1

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE
BIOLOGIA EN ACUICULTURA

SEGUNDO PROGRAMA DE TITULACION EXTRAORDINARIA EN

BIOLOGIA EN ACUICULTURA MEDIANTE CURSO DE TITULACION

PROYECTO DE INVESTIGACION
Influencia de la longitud de onda, intermitencia lumnica y aceite de pescado
en la produccin de -caroteno y crecimiento de
Dunaliella salina , en cultivos batch

Autores:
Bach. Juan Salinas Casana
Bach. Narda del Roco Villena Delgado

Nuevo Chimbote Per

2006

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE
BIOLOGIA EN ACUICULTURA

PROYECTO DE INVESTIGACION
Influencia de la longitud de onda, intermitencia lumnica y aceite de pescado
en la produccin de -caroteno y crecimiento de
Dunaliella salina , en cultivos batch

Autores:
Bach. Juan Salinas Casana
Bach. Narda del Roco Villena Delgado
El presente proyecto fue aprobado por el siguiente Jurado Calificador:

____________________________
Ms. ngel Castro Alvarado

____________________________
Ms. Fernando Merino Moya

____________________________
Ms. Orlinda Villanueva

PROYECTO DE INVESTIGACION
Influencia de la longitud de onda, intermitencia lumnica y aceite de pescado
en la produccin de -caroteno y crecimiento de
Dunaliella salina , en cultivos batch

El presente proyecto fue revisado y avalado por el Asesor de Tesis:

_____________________________
MS. ngel Castro Alvarado

AGRADECIMIENTOS

A la Bach. Katherine Giannize Guerrero Medina, por su participacin en

la elaboracin y planificacin del presente documento.

Al M en C William Capa Robles, por su valiosa colaboracin en la

obtencin de bibliografa.

DEDICATORIA

A mi querida madre Isabel

Por su valioso apoyo en toda
Mi formacin profesional.

A mi chinito feo pero lindo

Padre de mi hijo, actor en
Mis pesadillas.

6
PRESENTACION

Las investigaciones recientes se centran en la mxima utilizacin del

quantum de luz, el cual se justifica debido al alto valor monetario que tiene
determinados biocompuestos como el -caroteno. La especie Dunaliella sp.
es cultivada con el fin de sintetizar este pigmento, su cultivo debe ejecutarse
en dos etapas: 1.- En condiciones optimas para generar biomasa y 2.- En
condiciones de stress para sintetizar -caroteno. En el presente trabajo se
analiza

el

efecto

de

la

luz

intermitente,

aceite

de

pescado

luz

monocromtica en la sntesis de -caroteno, as como en el crecimiento de

Dunaliella salina .

Autores:

Bach. Juan Salinas Casana

Bach. Narda del Roco Villena Delgado

7
PROYECTO DE TESIS

I.

GENERALIDADES:
1. TITULO:

Influencia de la longitud de onda, intermitencia lumnica y

aceite

de

pescado

en

la

produccin

de

-caroteno

crecimiento de Dunaliella salina , en cultivos batch.

2. PERSONAL INVESTIGADOR:
2.1. Investigador:
2.1.1. Nombre:

Juan Salinas Casana .

2.1.2. Grado Acadmico: Bachiller en Ciencias de Biologa en

Acuicultura.
2.1.3. Direccin :

Av. Aviacin 437 Pueblo Libre,

Chimbote.

2.2. Investigador:
2.2.1. Nombre:

Narda del Roco Villena Delgado

2.2.2. Grado Acadmico: Bachiller en Ciencias de Biologa en

Acuicultura.
2.2.3. Direccin :

Urb. Bellamar A-10, Nuevo Chimbote.

3. TIPO DE INVESTIGACION:
3.1. Por su finalidad: Aplicada.
3.2. Por su tcnica de contrastacin: Experimental.
4. INSTITUCION DONDE SE DESARROLLARA EL PROYECTO:
Universidad Nacional del Santa
Laboratorio de Cultivos Auxiliares

8
5. CRONOGRAMA DE TRABAJO:
MES ES
ETAPAS
5.1.
5.2.
5.3.
5.4.

