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H O A V IN E A i
MANUAL DE ,
MICROBIOLOGIA AGRICOLA
MANUAL DE
MICROBIOLOGA AGRCOLA
RHIZOBIUM, PGPRs,
INDICADORES DE FERTILIDAD E
INOCUIDAD
2012
PRESENTACIN
A m i nietecita Adriana
Sol de m i vivir
COLABORADORES:
Laboratorio de Ecologa M icrobiana y Biotecnologa
M arino Tabusso - UNALM
Blga. Elena Ram os Vsquez
Blgo. M inora M atsubara Bautista
Blga. Katty Ogata Gutirrez
Bach. Blga. Stefany Cpeda Gonzles
Blga. N atalia Kohashikawa Takaezu
Blga. Pam ela Calvo Vlez
Centro de Ciencias Genmicas - UNA M (Cuernavaca, Mxico)
Dr. Ernesto Orm eo Orrillo
Coordinador de la Red Biofag - CYTED, Espaa
Dr. Juan Sanjun Pinilla (CSIC-EEZ, Granada)
Fotografas laterales
(D. Ziga, E. Ramos y R. Santos)
1.
2.
3.
4.
5.
INDICE
PRLOGO
I.
13
1.
2.
2.1.
2.2.
2.3.
3.
3.1.
3.2.
Recoleccin de nodulos
Aislamiento de rhizobios
Tratamiento de nodulos
Aislamiento de rhizobios a partir de nodulos
Mantenimiento y conservacin de rhizobios aislados
Pruebas de pureza
Crecimiento en agar levadura lactosa (LLA)
Crecimiento en agar peptona - glucosa con indicador
prpura de bromocresol (PGPBC)
3.3. Crecimiento en agar Luria Bertani (LB)
4.
Autenticacin de las cepas de rhizobios
4.1. Desinfeccin de semillas
4.2. Evaluacin de la germinacin
4.3. Preparacin del inoculo
4.4. Trasplante de semillas a tubos con solucin nutritiva
4.5. Inoculacin de las plntulas
5.
Caracterizacin fenotpica de cepas de rhizobios
5.1. Caracterizacin morfolgica de colonias
5.2. Produccin de acidez o alcalinidad en medio LMA
con azul de bromotimol (LMA-ABT) al 0.5%
5.3. Efecto de los agentes fsico-qumicos sobre el crecimiento
de las cepas de rhizobios
5.4. Tolerancia a iones metlicos Cu2+, Zn2+, Al3+, Mn2+
5.5. Crecimiento en diferentes fuentes de carbohidratos y aminocidos
5.6. Sensibilidad a antibiticos en disco
II.
6.
6.1.
6.2.
6.3.
6.4.
7.
7.1.
7.2.
7.3.
7.4.
17
17
17
17
18
19
19
19
19
20
20
20
20
20
21
22
22
22
23
24
26
26
31
31
31
31
32
32
33
34
34
36
39
39
40
41
42
45
46
47
47
50
Produccin de biofertilizantes
Produccin de biomasa del rhizobio
Preparacin del soporte slido
Presentacin del biofertilizante
Control de calidad del biofertilizante
Recuento de clulas viables de bacterias fijadoras de nitrgeno
Capacidad infectiva y efectiva de los inoculantes en
plntulas de leguminosas
18.3. Recuento de microorganismos contaminantes del biofertilizante
18.4. Anlisis fsico-qumico
19. Enumeracin de bacterias simbiticas fijadoras de
nitrgeno por nmero ms probable
53
53
53
55
56
56
56
56
56
58
63
65
66
66
66
69
70
71
72
73
73
73
79
81
81
83
86
86
88
90
90
90
90
90
91
92
92
92
92
92
93
95
99
100
106
107
111
A B R E V IA T U R A S
AP
APT
EC
LMC
CG
Brilla
CL
LST
SC
T-VB
TSC
CT
TY
M M - ABT
SS
Agua peptonada
Agua peptonada tam ponada
Caldo EC
Caldo extracto de levadura - m anitol
Caldo glucosa
Caldo lactosa bilis (2 %) verde brillante
Caldo lactosado
Caldo lauril sulfato triptosa
Caldo selenito cistina
Caldo tetrationato verde brillante
Caldo tripticasa de soya
Caldo triptona
Caldo triptona - extracto de levadura
M edio mineral sin nitrgeno con
indicador azul de bromotimol
Solucin salina 0.85 %
PRLOGO
a fertilidad del suelo generalmente est relacionada con la cantidad de nutrientes
disponibles para las plantas y los microorganismos juegan un rol importante en el
reciclaje de todos estos elementos nutricionales que muchas veces no se comprende.
A nivel mundial existen muchas investigaciones relacionadas con la dinmica de la
microflora de diferentes suelos y su relacin con la produccin de diferentes cultivos, pero
estos anlisis resultan an muy costosos.
En el primer manual Fertilidad Biolgica del Suelo con nfasis en el estudio del Rhizobium
editado en Junio del 2006 fue utilizado dentro del I Curso Internacional de Fertilidad
Biolgica del Suelo, auspiciado por la Red Biofag (Cyted Espaa). Despus de una revisin
e incorporacin de nuevas tcnicas como el aislamiento de bacterias promotoras de
crecimiento (PGPR) y pruebas de actividad microbiana investigados en nuestro laboratorio,
se propuso darle el ttulo de Microbiologa Agrcola: Rhizobium, PGPR, indicadores de
fertilidad e inocuidad, puesto que los ensayos se enfocan principalmente en el estudio de
los suelos para la produccin de diversos cultivos de manera sostenible.
Por otro lado, en los ltimos aos se ha incrementado la demanda de anlisis
microbiolgicos en suelos, agua de riego y residuos orgnicos, que nos indican la riqueza
natural de estos sustratos; y mas an por empresas que trabajan a nivel de exportacin de
cultivos, cuyas exigencias se basan en las normas de Eurepgap, son mayores cuando se
trata de productos orgnicos. Estas involucran las buenas prcticas agrcolas, seguridad
alimentaria, proteccin del ambiente y salud. Pero adems, los pequeos agricultores
cuya proyeccin es ofrecer productos nativos manejados de manera tradicional, tambin
requieren de estas tcnicas y conocimientos.
El presente manual se organiza en 6 captulos con un total de 30 temas. En primer
lugar se describe todo lo relacionado con el Rhizobium aislados de nodulos de diferentes
leguminosas, es decir, desde su aislamiento, purificacin, y autenticacin en plntulas
hasta su caracterizacin fenotpica: morfolgica y bioqumica.
En segundo lugar, se presentan las tcnicas de aislamiento de bacterias promotoras de
crecimiento con nfasis en Bacillus y Azotobacter no presentadas en el manual anterior de
Fertilidad Biolgica. As tambin se describen algunas tcnicas para evaluar la capacidad
promotora de crecimiento (PGPR), como solubilizacin de fosfato y produccin de cido
indol actico (AIA). En la presente obra, tambin se incluyen dos pruebas importantes
como es la capacidad antagnica de fitopatgenos y efecto de las bacterias en la germinacin
de semillas.
Todas estas pruebas, nos permite conocer no solo el potencial de la fijacin simbitica
de nitrgeno en diferentes ecosistemas, sino tambin diferentes bondades de las bacterias
PGPR que favorecen significativamente la produccin de leguminosas y otros cultivos.
13
Doris Ziga
14
I. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION
DE RHIZOBIOS
1. R eco lecci n de n o d u lo s
2. A islam ien to de rh izo b io s
3. P ru eb a s de p u re z a
4. A u te n tic a c i n de las cepas de rh izo b io s
5. C ara c te riz a c i n fen o tp ica de cepas de rh izo b io s
1.
RECOLECCION DE NODULOS
2.
1.
Con ayuda de una lampa, extraer la planta que presente mejor aspecto.
Luego colectar entre 10 y 20 nodulos de la raz (Figura 1.1).
2.
Colocar los nodulos en frascos con silica gel y algodn para su posterior
conservacin, asignndoles a cada muestra un cdigo de acuerdo al lugar
de muestreo y nm ero de planta. Se recom ienda un tiempo mximo de
3 meses de almacenamiento bajo esta condicin.
3.
AISLAMIENTO DE RHIZOBIOS
Con ayuda de pinzas estriles, abrir los sobres que contienen los nodulos.
