Sunteți pe pagina 1din 43

UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE

"GRIGORE T. POPA" IAI


FACULTATEA DE MEDICIN

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

STUDIU PRIVIND REZISTENA PRIN


METALO-BETA-LACTAMAZE LA TULPINI DE
BACILI GRAM-NEGATIVI IZOLATE N
NORD-ESTUL ROMNIEI

Conductor de doctorat
Prof. Univ. Dr. Luminia Smaranda Iancu
Doctorand
Ana Irina Vornicu (Mereu)
IAI
2013

CUPRINS
PARTEA GENERAL
1. Rezistena la carbapeneme.............................................
1.1. Scurt istoric.................................................................
1.2. Carbapenemele.......................................................
1.3. Mecanisme de rezisten la carbapeneme...............
2. Metalo--lactamazele.....................................................
2.1. Clasificarea metalo--lactamazelor........................
2.2. Metalo--lactamazele cromosomale.......................
2.3. Metalo--lactamazele transferabile.........................
2.4. Biochimia metalo--lactamazelor...........................
2.5. Metode de detectare a metalo--lactamazelor........
2.6. Inhibitorii de metalo--lactamaze...........................
2.7. Epidemiologia metalo--lactamazelor....................
2.8. Terapia infeciilor cu bacterii productoare de
metalo--lactamaze................................................
2.9. Concluzii.................................................................
PARTEA PERSONAL
Motivaia, scopul i obiectivele studiului doctoral.......
3. Material i metode......................................................
3.1. Selecia tulpinilor bacteriene...............................
3.2. Testarea sensibilitii la antibiotice.....................
3.3. Metode fenotipice de screening pentru
producerea de metalo--lactamaze.....................
3.4. Izolarea i purificarea ADN bacterian................
3.5. Detectarea prin PCR a genelor pentru
metalo--lactamaze.............................................
3.6. Determinarea spectrofotometric a activitii
enzimatice...........................................................
3.7. Investigarea suportului genetic al genelor pentru
metalo--lactamaze..........................................................
3.8. Metode de tipare molecular...............................
3.9. Analiza statistic.................................................
4. Rezultate....................................................................

1
1
2
3
3
3
6
7
32
33
37
37
39
40
41
42
42
44
47
52
56
63
65
71
76
77

4.1. Tulpinile bacteriene............................................


4.2. Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor studiate.
4.3. Performana detectrii fenotipice a
metalo--lactamazelor.........................................
4.4. Izolarea i purificarea ADN bacterian................
4.5. Genele pentru metalo--lactamaze.....................
4.6. Confirmarea producerii de metalo--lactamaze..
4.7. Suportul genetic al genelor pentru
metalo--lactamaze.............................................
4.8. Relaiile epidemiologice dintre izolatele
productoare de metalo--lactamaze..................
5. Discuii.......................................................................
5.1. Sensibilitatea la antibiotice.................................
5.2. Screening-ul fenotipic pentru producerea de
metalo--lactamaze............................................
5.3. Frecvena rezistenei prin metalo--lactamaze...
5.4. Caracteristicile integronilor de clas 1 asociai genelor
pentru metalo--lactamaze..............................................
5.5. Diseminarea genelor pentru metalo--lactamaze
la tulpinile studiate.............................................
6. Concluzii generale. Gradul de originalitate.
Perspective de cercetare.............................................
Bibliografie ...................................................................

77
77
84
88
90
98
99
103
108
108
113
115
121
123
126
128

Abrevieri
AIM
AK
AMA
ATM
bla
BLSE
bp
CAZ
CIP
CLSI
CMI
CT
DIM
DO
EDTA
ETP
EUCAST
FEP
FIM
GIM
GM
IMP
In
IPM
ISCR
kb
KHM
LEV
MBL
MEM
MLST
NDM
Omp
PCR
PFGE
PLP

Australian imipenemase
Amikacin
Acid mercaptoacetic
Aztreonam
Gena ce codific o -lactamaz
-lactamaze cu spectru extins
Perechi de baze
Ceftazidim
Ciprofloxacin
Clinical Laboratory Standards Institute
Concentraia Minim Inhibitorie
Colistin
Dutch imipenemase
Doxiciclin
Ethylenediaminetetraacetic acid
Ertapenem
European Comittee on Antimicrobial Susceptibility
Testing
Cefepim
Florence imipenemase
German imipenemase
Gentamicin
Imipenemase
Integron
Imipenem
Insertion Sequence Common Region
kilobaze
Kyorin Hospital metallo--lactamase
Levofloxacin
Metalo--lactamaze
Meropenem
Multilocus Sequence Typing
New Delhi metallo--lactamase
Protein din membrana extern (outer membrane
protein)
Polymerase Chain Reaction
Pulsed - Field Gel Electrophoresis
Proteine de Legare a Penicilinei

RAPD
SAM
SIM
SPM
ST
SXT
TE
TIC
TMB

Random Amplified Polymorphic DNA


Ampicilin-sulbactam
Seul imipenemase
Sao Paulo metallo--lactamase
Sequence Type
Trimetoprim-sulfametoxazol
Tetraciclin
Ticarcilin
Tripoli metallo--lactamase

***

Cuvinte cheie: metalo--lactamaze, rezistena la


carbapeneme, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter
baumannii, tipare molecular

MOTIVAIA, SCOPUL I OBIECTIVELE STUDIULUI


DOCTORAL
Tema aleas pentru realizarea tezei de doctorat
abordeaz un subiect de mare actualitate, ntruct emergena
bacteriilor rezistente i multirezistente la antibiotice a devenit
o problem de sntate public ngrijortoare. Rspndirea lactamazelor a distrus utilitatea benzilpenicilinei mpotriva
stafilococilor, a penicilinelor cu spectru larg i a
cefalosporinelor mpotriva bacteriilor Gram-negative. Noi
enzime i noi moduri de producere a vechilor enzime amenin
carbapenemele, antibiotice de rezerv, n prezent necesare
pentru tratamentul infeciilor severe noscomiale i n unele ri
a infeciilor comunitare cu bacili productori de -lactamaze
cu spectru extins i cefalosporinaze AmpC. Rezistena la
aceast clas de antibiotice crete rapid, cu limitarea opiunilor
terapeutice la substane vechi, mai toxice (polimixine,
fosfomicin) (Hamouda et al., 2011).
Subiectul este cu att mai important, cu ct datele din
literatura de specialitate sunt insuficiente pentru zona noastr.
Pseudomonas aeruginosa i Acinetobacter baumannii
sunt frecveni patogeni nosocomiali, fiind implicai ntr-o
gam larg de infecii, uneori dificil de controlat. Metalo-lactamazele hidrolizeaz majoritatea beta-lactaminelor
cunoscute (inclusiv carbapeneme i inhibitori de -lactamaze),
conferind astfel bacteriei gazd un profil larg de rezisten i
se asociaz cu elemente genetice mobile (integroni sau
plasmide) care promoveaz transmiterea lor rapid. Prima
MBL transferabil a fost descoperit n Japonia spre sfritul
anilor 80' la tulpini de P. aeruginosa multirezistente la
antibiotice. n ultimii 20 de ani au fost descrise peste 10 tipuri
de MBL, care au diseminat rapid printre tulpini de
Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. i de Enterobacteriaceae.
Avnd n vedere c pe plan european exist programe de
supraveghere a rezistenei la antibiotice prin producerea de
MBL, ne-am propus cunoaterea realitii la momentul de fa
1

n ceea ce privete profilul de sensibilitate la antibiotice i


determinarea frecvenei MBL la tulpini de bacili Gramnegativi, izolate n spitale din Nord-Estul Romniei.
Necesitatea major a utilizrii unor metode specifice de
diagnosticare i identificare a bacteriilor implicate n patologie
ne-a motivat s comparm diferite metode de detectare a
MBL, cu scopul de a evidenia eficacitatea, rapiditatea i
specificitatea fiecreia dintre acestea. Utilizarea metodelor
moleculare a completat evaluarea fenotipic a izolatelor i a
avut o importan major n caracterizarea tulpinilor rezistente,
care pun probleme de terapie i de rspndire n mediul de
spital.
Rezultatele studiului ar putea completa baza de date de
la nivel naional sau european, n ceea ce privete rezistena la
antibiotice prin producerea de MBL.
Stabilirea unui protocol de depistare a tulpinilor
productoare de MBL are importan major, att n stabilirea
ghidurilor terapeutice, ct i n recunoaterea prompt a unei
izbucniri epidemice de infecii nosocomiale i luarea msurilor
de control al infeciei.
Realizarea acestui studiu a fost posibil cu ajutorul
grantului intern de cercetare nr. 17078/30.09.2010, finanat de
U.M.F Grigore T. Popa, Iai, a unei burse de cercetare
oferite de Federaia European a Societilor de Microbiologie
(FEMS) n 2007 i a grantului CNCSIS ID-2543/2009.
Obiective
1. Investigarea profilului de sensibilitate la antibiotice la
tulpini de P. aeruginosa, izolate n spitale universitare din Iai.
2. Optimizarea unor metode de detectarea a producerii de
MBL la tulpini de Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter
spp., Enterobacteriaceae rezistente la imipenem.
3. Identificarea naturii MBL i investigarea suportului lor
genetic.
4. Investigarea mecanismelor de rspndire a genelor de
rezisten (expansiune clonal versus transfer orizontal).
2

PARTEA PERSONAL
Cuprinde capitolele 3, 4 i 5, respectiv, Material i
Metode, Rezultate i Discuii.