P rel im i nar
R ecol ecci n de dat os
Anl i si s de dat os
El aboraci n de i nform e

X
X

6. RECURSOS:
6.1. Personal:
6.1.1. Personal Investigador:
Bach. Juan Salinas Casana
Bach. Narda del Roco Villena Delgado
6.1.2. Personal Asesor:
Ms. ngel Castro Alvarado
6.2. Materiales:
6.2.1. Material de Oficina:
- Un (01) millar de papel bond A-4
- Un (01) millar de papel peridico oficio
- Diez (10) lapiceros
- Dos (02) cuadernos de 100 hojas
- Cuatro (04) disquetes para computadora HD-3
- Un (01) cuadernillo de papel milimetrado
- Un (01) CD-RW
6.2.2. Material de laboratorio
- Un (01) blower
- Un (01) espectrofotmetro
- Una (01) centrfuga
- Una (01) balanza electrnica
- Un (01) agitador magntico
- Un (01) microscopio compuesto
- Una (01) cmara de Newbauer
- Una (01) caja de laminillas porta objetos
- Una (01) caja de laminillas cubre objetos

9
- Una (01) estufa iluminada
- Tres (03) pipetas de 5 ml
- Diez (10) pipetas de 1 ml
- Una (01) probeta de 1000 ml
- Diez (10) tubos de ensayo
- Cinco (05) placas Petri
- Cinco (05) vasos de precipitacin de 25 ml
- Cinco (05) vasos de precipitacin de 100 ml
- Dos (02) goteros
- Dos (02) pizetas
- Un (01) set de nutrientes para Dunaliella salina por 100
litros de cultivo
6.2.3. Material fotogrfico:
- Dos (02) rollos de pelcula fotogrfica x 36
- Dos (02) rollos de slide x 36
6.2.4. Material para la construccin de estructuras:
- Un (01) filtro de carbn activado (filtroplas, paso 2)
- Doce (12) focos reflectores de 60 Watt
- Un (01) circuito electrnico
- Diez (10) metros de plstico de polietileno
- Diez (10) metros de manguera venoclisis
- Diez (10) tes para manguera de venoclisis
- Diez (10) vlvulas para manguera venoclisis
- Ocho (08) sockets de porcelana
- Cinco (05) interruptores
- Tres (03) tubos de plstico PVC de 1 x 5m
- Diez (10) tes de PVC de 1
- Diez (10) codos de PVC de 1

6.3. Servicios:

10
- Servicio de procesamiento automtico de datos
- Servicio de fotocopiado x 1000 copias
- Servicio de impresin de informe
- Servicio de encuadernacin del informe
- Servicio de anlisis cromatografico
7. PRESUPUESTO Y FINANCIAMIENTO:
PARTIDA
03.11.00
03.11.49
03.11.46
03.11.96
03.11.53
03.11.97
03.11.00
03.11.34
03.11.27
03.11.39

DES CRIPCI N
BIE NE S
Mat eri al de ofi ci na
Mat eri al de l aborat ori o
Mat eri al fot ogrfi co
Mat eri al para estructuras
Ot ros
S UB TOTAL (S / .)
SE RVICIO S
S ervi ci o de procesam i ent o de dat os
S ervi ci os no personal es
Ot ros
S UB TOTAL (S / .)
TOTAL (S / .)

Cambio del dlar: 3,21 nuevos soles.

UNS

OT RO S
70,00

S UB TOTAL
(S/ .)

14000,00

100,00
600,00
200,00
970,00

70,00
14000,00
100,00
600,00
200,00
14970,00

14000,00

300,00
600,00
200,00
1100,00
2070,00

300,00
600,00
200,00
1100,00
16070,00

14000,00

11
II.

PLAN DE INVESTIGACION:
1.

