind compus din acetonitril i soluie apoas 0,1%
HCOOH, profilul de gradient fiind urmtorul:
Timp (min.)
0
5,0
5,01
25,0

% soluie apoas 0,1% HCOOH


70,0
70,0
20,0
20,0

% acetonitril
30,0
30,0
80,0
80,0

Prezentarea sistemului cromatografic, a modalitii de prepararea a probelor i a


parametrilor operaionali folosii pentru detecia MS/MS sunt prezentai detaliat n tez.
Rezultate experimentale
Evaporarea soluiilor obinute prin dizolvarea direct a materialului de referin n hexan sub
curent de azot urmat de reluarea n metanol i analiza cromatografic a dus la randamente de
regsire inconsistente i lipsite de reproductibilitate. Explicaia cea mai plauzibil este antrenarea
cu vapori a acizilor ginkgolici n timpul etapei de evaporare. Aceste date confirm prerile exprimate
n literatur privind procedurile de extracie lichid-lichid aplicate acestor dureaz mult timp i le
lipsete reproductibilitatea [74, 75].
Pentru a elimina etapa de evaporare se poate folosi un raport volumetric mare ntre stratul
apos i cel de hexan. Acest raport a fost setat la 20/1. Fiind vorba de un volum mic de hexan
acesta se poate aduga direct n balonul cotat n care s-a realizat soluia de extract standardizat de
G.Biloba, mai mult, cum stratul de hexan este stratul superior luarea unei cote pri din el este
foarte uor de fcut. n cazul de fat analiii de interes fiind mai hidrofobi dect solventul de injecie
problema analitic se poate rezolva ncepnd separarea cromatografic la o compoziie a fazei
mobile la care analiii de interes s ramn blocai n capul coloanei n timp ce solventul de injecie
s se deplaseze lent n coloana cromatografic. n momentul n care frontul de solvent de injecie
este distanat suficient de analiii de interes se poate aplica un gradient de tip treapt la un procent
mare de solvent care s permit eliminarea rapid a solventului de injecie i separarea
cromatografic a analiilor de interes urmat de detecia lor. Este evident c succesul unei astfel de
abordri depinde de trei parametrii cheie: compoziia fazei mobile la nceputul gradientului (primul
palier), durata de timp pentru distanarea analiilor de interes de frontul de solvent i compoziia

15

final utilizat pentru eluarea analiilor de interes. O parte din rezultatele experimentale pe care se
bazeaz optimizarea metodei sunt redate n tabelul de mai jos:
Tabel 2.12. Influena parametrilor experimentali asupra atributelor de calitate ale picurilor analiilor
de interes rezultate n urma injeciilor de soluii n hexan
Condiii experimentale
Volum de
injecie
(L)

Primul
palier
(% ACN)

Al doilea
palier
(%ACN)

30
30
30
30
30
20
20
20
40

80
80
80
75
85
70
75
80
80

25
50
100
50
50
50
50
50
50

Rezoluie
C13:0/C15:1

Timp de
retenie
pentru
C17:1
(min)

Simetrie
de pic
pentru
C17:1

Lrgime
la baz
C17:1
(min)

2,5
2,1
1,3
2,9
1,6
3,1
3,0
2,1
2,1

19,7
19,0
18,0
27,3
18,4
28,7
24,2
19,0
18,9

1,16
1,05
2,56
1,25
1,20
1,72
1,31
1,39
1,56

0,55
0,79
0,97
0,85
0,70
1,38
0,84
0,63
0,59

Variaii de 33% ale procentului de acetonitril n compoziia primului palier au o influent


minim asupra rezoluiei calculate ntre acizii C13:0 respectiv C15:1 i asupra reteniei ultimului
analit de interes n ordinea de eluie, fapt care indic reinerea analiilor n faza staionar imediat
dup injecie. Palierul final are n schimb o influen major asupra reteniei i lrgimii de pic.
Pentru volumul de injecie dorit (50 L) programul optim de gradient este cel prezentat la condiii
experimentale. Injecia de probe extrase n hexan n prezena matricei considerate nu are nici un fel
de efect negativ asupra coloanei cromatografice. Confirmarea ordinii de eluie i a timpilor de
retenie obinui prin detecie UV s-a fcut prin detecie MS/MS.
n figura 2.46 cromatograma notat cu A corespunde concentraiei limit impuse pentru
acizii ginkgolici, cromatograma notat cu B corespunde la 20% din concentraia limit impus
(monitorizat la 310 nm) iar cea notat cu C aceleiai concentraii ca n cromatograma B dar
monitorizat la lungimea de und de 210 nm folosit n metoda compendial. Se poate observa
cresterea evident de selectivitate ce rezult prin folosirea unei lungimi de und mai mari, lungime
ce nu ar fi putut fi folosit dac modul de lucru al metodei nu ar fi realizat totodat concentrarea de
20 ori a probei.
Metoda cromatografic a fost validat complet, detaliile privind validarea metodei pot fi
gsite n tez.

**

mAU

**

C
8

DAD: 210 nm

*** ***

C15:1
13.561

DAD: 310 nm

C17:1
19.002

C13:0
12.932

A
0

DAD: 310 nm

-2
1

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

min

Fig. 2.46 Cromatograme rezultate n urma injectiilor de 50 L acizi ginkgolici extrai n hexan

16

Concluzii asupra studiului


Acizii ginkgolici pot fi extrai n hexan cu un randament de peste 96% din soluie de extract
standardizat de Ginkgko biloba n amestec de ap/acid formic/metanol n proporia volumetric
9/1/10. Cum acest randament se obine pentru un raport ntre soluia de extract standardizat de G.
Biloba de concentraia impus de metoda compendial i hexan de 20/1 este evident c se obine o
concentrare a analiilor de interes de 20 de ori n hexan. O astfel de concentrare permite folosirea
unei lungimi de und de 310 nm care este evident mult mai selectiv dect lungimea de und
impus de farmacopee (210 nm) i duce la obinerea unei limte de cuantificare care reprezint 20%
din concentraia limit de acizi ginkgolici admis de farmacopee. Metoda a fost validat complet
conform cerinelor n vigoare. Identitatea analiilor de interes a fost confirmat prin detecie MS i
MS/MS (folosind un detector de tip quadrupol, o interfa de tip electrospray i ionizarea analiilor n
pozitiv), mai mult n materialul de referin furnizat de Farmacopeea European au fost identificai
alti acizi ginkgolici precum i un compus nrudit cu acetia (cardanol) [76].
Prezenta metod demonstreaz nu numai c n anumite condiii se pot realiza injecii de
volum mare de analii cu o hidofobicitate mai pronunat dect a solventului de injecie far a avea
pierderi de eficien sau deformri ale picurilor analiilor de interes ci i faptul c o astfel de
abordare nu este doar un caz pur teoretic.