3. MATERIAL I METODE
3.1. SELECIA TULPINILOR BACTERIENE
Au fost incluse n studiu tulpini de bacili Gram-negativi
izolate n perioada 2004-2012 n laboratoarele unor spitale din
Iai, Bacu i Galai. Criterii de includere au fost: caracter
morfo-tinctorial de bacil Gram-negativ i certitudinea
semnificaiei clinice a izolatului n funcie de produsul
patologic. Identificarea bacteriilor a fost realizat pe baza
caracterelor microscopice, de cultur i biochimice.
Caracterele biochimice le-am determinat cu ajutorul sistemelor
multitest, TSI (Triple Sugar Iron), asociat cu MIU (Mobilitate,
Indol, Ureaz) i cu Simmons (citrat), i al celor microtest.
galeriile API 20E i API 20NE (bioMerieux, Marcy lEtoile,
Frana).
3.2. TESTAREA SENSIBILITII LA ANTIBIOTICE
Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor bacteriene
incluse n studiu a fost testat prin metoda difuzimetric la
urmtoarele antibiotice (Oxoid, Basingstoke, Marea Britanie):
amoxicilin+acid
clavulanic,
ampicilin
ampicilin,
+sulbactam, ceftazidim, cefepim, piperacilin+tazobactam,
aztreonam,
imipenem,
meropenem,
ciprofloxacin,
levofloxacin,
trimetoprim-sulfametoxazol,
tetraciclin,
doxiciclin, gentamicin, amikacin, tobramicin i colistin, n
funcie de identitatea bacteriei.
Prin metoda microdiluiilor n bulion am determinat
concentraia minim inhibitorie pentru ceftazidim i
imipenem. Interpretarea rezultatelor am efectuat-o pe baza
normelor CLSI (Clinical Laboratory and Standards Institute)
2004 - 2010. Controlul de calitate a fost asigurat cu tulpinile
3

de referin Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 i


Escherichia coli ATCC 25922.
Pentru clasificarea tulpinilor n multirezistente, MDR
(multidrug-resistant), extensiv rezistente, XDR (extensively
drug-resistant) i panrezistente, PDR (pandrug-resistant) am
folosit recomandrile recente propuse de un grup de experi
internaionali (Magiorakos et al., 2012).
3.3. METODE FENOTIPICE DE SCREENING PENTRU
PRODUCEREA DE METALO--LACTAMAZE
Testarea fenotipic pentru detectarea producerii de
MBL a fost efectuat prin cinci metode descrise anterior:
3.3.1. Metoda dublului disc ceftazidim/imipenem acid
mercaptoacetic, CuCl2, FeCl3 (Arakawa et al., 2000).
3.3.2. Metoda discului combinat imipenem-EDTA (Yong et
al., 2002).
3.3.3. Testul Hodge modificat (Lee et al., 2003).
3.3.4. Etest MBL (Walsh et al., 2002).
3.3.5. Testul microdiluiilor EPI (EDTA-phenanthrolineimipenem) (Migliavacca et al., 2002).
3.4. IZOLAREA I PURIFICAREA ADN BACTERIAN
Pentru extracia ADN bacterian am folosit patru
metode:
3.4.1. liza termic a celulelor bacteriene (fierberea);
3.4.2. liza chimic a celulelor bacteriene (Wilson, 2001);
3.4.3. extracia prin legare pe coloane cu membran de
silica, cu ajutorul kit-ului comercial GenElute Bacterial
Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA);
3.4.4. Extracia automat cu aparatul Maxwell16 AS2000
(Promega Corp., Madison, WI, SUA).

3.5. DETECTAREA PRIN PCR A GENELOR PENTRU


METALO--LACTAMAZE
Pentru detectarea genelor de tip blaVIM i blaIMP am
efectuat un multiplex PCR cu urmtorii primeri: IMP-DIAFWD (5-GGAATAGAGTGGCTTAATTCT-3), IMP-DIAREV (5-GTGATGCGTCYCCAAYTTCACT-3), VIM-DIAFWD (5-CAGATTGCCGATGGTGTTTGG-3), VIM-DIAREV (5-AGGTGGGCCATTCAGCCAGA-3) (Eurogentec,
Lige, Belgia), care genereaz ampliconi de 361 bp pentru
blaIMP i 523 bp pentru blaVIM, dup o metod descris anterior
(Docquier et al., 2003).
Amplificarea genei de tip blaNDM-1 am realizat-o cu
ajutorul primerilor NDM-Fm (5'- GGT TTG GCG ATC TGG
TTT TC-3') i NDM-Rm (5'- CGG AAT GGC TCA TCA
CGA TC -3') (Eurogentec, Lige, Belgia), care flancheaz un
fragment intern al genei de 621 bp, i conform protocolului
propus de Nordmann et al. (Nordmann et al., 2011a). Produii
PCR au fost separai prin electroforez n gel de agaroz 2%.
3.6. DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRIC A
ACTIVITII ENZIMATICE
Am testat aciunea de hidroliz a unei soluii de IPM 150
M de ctre extractul bacterian al tulpinilor pozitive pentru
gene blaVIM i blaIMP dup o metod descris anterior
(Gutirrez et al., 2007). Ulterior am urmrit inhibiia activitii
carbapenemazice prin EDTA, pentru a confirma prezena unei
MBL. Am calculat activitatea enzimatic specific (nmoli/min
mg protein).
3.7. INVESTIGAREA SUPORTULUI GENETIC AL
GENELOR PENTRU METALO--LACTAMAZE
Suportul genetic al blaVIM i blaIMP l-am investigat cu
primeri pentru regiunile conservate ale integronilor de clas 1
5CS i 3CS n combinaie cu primerii IMP DIA FWD, IMP

DIA REV, VIM DIA FWD, VIM DIA REV, conform unei
metode descrise anterior (Docquier et al., 2003). O parte din
ampliconii purificai (Wizard PCR Purification Kit Promega
Corp., Madison WI, SUA) au fost trimii pentru secveniere la
Macrogen Inc. (Amsterdam, Olanda), restul fiind secveniai n
Laboratorul de Biologie Molecular al Facultii de Biologie
din cadrul Universitii "Al. I. Cuza", Iai. Identitatea MBL a
fost stabilit prin compararea cu baza de date NCBI cu
ajutorul programului BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
3.8. METODE DE TIPARE MOLECULAR
Metodele de tipare utilizate au fost PFGE i RAPD.
Tiparea prin RAPD a fost realizat, pentru tulpinile de P.
aeruginosa cu primerii 272PSE i 208PSE (Campbell et al.,
2000) i cu primerul ERIC2 (Versalovic et al., 1991), conform
protocoalelor descrise anterior, iar pentru tulpinile de
A. baumannii, cu primerul 1254, dup metoda lui Akopyanz
(Akopyanz et al., 1992).
Dou sau mai multe probe cu acelai pattern de benzi
(analizate vizual) au fost incluse n acelai tip RAPD, denumit
cu litere majuscule sau cifre. Probele care au diferit prin una
sau mai multe benzi au fost considerate tipuri diferite. Tipurile
RAPD care au diferit prin maxim o band major sau trei
minore au fost considerate posibil nrudite. Benzile au fost
clasificate n majore, dac intensitatea lor a fost mai mare sau
egal cea a fragmentului de 1000- bp a marker-ului de greutate
molecular 200-bp ladder (Promega Corp., Madison WI,
USA). Benzile minore au fost cele cu o intensitate mai mic
dect cea a fragmentului de 1000- bp.
3.9. ANALIZA STATISTIC
Datele au fost centralizate n baze de date EXCEL i
SPSS 13.0 i prelucrate testele ANOVA i 2. Am considerat
ca semnificative valorile lui p < 0,05.

4. REZULTATE
4.1. TULPINILE BACTERIENE
Lotul de studiu a inclus 2147 bacili Gram-negativi, nonduplicat, selectai aleator dintre tulpinile cu semnificaie
clinic izolate n urmtoarele spitale: Spitalul de Boli
Infecioase Sf. Parascheva Iai, Institutul de Boli
Cardiovasculare "Prof. Dr. G.I.M. Georgescu" Iai, Spitalul de
Copii Sf. Maria Iai, Spitalul Clinic Dr. C.I. Parhon Iai,
Spitalul Clinic Judeean de Urgene Sf. Spiridon Iai,
Spitalul Judeean de Urgene Bacu i Spitalul Judeean de
Urgene Galai, n perioada 2004-2012 (tabel 4.I).

