Electroforeza n gel de poliacrilamid

SCOP
Electroforeza n gel de poliacrilamid este folosit n special pentru controlul
expresiei proteinelor de interes n bacterii.
DESCRIERE
Pentru aceasta, proba (sau suspensia bacteriana), este dizolvat in
20-50 l tampon de proba (125 mM Tris-HCl pH 6.8, 20% glicerol, 2% SDS, 5%
2--mercaptoetanol,

0.001%

albastru

de

bromfenol.

Proteinele

sunt

supuse

electroforezei pe un gel de concentra ie de 7.5 -15%.

CONDITII PREALABILE
SDS - PAGE
Soluii
Soluie stoc acrilamid (30%T 2.7%C))
Acrilamid
30 g
Bisacrilamid
0.8 g
Se aduce la 100 ml cu a.d., se filtreaz prin 0.2m, se pstreaz la +4
C la ntuneric.
Tampon de migrare X10 (0.25M Tris, pH 8.3, 1% SDS, 1.92M Glicina)
Tris
30.2 g
Glicin
144 g
SDS
10 g
Se aduce la 1 l cu a.d., se regleaz pH 8.3
Se dilueaz de 10 ori nainte de utilizare
Tampon pt. denaturare probe (sample buffer - 0.05M Tris, pH 6.8, 2% SDS, 10%
glycerol, 2 mM EDTA)
X5
X2
Tris/HCl 1M pH 6.8
2.5 ml
1 ml
SDS 10%
1 ml
4 ml
Glicerol
5 ml
2 ml
EDTA 0.1 M 1 ml
0.4 ml
Albastru de bromfenol 0.5 mg
0.2 mg
Se aduce la 10 ml cu a.d.
Se pstreaz la congelator.
Extemporaneu : 450 l TEX2 + 50 l/ml 2--mercaptoetanol,

Soluie de colorare (50% metanol, 0.2% Coomassie Blue)

Coomassie Blue R250
2g
Metanol
500 ml
A.d.
500 ml
Electroforeza in gel de poliacrilamida pagina 1 din 3

Se dizolv colorantul n metanol, se adaug apa. Se pstreaz la temp. camerei.

Pentru colorare : 45 ml soluie de colorare + 5 ml acid acetic; se coloreaz 5-10
min.
Soluie de decolorare I (30% metanol, 7.5% acid acetic)
Metanol
300 ml
Acid acetic
75 ml
A.d.
625 ml
Soluie de decolorare II (7.5 % acid acetic)
Acid acetic
75 ml
A.d.
925 ml
Montarea plcilor
se cur plcile de sticl, distan ierele i plcile albe cu detergent. Se
cltesc bine cu ap i apoi cu un amestec ap/alcool (1/1). Se terge bine
fiecare plac cu serveele care nu las scame.

pe suportul pentru geluri se pun :

placa de sticl cu distaniere
placa de sticl
se strnge totul cu cleti verzi
ce monteaz n suportul de turnare.
Prepararea gelului de migrare

se toarn soluia de gel, preparat conform tabelului, cu paharul, pn la

semn (aprox. 1/3 din plac);

se toarn peste fiecare gel cte 250 l 1ml apa distilata ca s se asigure
orizontalitatea i polimerizarea gelului;
se las s polimerizeze circa 2 ore (sau peste noapte)
se scot gelurile polimerizate, se cur de resturile de gel din exterior, se
spal cu ap i se pstreaz la frigider n tampon de migrare;
Prepararea gelului de concentrare (stacking)

se monteaz placa de gel, splata i tears bine n aparatul de

electroforez
se pune tampon de migrare 1x n cuva de jos
se prepar gelul de concentrare conform tabelului
se pune repede peste gelul de migrare cu o pipet automat de 1 ml, pn la
marginea plcii de sticl
se pune pieptenele i se las s polimerizeze (aprox. 20 min.)
se marcheaz poziia dinilor cu un marker
se scoate pieptenele i se cur fiecare godeu cu hrtie de filtru
se toarn tampon n cuva
se depun probele

Migrare
Se nchide cuva de electroforez
Se face legtura la generator

Electroforeza in gel de poliacrilamida pagina 2 din 3

Se fixeaz parametrii : 20 mA per plac (voltaj max.; 250 V

Se d drumul la migrare cca. 2 ore
Se oprete generatorul
Se scot cletii
Se pune placa pe hrtie de filtru, se scot distan ierele (dac sunt separate) ,
se desfac plcile cu o spatul, se ia gelul de migrare i se pune la colorat
5-10 min.
se arunc soluia de colorat, se spal gelul cu ap i se pune solu ia de
decolorare I; dac gelul se pstreaz mai mult vreme, se folose te solu ie
de decolorare II.