2.6. Aplicarea injeciilor de volum mare de solvent organic nemiscibil cu


faza mobil la determinarea indapamidului din snge prin HPLC-MS/MS
Problematica studiului
Indapamidul prezint proprietatea de se lega direct de suprafaa hematiilor prin urmare
determinarea sa n probe biologice trebuie fcut pe snge integral (care este o matrice mult mai
complex i mai dificil dect plasma uman). Concentraiile maxime plasmatice de indapamid n
snge sunt mici (n special pentru forma farmaceutic cu eliberare prelungit). Ca o consecin
metoda preferat de preparare a probelor n cazul studiilor de bioechivalen efectuate pe
indapamid n snge este extracia lichid-lichid urmat de evaporarea solventului de extracie i
reluarea ntr-un solvent oarecare miscibil cu faza mobil. O astfel de abordare este laborioas i
poate fi considerat ca mare consumatoare de timp (datorit numrului mare de probe ce trebuie
procesate n cadrul unui studiu de bioechivalen). S-a dorit dezvoltarea unei metode bazate pe
injectarea direct a solventului de extracie n coloana cromatografic, o astfel de abordare
eliminnd din prepararea probelor etapa de evaporare i reluare a analitului de interes ntr-un
solvent miscibil cu faza mobil. O astfel de metod de preparare a probelor ar trebui s fie
comparabil ca durat de timp necesar cu deproteinizarea cu solvent organic iar ca selectivitate i
sensibilitate cu extracia lichid-lichid. Un solvent organic nemiscibil cu faza mobil trebuie s
ndeplineasc anumite condiii pentru a putea fi folosit n acest scop: s aibe un caracter hidrofob
mai pronunat dect indapamidul, randamentul de extracie al indapamidului s fie ct mai apropiat
de 100%, randamentul de extracie al standardului intern s fie reproductibil i de preferin
densitatea solventului de extracie s fie mai mic dect a matricei biologice (acest lucru simplific
etapa de transfer a probei). Solventul organic nemiscibil cu faza mobil folosit este 1-octanolul al
crui log KOW calculat este 2,81.
Tabelul 2.17. Structura i valoarea log KOW pentru compuii studiai
Compus
Structur

log KOW calculat

H
N

Cl

Indapamid

O
O

2,66

NH2

Cl
O

Standard Intern (5-cloro-2-metoxi-N-[2-(4sulfamoil fenil)etil]benzamid)


O

N
H

O
S NH2

2,55

Condiii experimentale
Separarea cromatografic a fost efectuat folosind o coloan Zorbax SB C18 Rapid

17

Resolution, 5 cm x 4,6 mm i.d. x 1,8 m d.p. termostatat la 40oC. Coloana de gard folosit a fost
de tip Phenomenex C18 (2mm x 4 mm i.d.). Studiul a fost efectuat n condiii de gradient de
compoziie al fazei mobile. Faza mobil a fost compus din amestec acetonitril/metanol 1/1 (v/v) i
soluie apoas 0,1% HCOOH, profilul de gradient fiind urmtorul:
Timp (min.)
0
2,0
5,50
5,51
6,0
6,50
6,51
7,5

Modificator organic (%)


5
45
45
100
100
100
5
5

Debit (mL/min)
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
1,2
1,2
1,2

Detaliile privind sistemul cromatografic, parametrii deteciei MS/MS, precum i ai metodei de


preparare a probelor sunt detaliai n tez.
Investigarea efectelor ce apar la injectarea de volume mari de analii de interes dizolvai n
1-octanol a fost fcut n condiii izocratice, folosind ca modificator organic acetonitril, metanol
respectiv amestec de acetonitril i metanol n proporie volumetric de 1/1. Componenta apoas a
fazei mobile a fost soluie 0,1% HCOOH n ap de uz cromatografic. Volumele de injecie folosite
au fost 1, 10, 50, 75 respectiv 100 L iar concentraiile soluiilor n 1-octanol au fost astfel setate
nct cantitatea de analit injectat n coloan s rmn constant (1 g ).
Pentru a reduce timpul de procesare al unei probe extracia lichid-lichid, centrifugarea i
injectarea n sistemul HPLC se pot face folosind un flacon de autoinjector cu un design special.
Dup centrifugare se poate prelua o cot parte din stratul de octanol (stratul superior) cu controlul
atent al nivelului de inserie al acului n flacon. Astfel se poate elimina etapa de transfer a
supernatantului n flaconul de injecie i se reduce manipularea probei. Pentru a putea face acest
lucru este necesar un design special al geometriei interioare a flaconului care s permit
minimizarea riscului de antrenare accidental a sngelui n acul autoinjectorului (vezi Fig. 2.47). Un
numr mic de flacoane de autoinjector au fost confecionate in house din polipropilen conform
acestui design pentru a demonstra validitatea presupunerii privind injecia direct din flaconul n
care a avut loc extracia i centrifugarea probei biologice.

32

27

Cea mai joas poziie de


inserie a acului

3,2

11,5
7,5
5

Matrice
biologic
rezidual

14

Stratul de
1-octanol

9,5

Fig. 2.47 Design de flacon de autoinjector n care se pot face extracia, centrifugarea i injectarea
direct
Metoda analitic a fost aplicat pentru 2 studii de bioechivalen. Primul studiu a fost un
studiu multidoz efectuat pentru tablete acoperite cu eliberare prelungit coninnd 1,5 mg de
indapamid iar al doilea a fost un studiu cu doz unic efectuat pentru tablete acoperite cu eliberare
imediat coninnd 2,5 mg de indapamid.