Colocar los nodulos en placas Petri estriles y con ayuda de una pipeta
agregar una gota de agua destilada estril a cada uno.
Con una bagueta proceder a la m aceracin del nodulo (es necesario que
por cada nodulo se utilice una bagueta).
17
Para tener cultivos stocks, hacer crecer las cepas en Caldo Extracto de
Levadura - M anitol sin rojo congo (LMC) hasta una poblacin de
aproxim adam ente 108 cel/m L.
I
Enjuague: 5 - 6 veces con H20
EfEEEzEE3
Triturado del nodulo y siembra por estra en medio
LMA-RC. Incubar a 28 C por 24 - 72 h 5 - 7 das
Conservacin de cepas a 4 C
3.
PRUEBAS DE PUREZA
Sembrar los cultivos aislados en placas con LLA por estras paralelas.
Incubar a 28 C por 2 - 1 0 das (segn sea Khizobium sp. o Bradyrhizobium sp).
Observar el crecimiento de la bacteria.
Adicionar 5 m L del reactivo de Benedict, e incubar a tem peratura
ambiente por 10 min .
indicador prpura de
Cepas de rhizobios
EEEEEj
5EEEE3
Agregar 5 mL de
reactivo de.
Benedict e incubar
Evaluar crecimiento
y viraje de color
Evaluar crecimiento
Evaluar crecimiento
Rvo. Benedict.
19
4.2.
Evaluacin de la germinacin
La germinacin de las semillas se evala cada doce horas, teniendo en
consideracin los siguientes parmetros: porcentaje de germinacin,
nmero de radculas con punta roma, nmero de radculas con punta fina.
4.3.
4.4.
Las semillas grandes (pallar, frijol) colocarlas en placas Petri. Con ayuda
de un bistur y pinzas quitar el pericarpio.
Los tubos que contienen las semillas se cubren con un papel en la parte
externa inferior para proporcionarle la oscuridad necesaria a la raz.
30
Regar las plntulas con la solucin nutritiva cada 3 o 5 das (si fuera
necesario).
radcula de cada
Semilla grande: 3 - 4 h
i
Colocar las semillas en placas con papel filtro
humedecido con agua destilada estril
Semilla grande: 6 mL
Semilla pequea: 2 mL
i
Cubrir las semillas en placas y llevarlas a incubar a 24 C
l
Evaluacin de la germinacin
5.
TIEMPO
DIMETRO
TEXTURA
APARIENCIA
COLOR
GOMA
A z o rh iz o b iu m
2 d as
> 2 mm
C re m o s o
Translcidas
B la n co
R e g u la r
B ra d y rh iz o b iu m
5-7 d a s
< 2 mm
Opacas
B la n co
P oco a
re g u la r
( lc a li)
M e s o rh iz o b iu m
3-7 d a s
2 -4 m m
C re m o s o
Semitranslcidas
B la n co
R e g u la r a
A m a rillo
L ig o so /
Semitranslcidas
u opacas
B la n co
R h iz o b iu m
2-5 d a s
L ig o so /
c re m o so
2 -4 m m
cre m o s o
b eige
a b u n d a n te
A b u n d a n te
A zu l
( lc a li)
A zu l
( cid o )
A m a rillo
( cid o )
i
Sembrar por estra en medio LMA
con azul de bromotimol
Incubar a 28 C x 3 -1 2 das
I
Evaluar viraje del medio:
amarillo: acidez / azul: alcalinidad
F IG U R A 5.1. Produccin de acidez o alcalinidad
5.3.
Incubar a 28 C.
24
/
Cultivo de rhizobios de 24 a 48 h
1
Inoculo (5 j jL d e lO 6 UFC/mL)
Incubar a 28 C x
3 a 15 das
LMA
Incubar a 8, 28, 37 y 40 C
por 3 a 20 das
Cultivo de rhizobios de 24 a 48 h
Incubar a 28 C x 3 -1 2 das
25
5.5.
i
Transferir una asada del cultivo fresco
ai medio base con el carbohidrato o
aminocido de inters
i
Incubar a 28 C x 2 a 10 das
i
Evaluar viraje del medio:
5.6.
Colocar los discos sobre el medio sembrado (de 2 a 4 discos por placa).
I
Incubar a 28 C por 2 -1 0 das
1
Incubar a 28 C por 2 - 1 2 das
i
Evaluacin de la sensibilidad o resistencia de las cepas
FIGURA 5.5. Sensibilidad a antibiticos en disco
27
6.
Para confirmar la pureza se debe realizar una tincin Gram. Se debe observar
la morfologa al microscopio para verificar la presencia de bacilos Gram posi
tivos.
Las colonias del gnero Bacillus sp. se caracterizan por ser blanquecinas mucosas
o secas con bordes irregulares. Algunas colonias van a presentarse ms compac
tas y otras ms dispersas dado que el microorganismo es mtil y pueden hallarse
colonias muy invasivas.
6.3. Aislamientos de Azotobacter sp.
El procesamiento de la muestra se realiza de igual m anera que en el Tema 20 y se
realizan diluciones para el aislamiento del microorganismo segn Zapater (1975).
Colocar 1 mL de las diluciones (-2) hasta (-5) en tubos que contienen medio
mineral sin nitrgeno con el indicador azul de bromotimol (ABT) al 0.5%
y por triplicado.
Los tubos se reportan como positivos cuando hay viraje de color a amarillo,
presencia de turbidez y formacin de un velo en la superficie del caldo.
Tomar una alcuota de los tubos positivos y estriar en una placa que contiene
medio mineral sin nitrgeno.
En los tubos que contienen el medio sin nitrgeno es muy importante verificar la
formacin de velos que son estructuras en forma de pelcula o aspecto filamento
so entrelazados (observar al microscopio para no confundir con micelio de hon
gos). Adems de la formacin de turbidez en el medio, los tubos positivos sern
aquellos que presenten velo y /o turbidez.
Dado que el medio de cultivo no contiene nitrgeno, es bastante selectivo y solo per
mite que las bacterias que son fijadoras Ubres de nitrgeno puedan crecer. Las colo
nias de Azotobacter spp. en placa presentan en general una morfologa caracterstica,
son traslcidas, de consistencia mucosa, superficie hmeda y poco convexas.
6.4. Aislamiento de actinomicetos
Los actinomicetos son un grupo de bacterias filamentosas G ram positivas. Como
resultado de un adecuado crecimiento y ramificacin, se forma una estructura
ramificada de filamentos, denom inada micelio, el mismo que an siendo de di
mensiones bacterianas es anlogo al micelio que forman los hongos filamentosos.
M uchos actinomicetos forman esporas por esta razn. Las colonias son fciles de
reconocer por presentar una forma redondeada a m anera de costra; el color suele
ser muy variable: blancas, verdes, rojas, moradas, grises, marrones, entre otros y
su aspecto es espolvoreado en la superficie. Adicionalmente las placas que con
tienen actinomicetos suelen presentar un olor caracterstico a mohoso o a tierra
de campos recin arados.
Se sigue la metodologa del APHA-AWWA-WPCF (1998).
*
Sembrar por incorporacin, lm L de las diluciones (-2) hasta (-5) en placas con
medio de almidn-casena suplementado con fluconazol (al 0.25 % para inhi
bir el crecimiento de hongos), homogenizar e incubar a 28 C por 6 - 7das.
7.
7.1.
Sembrar una colonia de cada cepa en tubos con medio lquido especfico
para cada microorganismo y suplementado con 5 mM de L-triptofano.
Evaluacin
*
Tomar una alcuota de 100 pL del caldo bacteriano respectivo y adicionar 400
pL del reactivo de Salkowski
Agregar 400 pL
reactivo Salkowski,
del
7.2.
Evaluacin
Se tom arn como positivas las cepas que crezcan en el medio de cultivo y
muestren presencia de un halo transparente alrededor de la estra (Figura 7.2).
Cultivo en estudio
i
Sembrar la cepa con una estra en el
medio para solubilizadores de fosfatos
7.3.
Esta metodologa puede ser adaptada a las bacterias que se deseen probar, los
ensayos se realizan de acuerdo a A hm ed et al. (2005).
*
Simultneamente se har crecer en una placa con medio PDA el hongo fitopatgeno hasta obtener un crecimiento del micelio que llegue a cubrir toda
la placa.