4.2.
SENSIBILITATEA
TULPINILOR STUDIATE

LA

ANTIBIOTICE

Prin antibiograma difuzimetric, din totalul de 2147 de


tulpini, 932 (43,4%) au fost rezistente/intermediare la
7

imipenem. Dintre acestea, 862 tulpini au fost de P.


aeruginosa, 55 tulpini de A. baumannii, 6 tulpini de
Enterobacter cloacae i 3 tulpini de K. pneumoniae.
Rezistena la imipenem la speciile studiate a fost de 57,65%
pentru P. aeruginosa, 47,8% pentru A. baumannii, 13,9%
pentru Enterobacter spp. i de 2,8% pentru K. pneumoniae.
Izolatele sensibile la imipenem au fost excluse din studiu.
Clasificarea tulpinilor rezistente la imipenem, conform
definiiilor propuse n 2012 (Magiorakos et al., 2012) este
ilustrat n fig. 1.
100%
80%

PDR

60%

XDR

40%

MDR
modR

20%
0%
P. aeruginosa

A. baumannii

E. cloacae

K. pneumoniae

Fig. 1. Distribuia fenotipurilor de rezisten la tulpinile rezistente la


imipenem

Procentul de rezisten la IPM la tulpinile de P.


aeruginosa a variat de-a lungul perioadei de studiu, de la
48,27% n primii ani (2004-2007), la 61,8% n 2008, la
57,59% n 2009, la 64,66% n 2010 i la 51,12% la tulpinile
izolate n anii 2011-2012. n perioada 2004-2012, rezistena
tulpinilor de P. aeruginosa la IMP a nregistrat o tendin
cresctoare (y= 132,5 + 13,3 x) (fig. 2). De asemenea curba de
regresie privind evoluia n timp a mediilor frecvenelor
relative ale rezistenei la 12 antibiotice testate a evideniat
tendina de cretere a rezistenei globale la antibiotice a
izolatelor de P. aeruginosa de-a lungul celor 8 ani de studiu.
Valorile CMI la CAZ i IPM pentru tulpinile de P.
aeruginosa din lotul studiat s-au ncadrat ntre 1 - 128 g/ml,
cu predominana izolatelor cu rezisten nalt la cele dou
antibiotice (CMI 128 g/ml). Tulpinile de P. aeruginosa
8

studiate s-au remarcat prin valori ridicate ale CMI50 i CMI90


att pentru IPM (64 g/ml, respectiv >128 g/ml), ct i pentru
CAZ (32 g/ml, respectiv 128 g/ml).
300

Nr. tulpini rezistente IMP

y = 13,3x + 132,5
200

100

< 2007

2008

2009

2010

2011/12

Fig. 2. Variaia rezistenei de imipenem a tulpinilor de Pseudomonas


aeruginosa, ntre anii 2004-2012

4.3. PERFORMANA DETECTRII FENOTIPICE A


METALO--LACTAMAZELOR
Un numr de 210 tulpini (P. aeruginosa 154, A.
baumannii 52, K. pneumoniae 3 i E. cloacae - 1) au fost
investigate prin toate cele patru teste fenotipice. Am reunit
rezultatele obinute n tabelul 2.
Tabelul 2. Rezultatele testrilor fenotipice pentru producerea de
MBL

n cadrul acestui lot, prezena genelor pentru MBL VIM


i IMP a fost confirmat prin PCR la 47 tulpini de
P. aeruginosa, 2 tulpini de A baumannii i una de K.
pneumoniae. Comparnd rezultatele testelor fenotipice i ale
celor genotipice am calculat sensibilitile, specificitile i
prediciile pozitive ale metodelor de screening, conform
indicaiilor lui Ilstrup (Ilstrup, 1990) (tabelul 3). Nu am luat n
considerare enterobacteriaceele, datorit numrului mic de
tulpini.
Tabelul 3. Compararea a patru metode fenotipice pentru detectarea
MBL la bacili Gram-negativi cu detectarea prin PCR

Se, sensibilitatea; Sp, specificitatea; PP, predicia pozitiv; ND,


nedeterminat.

Testul discului combinat IPM+EDTA a nregistrat cea


mai mare rat de rezultate fals pozitive, 44% pentru
P. aeruginosa, 85% pentru A. baumannii, dei a avut o
sensibilitate de 100%. n cazul enterobacteriaceelor, testul
discului combinat nu a detectat tulpina de K. pneumoniae VIM
pozitiv i a identificat greit tulpina de E. cloacae ca
productoare de MBL.
Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (70%)
izolate de P. aeruginosa productoare de MBL. Au fost
nregistrate 14 rezultate fals negative. Zece izolate de P.
10

aeruginosa i dou de A. baumannii au dat rezultate pozitive la


testul Hodge modificat, dar negative la PCR, sugernd
prezena unui alt tip de carbapenemaz sau rezultat fals
pozitiv. La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K.
pneumoniae au prezentat rezultate pozitive, dei doar una
produce MBL. Pentru tulpina de E. cloacae testul Hodge
modificat a fost negativ.
Dei toate izolatele productoare de MBL au fost corect
identificate prin Etest MBL, au fost nregistrate rezultate fals
pozitive pentru 3 tulpini de P. aeruginosa i 3 tulpini de A.
baumannii. Testul EPI a avut o sensibilitate i o specificitate
de 100%, comparabil cu standardul de aur, PCR numai pentru
P. aeruginosa. Testul EPI a fost aplicat i pentru izolatele de
A. baumannii, K. pneumoniae i E. cloacae, ns acestea nu au
crescut n prezena agenilor chelatori, explicabil prin faptul c
metoda este optimizat doar pentru P. aeruginosa.
4.5. GENELE PENTRU METALO--LACTAMAZE
Lotul investigat prin PCR a inclus 175 tulpini de P.
aeruginosa (dintre care 60 sensibile i 115 rezistente la IPM),
25 tulpini de A. baumannii (dintre care 8 sensibile i 17
rezistente la IPM), 3 tulpini de K. pneumoniae i o tulpin de
E. cloacae, toate rezistente la IPM.
Prin multiplex PCR a rezultat un amplicon de 523 bp,
semnalnd o gen blaVIM-like la 46 de tulpini de P.
aeruginosa, 2 tulpini de A. baumannii i o tulpin de K.
pneumoniae. Un amplicon de 361 bp, sugestiv pentru o gen
blaIMP-like a fost obinut la o singur tulpin de P. aeruginosa
(Pa247IS) (fig. 3). Nici o gen blaNDM nu a fost identificat n
acest studiu. Nu am detectat gene pentru MBL la izolatele
sensibile la carbapeneme.
Din 115 tulpini de P. aeruginosa rezistente/intermediare
la imipenem, la 47 (40,86%) au fost detectate gene pentru
MBL. Raportat la ntregul lot de P. aeruginosa investigat prin
PCR, tulpinile productoare de MBL au reprezentat 26,8%.
Dou tulpini de A. baumannii au fost productoare de MBL,
11

adic 11,7% dintre izolatele rezistente la imipenem i 8% din


lot (fig. 4).

Fig. 3. Multiplex PCR pentru confirmarea prezenei genelor de tip


blaVIM i blaIMP. M = marker de greutate molecular de 100 bp DNA
ladder; CN= control negativ.

E. cloacae

K. pneumoniae

R non MBL
A. baumannii

MBL

P. aeruginosa

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Fig. 4. Ponderea rezistenei la imipenem i a MBL n lotul


studiat.

Izolatele de P. aeruginosa MBL pozitive au provenit cel


mai frecvent din urin (44,6%), urmat de puroi (31,9%),
sput (10,6%), aspirat traheal (8,5%), hemocultur (2,12%) i
12

lichid cefalorahidian (2,12%). Cele dou izolate de A. baumannii


MBL pozitive au fost izolate din puroi i din urin, iar tulpina
de K. pneumoniae MBL pozitiv din urin.
Izolatele MBL negative au provenit cel mai frecvent din
puroi (46%), urmat de urin (29%), sput (10,1%), aspirat
traheal (4%), hemocultur (3,1%), exsudat faringian (3,1%),
lichid cefalorahidian (1,5%), cateter (1,5%). Nu am observat o
asociere semnificativ a tulpinilor productoare de MBL cu un
anumit focar de infecie (p = 0,12).
Tulpinile de P. aeruginosa productoare de MBL au
fost rezistente n proporie de 100% la penicilinele i
cefalosporinele
anti-Pseudomonas,
carbapeneme,
fluorochinolone i aminoglicozide, spre deosebire de cele
MBL negative, la care procentul de rezisten a variat (fig. 5, 6).

100%
80%
60%
Sensibil
Rezistent

40%
20%
0%
TZP

CAZ FEP

ATM MEM CIP

LEV

GM

TOB

AK

CT

Fig. 5. Rezistena la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas


aeruginosa MBL pozitive

Rezistena la ATM s-a nregistrat la 14/47 tulpini MBL


(29,8%) i la 34/68 tulpini nonMBL (50%). Ponderea
rezistenei la ATM a tulpinilor nonMBL a fost semnificativ
mai crescut (p=0,049), evideniind un risc relativ de 1,68 ori
mai mare (RR=1,68; IC95%: 1,02-2,77) comparativ cu
tulpinile MBL pentru care acest antibiotic poate avea rol
terapeutic (RR=0,60; IC95%: 0,36-0,98).