18

Rezultate experimentale
Dup cum a fost demonstrat n capitolele precedente pentru a putea obine rezultate bune
injectnd volume mari de solveni de probe nemiscibili cu faza mobil trebuie ndeplinite simultan
trei condiii:
i) solventul de injecie are o hidrofobicitate i implicit un timp de retenie mai mare dect
analiii de interes;
ii) solubilitatea solventului de injecie n faza mobil este suficient de mic pentru a fora
saturarea fazei staionare din capul coloanei cromatografice cu solventul de injecie imediat dup
injecie;
iii) solventul de injecie trebuie eliminat din coloana cromatografic nainte de injecia
urmtoare.
n afar de aceste considerente teoretice n practic mai este important i obinerea unor
randamente consistente de extracie, precum i un proces de extracie ct mai selectiv.
Prin alegerea 1-octanolului ca solvent de extracie se ndeplineste condiia solventului de
injecie mai hidrofob dect analiii de interes.
Optimizarea metodei cromatografice s-a bazat pe studiul reteniei i simetriei de pic obinute
n condiii izocratice de eluie. Ca modificatori organici au fost luati n considerare succesiv
acetonitrilul, metanolul i amestecul 1/1 (v/v) de acetonitril i metanol. Componenta apoas a fazei
mobile a coninut n toate cazurile HCOOH 0,1% i debitul fazei mobile a fost setat la 0,8 mL/min.
Experimentele au fost fcute succesiv pentru 25% acetonitril, 35% metanol sau 30% amestec
acetonitril/metanol n compoziia fazei mobile. Pentru fiecare condiie de eluie au fost efectuate
injecii de 1, 10, 50, 75 respectiv 100 L de analii de interes dizolvai n 1-octanol i de 1-octanol
(solvent de injecie pur). Dup fiecare cromatogram 1-octanolul a fost eliminat din coloan prin
meninerea compoziiei fazei mobile la 100% modificator organic timp de 5 minute, urmat de
reechilibrarea n condiiile iniiale timp de alte 5 minute.Conform cu cele demonstrate n capitolele
precedente factorii de retenie scad liniar cu creterea volumului de injecie; cifrele negative din
figura 2.48 reprezint pantele funciilor de regresie liniare k = a + b Vinj .
25,0
Indapamid (25%ACN)
Indapamid (35% MeOH)
Indapamid (15% ACN+ 15% MeOH)
IS (25%ACN)
IS (35% MeOH)
IS (15% ACN+ 15% MeOH)

-0,1176
20,0
-0,1062
-0,0908

15,0

-0,0747

-0,0708
10,0
-0,0572

5,0

0,0
0

20

40

60

80

100

120

Volum injecie (uL)

2.48 Variaia factorilor de capacitate al analiilor de interes n funcie de volumul de injecie


n toate cazurile investigate experimental injeciile de 10 L de analii dizolvai n octanol duc
la forme de pic nedistorsionate. Pentru volume de injecie mai mari pot aprea efecte de
distorsionare a formei de pic fie pentru primul analit n ordinea de eluie (indapamidul), fie pentru
ambii analii, dup cum se poate vedea n figura 2.49 (exemplificare pentru volumul de injecie de
75 L). n unele cazuri se poate constata o distorsionare puternic a formei de pic pentru analiii de
interes, acest fenomen fiind datorat unei miscibiliti pariale a soventului de prob cu faza mobil i
implicit a unei saturri locale inadecvate cu 1-octanol a fazei staionare (o deviaie evident de la
condiia privind solubilitatea minim a solventului de injecie n faza mobil care s foreze blocarea
acestuia n capul coloanei).
n cazul n care doar primul compus este afectat este mai plauzibil s nvinuim efectul de
viscous fingering pentru rezultatele obinute (vscozitile la temperatura ambiant pentru 1octanol, acetonitril, metanol i ap sunt de 7,21, 0,34, 0,54, 1,0 cP) [77].

19

NH2
O

NH

200

O
HN

IS
(50 ng/mL)

2
1
0
4,7

1
Proba blanc (MRM 364,1 la 188,9)
0
4,8

4,9

5,1

5,2

5,3

5,4

Timp (min)

Gradient cromatogram MS

Cl

Scal IS (MRM 367,1 la 170,1)

Indapamid

Cl

O S

x105

x103

Indapamid

NH2

IS

mAU

(0,5 ng/mL)

DAD Sig=235,4 Ref=360,10

Scal Indapamid (MRM 364,1 la 188,9)

Din dependenele funcionale prezentate n figura 2.48 putem observa c cea mai important
scdere a factorului de retenie cu volumul de injecie se obine pentru folosirea ca modificator
organic a amestecului de acetonitril/metanol 1/1, ceea ce sugereaz c solventul de injecie
satureaz o poriune mai mare a fazei staionare. Prin urmare profilul de gradient a fost optimizat
folosind ca modificator organic acest amestec de acetonitril i metanol. Dup cum se poate vedea
n figura 2.49 gradientul elimin cu succes distorsiunile formei de pic pentru indapamid i crete
eficiena aparent.
Metoda analitic a fost validat conform ghidurilor n vigoare [78, 79] iar caracteristicile ei de
calitate sunt prezentate n tabelul Tabelul 2.20. Limita de cuantificare determinat pentru metod a
fost de 0,5 ng/mL iar limita superioar a domeniului de liniaritate a fost de 100 ng/mL. Funcia de
rspuns a fost o regresie liniar ponderat cu 1/x2 (R2 0,9918).

A
Gradient
100

Izocratic, 15% ACN+15% MeOH

Izocratic, 35% MeOH


Izocratic, 25% ACN

0
0

10

min

Fig. 2.49 Cromatogramele rezultate n urma injeciilor de 75L


Tabelul 2.20. Caracteristicile de calitate ale metodei bioanalitice rezultate n urma validrii.
Etap
Caracteristici
LOD = 0,3 ng/mL (S/N = 3); LLOQ = 0,5 ng/mL (S/N5); ULOQ = 100 ng/mL; Niveluri
de concentraie = 0,5/1/5/10/25/50/80 ng/mL; probe individuale/nivel: n = 6
Liniaritate
RSD% [4,4 9,7]%; Bias % [-7,4 8,0]%; Funcie de rspuns = liniar, pondere
1/x2
Niveluri de concentraie = 1,5/7,5/35/75 ng/mL; Repetabilitate: n = 10;
Reproductibilitate intermediar: n = 6
Precizie
Repetabilitate: RSD% [0,8 1,3]%; Bias% [-7,9 8,1]%
Reproductibilitate intermediar: RSD% [7,3 8,5]%; % Bias [-3,0 3,3]%
nghe/dezghe: n = 5; Niveluri de conc. = 4 (aceleai ca la precizie); RSD% [0,7
3,5]%; % Bias [-8,0 12,5]%
Termen lung (-40 oC) = 3 luni; n = 4; Niveluri de conc. = 4 (aceleai ca la
precizie);RSD% [0,9 2,2]%; % Bias [-14,3 12,8]%
Stabilitate
Termen scurt (25 oC) = 8 ore; n = 5; Niveluri de conc. = 4 (aceleai ca la
precizie);RSD% [0,8 3,9]%; % Bias [-8 14,6]%
Post-preparativ (25 oC) = 48 ore; n = 6; Niveluri de conc. = 4 (aceleai ca la
precizie);RSD% [0,5 4,9]%; % Bias [-9,6 12,8]%
IS (soluia stoc; 4 oC) = 30 zile; n = 12; RSD% (arie de pic) = 7,8%
Integritatea Rapoartele n care s-a fcut diluia = 1/10; 1/5; 1/2; Matricea utilizat pentru diluie:
diluiei
a) snge integral; b) soluie apoas NaCl 0,9%; probe individuale efectuate: n = 3
1/10: snge integral; RSD% = 5,4%; % bias = 13,9%; soluie apoas NaCl 0,9%;
RSD% = 0,8%; % bias = 7,9%;