Con un sacabocado de 1 cm. de dimetro retirar una porcin del micelio del
hongo ya crecido y colocarla boca abajo en el centro de la placa que contiene
las bacterias.
Se debe utilizar una placa control donde solo se sembrar el hongo sin bac
teria y placas donde se prueben cepas como controles positivos y negativos.
Todo el ensayo se realiza por duplicado.
Evaluar si hay inhibicin del crecimiento del hongo por las bacterias despus
de que la placa control haya completado su crecimiento (Figura 7.3).
Se utilizan semillas de diferentes cultivos a las que se les hace una prueba de
germinacin previa.
Se enjuagan con agua destilada estril hasta eliminar los residuos de alcohol.
Se procede a embeber las semillas con los inculos que contenga una pobla
cin bacteriana de 106 cel/m L.
Con ayuda de pinzas estriles se tom an 20 semillas y se colocan en placas Petri de 18 x 140 m m con papel filtro y papel toalla, esterilizados. La cantidad
de semillas por placa depende del tam ao de la semilla.
Es im portante tener un control solo con agua destilada estril y otro con el
medio de cultivo sin bacteria.
Evaluacin de la germinacin
La germinacin de semillas se evala cada 24 horas por un periodo determinado
de germinacin para cada tipo de semilla, teniendo en cuenta el porcentaje de
germinacin y la forma y tam ao de la radcula. Se sigui la metodologa de
M ishra (1998).
36
III.
CARACTERIZACIN MOLECULAR E
INTERPRETACIN DE DATOS MEDIANTE
AMPLIFICACIN BOX - PCR
8.
N o ta s generales p a ra h a c e r P C R
9.
INTRODUCCIN
Los microorganismos del suelo presentan un rol relevante para el m antenim ien
to de la vida, la fertilidad, la calidad y el equilibrio en el ecosistema. Estudiar
su diversidad resulta importante, porque estos microorganismos forman parte de
comunidades muy complejas y dinmicas conformadas por numerosas especies.
Para entender la funcin e interaccin de cada uno de los miembros que confor
m an estas comunidades en los nichos especficos es esencial la identificacin de
los mismos.
La tcnica de reaccin de la cadena polimerasa dirigida a rDNA 16s ha sido uti
lizada ampliamente en el estudio de la diversidad en procariotas. El m todo de
rep-PCR es utilizado en bacterias y proporciona un fingerprint de la estructura
cromosmica, la cual es considerada variable entre cepas y por comparacin, se
pueden detectar diferencias a nivel intra e interespecficas.
39
Refrigeradora a 4 C
Bao de agua a 80 C
Bao de agua a 37 C
Vortex
N aO H 0.05 M
Microtubos de 2 mL
40
B. Procedimiento
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
10.
A . Materiales y equipos
Horno microondas
Micropipetas de 0.1 - 2 pL y 1 - 10 pL
Tips de 10 pL
Transluminador de luz UV
Cm ara digital
Agarosa
Agua destilada
B. Procedimiento
B .l Preparacin del gel de agarosa 1%
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Retirar las paredes de goma de la bandeja del gel y el peine, teniendo cuidado
de no daar los pocilios de vertido de la muestra.
41
8.
La cmara de electroforesis es cargada con buffer TBE IX, hasta cubrir los
pocilios de muestra.
9.
A . Materiales y equipos
*
Termociclador
M icrotubos de 1.5 mL
MgC12 25 mM
Agua milli-Q
42
B. Procedimiento
B. 1 Mezcla de Reaccin
1.
2.
3.
Concentracin Concentracin
Volumen
Inicial
Final
(25 pL)
10
25
100
25
10
5
1,00
7,50
10,00
1,25
0,80
0,08
2,50
7,50
2,50
1,25
2,00
0,40
5 -8
c.s.p. 25,00
95 C por 3 min
desnaturalizacin
93 C por 45 segundos
annealing
53 C por 1 min
extensin
65 C por 8 min
Extensin final
65 C por 16 min
43
DORJS EL IZ A B E TH Z IG A DVILA
equipos
M icropipetas d e 0 . 1 - 2 p L y l - 1 0 p L
Tips de 10 pL
Cm ara digital
Buffer TBE IX
Agarosa
Agua destilada
Agua milli-Q
Procedimiento
1. Preparar agarosa al 1.5 % en buffer TBE IX y vertir en una bandeja electrofortica para gel de 15 x 15 cm.
2. Introducir el gel dentro de la cmara de electroforesis conteniendo la misma
solucin buffer.
3. M ezclar 1 pL del buffer de carga con 5 pL del amplificado.
4. M ezclar 1 pL del m arcador Gene Ruler 1 kb A D N Ladder Plus con 1 pL de
buffer de carga y 4 pL de agua milli-Q.
5. Se carga cada uno de los pocilios con los amplificados, colocando los marca
dores moleculares a los extremos del gel.
6. Se cierra la cmara de electroforesis y se conectan los cables en sus electrodos
correspondientes.
7. Las muestras son corridas a 80 V por 180 min.
8. El gel es revelado y observado a travs del fotodocumentador.
44
12.
A . Materiales
-
B. Procedimiento
1. Alinear las imgenes de los geles en funcin a los marcadores de peso molecular.
2. Com parar los perfiles BOX de cada una de las cepas ensayadas, buscando
bandas en com n que muestren un mismo peso molecular.
3. Form ar agrupamientos de alta similitud, de m anera que los patrones de los
diferentes grupos obtenidos se diferencien unos de otros.
4. Para hacer comparaciones entre geles, se alinean las bandas de los marcadores
con un mismo peso molecular
Extraccin del ADN bacteriano
1
Verificacin de la calidad de ADN extrado
D O RIS EL IZ A B E TH Z IG A DVILA
13.
La reaccin de amplificacin del gen ribosomal 16s se realiza con el fm de secuenciarlo y determ inar la identidad de las cepas ensayadas.
A. Materiales y equipos
Termociclador Eppendorf
M icrotubos de 1.5 mL
Primers:
fD 1: 5 - CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3
rD l:
M gCl2 25 mM
Agua milli-Q
B. Procedimiento
B .l Mezcla de Reaccin
1.
2.
Reactivos
Concentracin
Concentracin
Volumen
Inicial
Final
(25 pL)
10
25
10
10
10
5
1,00
1,50
0,50
0,50
0.50
0.50
2,50
1,50
0,20
0,20
0,20
0,10
5
c.s.p. 25,00
Buffer KC1(X)
MgCl2 (mM)
dNTPs (mM)
Primer fDl (pmol/mL)
Primer rDl (pmol/mL)
Taq ADN Polimerasa (U/pL)
ADN (pL)
Agua milli-Q (pL)
B. 2 Reaccin de amplificacin
3.
93 C por 2 min
desnaturalizacin
93 C por 45 segundos
annealing
62 C por 45 segundos
extensin
72 C por 2 min.
Extensin final
72 C por 5 min.
190
170
180
G C T T G 7 T T G .... CC GC. T G G T i C . . . C . . T . ' . . .
'
-A
:i <
. ;
! ':
J ; . ; L J J G & u ii.
10
290
300
G G ..G G G T G T C G G C C CACT 3G G
i \ -
32
CTG . G ..C
330
340
350
360
f ; ' |
L J s lM u ^ h
420
ilk ... m
L.
440
430
I ^
FIGURA 15.2 Secuencias del banco de genes (genebank, NCBI) y cepa en estudio. Tras la obten
cin de secuencias similares a las secuencias en estudio por medio de la NCBI, se procede a limpiar
las secuencias por medio de los programas BioEdit (arriba) y CHROMAS Lite (abajo), el primero
se emplea para comparar la semejanza entre las bases de la secuencia de la muestra con las secuen
cia extradas de la NCBI y el segundo para corroborar esta informacin con el cromatograma, ya
que en este se pueden observar los posibles errores de secuenciamiento.
48
FIGURA 15.4 Secuencias alineadas para la correccin de posibles errores. El programa CHROMAS, es determinante al momento de realizar las correcciones necesarias, ya que el cromatograma
permite determinar si la diferencia en una base es real o si existe un error en la lectura de este.
49
FIGURA 16.1 Alineacin de cepas de referencia y cepas en estudio para la creacin del dendograma. Se emple nuevamente el programa BioEdit para la alineacin de todas las secuencias en estu
dio corregidas y las secuencias de cepas tipo o de referencia para la construccin del dendograma.