13

100%
80%
60%
Sensibil
40%

Rezistent

20%
0%
TZP

CAZ FEP

ATM MEM CIP

LEV

GM

TOB

AK

CT

Fig. 6. Rezistena la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas


aeruginosa MBL negative

Distribuia pe ani a tulpinilor productoare de MBL din


lotul nostru a fost neuniform i am constat o cretere a
numrului lor n ultimii ani ai studiului (fig. 7).
35
30
25
20

non MBL

15

MBL

10
5
0
2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

2011

2012

Fig. 7. Distribuia pe ani a tulpinilor de Pseudomonas


aeruginosa productoare de MBL

Cele dou tulpini de A. baumannii productoare de


MBL au fost rezistente la peniciline plus inhibitor de lactamaz, peniciline anti-Pseudomonas plus un inhibitor de lactamaz, cefalosporine cu spectru extins, carbapeneme,
fluorochinolone i aminoglicozide. Una dintre ele a fost
14

rezistent i la DO i SXT, iar amndou au fost sensibile la


TOB i CT (fig. 8). Rezistena la antibiotice a celor 15 tulpini
de A. baumannii rezistente la IPM, la care nu am detectat gene
pentru MBL a fost urmtoarea: 100% la TZP, CAZ, SAM,
MEM, SXT, CIP, 93,3% la FEP, 66,6% la DO, 86,6% la GM,
40% la TOB, 73,3% la AK, iar la CT 0% (fig. 8).
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
TZP

CAZ

FEP

SAM

MEM

CIP

MBL

SXT

DO

GM

TOB

AK

CT

nonMBL

Fig. 8. Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Acinetobacter


baumannii rezistente la IPM MBL pozitive versus MBL negative

Izolate pozitive pentru gene ce codific MBL au fost


depistate n toate spitalele din Iai i n cel din Galai, astfel: 2
tulpini la Clinica de Chirurgie Cardiovascular a Institutului
de Boli Cardiovasculare Iai, 1 tulpin la Spitalul de Copii, 3
tulpini la Clinica de Urologie din Spitalul "Dr. C. I. Parhon",
14 tulpini la Spitalul "Sf. Spiridon" (5 la secia ATI, 3 la
Clinicile de Chirurgie, 2 la Dermatologie, cte una la Clinicile
de Diabet, Hematologie, Oncologie i Ortopedie), 29 tulpini la
Spitalul de Boli Infecioase i 1 tulpin la Clinica de Chirurgie
a Spitalului Judeean Galai.
Analiza spectrofotometric a artat c toate tulpinile
pozitive pentru genele blaVIM i blaIMP hidrolizeaz IPM,
avnd o activitate enzimatic specific cuprins ntre 70-155
nmol/minmg protein, ceea ce confirm producerea de MBL
de ctre aceste tulpini.
15

4.7. SUPORTUL GENETIC AL GENELOR PENTRU


METALO--LACTAMAZE
Prezena integronilor de clas 1 a fost confirmat n
toate izolatele productoare de MBL. Reaciile cu primerii
pentru regiunile conservate ale integronilor de clas 1 i
primerii pentru genele blaVIM i blaIMP au dezvluit c nu toi
integronii detectai adpostesc genele pentru MBL.
Tulpina Pa247IS conine un integron de clas 1, cu dou
casete genice, blaIMP-13 urmat de aacA4 (fig. 9).

Fig. 9. Structura integronului de clas 1 din tulpina Pa247IS

Tulpina Pa16GL deine dou cpii ale genei blaVIM-2. O


gen blaVIM-2 afl ntr-un un integron de clas 1, ca a doua
caset genic, ntre genele de rezisten la aminoglicozide
aacA4 i aadA2 (fig. 10). A doua gen blaVIM-2 a fost
identificat ntr-un fragment dintr-un integron de clas 1, n
aval de caseta genic aacA29a (fig. 10).

Fig. 10. Structura integronilor de clas 1 din tulpina Pa16GL

Reacia de amplificare cu primerii 5'CS i 3'CS a detectat


n 44 tulpini de P. aeruginosa doi integroni de clas 1: unul de
aprox. 0,8 kb i unul de aprox. 1,3 kb. Ampliconii de 0,8 kb nu
ar putea gzdui gene de tip blaVIM, ntruct acestea au
dimensiuni egale sau mai mari de 800 bp. Cel mai probabil
aceti integroni sunt lipsii de casete genice. Secvenierea
16

ampliconilor de 1,3 kb cu primerii ATTI i 3'CS, a evideniat


urmtoarea structur IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE1 (fig.
11).

Fig. 11. Structura integronului de clas 1 din 44 tulpini de P.


aeruginosa

Tulpina de P. aeruginosa Pa23IS gzduiete, pe lng


fragmentul de 0,8 kb, unul de 2,5 kb. Secvena acestui
integron de clas 1 de 2,5 kb a fost IntI1-attI-aacA7-blaVIMcmlA1-qacE1 (fig. 12). n acest caz, tipul de enzim VIM
nu a putut fi precizat, deoarece secvenierea a artat numai
primele 454 bp dintr-o gen blaVIM. n aval de acest fragment,
a urmat o secven de 215 bp, similar captului 3' al genei
cmlA1.

Fig. 12. Structura integronului de clas 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clas 1, de 3,3 kb i respectiv, 1,5 kb au


fost detectai la tulpinile de P. aeruginosa 281 i 83, care nu
produc MBL (fig.13).

Fig. 13. Structurile integronilor de clas 1 din tulpinile Pa281 (sus) i


Pa83 (jos).

17

4.8.
RELAIILE
EPIDEMIOLOGICE
DINTRE
IZOLATELE PRODUCTOARE DE METALO-LACTAMAZE
Analiza RAPD a fost efectuat pentru a determina
nrudirea genetic a izolatelor care poart acelai determinant
de rezisten i modul de transmitere al acestuia.
Tulpina Pa247IS a fost comparat cu dou tulpini
(AV65 i OV160) de P. aeruginosa productoare de IMP-13,
izolate n Italia. Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu
cel al tulpinii AV65, deci izolatul din Iai este nrudit clonal cu
cel responsabil de o izbucnire epidemic ntr-un spital din
sudul Italiei n 2003.
Cele 46 tulpini P. aeruginosa pozitive pentru blaVIM au
fost mprite n tipuri 7 RAPD, cu ajutorul primerului
272PSE, dup cum urmeaz: un tip major A (26 tulpini), tipul
B (14 tulpini), tipul C (2 tulpini) i tipurile D, E, F, G fiecare
cu cte o singur tulpin. Diferena dintre tipurile A, B i F
const ntr-o singur band, deci tulpinile sunt probabil
nrudite (fig. 14). Tulpinile din tipurile RAPD C, D, E i G
sunt diferite.

Fig. 14. Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE. M, marker de greutate


molecular, 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp, Madison, WI, USA).

18

Prezena aceluiai integron de clas 1, IntI1-attI-aacA7blaVIM-2-qacE1, la tulpini din tipuri RAPD diferite sugereaz
transferul orizontal al materialului genetic.
Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) productoare de VIM-2,
izolat n 2003 la Galai a fost diferit de tulpinile din Iai.
Prin RAPD cu primerul ERIC2, tulpinile P. aeruginosa
pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate n tipuri 10 tipuri
RAPD, notate cu cifre arabe (fig. 15).

Fig. 15. Tipurile RAPD cu primer ERIC2. M, marker de greutate


molecular, 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp, Madison, WI, USA).

Primerul ERIC2 a discriminat n interiorul tipurilor A i


B obinute cu primerul 272PSE, ncadrnd cteva izolate n
tipuri separate. Totui s-a distins n continuare un tip major 1,
cu 24 tulpini. Componena celorlalte tipuri a fost urmtoarea:
tipurile 2 i 3 cu cte 4 tulpini, tipurile 4 i 10 cu cte 2 tulpini
i tipurile 5, 6, 7, 8, 9, fiecare cu cte o singur tulpin.
Diferena dintre tipurile 1, 7 i 8 const ntr-o singur band,
deci tulpinile sunt probabil nrudite.
Distribuia tipurilor RAPD obinute cu primerul
272PSE n cele cinci spitale este prezentat n fig. 16.
Tulpinile din tipul A i B se regsesc n trei spitale, ceea ce
ilustreaz amploarea infeciei de spital ncruciate. Spitalul de
Boli Infecioase reunete trei tipuri RAPD, fapt explicat de
19

Nr. tulpini

specificul izolatelor de P. aeruginosa din aceast unitate, unde


sunt internai sau transferai pacieni cu diferite complicaii
infecioase din clinicile medicale i chirurgicale ieene.
Distribuia tipurilor RAPD obinute cu primerul ERIC2
n cele cinci spitale este ilustrat n fig. 17.
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0

RAPD tip A
RAPD tip F
RAPD tip B
RAPD tip C
RAPD tip D
RAPD tip E
BI

SS

UP

Ped

CCV

Nr. tulpini

Fig. 16. Distribuia tipurilor RAPD-272PSE n cele 5 spitale.