20

Etap

Caracteristici
1/5: snge integral; RSD% = 2,8%; % bias = 5,8%; soluie apoas NaCl 0,9%;
RSD% = 0,8%; % bias = 2,7%;
1/2: snge integral; RSD% = 0,1%; % bias = -2,9%; soluie apoas NaCl 0,9%;
RSD% = 2,6%; % bias = -5,9%;

Se pot observa uoare efecte de memorie pe tranziia corespunztoare indapamidului (vezi


Fig. 2.49, detaliul A). Acestea sunt nesemnificative considernd nivelul de arie obinut la LLOQ i nu
sunt necesare msuri suplimentare pentru eliminarea lui.
Pantele dreptelor de regresie ce caracterizeaz seturile de probe de calibrare procesate pe
parcursul ambelor studii de bioechivalen sunt prezentate n figura 2.52. Datele sunt prezentate n
ordinea desfurrii secvenelor analitice, cu meniunea c studiul multidoz s-a desfurat anterior
celui unidoz. Datele prezentate n figur demonstreaz reproductibilitatea metodei pe o perioad
lung de timp, i dup analizarea unui numr mare de probe.
0,045
Media 2 *deviaia standard (RSD% = 15%)
0,04

Valoarea pantei

0,035
0,03
0,025
0,02
0,015

Indapamid 1,5 mg (studiul multidoz)

0,01

Indapamid 2,5 mg (studiul unidoz)

0,005
0

25A

24A

23A

22A

21A

20A

19A

18A

16A

17A

14A

15A

13A

12A

11A

9A

10A

8A

7A

6A

5A

4A

3A

2A

1A

Calibrarea nr.

Fig. 2.52. Variaia pentelor dreptelor de regresie pe parcursul ambelor studii de bioechivalen
Reanaliza probelor din studiu a fost fcut la 2 sptmni dup finalizarea ambelor studii de
bioechivalen. De la fiecare voluntar au fost reanalizate 2 probe pe fiecare faz, una corespundea
la o valoare mic de concentraie iar cealalt la o valoare mare de concentraie (imediat dup tmax).
Asta nseamn c n total pentru studiul multidoz s-au reanalizat 100 probe iar pentru cel unidoz
96 de probe. Datele obinute au fost analizate conform procedurii Bland-Altman [80, 81] rezultatele
obinute fiind in limitele admise (cel mult 33% din numrul total de probe reanalizate pot fi n afara
intervalului de exactitate de 20%).
0,500
0,400
4

Diferen fa de valoarea medie

0,300
1

0,200

11

12

10

2
6

17

16

15

14
13

0,100
0,000
-0,100
-0,200
18

-0,300
0

10

20

30

40

50
#

60

70

80

90

100

Fig. 2.53. Graficul Bland-Altman ce ilustreaz rezultatele obinute la reanaliza probelor dup
finalizarea studiului multidoz
Parametrii farmacocinetici determinai prin aplicarea metodei au fost comparai cu valorile
experimentale raportate n literatur [82,83]. Datele de literatur existente sunt n bun concordan

21

cu cele obinute folosind metoda analitic bazat pe injecii de volum mare de probe extrase n 1octanol.
Concluzii asupra studiului
Principiul injeciei directe de volum mare de solvent organic nemiscibil cu faza mobil a fost
aplicat cu succes n 2 studii de bioechivalen. Aceast abordare experimental a premis nu numai
simplificarea metodei de preparare a probelor (i implicit scderea duratei de timp necesare pentru
aceasta) ci i creterea sensibilitii metodei analitice. Chiar dac sngele uman integral este o
matrice extrem de complex aceast modalitate de preparare a probelor permite reducerea
substanial a cantitii de matrice rezidual introdus n coloana cromatografic. O eliminare
suplimentar a matricei reziduale se face prin reducerea duratei de timp n care efluentul din
coloana cromatografic ajunge la sursa MS i prin aplicarea gradientului rapid de splare la sfritul
separrii cromatografice (n timpul acestui gradient efluentul provenit din coloana cromatografic
este deviat de asemenea la linia de rezidii). Dei principalul scop al gradientului de splare este
eliminarea rapid a dopului de 1-octanol din coloan acest gradient elimin i matricea rezidual cu
caracter puternic hidrofob (grsimile) care altfel ar putea colmata coloana cromatografic. Eficiena
acestui program de splare este demonstrat de faptul c att validarea metodei ct i ambele studii
de bioechivalen au fost efectuate pe o singur coloan cromatografic (coloana a rezistat cu
succes la circa 3000 de injecii de volum mare de probe biologice extrase n 1-octanol).
Atributele de calitate ale acestei metode au fost demonstrate nu numai n timpul validrii
metodei ci i prin rezultatele obinute la analiza/reanaliza probelor reale de la voluntari pe parcursul
desfurrii celor 2 studii de bioechivalen. Parametrii farmacocinetici calculai pe baza metodei
analitice sunt n bun concordan cu datele de literatur [84].
Este prima dat cnd o astfel de metod cromatografic bazat pe injecie de volum mare
de solveni nemiscibili cu faza mobil a fost aplicat la studii de bioechivalen avnd ca matrice
snge uman integral. O astfel de metod produce rezultate echivalente cu abordarea clasic
utilizat pentru aceast matrice biologic (extracia lichid-lichid urmat de evaporarea solventului de
extracie i reluarea reziduului n sovent miscibil cu faza mobil) dar are avantaje evidente n ceea
ce privete simplificarea modului de lucru i implicit a duratei de timp necesare pentru prepararea
probelor.