ANTECEDENTES, JUSTIFICACION E IMPORTANCIA

DEL PROBLEMA:
La humanidad es cada vez ms conciente de que los recursos
naturales no son ilimitados. Aunque los ecosistemas terrestres son
muy eficientes y potencialmente renovables; no obstante, pueden
sufrir un fuerte desequilibrio si el hombre acta desmedidamente
(MARGALEF,

1977;

RUSSELL-HUNTER,

1973;

SUTTON

&

HARMON, 1991). As lo ilustr TRESIERRA et al. (1994) con

respecto

explotacin

la

anchoveta

trajo

una

peruana

fuerte

Engraulis

deplecin

del

ringers
recurso

cuya
con

consecuencias funestas para la economa peruana.

Los gobiernos no son ajenos al problema de la ecologa
mundial, como lo revela el protocolo de Montreal de 1987
referente a la eliminacin de los clorofluorocarbonos y la Cumbre
de la Tierra de 1992 en la que se redactaron dos documentos: la
Declaracin de Ro y la Agenda 21, que contiene directrices
para

que

las

naciones

consigan

un

desarrollo

sostenible

(AWAKE, 1996). A pesar de estos dos importantes acuerdos, la

reciente publicacin Living Planet Index presentado por el Fondo
Mundial para la Naturaleza revela que se ha destruido el 30% del
medio marino la cual se refleja en la escasez de especies como el
atn del Atlntico y la tortuga lad en aguas asiticas. El ndice de
ecosistemas de agua dulce ha descendido en un 50% debido a la
contaminacin agrcola e industrial, as como al gran aumento del
consumo de agua (AWAKE, 1999).
Debido a que las actividades humanas domsticas e industriales
son en su mayora de tipo extractiva y consumista, se ocasionaron
los problemas descritos anteriormente. Frente a esta situacin la
acuicultura

surge

como

una

actividad

comercial

de

ndole

productiva, que pretende suplir lo que las actividades extractivas,

no logran satisfacer. En 1988 del total de productos acucolas

12
comercializados el 15% provena de la acuicultura. ALBENTOSA
en 1991 report que la pesca aumenta en un 0,3% anual, mientras
que la acuicultura aumenta en un 5,5% anual, cantidad que tiende a
crecer cada ao.
De acuerdo a los taxones la acuicultura produjo (1991) en peces
un 7% en crustceos un 4%, en algas un 75% y en moluscos un
79% en comparacin a la pesca (ALBENTOSA, 1991). Esto
muestra claramente que las algas y los moluscos tienen una mayor
tasa comparativa en produccin con respecto a la pesca. En gran
parte se debe a que los bancos naturales de algas y moluscos se
encuentran en su mayora restringidos a las zonas costeras
arenosas y rocosas (DAWES, 1991; MARGALEF, 1977; VEGAS,
1971). Esta situacin permitir que la industria productiva de algas
y moluscos aumente a medida que incremente la demanda de estos
organismos o sus derivados.
Con respecto a las algas, desde el ao 2700 a.c. eran explotadas
en el lejano oriente como fuente directa de alimento, fines
medicinales, forraje, fertilizantes y sales, ficocoloides, en la
produccin de papel, o como fuente de metano combustible
(ACLETO, 1986; DAWES,1986) y actualmente se conocen ms de
400 formas de utilizacin de las algas (CAMARA, 1982).
Las microalgas tambin son usadas como alimento vivo para
numerosos organismos acuticos tales como Artemia, Brachionus,
larvas de Argopecten purpuratus , larvas de Ostrea y Crassostrea y
alevinos de distintos peces (BARNABE, 1991; BOROWITZKA,
1993; DHERT & SORGELOOS, 1995; HEPHER, 1993; IVERSEN,
1982; MARTINEZ, 1987; MORALES, 1989; NAYAR et al., 1998;
RADMER

&

PARKER,

1994;

SORGELOOS

et

al.,

1994;