RAPD tip 1

18
16
14
12
10
8
6
4
2
0

RAPD tip 2
RAPD tip 3
RAPD tip 4
RAPD tip 5
RAPD tip 6
RAPD tip 7
RAPD tip 8
BI

SS

UP

Ped

CCV

RAPD tip 9
RAPD tip 10

Fig. 17. Distribuia tipurilor RAPD-ERIC2 n cele 5 spitale. BI=


Spitalul de Boli Infecioase; SS = Spitalul "Sf. Spiridon"; CCV =
Clinica de Chirurgie Cardiovascular de la Institutul de Boli
Cardiovasculare Iai; UP = Clinica de Urologie de la Spitalul "Dr. C.
I. Parhon", Ped = Spitalul de Copii.

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente n aceleai trei


spitale, ca i tipul A, ceea ce confirm rezultatele privind
amploarea infeciei de spital ncruciate. Pe lng Spitalul de
Boli Infecioase i Spitalul "Sf. Spiridon" reunete mai multe
tipuri RAPD-ERIC2.
5. DISCUII
n lotul studiat rezistena global la IPM a tulpinilor de
P. aeruginosa a fost de 57,65%, concordant cu raportul
sistemului european de supraveghere a rezistenei la
antibiotice, EARSS (European Antimicrobial Surveillance
System) din cadrul ECDC (European Center for Disease
Prevention and Control), care situeaz Romnia printre rile
cu rezisten peste 50% la carbapeneme, alturi de Grecia. Am
remarcat prezena unor fluctuaii anuale ale rezistenei la IPM,
nu ntotdeauna semnificative statistic, att n studiul nostru, ct
i n raportrile pentru alte ri ale EARSS.
Rezistena la carbapeneme la P. aeruginosa este adesea
asociat cu rezisten i la alte antibiotice, ceea ce limiteaz
opiunile terapeutice (Livermore, 2001). Tulpinile de P. aeruginosa
rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente n
proporie de peste 90% la TZP, cefalosporinele antiPseudomonas, fluorochinolone i aminoglicozide. Majoritatea
au fost sensibile la ATM i toate si-au pstrat sensibilitatea la
CT. Rezultate similare au fost raportate n Brazilia, unde, din
512 izolate de P. aeruginosa, 57,6% au fost rezistente la IPM,
toate fiind sensibile la CT, iar 30,8% fiind rezistente la ATM
i 50,6% la AK (Zavascki et al., 2007). n acelai studiu s-a
raportat un procent de 16,7% XDR, comparabil cu 17,2%
XDR n rezultatele noastre.
Dei investigarea a 526 tulpini de P. aeruginosa izolate
ntr-un spital din Serbia a artat 31% rezisten la IPM, mai
puin dect procentul identificat de noi, proporia izolatelor
XDR a fost de 29,4%, mai mare dect 17,2% n studiul nostru.
21

Similar rezultatelor noastre, sensibilitatea la CT a fost tot de


100%, ns contrar rezultatelor noastre, al doilea cel mai activ
antibiotic fa de P. aeruginosa rezistent la IPM, dup CT a
fost LEV, urmat de CIP, cu procente de sensibilitate mai mari
dect ATM i AK (Jovcic et al., 2011).
Rezistena la IPM a tulpinilor de A. baumannii
investigate de noi a fost de 47,8%, aproape jumtate dintre ele
fiind XDR. Chiar dac n studiul nostru tulpinile au fost
selectate aleator, cu predominana celor rezistente la
imipenem, procentul raportat de noi a avut o valoare apropiat
de o parte dintre cele observate n ultimii anii pentru aceast
bacterie. n studiul nostru, antibioticele cele mai active asupra
tulpinilor de A. baumannii rezistente la IPM au fost CT, urmat
de TOB i DO. Rezultate similare au descris Mammina et al.
ntr-un studiu efectuat ntr-un spital din Palermo, pe 61 izolate
de A. baumannii rezistente la carbapeneme, care au fost n
proporie de 100% sensibile la CT i 100% rezistente la
cefalosporine, la combinaii -lactamin-inhibitor de lactamaz i la fluorochinolone, sensibilitatea la
aminoglicozide fiind variabil, cea mai activ TOB, cea mai
puin activ GM (Mammina et al., 2012).
Detectarea precoce a tulpinilor productoare de MBL
este esenial pentru controlul infeciei i pentru prevenirea
diseminrii acestor microorganisme. Faptul c activitatea
MBL este inhibat de substane chelatoare, precum, EDTA,
compui tiolici, acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a
diverse
metode
de
screening
pentru
detectarea
microorganismelor care produc MBL. n 2002, au fost propuse
trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de
Pseudomonas spp. i Acinetobacter spp.: testul EPI, cu EDTA
i orto-fenantrolin (Migliavacca et al., 2002), testul discului
combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al., 2002) i Etest MBL
(Walsh et al., 2002), pe care le-am utilizat n studiul nostru.
Am inclus i testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4
(Lee et al, 2003). La testele cu discuri impregnate cu soluii de
CuCl2 i FeCl3 i acid mercaptoacetic am renunat, din cauza
22

aciunii antibacteriene demonstrate, a rezultatelor ambigui i a


toxicitii i mirosului neplcut al compuilor tiolici.
Contrar studiilor anterioare, rezultatele noastre au artat
specificitate i predicie pozitiv sczute ale testului discului
combinat IPM-EDTA. Rezultatele fals pozitive nregistrate ar
putea fi explicate prin: efectul antibacterian al EDTA (Chu et
al., 2005), prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al.,
2009), inactivarea imipenemului de ctre zincul chelat (Baxter
et al., 1997), prezena de enzime tip OXA-10 i /sau OXA-14
cu activitate carbapenemazic mai eficient n forma dimeric
stabilizat de ionii de Zn2+, i care sunt parial inhibate de
EDTA (Danel et al., 2001). Poate nu n ultimul rnd ar trebui
s lum n considerare influena unei singure clone n
interpretarea rezultatelor (a fost demonstrat nrudirea clonal
a multor tulpini investigate, subcap. 4.8.)
Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de
P. aeruginosa productoare de MBL, fr rezultate fals
pozitive sau fals negative, n acord cu alte raportri
(Henrichfreise et al., 2005, Sardelic et al., 2012), dei astfel de
rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al., 2002).
Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (70,2%)
izolate de P. aeruginosa productoare de MBL. Zece izolate de
P. aeruginosa i dou izolate de A. baumannii au dat rezultate
pozitive la testul Hodge modificat, dar negative la PCR,
sugernd prezena unui alt tip de carbapenemaz. La testul
Hodge modificat toate cele trei tulpini de K. pneumoniae au
prezentat rezultate pozitive, dei doar una produce MBL.
Literatura cuprinde semnalri ale diverselor combinaii de
determinani de rezisten, ca alterarea permeabilitii
membranei externe asociat cu cefalosporinaz AmpC sau cu
-lactamaze cu spectru extins (CTX-M, SHV), la tulpini de
K. pneumoniae nsoite de o creterea variabil a CMI la
carbapeneme (Carvalhaes et al., 2010). Totodat, s-au descris
pn la 25% rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat,
mai ales pentru izolate productoare de CTX-M sau
hiperproductoare de AmpC (Pasteran et al., 2010).
23

n studiul nostru metoda Etest MBL a avut o


sensibilitate de 100% pentru tulpinile de P. aeruginosa i A.
baumannii, mai mare dect n raportrile lui Walsh et al.
(94%), Yan et al., (87%), Pitout et al. (96%) sau Qu et al.
(85,7%) (Walsh et al., 2002; Yan et al., 2004; Pitout et al.,
2005; Qu et al., 2009). n ceea ce privete specificitatea Etest
MBL, rezultatele noastre sunt n acord cu majoritatea autorilor
menionai.
ntr-un lot de 175 tulpini de P. aeruginosa, proporia
tulpinilor productoare de MBL a fost de 26,8% din ntregul
lot i de 40,86% dintre izolatele intermediare i rezistente la
imipenem. ntr-un lot de 17 tulpini de A. baumannii i 3 tulpini
de K. pneumoniae rezistente la imipenem doar dou, respectiv
una, au fost pozitive pentru producerea de MBL. n marea
majoritate (98%) am detectat MBL tip VIM, acestea fiind cel
mai frecvent raportate i la nivel mondial (Dugal, Fernandes,
2011). O singur tulpin, Pa247IS, a fost detectat
productoare de IMP-13. Situaia MBL n alte regiuni din
Romnia pare c respect pattern-ul epidemiologic observat
de Cornaglia (Cornaglia, 2011). ntre 2007-2008, dintre 84
tulpini de P. aeruginosa multirezistente izolate n spitale din
Bucureti, 5 produceau VIM-2 (Stru et al., 2010).
n perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de
bacili Gram-negativi (enterobacterii i pseudomonade) izolate
din secii de terapie intensiv din spitale bucuretene, 34% au
avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste
fenotipice, iar gena blaVIM a fost identificat la peste 50%
dintre tulpinile de P. aeruginosa rezistente la carbapeneme
(Czobor et al., 2012). n contrast cu aceste rezultate, nicio
tulpin de P. aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de
Boli Infecioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM
sau blaIMP (Crciuna et al., 2010).
Cernat et al. au raportat o prevalen crescut a MBL
IMP-1 i VIM-2 la tulpini de A. baumannii izolate la Institutul
de Cardiologie din Bucureti ntre anii 2003-2006 (Cernat et
al., 2007). Un procent mare (83%) de tulpini de A. baumannii
24