2.7. Aplicarea injeciilor de volum mare de solvent organic nemiscibil cu


faza mobil la determinarea fenspiridei din plasm prin HPLC-MS/MS
Problematica studiului
Cea mai simpl modalitate de preparare a probelor bionanalitice este deproteinizarea cu
solvent organic (de obicei n proporie de 2 pari de solvent organic la o parte de plasm); aceast
metod de preparare a probelor are ca principal dezavantaj diluia analitului de interes n proba
final, prin urmare poate fi folosit doar n cazul n care sensibilitatea metodei nu este afectat de
aceasta. n cazul n care sensibilitatea metodei analitice este insuficient se prefer folosirea
extraciei lichid-lichid, urmat de evaporarea solventului de extracie i reluarea reziduului sec
obinut ntr-un volum mic de solvent compatibil cu faza mobil (acest abordare permite creterea
cantitii absolute de analit injectat n coloana cromatografic). Singurul dezavantaj al unei astfel
de metode de preparare a probelor este manipularea extensiv a probelor, care duce nu numai la o
durat mare de timp necesar pentru procesarea probelor ci poate cauza i apariia de erori
aleatoare n timpul preparrii probelor. n cazul n care un volum mare din solventul de extracie ar
putea fi injectat direct n coloana cromatografic ar fi eliminate aceste inconveniente. Ca solvent de
extracie a fost folosit 1-octanolul, acesta fiind mai hidrofob dect fenspirida, i ca standard intern a
fost folosit trimetazidina. ntruct att fenspirida ct i standardul intern ales au caracter bazic a fost
necesar alcalinizarea plasmei pentru obinerea de randamente reproductibile de extracie.
Tabelul 2.23. Structura i valoarea log KOW pentru compuii studiai
Compus
Structur
log KOW calculat
O

Fenspirid

O
NH

2,28

22

Compus

Structur

log KOW calculat

O
O

Standard Intern
(trimetazidin)

0,63

NH

Condiii experimentale
Separarea cromatografic a fost efectuat folosind o coloan Zorbax SB C18 Rapid
Resolution, 5 cm x 4,6 mm i.d. x 1,8 m d.p. termostatat la 50oC. Coloana de gard folosit a fost
de tip Phenomenex C18 (2mm x 4 mm i.d.). Studiul a fost efectuat n condiii de gradient de
compoziie al fazei mobile. Faza mobil a fost compus din amestec acetonitril i soluie apoas
0,2% HCOOH, profilul de gradient fiind urmtorul:
Timp (min.)
Modificator organic (%)
Debit (mL/min)
0
2
0,8
5,0
30
0,8
5,01
100
0,8
5,50
100
0,8
6,0
100
1,2
6,01
2
1,2
Detaliile privind sistemul cromatografic, parametrii deteciei MS/MS, precum i ai metodei de
preparare a probelor sunt detaliai n tez.
Metoda analitic a fost aplicat pentru probele rezultate n urma a 2 studii de bioechivalen
efectuate pe tablete acoperite cu eliberare prelungit coninnd 80 mg de clorhidrat de fenspirid.
Primul a fost un studiu unidoz (efectuat att n condiii pe nemncate ct i n condiii pe mncate)
iar al doilea a fost un studiu multidoz.
Rezultate experimentale
Valorile log KOW calculate pentru analiii de interes sunt inferioare celei calculate pentru 1octanol, prin urmare acest solvent s-ar preta la injecii de volum mare. Folosind detectorul de indice
de refracie a fost determinat i factorul de retenie pentru nceputul frontului de 1-octanol, n figura
de mai jos sunt prezentate datele de retenie comparative pentru 1-octanol i cei 2 analii de interes
(desigur, n condiii izocratice i pentru un volum de injecie de 100 L 1-octanol). Este evident c
frontul de 1-octanol elueaz mult dup analiii de interes pentru toate procentele de solvent organic
investigate.
200

k1-octanol
ktrimetazidin
kfenspirid

180
160
140
120

k 100
80
60
40
20
0
0

10

15

20

25

30

% ACN

Fig. 2.54 Variaia factorilor de retenie al analiilor de interes i a solventului de injecien


funcie de compoziia fazei mobile.
Scderea reteniei analiilor de interes cu creterea volumului de injecie ar trebui s fie liniar
datorit saturrii cu solvent de injecie a unui volum proporional de faz mobil din coloana
cromatografic. S-a studiat ce se ntmpl cu retenia fenspiridei pentru procentaje diferite de
acetonitril n compoziia fazei mobile. Dup cum se poate observa mai jos un procent mai mare de
solvent organic n compoziia fazei mobile are efecte negative (un procent mai mare de solvent

23

organic n compoziia fazei mobile genereaz o oarecare solubilitate a solventului de injecie n faza
mobil, ceea ce duce la rspndirea lui pe o lungime mai mare a coloanei cromatografice fr a
genera o saturare complet a unei poriuni din faza staionar).

20

1
1
2
3
4
5

y = -0,0691*x + 16,387
R^2 = 0,9929
y = -0,0482*x + 13,612
R^2 = 0,9606
y = -0,0251*x + 1,9786
R^2 = 0,9840
y = -0,0103*x + 3,7591
R^2 = 0,9144
y = -0,0095*x + 2,3267
R^2 = 0,9981

18

16
14
12

10
8

6
4

2
4

40

AC
N

20

5 2
0

60

80
10

V ol.

100

L
Inj. (

Fig. 2.55 Variaia factorilor de retenie ai fenspiridei la injecii de volum cresctor pentru diverse
compoziii ale fazei mobile.
Dup cum se poate remarca n figura 2.56 nu se poate observa nici un efect de distorsionare
a formei de pic sau de lrgire excesiv a picurilor corespunztoare analiilor de interes n cazul
injeciilor de 100 L pentru condiiile de eluie izocratice. Avnd n vedere faptul c picul
standardului intern este foarte aproape de timpul mort al coloanei pentru procente mai mari de
acetonitril n compoziia fazei mobile i c trebuie eliminat dopul de 1-octanol dup fiecare injecie a
fost preferat o metod analitic n regim de gradient al fazei mobile.
12