50
17.
P ro d u c c i n de b iofertilizantes
18.
19.
Cantidad de inoculante
250 g
Cantidad de semilla
35 kg (semilla mediana: frijol)
53
Diluyente (agua)
600 mL
D O R IS E L IZ A B E TH Z 1G A D V ILA
Cepa de Rhizobium
Siem bra en
m edio lquido
Siem bra en
m ayor
volum en
Em pacado en bolsas
de 250 g
Esterilizar a 121 C x
30 min por dos das
I
M aduracin a 28 C
por 7 das
I
Alm acenam iento a 4o C
por 3 a 6 m eses
agitacin
54
17.3
E C O R IZ O - I n o c u la n te s s a lu d a b le s p a r a c u ltiv o s L a b o r a to r io d e E c o lo g a
M ic r o b ia n a y B io te c n o lo g a M a r in o T a b u s s o - U N A L M
I N O C U L A N T E P A R A A R V E JA H O L A N T A O
^
.
'
P r e s e n ta c i n
F r a s c o x 4 0 m L , r in d e p a r a 3 0 k g d e s e m illa
C o n c e n tr a c i n d e r h iz o b io s
10s c el/ m L
A p lic a c i n
M e z c la r u n if o r m e m e n te el in o c u la n te c o n 2 0 0 g d e s u e lo y la s e m i
lla. D e ja r s e c a r p o r 30 m in u to s b a jo la s o m b r a . S e m b ra r.
C o n s e r v a r e n re fr ig e r a c i n h a s ta s u u s o . N o e x p o n e r las s e m illa s
P r e c a u c io n e s
tr a ta d a s al s o l n i a v ie n to s d e s e c a n te s . U tiliz a r t o d o el p r o d u c to e n
el m o m e n to . U s a r g u a n te s p a r a la a p lic a c i n .
L o te
003
F e c h a d e P r o d u c c i n
1 5 -0 1 -2 0 1 2
F e c h a d e V e n c im ie n to
1 5 -0 3 -2 0 1 2
DO RIS EL IZ A B E TH Z IG A D V ILA
"
Inoculante
10 g
10"'
1 mL
Tubos con 9 mL
S.S. 0.85%
10
10
1 mL
r
10-4 ...
1 mL
i'
1 mL
ir
Incorporar
medio LMA
1
Elegir las placas con 30 - 300 colonias
y realizar el conteo
57
1(T
1 mL
i
Tomar 1 mL cada una de las diluciones e inocular a cada uno de los cuatro
tubos que contienen plantas de trbol blanco (Trifolium repens) de una semana
de crecimiento (Figura 19.1).
58
m a n u a l d e m ic r o b io l o g a a g r c o l a r h iz o b iu m , pgprs , in d ic a d o r e s d e f e r t il id a d e in o c u id a d
Suelo
10 g
1
'
l
\
10-1
90 mL
S.S.0.85%
1 mL
1 mL
1 mL
Tubos con 9
mL S.S. 0.85%
10r3
1 0':
1 mL
10'4
1 mL
...
10'5
1 mL
u
i
Incubar a 22 - 24C
p o r 2 8 d a s
t
Evaluar la presencia de nodulos cada 7 das y
contar el nmero de plantas noduladas
i
Expresar los resultados en
N M P /g
59
1 1 mL
V. INDICADORES DE LA FERTILIDAD
BIOLOGICA DEL SUELO
20. Preparacin de muestras y diluciones
21. Recuento de bacterias
22. Recuento de hongos totales
23. Recuento de bacterias anaerobias mesfilas
24. Enumeracin de bacterias fijadoras de nitrgeno de vida libre
26. Actividad microbiana
INTRODUCCIN
l componente microbiolgico del suelo puede ser til como indicador del
estado general del suelo, pues una buena actividad microbiana, es reflejo
de condiciones fisicoqumicas ptimas para el desarrollo de procesos metablicos de microorganismos (bacterias, hongos y actinomicetos) que actan
sobre sustratos orgnicos y cultivos asociados.
Para evaluar la calidad del compost como inoculante, tambin se tom a en cuenta
el factor microbiano. El compost term inado debe contener al menos 108 U F C /g
de peso seco de bacterias aerobias y estar en relacin 10:1o mayor a las bacterias
anaerobias. Adems, la carga de mohos y levaduras debe estar en 103-104 U F C /g
y la de actinomicetos entre 106-108 U F C /g. U n compost de mala calidad puede
estar asociado a inm adurez del procesamiento y puede inhibir la germinacin de
semillas o causar una rpida disminucin del nitrgeno del suelo.
Por otro lado, la medicin de C 0 2 producido es una estimacin de la actividad y
por tanto de la presencia microbiana. Tal actividad vara en funcin de muchos
factores, como el uso del suelo, mineraloga, cobertura vegetal, prcticas de m ane
jo, calidad de los residuos que entran al sistema, factores ambientales, entre otros.
De esta m anera podem os afirmar que la actividad m icrobiana nos da idea de la
biota del suelo y puede ser un parm etro til para la medicin de su fertilidad.
63
Agua peptonada
Muestra
10'1
1 mL
10'2
65
103
21.
RECUENTO DE BACTERIAS
Incubar a 28 C por 48 h.
M edir 10 mL de muestra y agregar a un m atraz con 90 m L de agua peptonada 0.1% (diluyente). Hom ogenizar (dilucin 104).
Incubar a 35 C por 48 h.
66
Muestra
10 g
1 mL
10-1
1 mL
1 mL
9 mL
9 mL
SS 0.85%
SS 0.85%
10-2
1 mL
10-3
9 mL
SS 0.85%
10-4
1 mL
1 mL
...
9 mL
SS 0.85%
10-6
1 mL
'
1
Incubar a 28 C por 48 h
1
Elegir las placas que contengan entre 30 - 300 colonias
67
10 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
i
1 mL
r
1 mL
' r
i
Incubar a 35C por 48 h
i
Elegir las placas que contengan entre 30 - 300 colonias
i
Expresin de Resultados: UFC/mL
68
22.
ii
it
ii
ii
ii
|i
i|
i
Incubar a 22 C por 3-5 das
4
Elegir las placas que contengan entre 8 - 8 0 colonias
4
Expresin de resultados: UFC/g suelo seco
69
23.
*
*
Pesar 10 g de la m uestra y diluir con agua peptona, agitar por 2 min. Realizar
diluciones hasta 10'3.
Transferir 1 m L de cada dilucin por duplicado, adicionar agar triptona sulfito neom icina (TSN) y homogenizar.
Dejar solidificar. Invertir las placas e introducirlas en una jarra de anaerobiosis.
Incubar a 35 C durante 24 horas.
Hacer el conteo de colonias en placas que contengan de 30 - 300 colonias.
Expresar los resultados como U F C /g de suelo seco (Figura 23.1).
9 mL
A P 0 .1%
1 mL
'i.
....
ii
ii
ii
ii
In c o rp o ra r m e d io T S N
In c u b a r en ja rra de a n a e ro b io s is a 35 1 C p o r 2 4 h
I
R e a liza r el c o n te o en p la ca s q ue co n te n g a n e n tre 30 3 00 c o lo n ia s
i
E xp re si n de R e su lta d o s: U F C /g su e lo seco
24.
RECUENTO DE ACTINOMICETOS
Pesar 10 g de la muestra y diluir con agua peptona, agitar por 2 min. Realizar
diluciones hasta 10'5.
Transferir 1 m L de cada dilucin por duplicado, adicionar 18 mL de agar
alm idn - casena y homogenizar.
Sembrar por incorporacin usando 1 mL de las diluciones -2 hasta -5 con
agar alm idn - casena suplementado con fluconazol al 0.25 % para inhibir el
crecimiento de hongos.
Incubar a 28 C por 6 - 7 das.
Hacer el conteo de colonias en placas que contengan de 30 - 300 colonias.
Reportar como U F C /gram o de suelo seco (Figura 24.1).
Muestra
I
Incubar a 28 C por 6 - 7 das
i
Expresin de resultados: UFC/g suelo seco
71
Suelo
Tubos con 9 mL
AP 0.1 %
1 mL /tb
1 mL /tb
.
|
1 mL /tb
10 mL caldo mineral
sin nitrgeno - ABT
1
Viraie de color a amarillo se reoorta como positivos
i
Leer los tubos positivos y consultar la tabla de NMP
para reportar el resultado final
FIGURA 25.1. Enumeracin de bacterias fijadoras de nitrgeno de vida libre
72
Del mismo m odo se instala un recipiente vaco que sirve como blanco.