STEFFENS, 1987). Tambin tiene uso en la alimentacin humana

debido al alto contenido proteico en algunas especies, al contenido
de grasas poliinsaturadas, al contenido de antioxidantes y al poder

13
anticancergeno (RODRIGUEZ, 1986; DAVISON et al., 1993;
PALOZZA & KRINSKY, 1992; PALOZZA et al., 1992).
Son

muchos

los

esfuerzos

cientficos

por

aumentar

la

produccin microalgal bajo sistemas controlados. Para lograr esto

se investig la dinmica poblacional de las microalgas, lo cual
permiti conocer que hace que determinadas especies abunden ms
que otras (KWANDRANS et al., 1998; LOMAS & GLIBERT, 2000;
MARGALEF, 1977; REGAN & IVANCIC, 1983; RINGUELET,
1962; RUSELL-HUNTER, 1973; SUTTON & HARMON, 1991;
WETZEL, 1981). Tambin, se han realizado muchos estudios
destinados a conocer el efecto de los micronutrientes en la
produccin masiva microalgal a fin de generar una tecnologa que
sea

factible

econmicamente

(ADMIRAAL

et

al.,

1987;

BRZEZINSKI & CONLEY, 1994; HEPHER, 1983; MARTINEZ,

1987;

QAFAITI

&

STEPHENS,

1989;

ROOSLER,

1988;

STEFFENS, 1987; VRIELING et al., 1999).

En las ltimas dcadas, la biotecnologa microalgal a hecho
grandes avances en relacin al cultivo de especies destinadas a la
obtencin de biomolculas de alto valor agregado. As, algunas
algas cuyas concentraciones de molculas son de inters se estn
produciendo comercialmente a nivel mundial, sobresaliendo los
gneros

Dunaliella,

Spirulina,

Porphyridium,

Botriococus,

Isochrysis, Chlorella y Hematococus (CIFUENTES et al., 1995;

PANIAGUA-MICHEL & SASSON, 1995; UKELES, 1976).
La

demanda

por

ficomolculas

de

inters

industrial

est

dominada principalmente por coloides, cidos grasos, sustancias

farmacodinmicas, aminocidos y pigmentos. Con respecto a los
pigmentos, los carotenos son uno de los que mayor demanda
presenta. Estos pigmentos, cuyos precios oscilan segn SIGMA
CHEMICAL COMPANY (1982) entre 1250 y 1400 dlares por Kg,
debe su nombre a Daucus carota comnmente conocida como
zanahoria, de donde se deriva la palabra caroteno (HENRIQUES

14
et al., 1998). Los carotenos se encuentran bsicamente en todo
organismo vivo, desde las unicelulares hasta el ser humano
(GOODWIN, 1984). En la ltima dcada, estos pigmentos han
adquirido un papel relevante en la nutricin y medicina; siendo los
productores dominantes las firmas comerciales ROCHE y BASF, en
el Per no se produce comercialmente esta molcula. Se utiliza
como precursor de la vitamina A, como antioxidante el cual se
piensa cumple una funcin sinrgica con las vitaminas C y E, como
anticancergeno, entre otros usos y aplicaciones (DAVISON et al.,
1993; HENRIQUES et al., 1998; PALOZZA & KRINSKY, 1992;
PALOZZA et al., 1992). En acuicultura causa pigmentacin en
peces, moluscos y crustceos la cual repercute en la apariencia,
aceptacin y precio de estos organismos (CHIEN & JENG, 1992;
D'ABRAMO et al., 1983; GARCIA et al., 2003; SOMMER et al.,
1991).
Debido al alto potencial nutritivo se han realizado numerosos
estudios destinados a la biosntesis de pigmentos (ABE et al.,
1999; CASTRO et al., 2000; CASTRO et al., 2003; GRUNEWALD
& HAGEN, 2001; HAGEN et al., 2001; LIU & LEE, 2000;
LUBIAN et al., 2000; MASOJIDEK et al., 2000; RENSTRM &
LIAAEN-JENSEN, 1981). De stos, se determin que las especies
Dunaliella salinas y Dunaliella bardawil son las microalgas que
acumulan gran cantidad de carotenos cuando son sometidos a altas
radiaciones, elevadas concentraciones salinas y deficiencia de
fuentes de nitrgeno (BEN-AMOTZ & AVRON, 1990; BENAMOTZ et al., 1991; BEN-AMOTZ, 1996; BOROWITZKA et al.,
1990; BOROWITZKA, 1991; FABREGAS et al., 1989; FABREGAS
et al., 1995; HENRIQUES et al., 1998; LEBOULANGER et al.,
1998;