productoare de MBL a fost observat i la Spitalul Fundeni din


Bucureti, dar nu a fost efectuat confirmarea rezultatelor prin
PCR (Borcan et al., 2012). Un studiu care a inclus 13 tulpini
de A. baumannii rezistente la carbapeneme, izolate n spitale
din Timioara, Arad i Reia nu a detectat MBL (Bonin et al.,
2011).
Procente apropiate de cele din studiul nostru privind
frecvena MBL la tulpini de P. aeruginosa au fost raportate n
Brazilia (Franco et al., 2010), Iran (Yousefi et al., 2010) i
Taiwan (Lee et al., 2008).
Metalo--lactamaza IMP-13 a fost descris prima dat
n 2005, la tulpini de P. aeruginosa din Italia, care au fost
implicate i n izbucniri de infecii nosocomiale (Pagani et al.,
2005). Ocazional a fost detectat i n alte ri europene
Romnia (Mereu et al., 2007), Austria (Duljasz et al., 2009),
Belgia (Naas et al., 2011), Frana (Fournier et al., 2012) i
surprinztor, n Argentina (Santella et al., 2010). Tulpinile
italiene productoare de IMP-13 fac parte din aceeai clon, cu
care este nrudit tulpina Pa247IS, izolat la Iai. Mai mult,
analiza MLST a artat c tulpinile izolate n Argentina, Italia,
Romnia, Austria (Santella et al., 2010) i o parte din cele
izolate n Frana (Fournier et al., 2012) fac parte din acelai tip
ST621, ceea ce demonstreaz un "strmo" comun al acestora,
care a achiziionat gena blaIMP-13 ntr-un punct genetic
conservat i apoi a evoluat ca o clon cu rspndire mondial.
Dat fiind perioada destul de lung de timp dintre
izolarea i testarea tulpinii Pa247, nu am gsit informaii care
s documenteze o cltorie n Italia a pacientului de la care a
fost izolat tulpina, astfel c nu am putut stabili dac e un caz
de import sau de prezena clonei ST621 n ara noastr.
Faptul c n Iai, n 2007, dintre 26 tulpini de bacili
Gram-negativi (22 P. aeruginosa i 4 A. baumannii)
rezisteni la imipenem, izolai n spitale ieene, doar la o
tulpin de P. aeruginosa a fost evideniat o gen pentru
MBL (blaIMP-13), iar n prezent dintre 103 tulpini de bacili
Gram-negativi (90 P. aeruginosa i 13 A. baumannii),
25

rezisteni la imipenem, izolai din aceleai spitale, la 47 (45


P. aeruginosa i 2 A. baumannii) a fost identificat gena
blaVIM, sugereaz c numrul MBL, n special al celor VIM-2,
crete. Emergena MBL VIM la K. pneumoniae n aceeai
zon este un argument n plus.
Investigarea suportului genetic al MBL a identificat
cinci tipuri de integroni de clas 1, care conin astfel de gene la
tulpinile de P. aeruginosa. n cazul tulpinilor de A. baumannii
i de K. pneumoniae, gena blaVIM nu a fost asociat cu
integroni de clas 1.
La 44 tulpini de P. aeruginosa am identificat blaVIM-2
ntr-un integron de clas 1, cu doar dou casete genice n
regiunea variabil, n ordine, aacA7 i blaVIM-2. Integroni
similari au fost raportai la o tulpin de P. aeruginosa izolat
n Spania (Cabot et al., 2012) i la una din Japonia (Zhao et al.,
2009). Un integron de clas 1 coninnd aacA7 and blaVIM-2 a
fost semnalat i n Romnia, la tulpini izolate n spitale din
Bucureti (Stru et al., 2010), dar regiunea aflat n aval de
gena blaVIM-2 a fost diferit de cea descris de noi. Integronul
caracterizat de Stru et al. coninea trei casete genice n
regiunea variabil, aacA7, blaVIM-2, dhfrB, asemntori
integronilor detectai in Rusia, SUA, India (Toleman et al.,
2007), Norvegia (Samuelsen et al., 2009) i Taiwan (Yan et
al., 2006), iar n locul regiunii 3CS, se afla gena tniC (codific
rezolvaza Tn5090) (Toleman et al., 2007).
Dei tulpina Pa23 a prezentat fenotip productor de
MBL, integronul de clas 1 detectat a inclus gena blaVIM
parial deletat, urmat de un fragment parial al genei cmlA1.
Dat fiind faptul c am obinut un amplicon de dimensiune
corect la amplificarea cu primerii VIM-DIA, suspectm
existena genei n variant complet n alt parte n genom.
Prezena a dou cpii ale genei blaVIM-2 n genomul
tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular, fiind descris la
tulpini de P. aeruginosa izolate la Bucureti (Stru et al.,
2010). Cea de a doua gen blaVIM-2 este situat n aval de
caseta genic aacA29a, similar aranjamentului din integronul
26

In59, detectat n Frana cam n aceeai perioad (Poirel et al.,


2001). Spre deosebire de In59, n aval de blaVIM-2 nu am
identificat regiunea 3'CS a unui integron de clas 1, deci nu
cunoatem suportul genetic al acestor dou casete genice
(aacA29a-blaVIM-2). Lipsa regiunii 3CS este caracteristic
integronilor gzduii de transposonii Tn5090, considerat
progenitorul tipului clasic de integron de clas 1, nainte de
adiia genei de fuziune qac/sul i pierderea genelor de
transpoziie (tniC) (Toleman et al., 2007).
Integronul de clas 1 identificat la tulpina PA247IS,
care adpostete gena blaIMP-13, a fost identic cu integronul
InPSG, descris la tulpini de P. aeruginosa izolate n Italia
(Pagani et al, 2005), Austria (Duljasz et al., 2009), Argentina
(Santella et al., 2010) i Belgia (Naas et al., 2011). Integronul
InPSG este inserat n situsul res al unui transpozon Tn5051like, cu localizare cromosomal (Pagani et al., 2005, Santella
et al., 2010). nrudirea clonal a tulpinii Pa247IS cu izolate din
sudul Italiei i din Belgia indic posibilitatea prezenei acestui
tip de transpozon i n tulpina izolat la Iai. Aceste rezultate
sugereaz o origine genetic comun a tulpinilor de P. aeruginosa
productoare de IMP-13 care circul n lume.
Tiparea molecular clasific tulpinile dintr-o specie
bacterian pe baza diferenelor ntre genomele bacteriene,
foarte util n ancheta epidemiologic a infeciilor
nosocomiale. E important de stabilit dac sunt cauzate de
aceeai clon bacterian (izbucnire monoclonal), n care
microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul.
Infeciile nosocomiale cu clone diferite din aceeai specie
(izbucnire policlonal) se pot datora presiunii selective a
antibioticelor utilizate.
n urma RAPD cu primerul 272 au rezultat apte tipuri
RAPD (A-G) n cadrul tulpinilor de P. aeruginosa pozitive
pentru gena blaVIM. Tipurile A-F au fost identificate la izolate
din spitalele ieene, iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galai.
Tulpina Pa247IS, pozitiv pentru blaIMP-13 a generat un pattern
diferit.
27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai


mare, identificnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din
spitalele ieene.
Faptul c mai mult de jumtate dintre tulpini sunt
nrudite clonal arat c mecansimul major de diseminare a
genelor pentru MBL n regiunea noastr l reprezint
expansiunea clonal. Identificarea aceluiai integron, IntI1attI-aacA7-blaVIM-2-qacE1, la tulpini de P. aeruginosa din
diverse tipuri RAPD, de la diveri pacieni spitalizai n ani
diferii sugereaz persistena integronului n comunitatea
bacterian local i transferul orizontal al integronului nsui,
nu doar a casetei genice blaVIM-2. Dei integronii nu sunt
mobili per se, mai muli integroni de clas 1 au fost descrii n
transpozoni, care i mobilizeaz (Fluit et al., 1999). Este
posibil ca acest integron de clas 1 caracterizat de noi s fac
parte tot dintr-un transpozon.
n Spitalul de Boli Infecioase, tipul RAPD 1 a fost
prezent din 2008 pn n 2012. n 2010 apar i tipurile 9, 10,
iar n 2012, tipurile 2 i 4. La Spitalul "Sf. Spiridon", tipul
RAPD 1 a fost prezent din 2010 pn n 2012, n 2011 s-au
adugat tipurile 2 i 5, iar n 2012 tipurile 6 i 3.
Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului
"Dr. C.I. Parhon", dei sunt ncadrate n tipurile 7 i 8, sunt
posibil nrudite cu tulpinile din tipul 1, evideniate n celelalte
spitale.
O tulpin de P. aeruginosa izolat n noiembrie 2012 la
Spitalul de Pediatrie a fost nrudit clonal cu o tulpin izolat
n luna august a aceluiai an la Spitalul de Boli Infecioase.
Tulpina de P. aeruginosa izolat de la Clinica de
Chirurgie Cardiovascular n septembrie 2009 a fost ncadrat
n tipul 1, circulant la acea vreme n Spitalul de Boli
Infecioase. Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor
despre istoricul pacienilor de la care au fost izolate tulpinile,
care s arate spitalizrile multiple sau transferul
inter/intraspitalicesc, explicnd astfel prezena aceluiai tip
RAPD n diferite spitale.
28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente n secii diferite din


trei spitale din Iai i au persistat de-a lungul anilor, ceea ce
sugereaz succesul unei clone n acapararea unei nie
ecologice i ilustreaz amploarea infeciei de spital ncruciate.
Spitalele de Boli Infecioase i "Sf. Spiridon" reunesc mai
multe tipuri RAPD diferite, fapt explicat de specificul acestor
uniti. Pe de o parte Spitalul "Sf. Spiridon" reunete pacieni
din regiunea de Nord-Est a Romniei, iar n Spitalul de Boli
Infecioase sunt internai sau transferai pacieni cu diferite
complicaii infecioase din clinicile medicale i chirurgicale
ieene.
6. CONCLUZII GENERALE
1. Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 i IMP-13 la
tulpini de P. aeruginosa i a unei gene de tip VIM la
K. pneumoniae din Romnia. Gene de tip VIM au fost
detectate i la A. baumannii.
2. Tulpina de P. aeruginosa blaIMP-13 pozitiv izolat n
Romnia este nrudit clonal i conine un integron identic
cu o tulpin de P. aeruginosa productoare de IMP-13 care
a determinat o izbucnire de infecie nosocomial n sudul
Italiei.
3. Chiar dac rezistena global la antibiotice a tulpinilor de
P. aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ
statistic n perioada 2004-2011, aceasta a nregistrat o
tendin cresctoare (y = 0,0379x - 75,533).
4. Procentul de rezisten nregistrat la imipenem (57,65%)
trage un semnal de alarm asupra utilizrii corecte,
restrictive a acestor antibiotice n terapia infeciilor produse
de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae, P. aeruginosa,
Acinetobacter spp). n perioada 2004-2011, rezistena
tulpinilor de P. aeruginosa la imipenem a avut tendin
cresctoare.

29

5. Supravegherea n condiii standardizate a sensibilitii la


antibiotice a tulpinilor de P. aeruginosa este util pentru
cunoaterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor
la antibiotice, cu implicaii directe n
actualizarea
ghidurilor de terapie i limitarea rspndirii tulpinilor
multirezistente.
6. Prezena metalo--lactamazelor (28,5% dintre tulpinile de
P. aeruginosa rezistente la imipenem) limiteaz opiunile
terapeutice n multe cazuri la colistin i impune msuri
pentru prevenirea infeciei nosocomiale i a transferului
orizontal al acestor bacterii.
7. Studiul nostru nu a evideniat nicio tulpin panrezistent.
8. Tiparea molecular prin RAPD a demonstrat nrudirea
clonal a mai mult de jumtate dintre izolatele
productoare de metalo--lactamaze, provenite din
secii i spitale diferite, ceea ce reclam adoptarea unor
msuri riguroase de stopare a infeciilor ncruciate i de
control a infeciei nosocomiale.
9. Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezisten
sugestiv pentru producerea de metalo--lactamaze ar trebui
s includ testul discului combinat IPM+EDTA, urmat de
testul Hodge modificat, cu adaos de sulfat de zinc.
Confirmarea rezultatelor se realizeaz prin tehnici de
biologie molecular.
10. Lipsa unor noi antibiotice, active fa de bacteriile Gramnegative, face din controlul infeciei cea mai important
msur mpotriva tulpinilor multirezistente.

30

GRADUL DE ORIGINALITATE
Originalitatea studiului de fa const n investigarea
pentru prima dat a prezenei metalo--lactamazelor la bacili
Gram-negativi izolai n spitale din regiunea Moldovei, fiind i
printre primele studii de acest fel din ar.
Acest studiu a semnalat pentru prima oar n ara
noastr enzimele VIM-2 i IMP-13 la tulpini de P. aeruginosa,
cu caracterizarea integronilor care adpostesc genele lor
codante. De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K.
pneumoniae.
Este un studiu care s-a desfurat pe mai muli ani i a
permis observarea creterii rezistenei la antibiotice, inclusiv
la carbapeneme a tulpinilor de P. aeruginosa, cu emergena
MBL.
n baza tiprii moleculare a tulpinilor de P. aeruginosa
productoare de MBL, teza a scos n eviden expansiunea
clonal, ca principal mecanism de transfer al genelor pentru
MBL. Prin compararea tulpinii productoare de IMP-13 cu
tulpini izolate n spitale din Italia i Argentina, a fost
demonstrat prezena unei clone cu diseminare internaional
ntr-un spital din Iai.
De asemenea, originalitatea studiului const i n
elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor productoare
de MBL n laboratoarele de microbiologie.
PERSPECTIVE DE CERCETARE
Detectarea i caracterizarea altor mecanisme de rezisten
la imipenem (alte clase de carbapenemaze, deficit de porine,
pompe
de
eflux, hiperactivitatea
cefalosporinazei
cromosomale AmpC).
Continuarea studiului rezistenei la carbapeneme a
tulpinilor de Enterobacteriaceae i Acinetobacter spp.
Introducerea sistematic a metodelor moleculare de tipare
n ancheta epidemiologic a infeciilor nosocomiale.
31

Bibliografie selectiv
Akopyanz N, Bukanov NO, Westblom TU. DNA
diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori
detected by PCR-based RAPD fingerprinting. Nucleic Acids
Res 1992; 20: 5137-5142.
Arakawa Y, Shibata N, Shibayama K et al. Convenient
test for screening metallo--lactamase-producing gramnegative bacteria by using thiol compounds. J Clin Microbiol
2000; 38(1): 40-43.
Bonin RA, Poirel L, Licker M, Nordmann P. Genetic
diversity of carbapenem hydrolysing -lactamases in
Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals. Clin
Microbiol Infect 2011; 17(10): 1524-1527.
Cabot G, Ocampo-Sosa AA, Angeles-Dominguez M et
al. genetic markers of widespread extensively drug-resistant
Pseudomonas aeruginosa high-risk clones. Antimicrob Agents
Chemother 2012; 56(12): 6349-6357.
Campbell M, Mahenthiralingam E, Speert DP.
Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of
Pseudomonas aeruginosa. J Clin Microbiol 2000; 38(12):
4614-4615.
Carvalhaes C, Picao R, Nicoletti AG, Gales A. Cloverleaf
test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase
production in Klebsiella pneumoniae: be aware of false
positive results. J Antimicrob Chemother 2010; 65: 249-251.
Cernat R., C. Balotescu, Lazar V et al. Genetic
characterisation of highly prevalent MBLs and OXA
carbapenemases
in
multidrug-resistant
Acinetobacter
baumannii strains in a Romanian hospital. Clin Microbiol
Infect 2007; 13(s1): O436
Chu YW, Cheung T, Ngan J, Kam KM. EDTA
susceptibility leading to false detection of metallo-betalactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an
imipenem-EDTA disk method. Int J Antimicrob Agents 2005;
26(4): 340-343.