Donde:
N: norm alidad del HC1
26.2. Determinacin de la actividad deshidrogenasa de los microorganismos
del suelo
La actividad deshidrogenasa en suelos, se determ ina por reduccin de sales tetrazolium, su extraccin y cuantificacin espectrofotomtrica de acuerdo al m todo
descrito por Casida (1977) y modificado para la presente obra (Ramos y Ziga,
2007).
Se tom an 10 g de suelo tam izado (peso hmedo), que son mezclados con 0.1
g de carbonato de calcio, C a C 0 3.
De esta mezcla se pesan 2 g en frascos estriles color m bar con cierre her
mtico.
73
D O R IS EL IZ A B E TH Z IG A D V ILA
Adicionar 0.5mL de
sol. glucosa 25%
i
Incubar a 28C por 24 horas
i
Trasvasar el contenido del vial a un matraz
Adicionar 3.5mL
de BaCI2 +
fenoftalena
i
Calcular la tasa de C 0 2 producido: mg C 0 2/g*h
FIGURA 26.1. Respiracin de los microorganismos del suelo
i
Pesar 2 g
Muestra
+ 1 mL agua
+ 1 mL TTC 3 %
Incubar a 37 1C / 24 horas
i
Aadir 12 mL de etanol absoluto y
agitar vigorosamente por 5min
Filtrar al vacio
i
Leer al espectrofotmetro a 485 nm
i
Cuantificar la cantidad de formazn haciendo uso
de una curva de calibracin
i
pg de formazn/ g suelo seco/ 24h
FIGURA 26.2. Determinacin de la actividad microbiana de los microorganismos del suelo
75
co li
S a lm o n ella
sp.
INTRODUCCIN
as pruebas de inocuidad en suelo y agua son ensayos que se realizan para
la determ inacin del estado sanitario de muestras de suelo, compost, bioles, agua y otros, para m inim izar los riesgos para la salud hum ana durante
su manejo para la produccin de cultivos.
79
27.
27.1.
Expresin de Resultados
Elegir la dilucin ms alta en la que sean positivos de formacin de gas los tres
tubos de una dilucin y tom ar en cuenta las diluciones superiores ms prximas.
Por ejemplo:
N de tubos positivos
Ejemplo
1
2
3
4
-1
-2
-3
-4
3/3
0/3
2/3
3/3
3/3
0/3
2 /3
3/3
1/3
0/3
1/3
3/3
0/3
0/3
1/3
3/3
Para la lectura en la tabla del Nm ero M s Probable, se tom aran las siguientes
combinaciones de tubos positivos:
Ejemplo
1
2
3
4
Combinacin
de positivos
3:1:0
0:0:0
2:1:1
3:3:3
Clave N M P
40
<3
20
1 100
N M P /g mL
400
<3
200
11 000
81
Suelo
i
Incubar a 36 + 1 C por 24 - 48 h
'i
Seleccionar los tubos positivos (presencia de gas) y transferir
una asada a caldo lactosa bilis (2%) verde brillante
II
|
Incubar a 36 + 1 C por 24 - 48 h
I
Leer los tubos positivos y consultar la tabla de NMP
para reportar el resultado final
FIGURA 27.1. Enumeracin de coliformes totales (ICMSF, 2000)
82
Para agua potable utilizar 10 tubos con caldo lauril sulfato triptosa a doble
concentracin y agregarle 10 mL de la muestra.
"
Pasadas las 24 primeras horas, anotar los tubos que muestren produccin
de gas. Volver a la estufa los tubos negativos para su incubacin durante 24
horas ms.
Pasadas las 48 horas, anotar los tubos que muestren produccin de gas.
Confirmar que los tubos de caldo lauril sulfato seleccionados en su lugar son
positivos de organismos coliformes, transfiriendo una asada de cada tubo a
otro de caldo lactosa bilis (2%) verde brillante (Figura 27.2).
Expresin de Resultados
83
E je m p lo
1 mL
0 .1 m L
0 .0 1 m L
0 .0 0 1 m L
a
b
c
5/5
5/5
0/5
5/5
4/5
1/5
2/5
2/5
0/5
0/5
0/5
0/5
C o m b in a c i n d e
n d ic e
p o s itiv o s
N M P /lO O m L
5-2-0
5-4-2
5.000
2.200
20
0 -1 -0
E je m p lo
d
e
1mL
5 /5
5 /5
0 .1 m L
3/5
3/5
0 .0 0 1 m L
0 .0 1 m L
1/5
0/5
1/5
2 /5
84
C o m b in a c i n d e
n d ic e
p o s itiv o s
N M P /1 0 0 m L
5-3-2
5-3-2
1.400
1.400
10 mL
m
i ,
Muestra
original
10 mL /tb
10
10'
90 mL
AP 0.1%
Ctst
1 mL /tb
1 mL /tb
MI
lili
" i
Seleccionar los tubos positivos (presencia de gas)
iii
1
Incubar a 35 + 0.5 C por 24 - 48 h
85
28.
28.1.
Tomar los tubos de caldo lauril sulfato triptosa gas positivo, presuntivas de
crecimiento coliforme.
Incubar los tubos de caldo E. coli a 44.5 + 0.2C y ver si son positivos (forma
cin de gas) a las 24 y 48 horas.
Se presume que los tubos de caldo E. coli que presenten gas son tam bin posi
tivos de organismos Coliformes de origen fecal (Figura 28.1).
Expresin de Resultados
Similar a la expresin de coliformes totales (ICMSF, 2000).
86
1 mL
Tubos con 9 mL
AP 0.1%
10"
1 mL /tb
10-
10'2
|
1 mL/tb
1 mL /tb
i9 lll
1
Incubar a 36 + 1C por 24 - 48 horas
" i
Seleccionar los tubos positivos (presencia de gas) y transferir
una asada a caldo EC
919 99!
10 mL Caldo EC
i
Incubar a 44.5 + 0.2 C por 24 - 48 horas
i
Leer los tubos positivos y consultar la Tabla de NMP
para reportar el resultado final
87
28.2.
Tomar los tubos de caldo lauril sulfato triptosa gas positivo, procedentes de
las presuntivas de coliformes.
Incubar los tubos de caldo EC a 44.5 + 0.2C y observar si dan positivo (for
macin de gas) a las 24 y 48 horas (Figura 28.2).
Se presume que los tubos de caldo EC que presenten gas son positivos de
organismos coliformes de origen fecal.
Expresin de Resultados
Similar a lo aplicado en coliformes totales (Standard Methods, 1998).
10 mL
Muestra
original
90 mL
AP 0.1 %
10 m L/tb
1 mL /tb
10'1
1 mL /tb
I
Seleccionar los tubos positivos (presencia de gas)
10 mL Caldo EC
1
Incubar a 44,5 + 0.2 C por 24 - 48 h
I
Leer los tubos positivos y consultar la tabla de NMP
para reportar el resultado final
89
Sembrar por estras una asada de cada tubo de caldo EC positivo con gas, en
placas de agar EMB o EN D O e Incubar por 2 4 h a 3 5 - 3 7 C (Figura 28.1).
Tomar una colonia representativa (nucleada con o sin brillo metlico) de cada
placa y sembrarla por estras en una placa de agar nutritivo. Incubar la placa
invertida durante 24 horas a 35 - 37 C.
Seleccionar colonias individuales y sembrar una asada en agar nutritivo incli
nado y en caldo lactosado. Incubar los cultivos durante 24 horas a 35 - 37 C.
A partir de los tubos con gas positivo en Caldo Lactosado, hacer una exten
sin y teir por el m todo de Gram para confirmar la presencia de bacilos
G ram negativos no esporulados.
Para inocular los medios IMVIC que se m encionan a continuacin, utilizar
un asa de Kolle y hacer siembras a partir de cultivos de 24 horas en agar nu
tritivo inclinado.
Inocular tubos de caldo triptona a partir de cultivos puros e incubar los tubos
sembrados a 35 - 37 C durante 24 horas (Figura 29.1)
Inocular tubos de caldo glucosa a partir de cultivos puros e incubarlos a 35 37 C durante 48 h (Figura 29.1).