MENDOZA

et

al.,

1996;

MENDOZA

et

al.,

1999;

PANIAGUA-MICHEL & SASSON, 1995).

Actualmente se viene investigando los factores fsicos tales
como el uso de fotobiorreactores (CHINI et al., 2000; ERIKSEN et

15
al., 1998; MULLER-FEUGA et al., 1998; OLGUIN & OLMOS,
1999; RICHMOND & CHENG-WU, 2001), el efecto de la radiacin
en la microalga (BROWN et al., 1993; FAN et al., 1994;
TOMASELLI et al., 1997), la radiacin ultravioleta (BUMA et al.,
2000; HAZZARD et al., 1997; PELLE et al., 1990), entre otros
parmetros con el objetivo de optimizar la utilizacin del quantum
de luz, produccin de carotenos y crecimiento.
Comnmente el cultivo de Dunaliella sp. con fines de producir
carotenos se realiza en dos etapas: 1) Cultivo en condiciones
ptimas a fin de lograr la mayor produccin de biomasa y 2)
exposicin a condiciones extremas (salinidad, irradiancia, etc.)
para lograr una mayor sntesis de carotenos. BOROWITZKA &
BOROWITZKA (1988 in PANIAGUA-MICHEL & SASSON, 1995)
proponen un sistema esttico o semicontinuo a una salinidad
intermedia suboptima, tanto para el crecimiento como para la
sntesis de carotenos. No obstante, el tiempo requerido a fin de
alcanzar las concentraciones de carotenos adecuadas podra ser una
limitante para fines comerciales.
OGBONNA & TANAKA (2000), llegaron a la conclusin que el
cultivo

en

condiciones

heterotrficas

secuencialmente

con

condiciones fotoautotrficas pueden ser usadas para la produccin

de

metabolitos

celulares,

pero

estos

dependen

de

una

alta

eficiencia de conversin de luz de las algas y de un balance entre

metabolismo fotoautotrfico y heterotrfico.
Referente a la conversin de luz se ha encontrado que la
intermitencia

de

luz/oscuridad

incrementa

la

eficiencia

de

utilizacin de luz (BERND & KROON, 1994; JANSSEN et al.,

2000; OGBONNA & TANAKA, 2000; ZOU & RICHMOND, 2000).
JANSSEN et al. (2000) encontraron en Dunaliella tertiolecta una
respuesta similar a los reportados por los investigadores citados
anteriormente. Con respecto a esto GROBBELAAR (2000) report

16
que

la

tasa

fotosinttica

exponencialmente

con

el

de

las

microalgas

incremento

de

la

se

incrementa

intermitencia

de

luz/oscuridad en el rango 0,05-5000 Hertz, dependiendo del estado

de aclimatacin del alga a la luz, la historia lumnica y las
caractersticas de respiracin (metabolismo) intrnsecas del alga.
Adicionalmente,

MARSHALL

(1991)

menciona

que

el

fitoplancton presenta un fenmeno llamado adaptacin cromtica

complementaria, en la que la proporcin de pigmentos accesorios
vara de acuerdo a la longitud de onda dominante. Se han hecho
estudios que muestran que determinadas longitudes de onda, tanto
del

espectro

visible

como

invisible

(BUMA

et

al.,

2000,

HAZZARD et al., 1997), favorece la sntesis de -caroteno entre

otros pigmentos, tales como la luz ultravioleta (200-300 nm) y
entre el rojo y el verde (400-500 nm). As mismo NAKAJIMA &
UEDA