3.709

23

2.802

x105 24
2.2
3
2.8

1.114

Gradient
6.138

1.6

3.133
3.290

1.8

2.690

Abunden

1.4

6.325

1.013

2.2

2.250

0.903

2.4

1.420

2.6

1.2

Izocratic

10% ACN

0.8

7.5% ACN

0.6

5% ACN

0.4

2.5% ACN
0.2

IS

0
0.5

1.5

2.5

FEN
3.5

4.5

5.5

6.5

2% ACN
7

7.5

8.5

9.5 10 10.5 11 11.5

Timp de achiziie (min)

Fig. 2.56 Injecii de 100 L probe n 1-octanol pentru diverse compoziii ale fazei mobile
Metoda bazat pe injecia de volum mare de 1-octanol este comparabil din punctul de
vedere al duratei de preparare a probelor cu deproteinizarea cu acetonitril, de aceea se pune
ntrebarea dac nu cumva o astfel de abordare nu este mai avantajoas. Aceast abordare
clasic const n precipitarea unei cote pri de 200 L de plasm impurificat controlat cu
fenspirid cu 400 L de soluie 15 ng/mL standard intern n acetonitril, urmat de centrifugare,

24

IS

1
1

1 2

Extracie cu
1-octanol
(Vinj=75 L)

x103
1.5
23 3

1.4
1.3

0.8

1.2

0.7

1.1
1

Deproteinizare
cu ACN
(Vinj=2 L)

0.6
0.5

0.9
0.8

0.4

0.7
0.6

0.2
0.1

3.4 3.6 3.8

4.2 4.4

IS

0.5

3.903
Fenspirid

3.109

0.3

Scala fenspiridei

Scala IS

0.9

IS
3.591
Fenspirid

1.1

2.756

x104

3.903
Fenspirid

3.109

separarea supernatantului i injecia direct n coloana cromatografic. Condiiile de separare au


fost pstrate neschimbate, cu excepia volumului de injecie. n aceste condiii volumul maxim de
prob care poate fi injectat fr a avea loc nici un fenomen de deformare a picurilor cromatografice
este de 2 L. Dintr-un simplu calcul matematic rezult c prin folosirea extraciei cu 1-octanol
cantitatea absolut de analit injectat n coloana cromatografic este de 62,5 ori mai mare dect
cea injectat n cazul deproteinizrii cu solvent organic. Acest lucru se poate vedea i din
cromatogramele suprapuse n figura 2.57 care sunt obinute n urma injeciei unor probe de plasm
impurificat controlat cu fenspirid la nivelul de 15 ng/mL procesat prin cele 2 metode alternative
(extracie n 1-octanol respectiv deproteinizare cu acetonitril).

0.4
0.3
0.2
0.1

2.4 2.6 2.8


0

3.2 3.4 3.6

0.2 0.4 0.6 0.8

1.2 1.4 1.6 1.8

2.2 2.4 2.6 2.8

3.2 3.4 3.6 3.8

4.2 4.4 4.6 4.8

Timp de achiziie (min)

Fig 2.57 Cromatogramele rezultate pentru o prob de plasm coninnd 15 ng/mL fenspirid
procesat prin 2 metode alternative
Dup cum era de ateptat timpii de retenie sunt mai mari n cromatograma rezultat n urma
deproteinizrii cu acetonitril (nu exist solvent care s blocheze faza staionar n capul coloanei
cromatografice). Se poate observa de asemenea i apariia unor interferene pe tranziiile de mas
ale ambilor analii de interes (picurile care preced att fenspirida ct i standardul intern), n cazul
fenspiridei separarea cromatografic ntre interferen i analitul de interes fiind mai bun dect n
cazul standardului intern.La aplicarea metodei de preparare a probelor bazate pe deproteinizarea
cu acetonitril nivelul de concentraie de 15 ng/mL poate fi considerat ca LLOQ-ul metodei pe baza
raportului semnal/zgomot.
Metoda a fost validat complet conform ghidurilor n vigoare detalii privind validarea metodei
fiind prezentate n tez.
Tabelul 2.26 Caracteristicile de calitate ale metodei analitice.
Etap
Caracteristici
Niveluri de conc. = 5/10/50/100/250/400/500/600/800/2000 ng/mL; probe
individuale/nivel: n = 6;

Liniaritate

Precizie

LOD instrumental = 0,6 ng/mL (S/N = 3); LLOQ instrumental = 1 ng/mL (S/N = 5);
LLOQ = 5 ng/mL (din calibrare); ULOQ = 2000 ng/mL;
Funcia de rspuns = liniar, factor de ponderare 1/x2; B: 0,00337 0,00006 (sD);
A: 0,0043 0,0008 (sD); coeficient de corelaie (rxy): 0,9982;
Valorile reinterpolate: RSD% [0,9 5,6]% ; Bias % [-10,4 9,6]%;
IS (RSD% pe ariile de pic pe parcursul ntregii calibrri) = 6,0%
Nivelurile probelor QC = 5/15/100/250 ng/mL (studiul unidoz); Nivelurile probelor
QC = 10/30/300/700/1500 ng/mL (studiul multidoz); repetabilitate: n = 10;
reproductibilitate intermediar: n = 6
Repetabilitate: RSD% [0,7 2,1]%; Bias% [-12,1 6,8]% (studiul unidoz)
Repetabilitate: RSD% [0,7 2,3]%; Bias% [-11,4 3,2]% (studiul multidoz)
Reproductibilitate intermediar: RSD% [1,8 8,4]%; Bias% [-16,4 (la LLOQ)

25

Etap

Stabilitate

Integritatea
diluiei

Caracteristici
10,9]%
Reproductibilitate intermediar: RSD% [1,8 7,4]%; Bias% [-12,5 9,2]%
nghe/dezghe: n = 5; Niveluri de conc. = 4 (5/15/250/700 ng/mL); RSD% [1,9
6,4]%; Bias% [-11,9 13,7]%
Termen lung (-40 oC) = 4 luni; prelevri = 5; Niveluri de conc. = 4 ; RSD% [2,7
8,2]%; Bias% [-14,0 7,0]%
Termen scurt (-70 oC / ghea carbonic: acoper perioada de transfer de la
centrul clinic la laboratorul bioanalitic) = 1 zi; prelevri = 4; Niveluri de conc. = 4 ;
RSD% [0,7 4,3]%; Bias% [-7,7 12,0]%
Termen scurt la 25 oC = 24 ore; Prelevri = 5; Niveluri de conc. = 4 ; RSD% [2,4
8,1]%; Bias% [-14,3 10,5]%
Post preparativ (25 oC) = 113 ore; prelevri = 5; Niveluri de conc. = 4 ; RSD%
[2,5 6,7]%; Bias% [-11,8 7,7]%
Fenspirid (soluie stoc; 4 oC) = 77 zile; prelevri = 5; Niveluri de conc. = 4;
RSD% [0,5 4,8]%; Bias% [-9,1 7,5]%
IS (soluie stoc; 4 oC) = 70 zile; prelevri = 8; RSD% (arie de pic) = 10,1%
Rapoartele n care s-a fcut diluia = 1/10; 1/5; 1/2; Matricea utilizat pentru diluie
a) plasm blanc; b) soluie apoas Na2CO3 5%;
probe individuale: n = 3
1/10: a) RSD% = 4,8%; Bias%= 5,1%; b) RSD% = 1,1%; Bias%= 11,8%;
1/5: a) RSD% = 3,5%; Bias%= -0,4%; b) RSD% = 2,8%; Bias%= 0,1%;
1/2: a) RSD% = 3,6%; Bias%= -2,4%; b) RSD% = 2,7%; Bias%= -0,3%;