Pipetear 1 mL de cada cultivo en tubos vacos y aadir a cada uno de ellos 0.6
mL de la solucin de a-naftol y 0.2 mL de la solucin de hidrxido potsico
al 40%.
Agitar los tubos y dejarlos en reposo durante 2 - 4 h. Observar los resultados.
La aparicin en la mezcla de un color carmes se anota como prueba positiva.
90
Expresin de resultados
Similar a la expresin de coliformes fecales.
Caldo EC positivo
A is la r co lo n ia s y p u rifica r
Caldo Triptona
Caldo MR - VP
_______ I
Agar citrato
de Simmons
In c u b a r 2 4h a
3 5 -3 7 C
In c u b a r 5 d a s a
3 5 -3 7 C
A d ic io n a r
re a c tiv o de
K o va cs
A d ic io n a r sol.
rojo de m etilo
0 .0 3%
In cu b a r 48 h a
3 5 -3 7 C
In c u b a r 4 8 h a
3 5 -3 7 C
A 1 m L d e cultivo ,
a d ic io n a r 0 .6 mL
a -n a fto l + 0.2 mL
KO H 40 %
N e g a tivo : no hay
ca m b io de co lo r
P o s itiv o : fo rm a c i n
de un a n illo rojo
P o sitivo : c o lo ra ci n
roja
N e g a tivo : no hay
ca m b io de co lo r
Reacciones tpicas de E. c o li
i
Los tu b o s de EC q u e co n firm a n la p re se n cia de E. c o li son p o s itiv o s y se
le e n en la ta b la d e N M P p a ra re p o rta r el re su lta d o fin a l
91
Pipetear 1 mL del cultivo de pre - enriquecimiento en 10 mL de caldo Selenito Cistina. Incubar a 43 C, durante 24 horas.
Transferir 1 mL de cultivo de pre - enriquecimiento a 10 mL de Caldo Tetrationato Verde Brillante. Incubar a 43 C durante 24 horas.
Incubar las placas de agar bismuto sulfito a 35 - 37C durante 48 horas. Las
colonias tpicas de Salmonella en agar bismuto sulfito aparecen marrones o
grises a negro, a veces con un brillo metlico. El medio que rodea las colonias
es, generalmente, m arrn al principio, cambiando a negro segn transcurre
el tiempo de incubacin. Algunas cepas producen colonias verdes, con el
medio que las rodea muy poco o nada oscurecido.
Tomar con una aguja de Kolle estril dos o ms colonias de cada tipo sospe
choso del agar verde brillante, del agar sulfito bismuto y del medio XLD y
pasar a tubos de agar triple azcar hierro y agar lisina hierro inclinados.
reaccin cida (color amarillo), con o sin produccin de SH2, que da lugar al
ennegrecimiento del agar. La reaccin sospechosa en agar triple azcar hierro
indica que el organismo fermenta la glucosa (columna amarilla) pero que no
fermenta la lactosa ni la sacarosa (parte inclinada roja), reacciones tpicas de
las Salmonella. Sin embargo, algunas cepas pueden fermentar la sacarosa o la
lactosa y producir acidez (color amarillo) tanto en la parte inclinada como en
la colum na de medio. Los cultivos sospechosos de Salmonella presentan en el
agar lisina hierro una reaccin alcalina (color prpura) en todo el medio, con
o sin produccin de SH2 (ennegrecimiento).
30.5 Serologa somtica
Depositar una pequea cantidad de cultivo del medio TSI en una lm ina co
locar una gota de solucin salina fisiolgica y emulsionar el cultivo.
A adir una gota del antisuero y emulsionar con la ayuda del asa de Kolle.
Expresin de resultados
El resultado se expresa como presencia o ausencia del microorganismo en 25 g de
suelo mL de agua.
93
225 mL APT
10 mL Caldo
Tetrationato
10 mL caldo
Selenita Cistina
Incubar a 43C por 24 horas
AgarXLD
IL------ 1
AgarBPLS
IL------ 1
Agar BAS
IL
"1
1
Incubar a 35 - 37 C por 24 horas
Agar TSI
Agar LIA
1
Serologa: somtica y flagelar
i
Expresin de Resultados: Presencia - Ausencia / 25g
94
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Matos, G., Ormeo, E. y Ziga D. 1998. Diversidad de los rizobios que nodulan el cultivo de pallar (.Phaseolus lunatus L.) en la Costa Central del Per.
Ecologa Aplicada. 1:42-46.
Naik, P. R. and Sakthivel, N. 2006. Functional characterization of a novel hydrocarbonoclastic Pseudomonas sp. strain PUP6 with plant-growth-promoting
traits and antifungal potential. Research in Microbiology 157: 538-546.
Nautiyal C. S. 1999. A n efficient microbiological growth mdium for screening phosphate solubilizing microorganisms. FEM S Microbiol. Lett. 170:
265-270.
ANEXOS
ANEXO N 1 Medios de cultivo y reactivos
ANEXO N 2
ANEXO N 3
ANEXO N 4
10.00 g
0.50 g
0.50 g
0.10g
0.20 g
15.00 g
1000 mL
6.8
*Colorantes:
Rojo congo al 0.0025 %
10 m L /L de LM A
Azul de Bromotimol 0.5% en alcohol al 70%
5 m L /L de LM A
10.00 g
0.50 g
0.50 g
0.10g
0.20 g
15.00 g
1000 mL
6.8
REACTIVO DE BENEDICT
Solucin A
Citrato de Sodio
Carbonato de Sodio
Agua destilada
17.3 g.
10.0 g.
10.0 m L .
Solucin B
Sulfato de Cobre
Agua destilada
1.73 g
10.0 mL
5.00 g
10.00 g
15.00 g
10.00 mL
1000 mL
6.8
100
5. MEDIO LB
Triptona
Extracto de levadura
NaCl
Agar
Agua destilada
pH
10.00 g
5.00 g
5.00 g
15.00 g
1000 mL
6.8 - 7.0
Solucin 4
13.26 g /L
123.3 g /L
87 g /L
0.338 g /L
H 3B 0 3
Z n S 0 4. 7H20
C u S 0 4. 5H20
CoSO4. 7HzO
N a2M o 0 2. 2H20
0.247
0.288
0.100
0.056
0.048
g /L
g /L
g /L
g /L
g /L
Tomar 5mL cada solucin stock y aadir 10L de agua destilada, ajustar
el pH a 6.6 - 6.8 para prepar solucin nutritiva N +, aadir KN03(0.05%).
7. MEDIO BASE BERGENSEN
k 2h p o 4
k h ,p o 4
M g S 0 4.7H20
NaCl
CaCl2
d jF e
Glutam ato monosodico
Tiam ina
Biotina
Pentotenato clcico
M anitol
Azul de bromotimol (sol. al 5% en etanol 70 %)
Agua destilada
pH
0.3 g
0.3 g
0.15 g
0.05 g
0.05 g
6 mg
11 g
0.1 mg
0.2 mg
0.1 mg
10g
5 mL
1000 mL
7
10.0 g
5.0 g
o.i g
0.25 g
0.2 g
5.0 g
15.0 g
1000 mL
7.0
9. SOLUCIN DE SALKOWSKY
2% de FeCl3 0.05M en 35% de Acido Perclrico.
10. MEDIO GLUCOSA TRIPTONA EXTRACTO DE CARNE (TGE)
Utilizado para el aislamiento de bacterias del gnero Bacillus.
Triptona
Extracto de carne
D-Glucosa
Agar
pH
5.0 g
3.0 g
LOg
15 g
7 . 0 + /- 0 . 1
0.655 g
0.2 g
0.02 g
0.01 g
3.4 g
0.0108 g
0.15 g
10 g
15.0 g
10 g
5 mL
7
4.0
20.0 g
15.0 g
5.6+/-0.1
10.0 g
0.3 g
2.0 g
2.0 g
2.0 g
0.05 g
0.02 g
0.01 g
15.0 g
1000mL
14.