(1997),

determinaron

que

la

reduccin

de

algunos

pigmentos luminosos no reduce la tasa fotosinttica, por el

contrario presenta una alta productividad fotosinttica.
En cuanto al uso de sustratos orgnicos, tales como cido
actico, lpidos, harina y aceite de pescado entre otros, tambin se
observa que favorece tanto el crecimiento como la carotenognesis
(CASTRO et al., 2001; MERINO, 1999). CASTRO et al. (2002)
encontraron que al adicionar 1 ml de aceite de pescado, al inicio de
la fase estacionaria como fuente de carbono, incrementaba la
produccin de los carotenos debido a que favoreca la ruta
metablica de la sntesis de carotenos, probablemente por la
presencia de acido oleico en el aceite de pescado.
Teniendo como marco referencial lo expuesto anteriormente y
pretendiendo abarcar solo una pequea parte de la problemtica de
la produccin de carotenos, es que se propone estudiar la
influencia de la longitud de onda, intermitencia lumnica y aceite
de pescado en la produccin de -caroteno y crecimiento en

17
Dunaliella salina proveniente de una cepa del humedal de
Villamara en Chimbote-Per (LOAYZA et al., 2002; LOAYZA,
2002).
2. OBJETIVOS:
2.1. OBJETIVO GENERAL:
Evaluar

la

produccin

de

-caroteno

crecimiento

en

Dunaliella salina mediante la variacin de la longitud de

onda, intermitencia lumnica y aceite de pescado.
2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS:
- Determinar la influencia de la longitud de onda (450 nm,
480 nm,

550 nm) en la produccin

de -caroteno

crecimiento.
- Determinar la influencia de la intermitencia lumnica (10
hertz, 505 hertz, 1000 hertz) en la produccin de -caroteno
y crecimiento.
- Determinar la influencia de la concentracin de aceite de
pescado (0,5 ml, 1,0 ml, 1,5 ml por litro de cultivo) en la
produccin de -caroteno y crecimiento.
- Determinar la velocidad de crecimiento (=da - 1 )
- Determinar la productividad volumtrica del -caroteno
(Qp= mg/l caroteno x da l - 1 ).
3. PROBLEMA:
Cul es la influencia de la longitud de onda, intermitencia
lumnica y concentracin de aceite de pescado en la produccin de
-caroteno y crecimiento en Dunaliella salina ?
4. HIPOTESIS:
Se lograr una mayor produccin de -caroteno a 480 nm de
longitud de onda y 505 hertz de intermitencia lumnica y 1,0 ml de
aceite de pescado.
Variables independientes:
-

Longitud de onda (450 nm, 480 nm, 550 nm)

18
-

Intermitencia lumnica (10 Hz, 505 Hz, 1000 Hz)

Aceite de pescado (0,5 ml, 1,0 ml, 1,5 ml)

Variables dependientes:
-

Concentracin de -caroteno (mg l - 1 )

Crecimiento (cel l - 1 )

Velocidad de crecimiento (da - 1 )

Productividad volumtrica (mg -caroteno x da - 1 )

5. DISEO EXPERIMENTAL:
Se aplicar el programa SUPERFICIE RESPUESTA usando un
diseo factorial de 3 variables: longitud de onda (L), intermitencia
lumnica

(Hz)

y aceite

de pescado

(C), con dos

variables

respuestas: productividad volumtrica y velocidad de crecimiento;

con dos puntos centrales.
FV
A en b 1

GL
a-1

SC
SCA(b 1 )

CM
MSE

RAZON
Fo=CM/MSE

A en b 2

a-1

SCA(b 2 )

MSE

Fo=CM/MSE

A en b 3

a-1

SCA(b 3 )

MSE

Fo=CM/MSE

B en a 1

a-1

SCB(a 1 )