32

Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance


standards for antimicrobial susceptibility testing. 22th
informational supplement. 2012; CLSI M100-S22, Wayne, PA.
Cornaglia G, Giamarellou H, Rossolini GM. Metallo-lactamases: a last frontier for -lactams? Lancet Infect Dis
2011; 11(5): 381-393.
Crciuna C, Butiuc-Keul A, Flonta M et al. Application
of molecular techniques to the study of Pseudomonas
aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca, Romania. Analele
Universitii din Oradea-Fascicula Biologie 2010; XVII(2):
243-247.
Czobor I, Chifiriuc MC, Mruescu LG et al. Phenotypic
and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance
amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from
Romanian hospitals. Roum Arch Microbiol Immunol 2012;
71(3): 131-132.
Docquier JD, Riccio ML, Mugnaioli C et al. IMP-12, a
new
plasmid-encoded
metallo--lactamase
from
a
Pseudomonas putida clinical isolate. Antimicrob Agents
Chemother 2003; 47(5): 1522-1528.
Dugal S, Fernandes A. Carbapenem hydrolysing metallo-lactamases: a review. Int J Curr Pharm Res 2011; 3(3): 9-16.
Duljasz W, Gniadkowski M, Sitter S et al. First
organisms with acquired metallo--lactamases (IMP-13, IMP22, and VIM-2) reported in Austria. Antimicrob Agents
Chemother 2009; 53(5): 2221-2222.
Fluit AC, Schmitz FJ. Class 1 integrons, gene cassettes,
mobility, and epidemiology. Eur J Clin Microbiol Infect Dis
1999; 18(11) :761-770.
Fournier D, Jeannot K, Robert-Nicoud M et al.Spread of
the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through
sequence types ST621, ST308 and ST111. Int J Antimicrob
Agents 2012;40(6): 571-573.
Franco M, Caiaffa-Filho HH, Burattini MN, Rossi F.
Metallo-beta-lactamases
among
imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital.


Clinics 2010; 65(9): 825-829.
Gutirrez O, Juan C, Cercenado et al. Molecular
epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in
Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals.
Antimicrob Agents Chemother 2007; 51(12): 4329-4335
Hamouda A, Findlay J, Amyes SGB. Carbapenems: do
they have a future? J Med Microbiol 2011; 60(3): 1229-1230.
Henrichfreise B, Wiegand I, Sherwood KJ, Wiedemann
B. Detection of VIM-2 metallo--lactamase in Pseudomonas
aeruginosa from Germany. Antimicrob Agents Chemother
2005; 49(4): 1668-1669.
Jovcic B, Vasiljevcic Z, Djukic S et al. Emergence of
VIM-2 metallo - beta - lactamase producing Pseudomonas
aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia. J Med
Microbiol 2011; 60(6): 868-869.
Lee K, Lim Y, Yong D et al. Evaluation of the Hodge
test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for
differentiating metallo--lactamase-producing isolates of
Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp. J Clin Microbiol
2003; 41(10): 4623-4629.
Lee MF, Peng CF, Hsu HJ, Chen YH. Molecular
characterisation of the metallo-- lactamase genes in
imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university
hospital in southern Taiwan. Int J Antimicrob Agents 2008; 32(6):
475-480.
Livermore DM. Of Pseudomonas, porins, pumps and
carbapenems. J Antimicrob Chemother 2001; 47(3): 247-250.
Magiorakos AP, Srinivasan A, Carey RB et al.
Multidrug-resistant, extensively drug- resistant and pandrugresistant: an international expert proposal for interim standard
definitions for acquired resistance. Clin Microbiol Infect 2012;
18(3): 268-281.
Mammina C, Palma DM, Bonura C et al. Epidemiology
and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo, Italy. BMC


Research Notes 2012; 5: 365-373.
Mereu AI, Docquier J, Rossolini G, Buiuc D. Detection
of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in
hospitals from Romaniaresearch fellowship report.
Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007; 52(1-2): 45-49.
Migliavacca R, Docquier JD, Mugnaioli C et al. Simple
microdilution test for detection of metallo--lactamase
production in Pseudomonas aeruginosa. J Clin Microbiol
2002; 40(11): 4388-4390.
Naas T, Bogaerts P, Kostyanev T et al. Silent spread of
IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to
sequence type 621 in Belgium. J Antimicrob Chemother 2011;
66(9): 2178-2179.
Nordmann P, Poirel L, Carrr A et al. How to detect
NDM-1 producers. J Clin Microbiol 2011; 49(2): 718-721.
Pagani L, Colinon C, Migliavacca R et al. Nosocomial
outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas
aeruginosa producing IMP-13 metallo--lactamase. J Clin
Microbiol 2005; 43(8): 3824-3828.
Pasteran F, Mendez T, Rapoport M, Corso A. Controlling
the false positive results of the Hodge and Masuda assays for
class A carbapenemase detection in species of
Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol 2010; 48(4): 1323-1332.
Poirel L, Lambert T, Trkogl S et al. Characterization of
class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain
the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing -lactamase gene and of
two novel aminoglycoside resistance gene cassettes.
Antimicrob Agents Chemother 2001; 45(2): 546-552.
Qu TT, Zhang JL, Wang J et al. Evaluation of phenotypic
tests for detection of metallo--lactamase- producing
Pseudomonas aeruginosa strains in China. J Clin Microbiol
2009; 47(4):1136-1142.
Ratkai C, Quinteira S, Grosso F et al. Controlling for
false positives: interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo--lactamases. J


Antimicrob Chemother 2009; 64(3): 657-658.
Samuelsen , Buar L, Toleman MA et al. The first
metallo--lactamase identified in Norway is associated with a
TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of
sequence type 233 imported from Ghana. Antimicrob Agents
Chemother 2009; 53(1): 331-332.
Sardelic S, Bedenic B, Colinon-Dupuich C et al.
Infrequent finding of metallo--lactamase VIM-2 in
carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from
Croatia. Antimicrob Agents Chemother 2012; 56(5): 2746-2749.
Stru M, Dinu S, Creoiu S et al. Molecular
characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2
gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates
from Romania. Clin Microbiol Infect 2010;16(S2):197.
Toleman MA, Vinodh H, Sekar U et al. blaVIM-2harboring integrons isolated in India, Russia, and the United
States arise from an ancestral class 1 integron predating the
formation of the 3 conserved sequence. Antimicrob Agents
Chemother 2007; 51(7): 2636-2638.
Van Belkum A, Tassios PT, Dijskhoorn L et al.
Guidelines for the validation and application of typing
methods for use in bacterial epidemiology. Clin Microbiol
Infect Dis 2007; 13(Suppl. 3): 1-46.
Versalovic J, Koeuth T, Lupski JR. Distribution of
repetitive DNA sequences in eubacteria and application to
fingerprinting of bacterial genomes. Nucl Acids Res 1991;
19(24): 6823-6831.
Walsh TR, Bolmstrm A, Qwrnstrm A, Gales A.
Evaluation of a new Etest for detecting metallo--lactamases
in routine clinical testing. J Clin Microbiol 2002; 40(8): 27552759.
Wilson, K. Preparation of genomic DNA from bacteria.
Curr Protoc Mol Biol 2001; 00:2.4.12.4.5.
Yong D, Lee K, Yum JH et al. Imipenem-EDTA disk
method for differentiation of metallo--lactamase-producing
36

clinical isolates of Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp. J


Clin Microbiol 2002; 40(10): 3798-3801.
Yousefi S, Farajnia S, Nahaei MR et al. detection of
metallo- -lactamase-encoding genes among clinical isolates
of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran. Diagn
Microbiol Infect Dis 2010; 68(3): 322-325.
Zavascki AP, Barth AL, Gonalves ALS et al. The
influence of metallo--lactamase production on mortality in
nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections. J Antimicrob
Chemother 2006; 58(2): 387-392
Zhao WH, Chen G, Ito R, Hu ZQ. Relevance of
resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1,
blaIMP-7, blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of
Pseudomonas aeruginosa. J Med Microbiol 2009; 58(8):
1080-1085.

***

Teza cuprinde: 67 de figuri, 34 de tabele i


481 titluri bibliografice.

37

ANEX
Lista de articole din tematica tezei de doctorat
Articole n reviste cotate ISI
1. Mereu AI, Bdescu AC, Dorneanu OS, Iancu LS,
Tuchilu CG. Spread of VIM-2-metallo--lactamase in
Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii
clinical isolates from Iasi, Romania. Rev Romn Med Lab
2013; 21 (4): in press. Factor de impact 0,097.
2. Santella G, Pollini S, Docquier JD, Mereu AI, Gutkind
G, Rossolini GM, Radice M. Intercontinental
dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas
aeruginosa belonging in sequence type 621. J Clin
Microbiol 2010; 48(11): 4342-4343. Factor de impact 4,068.
Articole n reviste B+
3. Mereu AI, Tuchilu CG, Bdescu AC, Iancu LS.
Rezistena prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de
Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme. Rev
Med Chir Soc Med Nat Iai 2011; 115(4): 1208-1213.
4. Mereu AI, Enache E, Dumitracu A, Vremer T, Coman
G. Emergena rezistenei la carbapeneme la tulpini
Klebsiella pneumoniae izolate din infecii ale tractusului
urinar. Rev Med Chir Soc Med Nat Iai 2011; 115(2): 531-535.
5. Mereu AI, Docquier JD, Rossolini GM, Buiuc D.
Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative
bacilli isolated in hospitals from Romania--research
fellowship report. Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol
2007; 52(1-2): 45-49. Citat de 3 ori.
6. Mereu AI, Poiat A, Tuchilu CG, Dorneanu O, Nistor
S, Copcianu B. Metode de screening al bacililor gramnegativi productori de metalo--lactamaze. Rev Med Chir
Soc Med Nat Iai 2005; 109(2): 387-391.

38