5.0 g
2.5 g
1.0 g
15.0 g
1000 mL
Sacarosa
N itrato sdico N a N 0 3
M g S 0 4.7H20
KC1
2 F eS 0 4.7H20
k 2h p o 4
Agar
Rosa de Bengala
Agua destilada
pH
16. A G A R T SN
Para recuento de bacterias anaerobias
Peptona de casena
Extracto de Levadura
Sulfito sdico
Citrato de Hierro III
Polimixina B sulfato
Neomicina Sulfato
Agar
Agua destilada
pH
15.0 g
10.0 g
1.0 g
0.5 g
0.02 g
0.05 g
13.5 g
1000 mL
7.2 0.2
CALDO LACTOSADO.
Este medio de cultivo est exento de sustancias inhibidoras para el ensayo
previo de bacterias Coliformes, especialmente E. coli. Utilizado para el enri
quecimiento de Salmonella. Composicin (g/L):
Peptona de g elatin a.................................... 5.0
Extracto de c a rn e ........................................ 3.0
L a c to sa ..........................................................5.0
Disolver y distribuir en tubos de ensayo provistos de campanas D urham y
esterilizar en autoclave (15 minutos a 121C). El caldo preparado es claro e
incoloro. pH: 6.9 + 0.1
18.
Composicin (g/L):
Peptona de C asen a.........................................................5.0
L(-) - cistin a....................................................................... 0.01
L a c to sa .............................................................................. 4.0
Fosfato s d ico .................................................................. 2.0
Hidrgenoselenito s d ic o ............................................. 4.0
Disolver a temperatura ambiente. En caso necesario calentar brevemente
como mximo a 60C, esterizar por filtracin, si se prevee un almacenamien
to prolongado y distribuir en tubos. N o esterilizar en autoclave. pH: 7.0 + 0.2
19.
CALDO TETRATIONATO.
Este caldo es utilizado para el enriquecimiento selectivo de Salmonelas.
Composicin (g/L):
Peptona de C asen a..........................................................2.5
Peptona de C a rn e ............................................................. 2.5
M ezcla de sales b ilia res.................................................... 1.0
Carbonato de c a lc io ........................................................10.0
Tiosulfato de so d io ..........................................................30.0
Disolver los ingredientes y en caso necesario, calentar brevemente y enfriar
rpidamente. Queda un sedimento de Carbonato de Calcio. N o necesita este
rilizar. pH: 7.0 + 0.1
20.
3.0
5.0
3.5
7.5
7.5
5.0
2.5
6.8
0.8
0.08
13.5
AG ARBPLS
Selectivo para el aislamiento de Salmonella a partir de materiales patolgi
cos, alimentos, etc. Composicin en (g/L):
Peptona de carne
5.0
Peptona de casena
5.0
Extracto de carne
5.0
104
Cloruro de sodio
Hidrogenofosfato disdico
Lactosa
Sacarosa
Rojo de fenol
Verde brilante
Agar
pH:
3.0
2.0
10.0
10.0
0.8
0.0125
12
6.9 0. 1
5.0
10.0
5.0
4.0
0.3
8.0
5 mL
20.0
15
5.0
3.0
3.0
5.0
10
10
1.0
0.5
0.3
0.024
12
105
Composicin (g/L)
Peptona de carne
Extracto de levadura
D(+)Glucosa
L-Lisina m onoclorhidrata
Tiosulfato sdico
Citrato de amonio y hierro (III)
Prpura de Bromocresol
Agar
5
3
1.0
10.0
0.04
0.5
0.02
12.5
ANEXO N 2
Tabla A .2.1 Ensayos de Sensibilidad a diferentes antibiticos
Sigla
Potencia
Resistente
Susceptible
10 mcg
<13mm
>17mm
CFM
5 mcg
<15mm
>19mm
30 mcg
<12mm
>18mm
DXS
30 mcg
<12mm
>16mm
EM
15 mcg
<13mm
>23mm
Estreptomocina
10 mcg
< llm m
>15mm
Kanamicina
30 mcg
<13mm
>18mm
Lincomicina
2 mcg
<16mm
>21mm
Norfloxacino
OR
10 mcg
<12mm
>17mm
Penicilina
10UOF
<19mm
>20mm
Rifampicina
5 mcg
<16mm
>20mm
Sulfatrimetoprim
SX
25 mcg
<10mm
>16mm
Tetraciclina
30 mcg
<14mm
>19mm
Agente microbiano
Ampicilina
Cefixima
Cloranfenicol
Doxiciclina
Eritromicina
106
Tabla A .3.1
Indice NMP para varias combinaciones de resultados positivos cuando son
usados tres tubos por dilucin (1 0 1, 1 0 2, 1 0 3) (ICMSF, 2000)
0
0
0
0
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
0 .0 1
0 .0 0 1
0
0
1
2
0
0
1
1
2
0
0
1
1
2
2
3
0
0
0
1
1
1
2
2
2
3
3
3
0
1
0
0
0
1
0
1
0
0
1
0
1
0
1
0
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
2
107
N M P /g
<3
3
3
6
4
7
7
11
11
9
14
15
20
21
28
29
23
39
64
43
75
120
93
150
210
240
460
1100
Tabla A .3.2
TABLA 922: IV. Indice NMP y lmites de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos cuando son usados cinco tubos por
dilucin (10 mL, 1.0 mL, 0.1 mL) (Standard Methods, 2005)
C o m b in a c i n
d e P o s itiv o s
n d ic e
L m ite s
C o n fia n z a
P / 1 0 0
m L
In fe rio r
d e
C o m b in a c i n
d e
P o s itiv o s
S u p e rio r
n d ic e
L m ite s
C o n fia n z a
P / 1 0 0
m L
In fe rio r
d e
S u p e rio r
6 .8
4 -0 -3
2 5
9 .8
7 0
1 .8
0 .0 9 0
6 .8
4 -1 -0
1 7
6 .0
4 0
0 -1 -0
1 .8
0 .0 9 0
6 .9
4 -1 -1
2 1
6 .8
4 2
0 -1 -1
3 .6
0 .7 0
10
4 -1 -2
2 6
9 .8
7 0
0 -2 -0
3 .7
0 .7 0
10
4 -1 -3
31
1 0
7 0
0 -2 -1
5 .5
1 .8
15
4 -2 -0
2 2
6 .8
5 0
7 0
0 -0 -0
0 -0 -1
<
1 .8
0 -3 -0
5 .6
1 .8
15
4 -2 -1
2 6
9 .8
1 -0 -0
2 .0
0 .1 0
1 0
4 -2 -2
3 2
1 0
7 0
1 -0 -1
4 .0
0 .7 0
10
4 -2 -3
3 8
1 4
1 0 0
7 0
1 -1 -2
6 .0
1 .8
15
4 -3 -0
2 7
9 .9
1 -1 -0
4 .0
0 .7 1
12
4 -3 -1
3 3
1 0
7 0
1 -1 -1
6 .1
1 .8
15
4 -3 -2
3 9
1 4
1 0 0
1 -1 -2
8 .1
3 .4
2 2
4 -4 -0
3 4
1 4
1 0 0
1 -2 -0
6 .1
1 .8
15
4 -4 -1
4 0
1 4
1 0 0
1 -2 -1
8 .2
3 .4
2 2
4 -4 -2
4 7
1 5
1 2 0
1 -3 -0
8 .3
3 .4
2 2
4 -5 -0