MSE

Fo=CM/MSE

B en a 2

a-1

SCB(a 2 )

MSE

Fo=CM/MSE

B en a 3

a-1

SCB(a 3 )

MSE

Fo=CM/MSE

a-b(n-1)
a.b(n-1)

SSE

error
TOTAL
El

nivel

de

significancia

(P0,05)

entre

tratamientos

se

determinara aplicando un anlisis a posteriori a travs de la prueba

de Tukey segn recomienda STEEL & TORRIE (1984). Las
corridas experimentales a ejecutar ser segn lo determina el
programa SUPERFICIE RESPUESTA :

E xp e r i m e n t o
1
2

C o n s t i t u ye n t e
Hz

-1

-1

+1

+1

19
3

+1

+1

-1

-1

+1

+1

-1

-1

+1

-1

+1

+1

+1

-1

10

-1

11

12

-1

-1

-1

13

+1

-1

+1

14

-1

+1

+1

15

+1

16

-1

Longitud de onda (L):

Aceite de pescado (C):

-1 = 450 nm

-1 = 0,5 ml

+1 = 550 nm

+1 = 1,5 ml

0 = 480 nm

0 = 1,0 ml

Intermitencia lumnica (Hz):

-1 = 10 Hertz
+1 = 505 Hertz
0 = 1000 Hertz
6. ESTRATEGIA DE TRABAJO:
6.1. CEPA DE CULTIVO:
La cepa de Dunaliella salina ser obtenida del humedal de
Villamara (Chimbote, Per). Para la obtencin de un
cultivo

puro,

se

usar

medio

de

cultivo

slido

ms

estreptomicina (25 mg l - 1 ) y se aplicar la tcnica de las

estras (GUILLARD, 1973).

6.2. MEDIO DE CULTIVO:

Durante todo el proceso de investigacin, incluidos el
mantenimiento de la cepa, obtencin de inculo y el cultivo

20
experimental se utilizar el medio de cultivo recomendado por
CASTRO et al. (2000), el cual contiene lo siguiente:
g l -1
9,98

Nu tri en tes
NaHC O 3
(NH 4 ) 2 S O 4

0,34*

K 2 HP O 4

0,015

C l 2 Mg.10H 2 O

0,065

FeS O 4 .7H 2 O

0,020

ZnS O 4 .7H 2 O

2,6 x 10 - 4

NaC l

50

El medio de cultivo fue diseado para obtener una biomasa

final de 1 g l - 1 en peso seco.
* La fuente nitrogenada ser el nutriente limitante.
Este medio ser ajustado a pH 5,0 con cido clorhdrico 1N
previo a la esterilizacin, luego se pasar a la autoclave a
121 C y 1,05 Kg cm - 2 por 15 minutos. Se dejar en reposo 24
horas y se ajustar a pH 8,0 agregando NaOH 0,1N (CICESE,
s/f).
Se usar agua destilada el cual contendr estreptomicina 25
mg l - 1 segn lo recomienda GONZALEZ et al. (1995), a fin de
prevenir la contaminacin por algas verde-azules.
6.3. OBTENCION DE INOCULO:
Una vez purificada la cepa de cultivo se usar el medio de
cultivo

descrito

anteriormente

para

obtener

el

inculo

adecuado para el cultivo experimental. Para ello se usarn

inicialmente vasos de precipitacin de 25 ml y luego de 100
ml conteniendo agua destilada con estreptomicina (25 mg l - 1 ),
que estarn bajo iluminacin (fluorescente de luz blanca),
aireacin (blower) y agitacin (agitador magntico) constante.
Para la aireacin se utilizar un blower de HP. Antes del
ingreso del aire al sistema de cultivo, pasar por un filtro de

21
carbn activado (495 cm 3 ) de la firma comercial Rotoplas
(filtroplas, paso2) aprobado por la FDA (ver fig. 1). El
burbujeo de aire ser de 200 ml min - 1 . Una vez alcanzada la
fase

exponencial

ser

usado

el

volumen

como

inculo

requerido (25% v/v) para el cultivo experimental.

