Construccin curva de calibrado de clulas Peso seco

Para la curva de calibrado de peso seco, se debe realizar haciendo una correlacin con la
turbidimetra, es decir, se realiza la turbidimetra, y con sta misma muestra se realiza la
determinacin de peso seco. As se obtiene una grfica que relaciona el peso seco con la
turbidimetra, dando una idea de lo que se debera obtener en el cultivo de E. coli.
Turbidimetra:
El mtodo de turbidimetra se utiliza para la determinacin de la biomasa celular y se caracteriza
por ser rpido y til. Se basa en que cuando un haz de luz paralelo golpea una partcula en
suspensin, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es
transmitida, la turbidimetra cuantifica la luz residual transmitida mediante el uso de un
espectrofotmetro. La turbidimetra se realiza usualmente en la regin de 600 a 700 nm donde la
absorcin de luz por parte de las clulas es mnima.
En un espectrofotmetro la linealidad de los datos obtenidos se mantiene entre las 0.2 a 1.0
unidades de absorbancia (1 unidad de absorbancia 0.5 g L-1 de clula). Sin embargo, esta
relacin debe ser confirmada para cada experimento por cuando depende del color del caldo y del
tamao y forma de las clulas. La conversin de unidades de absorbancia a masa de ulula seca
debe ser tratada con cuidado. Al respecto, estudios tericos y experimentales han demostrado que
soluciones diluidas de diferentes tipos de microorganismos, independientemente del tamao
celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentracin de peso seco. Esto quiere
decir que en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco,
independientemente del tamao celular del microorganismo. Sin embargo, se encuentran
absorbancias muy diferentes para clulas microbianas de distintos tamaos. Por esta razn, para
estimar la biomasa de microorganismos totales en una suspensin se debe realizarse una "curva
de calibracin" para cada tipo de microorganismo, slo de esta forma es posible relacionar la
absorbancia con la biomasa de microorganismos totales. (BRIAN MCNEIL, 2008)
Determinacin de la concentracin de sustrato
Para esta experiencia se utilizar el mtodo del DNS, el cual se basa en la reaccin del reactivo
DNS (Dinitrosaliclico) con azcares reductores, lo que resulta en la formacin de un compuesto de
color amarillo cuya densidad ptica es proporcional a la concentracin de grupos reductores.
(Instituto Vasco De Investigacion Y Desarrollo Rural, 2008) (Universidad de Valencia, 2006)
Preparacin del reactivo DNS
Disolver 4 g de NaOH en 125 mL de agua destilada en un vaso de precipitado de
500mL.
Adicionar 75 g de tartrato de sodio y potasio.
Agregar lentamente 2.5 g de cido Dinitrosaliclico, agitando bajo calentamiento.
Aforar a 250 mL con agua destilada.
Almacenar a temperatura ambiente protegido de la luz.
Determinacin de la concentracin de azucares:
Agregar 1 mL de reactivo DNS a una muestra de volumen conocido en un tubo de ensayo
con tapa.
Llevar a bao con agua en ebullicin durante 5 min.
Enfriar rpidamente en un bao de hielo.
Agregar 10 mL de agua destilada y dejar reposar por 15 min.
Leer la densidad ptica a 540 nm, contra un blanco de 1 mL de agua destilada.
Construccin de Curva de Calibrado DNS
Se realizaran diluciones seriadas de glucosa tomando en un tubo de ensayo tomando primero un
blanco de 0 ml de glucosa y 10 de agua destilada, luego, 1 ml de Energtica y 9 de agua destilada
hasta llegar a un tubo con solo 10 ml de Energtica. (Las diluciones pueden variar segn la
concentracin inicial de azucares en la Bebida Energtica, la cual se determinara en un inicio)

Reactivos
Medio LB
NaOH
Tartrato de sodio y potasio
cido Dinitrosaliclico
Glucosa
KH2PO4
Na2HPO4 anhidro
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Agua destilada
Hielo

Materiales
3 vasos de precipitado de 500 mL.
1 matraz Erlenmeyer 500ml
1 matraz aforo 100 ml
3 matraz aforo 500 ml
Petris o capsula (para peso-seco)
Pipetas (1ml, 5 ml, 10ml)
Pro-pipetas
Papel filtro (para peso-seco)
Esptula
Papel aluminio
Maskin tape
PLASTICO PARA SELLAR, NO ME ACUERDO EL NOMBRE
Equipo
- Agitador magntico y temperatura
- Balanza analtica
- Espectrofotmetro (con cubetas)
- Estufa de incubacin (para peso-seco)
- Autoclave
- Reactor
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