Parametrii farmacocinetici determinai pentru fenspirid n cadrul studiilor de bioechivalen


sunt n concordan cu datele de literatur [85-88].
Concluzii asupra studiului
Principiul injeciei directe de volum mare de solvent organic nemiscibil cu faza mobil a fost
aplicat cu succes pentru determinarea fenspiridei din probe de plasm extrase cu 1-octanol. Din
punctul de vedere al simplitii operaiilor efectuate i al duratei de timp necesare pentru prepararea
probelor aceast metod este net superioar extraciei lichid-lichid i comparabil cu
deproteinizarea cu solvent organic. Dei comparabil cu deproteinizarea cu acetonitril (care este
abordarea clasic preferat pentru procesarea probelor de plasm) o astfel de metod este
superioar deproteinizrii cu acetonitril din punctul de vedere al sensibilitii i al selectivitii. Mai
mult, cele peste 4000 de injecii de volum mare de 1-octanol (considernd att validarea ct i studiile
de bioechivalen) au fost fcute pe o singur coloan cromatografic, ceea ce demonstreaz
retrospectiv fiabilitatea metodei cromatografice.
Metoda a fost validat integral iar atributele ei de calitate au fost demonstrate nu numai n
timpul validrii metodei ci i prin rezultatele obinute la analiza probelor reale de la voluntari pe
parcursul desfurrii celor 2 studii de bioechivalen. Parametrii farmacocinetici calculai pe baza
metodei analitice sunt de asemenea n bun concordan cu datele de literatur [89].

26

Concluzii finale
La finalul acestui material se pot formula unele concluzii in ceea ce privete rezultatele
obinute pentru cele trei categorii de solveni de prob investigai.
Prima categorie de solveni de prob investigai a fost reprezentat de solveni organici
miscibili cu faza mobil (o categorie de solveni utilizat frecvent n cromatografia de lichide n faz
invers). n ceea ce privete aceast categorie de solveni lucrurile sunt destul de evidente, nu este
posibil un volum de injecie cu adevrat mare, dac se poate injecta un volum mai mare de 5 L
fr efecte nedorite asupra formei de pic este excelent. Asupra cauzei principale a deformrilor
aprute exist 2 supoziii n literatur: prima se refer la tria elutropic a solventului (cu ct
solventul are o trie elutropic mai mare, cu att efectele negative asupra formei de pic sunt mai
severe i apar la un volum de injecie mai mic) iar a doua la efectele diferenei de vscozitate ntre
solventul probei i faza mobil. De asemenea mai exist i o teorie empiric primii compui n
ordinea de eluie sunt cei mai afectai, cei cu factori de retenie mai mari sunt afectai ntr-o mai
mic msur sau chiar neafectai. Prin alegerea unui set de trei solveni cu trii elutropice i
vscoziti cunoscute, a unui set de ase compui care n condiiile separrii cunoscute elueaz pe
un interval larg de factori de retenie (ntre 1,8 i 15,6) i injectarea de volume cresctoare a fost
infirmat n primul rnd teoria empiric, i n al doilea rnd s-a constatat c efectul triei elutropice
este mai pronunat dect efectul vscozitii solventului.
A doua categorie de solveni de prob investigai a fost reprezentat de solvenii apoi
(acetia reprezint amestecuri binare de solvent organic i ap sau ap n care este dizolvat un
aditiv anorganic oarecare, fie el o sare sau un agent de reglare a pH-ului). Influena creterii
volumului de injecie asupra factorului de retenie este prefect predictibil dar nesemnificativ n
valori absolute (factorul de retenie crete liniar cu volumul de injecie iar panta este apropiat ca
ordin de mrime de 1 10-3). Practic creterea volumului de injecie cu 100 L genereaz o cretere
a factorului de retenie cu 0,1 uniti. n ceea ce privete eficienta i forma picurilor injeciile de
volum mare genereaz forme de pic excelente pentru marea majoritate a analiilor. Excepiile de la
aceast regul apar la volume de injecie mari (500 L) fie pentru primii analii n ordinea de eluie,
fie pentru analiii analiii uor disociabili n condiiile unei diferene ntre pH-ul solventului de injecie
(probele ce conin ap neaditivat) i cel al fazei mobile. Diferena de pH ntre solventul de injecie
i faza mobil se poate rezolva prin aditivarea probei cu un agent de reglare a pH-ului iar efectele
negative n cazul primilor analii n ordinea de eluie se pot rezolva prin creterea moderat a
procentajului de ap n prob i volumul de injecie poate fi crescut astfel cu cteva ordine de
mrime, cu creterea implicit a limitei de detecie a metodei analitice date.
A treia i cea mai important categorie de solveni de prob investigai o reprezint solvenii
organici nemiscibili cu faza mobil. Aceti solveni pot fi mprii la rndul lor n trei categorii n
funcie de hidrofobicitatea pe care o au comparativ cu analiii de interes: solveni mai hidrofobi
dect analiii de interes, solveni cu aproximativ aceeai hidrofobicitate ca a analiii de interes i
solveni mai puin hidrofobi dect analiii de interes (clasificarea cea mai relevant pentru c n
practic trebuie ales un solvent potrivit pentru analiii de interes). Pe parcursul tezei abordarea a
fost oarecum invers, pentru un set de solveni hidrofobi nemiscibili cu faza mobil dat au fost