4 1
1 4
1 0 0
1 -3 -1
1 0
3 .5
2 2
4 -5 -1
4 8
1 5
1 2 0
1 -4 -0
1 0
3 .5
2 2
5 -0 -0
2 3
6 .8
7 0
2 -0 -0
4 .5
0 .7 9
15
5 -0 -1
31
1 0
7 0
2 -0 -1
6 .8
1 .8
15
5 -0 -2
4 3
1 4
1 0 0
2 -0 -2
9 .1
3 .4
2 2
5 -0 -3
5 8
2 2
1 5 0
2 -1 -0
6 .8
1 .8
17
5 -1 -0
3 3
1 0
1 0 0
2 -1 -1
9 .2
3 .4
2 2
5 -1 -1
4 6
1 4
1 2 0
2 -1 -2
1 2
4 .1
2 6
5 -1 -2
6 3
2 2
1 5 0
2 -2 -0
9 .3
3 .4
2 2
5 -1 -3
8 4
3 4
2 2 0
2 -2 -1
1 2
4 .1
2 6
5 -2 -0
4 9
15
1 5 0
2 -2 -2
1 4
5 .9
3 6
5 -2 -1
7 0
2 2
1 7 0
2 -3 -0
1 2
4 .1
2 6
5 -2 -2
9 4
3 4
2 3 0
2 -3 -1
14
5 .9
3 6
5 -2 -3
1 2 0
3 6
2 5 0
2 -4 -0
15
5 .9
3 6
5 -2 -4
1 5 0
5 8
4 0 0
3 -0 -0
7 .8
2 .1
2 2
5 -3 -0
7 9
2 2
2 2 0
3 -0 -1
11
3 .5
2 3
5 -3 -1
1 1 0
3 4
2 5 0
3 -0 -2
13
6 .5
3 5
5 -3 -2
1 4 0
5 2
4 0 0
3 -1 -0
11
3 .5
2 6
5 -3 -3
1 7 0
7 0
4 0 0
3 -1 -1
1 4
5 .6
3 6
5 -3 -4
2 1 0
7 0
4 0 0
3 -1 -2
1 7
6 .0
3 6
5 -4 -0
1 3 0
3 6
4 0 0
3 -2 -0
1 4
5 .7
3 6
5 -4 -1
1 7 0
5 8
4 0 0
3 -2 -1
17
6 .8
4 0
5 -4 -2
2 2 0
7 0
4 4 0
3 -2 -2
2 0
6 .8
4 0
5 -4 -3
2 8 0
1 0 0
7 1 0
3 -3 -0
1 7
6 .8
4 0
5 -4 -4
3 5 0
1 0 0
7 1 0
3 -3 -1
2 1
6 .8
4 0
5 -4 -5
4 3 0
1 5 0
1 1 0 0
3 -3 -2
2 4
9 .8
7 0
5 -5 -0
2 4 0
7 0
7 1 0
3 -4 -0
2 1
6 .8
4 0
5 -5 -1
3 5 0
1 0 0
1 1 0 0
3 -4 -1
2 4
9 .8
7 0
5 -5 -2
5 4 0
1 5 0
1 7 0 0
3 -5 -0
2 5
9 .8
7 0
5 -5 -3
9 2 0
2 2 0
2 6 0 0
4 -0 -0
13
4 .1
3 5
5 -5 -4
1 6 0 0
4 0 0
4 6 0 0
4 -0 -1
1 7
5 .9
3 6
5 -5 -5
4 -0 -2
2 1
6 .8
4 0
108
>
1 6 0 0
7 0 0
Tabla A .3.3
TABLA 922: HI. ndice NM P y lmites de confianza al 95% para todas las
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando son usadas diez
porciones de 10 mL (Standard Methods, 2005)
N de Tubos
Positivos (10 mL)
0
Indice
NMP/lOOmL
<
1 .1
3 .4
1 .1
0 .0 5 1
5 .9
2 .2
0 .3 7
8 .2
3 .6
0 .9 1
9 .7
5 .1
1 .6
1 3
6 .9
2 .5
1 5
9 .2
3 .3
1 9
1 2
4 .8
2 4
1 6
5 .8
3 4
2 3
8 .1
1 0
> 2 3
1 3
109
5 3
Tabla A .3.4
Estimacin de la cantidad de rhizobiosa
C a n tid a d
d e r h iz o b io s
(m , v e r f rm u la ) e s tim a d a
d ilu c io n e s
d e
s e g n
1 /1 0
(A
e l re c u e n to
Tubos positivos
n
Etapas de dilucin(es)
s =
>
2 0
4 0
d e p la n ta s in fe c ta d a s :
1 0 )*
10
1 0 8
3 9
3 8
19
6 .9
18
1 .8
3 .4
3 7
3 6
1 .0
35
17
3 4
5 .9
1 0 7
3 .1
3 3
16
3 2
s =
1 0
>
1 .7
1 .0
31
3 0
5 .8
15
2 9
14
2 8
6 .9
1 0 6
3 .1
3 .4
1 .7
1 .8
1 .0
1 .0
2 7
13
2 6
5 .8
2 5
12
2 4
2 3
2 2
11
1 .0
1 .0
5 .8
lO 3
1 0
15
14
6 .9
3 .4
1 .7
1 .8
11
10
9
4
8
7
6
5
1 .7
1 .0
1 .0
1 .0
102
5 .8
5 .8
x
3 .4
1 .7
1 .7
1 .7
1 .0
1 .0
1 .0
1 0 1
5 .8
10*
a p ro x im a d a
d e
lo s lm ite s
C o c h r a n e , B io m e tric s ,
1 0 1
3 .1
1 .7
1 .7
1 .7
1 .7
1 .0
1 .0
1 .0
5 .8
<
5 .8
3 .1
1 .7
1 .7
1 .7
1 .7
1 .0
1 .0
1 .0
0 .6
0 .6
0 .6
0 .6
< 0 .6
< 0 .6
1 0 7
V III2
1 9 5 0 , c a p . 6 , p .
5 .8
3 .1
- ) :
e l c u a d ro
1 .0
1
3 .1
1 0 5
1 0 3
c o n fia n z a * *
d e : V in c e n t. L . M .
1 .0
5 .9
3 .1
n
s e g n
6 .9
3 .1
(X ,
c a lc u la d o
1 0 2
3 .1
109
d e
7 x
1 .8
5 .8 x 1 0 '
A m p litu d
s =
>
1 0 2
3 .1
0 .6
3 .1
< 0 .6
x lO
1 .0
1 0 3
3 .1
1 .0
1 .7
5 .9
3 .1
3 .1
1 .0
1 0 3
1 .7
5 .8
3 .1
5 .8
5 .8
1 0 3
12
1 0 '1
1 .7
5 .8
13
3 .1
17
a. T o m a d o
>
3 .1
5 .8
16
* *
s =
1 .7
1 .0
18
C u a d ro
1 0 5
1 .7
19
x
3 .1
10
2 0
5 .9
1 0 5
3 .1
5 .8
21
F a c to r, 9 5 %
6 .6
3 .8
d e
F is h e r y
10 5 .
1 9 7 0
11
Y a te s
(1 9 6 3 )
M A N U A L D E M IC R O B IO LO G A A G R C O L A R H IZO B IU M , PGPRS, IN D IC A D O R ES D E F E R T IL ID A D E IN O C U ID A D
Donde:
n : cantidad de repeticiones por dilucin
s : cantidad de diluciones trabajadas
Consideraciones para la lectura de la Tabla de Estimacin de la Cantidad de
Rhizobios
1. Sumar la cantidad total de tubos positivos (presencia de nodulos) en todas las
diluciones trabajadas.
2. El nm ero obtenido en el paso anterior debe ser buscado en la columna de
tubos positivos para el n y s adecuados.
3. Calcular el nm ero de clulas de Rhizobium / g de suelo.
vxn
El buffer TBE tiene mayor capacidad de am ortiguam iento que el buffer TAE.
108 g
55 g
40 mL
1000mL
48.40 g
11.42 mL
20 mL
1000mL
ni
100 pL
1000 mL
0.5
0.7
1.0
1.2
1.5
2.0
1 .0 -3 0
0 .8 - 1 2
0 .5 - 1 0
0 .4 - 3 .0
0 .2 - 3 .0
112
O
O
1
Concentracin
de Agarosa (%)
FE DE ERRATAS
PG INA 69
DICE: Expresar los resultados en U F C /g de suelo seco (Figura 21.1).
DEBE DECIR: Expresar los resultados en U F C /g de suelo seco (Figura 22.1).
PGINA 75
DICE: Se efecta la lectura al espectrofotmetro de la solucin obtenida contra el
sobrenadante del blanco, a una longitud de onda de 485 nm (Figura 26.1).
DEBE DECIR: Se efecta la lectura al espectrofotmetro de la solucin obtenida
contra el sobrenadante del blanco, a una longitud de onda de 485 nm (Figura 26.2).
PG INA 92
DICE: Incubar las placas de agar xilosa Usina desoxicolato (XLD) a 35 - 37 C
durante 48 h. Las colonias tpicas de Salmonella son del mismo color que el medio
de cultivo, transparentes, a veces con centros negros (Figura 29.1).
DEBE DECIR: Incubar las placas de agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) a 35
- 37 C durante 48 h. Las colonias tpicas de Salmonella son del mismo color que el
medio de cultivo, transparentes, a veces con centros negros (Figura 30.1).
* H O a VIN'EAV
jm
s\ Ws EDIAGRARIA
'S > o
v i*1*
9 786124
147043