Fi g. 1.

Si st em a de cul ti vo para l a obt enci n de i nocul o. 1.Com prensora, 2.- Fi l t ro de carbn act i vado, 3.- Vaso de
preci pi t aci n con el m edi o de cul t i vo, 4.- Tubo
fl uorescent e.

6.4. SISTEMA DE CULTIVO EXPERIMENTAL:

La unidad experimental estar

constituida por mangas de

polipropileno de 2,0 l de capacidad, con 1,0 l de medio de

cultivo lquido (incluido el inculo) y se realizar por
triplicado, mediante cultivos batch.
Se agitar constantemente la suspensin algal mediante
burbujeo de aire procedente de un blower de HP, a razn de
200 ml min - 1 . El aire ser filtrado por un sistema de carbn
activado recomendado por PANIAGUA-MICHEL (1995).
Para

la

iluminacin

monocromtica

se

usar

focos

reflectores (General Electric) de 60 Watts de color violeta,

azul y verde correspondiente a la longitud de onda indicada.
La intermitencia lumnica ser controlada por un circuito
electrnico diseado con ese fin. La figura 2 esquematiza el
sistema de cultivo para esta fase de la investigacin.

22

2
3

Fi g. 2. S ist em a de cul t i vo del ex peri m ent o. 1.- C om prensora; 2.Mangas de poli et i l eno; 3.- Focos refl e ct ores; 4.- Ci rcui t o
el ect rni co; 5.- C ubi ert a ai sl adora de l uz nat ural .

6.5. OBTENCION DE MUESTRAS:

Cada 8 horas se efectuar un conteo del crecimiento para
cada una de las replicas, las muestras se inmovilizarn con
solucin de lugol, se usarn una cmara Newbauer y un
microscopio

binocular.

Las

velocidades

de

crecimiento

especfico () sern calculadas usando datos de la fase

exponencial de la curva de crecimiento, segn GUILLARD
(1973). Con la informacin obtenida, se construir las curvas
de crecimiento y se determinar la velocidad de crecimiento
especfica (da - 1 ).
El contenido de -caroteno se determinar centrifugando
20 ml a 4000 rpm durante 10 min a 15 C por cada repeticin
cada 24 horas. Se eliminar el sobrenadante y se agregar de 3
a 4 ml de acetona grado HPLC y se macerar con varilla de
vidrio utilizando un bao con hielo por la friccin del vidrio,
luego se transferir a un tubo con tapa de rosca y se dejar
reposar a -20 C durante 24 h cubierto con papel de aluminio.
Luego se transferir a una temperatura de 10 C y se dejar
reposar hasta alcanzar esta temperatura, posteriormente se
centrifugar a 4000 rpm, durante 20 min a 10 C el
sobrenadante se colocar en un vial eppendorf para su

23
posterior anlisis por HPLC (IBARRA & HERNANDEZ,
2004).

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Anexo
Tabla 01: Registro diario de la temperatura.
FECHA
TEMPERATURA
07:00
T ambiental
T agua
T ambiental
T agua
T ambiental
T agua

15:00

23:00

37
T ambiental
T agua
T ambiental
T agua
T ambiental
T agua
T ambiental
T agua
T ambiental
T agua
T ambiental
T agua
T ambiental
T agua
T ambiental
T agua
T ambiental
T agua
T ambiental
T agua
T ambiental
T agua
T ambiental
T agua
T ambiental
T agua
T ambiental
T agua
T ambiental
T agua
T ambiental
T agua
T ambiental
T agua
T ambiental
T agua
Tabla 02: Registro diario de la concentracin celular (cel/ml).
EXPERIMENTO
07:00
15:00
Rep.1
Rep. 2
Rep. 1
Rep. 2
1
2
3
4
5
6
7

23:00
Rep. 1
Rep. 2

38
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Tabla 03: Registro de la concentracin de -caroteno.
FECHA
EXP.
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