27

investigai analii de interes de hidrofobiciti diferite i n condiii diferite pentru a se putea dezvolta
un model teoretic care s poat prevedea n ce condiii injecia de volume mari de analii dizolvai
ntr-un solvent nemiscibil cu faza mobil poate fi un succes.
Indiferent de ct de hidrofob este un analit de interes comparativ cu solventul de injecie s-a
constatat c retenia scade liniar cu creterea volumului de injecie deoarece cu creterea volumului
de injecie crete numrul de centrii de adsorpie din faza staionar blocai de solventul hidrofob
injectat (cu toate acestea coeficienii de corelaie ai dependenelor liniare ntre volumul de injecie i
factorii de retenie sunt mai buni n cazul analiilor cu o hidrofobicitate mai mic dect a solventului
de injecie).
Din punctul de vedere al formei de pic i al eficienei cromatografice cazul ideal este cel al
analiilor mai puin hidrofobi dect solventul de injecie. Se pot injecta volume de pn la 200 L
avnd ca singurul efect negativ diminuarea moderat a eficienei picurilor. n cazurile cele mai
favorabile (procente de solvent organic de cel mult 5% n compoziia fazei mobile) se pot injecta
chiar i 500 L cu obinerea unor forme de pic acceptabile.
n cazul analiilor cu o hidrofobicitate egal sau mai mare cu a solventului de injecie
efectele volumului de injecie asupra formei de pic a analiilor sunt suficient de pronunate ca
injecia de volume mari s nu aibe aplicabilitate practic (cel puin pentru metode izocratice). Pentru
analiii cu o hidrofobicitate mai mare dect a solventului de injecie exist o posibilitate de a injecta
volume mari de prob i de a obine totui forme de pic acceptabile folosind gradieni de tip treapt
astfel: proba e injectat la o compoziie a fazei mobile suficient de srac n modificator organic
pentru a concentra att analitul ct i solventul de injecie n capul coloanei; apoi compoziia fazei
mobile e setat la un procent de modificator organic care s permit eluarea solventului de injecie
i s pstreze analiii de interes n capul coloanei. n cele din urm compoziia fazei mobile e setat
la un procent de modificator organic suficient de mare pentru a permite eluia analiilor de interes.
Pe parcursul tezei a fost demonstrat succesul unei astfel de abordri pentru acizii ginkgolici, totui o
astfel de abordare este mai laborioas i reprezint un fel de abordare de rezerv n cazul n care
nu se gsete un solvent mai hidrofob dect analitul de interes care s poat fi utilizat cu succes.
Ca o concluzie cele mai bune rezultate injectnd volume mari de probe dizolvate n solveni
organici nemiscibili cu faza mobil se obin dac sunt ndeplinite simultan patru condiii:
i) analitul de interes e solubil n solventul de injecie (sau poate extrage analitul de interes din
matricea n care se afl);
ii) solventul de injecie are o hidrofobicitate i implicit un timp de retenie mai mare dect
analiii de interes;
iii) solubilitatea solventului de injecie n faza mobil este suficient de mic pentru a fora
saturarea fazei staionare din capul coloanei cromatografice cu solventul de injecie imediat dup
injecie;
iv) solventul de injecie trebuie eliminat din coloana cromatografic nainte de injecia
urmtoare.
n practic cea mai bun abordare este un gradient care pleac dintr-un procent mare de
solvent apos i permite separarea analiilor de interes sub forma unor picuri cu eficien ct mai

28

mare. Imediat dup eluia acestora procentul de modificator organic e crescut la 100% (sau la
procentul maxim care nu genereaz precipitarea srurilor folosite ca aditivi n faza mobil), dopul
de solvent de injecie este eliminat din coloan, coloana e reechilibrat i se poate trece la injecia
urmtoare.
Aceast modalitate de lucru a fost folosit pentru determinarea indapamidului din snge
uman integral i a fenspiridei din plasm uman cu deplin succes, att pe parcursul validrii ct i al
studiilor de bioechivalen aferente fiecrui produs.
Ca solvent nemiscibil cu faza mobil 1-octanolul pare s fie de departe cea mai bun
variant de ncercat, cel puin n cazul metodelor bioanalitice: un numr mare de compui sunt
solubili n el (i implicit pot fi extrai cu 1-octanol), are densitate mai mic dect apa prin urmare
stratul de extractant va fi intotdeauna deasupra stratului de plasm/snge i implicit va fi mai uor
de prelevat, are volatilitate mic (nu exist riscul evaporrii rapide a solventului n flacoanele de
autosampler), este un solvent utilizat pentru multe aplicaii practice (i implicit e uor de procurat i
are un pre de cost relativ mic). De asemenea pe parcursul injectrii miilor de probe nu au fost
constatate efecte negative asupra garniturilor de etanare ale valvei de injecie. Desigur, n cazul n
care 1-octanolul nu e solventul potrivit pentru analitul de interes (fie din cauza hidrofobicitii
analitului de interes, fie din cauza solubilitii analitului de interes n 1-octanol) pot fi ncercai ali
solveni hidrofobi.

29

Lucrri publicate pe tema tezei de doctorat

S.Udrescu, A.Medvedovici, V.David, Effect of large volume injection of hydrophobic solvents


on the retention of less hydrophobic pharmaceutical solutes in RP-LC. Journal of Separation
Science, 31 (16-17), 2939-2945 (2008).

F.I. = 2,631

S.Udrescu, I.D.Sora, V.David, A.Medvedovici, Large volume injection of hexane solutions in


RP/LC to enhance on sensitivity of the assay of ginkolic acids in Gingko biloba standardized
extracts. Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies, 33 (1), 133-149 (2010). F.I.
= 0,953
D.I.Sora, S.Udrescu, F.Albu, V.David, A.Medvedovici, Analytical issues in HPLC/MS/MS
simultaneous assay of furosemide, spironolactone and canrenone in human plasma
samples. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 52 (5), 734-740 (2010).

F.I.

= 2,733
S.Udrescu, I.D.Sora, F.Albu, V.David, A.Medvedovici, Large volume injection of 1-octanol as
sample diluent in reversed phase liquid chromatography: application in bioanalysis for
assaying of indapamide in whole blood. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 54
(5), 1163-1172 (2011).

F.I. = 2,733

A.Medvedovici, S.Udrescu, F.Albu, F.Tache, V.David, Large volume injection of sample diluents
not miscible with the mobile phase as an alternative approach in sample preparation for
bioanalysis: an application for fenspiride bioequivalence, Bioanalysis, 3 (17), 1935-1947
(2011).

F.I. = 1,337

30