Pregtire probe
Se ia volumul de prob care conine cantitatea dorit de protein (30 - 40 g
per godeu) dat nu mai mult 10 g pe band
Dac concentraia este suficienta se adaug direct tamponul de proba, dac
nu se fac paii urmtori
se dilueaz la 1 ml cu a.d.
se adaug 50 l soluie 0.15% deoxicolat de Na; se incubeaz 15 min
la temp. camerei.
se adaug 50 l soluie 72% TCA; se incubeaz 10 min la temp.
camerei.
se centrifug 10 min la 10 000 g.
se nltur supernatantul i se spal de 2 ori cu 0,5 ml aceton rece
(centrifugare cte 5 min la 10 000 g).
Se dizolv pp. n tampon de prob 2X sau 5X (cu 100 mM DTT sau 5%
2--mercaptoetanol).
Se fierb probele 5 min.
Inportant
Splarea cu aceton trebuie fcut cu grij. Altfel probele pot fi prea acide.
Cantitatea de protein nu trebuie s fie prea mare. Cantitile mari nu mai
pot fi diluate n tampon de prob.

Electroforeza in gel de poliacrilamida pagina 3 din 3

Concentraia reactivilor pentru SDS-PAGE gel separare (Tampoane standard)

%
Numarul de geluri
1.5M TrisHCl pH 8.8
30% Acrilamida
0.8% bis acrilamida
H2O
10% SDS (l)
10% APS (l)
TEMED (l)
TOTAL
%
Numarul de geluri
1.5M TrisHCl pH 8.8
30% Acrilamida
0.8% bis acrilamida
H2O
10% SDS (l)
10% APS (l)
TEMED (l)
TOTAL
%
Numarul de geluri
1.5M TrisHCl pH 8.8
30% Acrilamida
0.8% bis acrilamida
H2O
10% SDS (l)
10% APS (l)
TEMED (l)
TOTAL

7.50%

7.50% 7.50% 7.50% 7.50% 7.50%

1
2
3
4
5
6

1.25

2.50

3.75

5.00

6.25

7.50

1.25
2.42
50
25
2.5
5

2.50
4.85
100
50
5.0
10

3.75
7.27
150
75
7.5
15

5.00
9.69
200
100
10.0
20

6.25
12.11
250
125
12.5
25

7.50
14.54
300
150
15.0
30

10.00% 10.00% 10.00% 10.00% 10.00% 10.00%

1
2
3
4
5
6
1.25

2.50

3.75

5.00

6.25

7.50

1.67
2.01
50
25
2.5
5

3.33
4.01
100
50
5.0
10

5.00
6.02
150
75
7.5
15

6.67
8.02
200
100
10.0
20

8.33
10.03
250
125
12.5
25

10.00
12.04
300
150
15.0
30

12.50% 12.50% 12.50% 12.50% 12.50% 12.50%

1
2
3
4
5
6
1.25
2.08
1.59
50
25
2.5
5

2.50
4.17
3.18
100
50
5.0
10

3.75
6.25
4.77
150
75
7.5
15

5.00
8.33
6.36
200
100
10.0
20

6.25
10.42
7.95
250
125
12.5
25

7.50
12.50
9.54
300
150
15.0
30

%
Numarul de geluri
1.5M TrisHCl pH 8.8
30% Acrilamida
0.8% bis acrilamida
H2O
10% SDS (l)
10% APS (l)
TEMED (l)
TOTAL
%
Numarul de geluri
1.5M TrisHCl pH 8.8
30% Acrilamida
0.8% bis acrilamida
H2O
10% SDS (l)
10% APS (l)
TEMED (l)
TOTAL
%
Numarul de geluri
1.5M TrisHCl pH 8.8
30% Acrilamida
0.8% bis acrilamida
H2O
10% SDS (l)
10% APS (l)
TEMED (l)
TOTAL

15.00% 15.00% 15.00% 15.00% 15.00% 15.00%

1
2
3
4
5
6
1.25

2.50

3.75

5.00

6.25

7.50

2.50
1.17
50
25
2.5
5

5.00
2.35
100
50
5.0
10

7.50
3.52
150
75
7.5
15

10.00
4.69
200
100
10.0
20

12.50
5.86
250
125
12.5
25

15.00
7.04
300
150
15.0
30

17.50% 17.50% 17.50% 17.50% 17.50% 17.50%

1
2
3
4
5
6
1.25

2.50

3.75

5.00

6.25

7.50

2.92
0.76
50
25
2.5
5

5.83
1.51
100
50
5.0
10

8.75
2.27
150
75
7.5
15

11.67
3.02
200
100
10.0
20

14.58
3.78
250
125
12.5
25

17.50
4.54
300
150
15.0
30

20.00% 20.00% 20.00% 20.00% 20.00% 20.00%

1
2
3
4
5
6
1.25

2.50

3.75

5.00

6.25

7.50

3.33
0.34
50
25
2.5
5

6.67
0.68
100
50
5.0
10

10.00
1.02
150
75
7.5
15

13.33
1.36
200
100
10.0
20

16.67
1.70
250
125
12.5
25

20.00
2.04
300
150
15.0
30

* Zonele gri sunt iniiatorii de polimerizare Se adaug dup amestecarea completa a celorlali reactivi
* nainte iniierii polimerizrii amestecul pate fi degazat

Concentraia reactivilor pentru SDS-PAGE gel concentrare

(Tampoane standard)
%

3.00% 3.00% 3.00% 3.00% 3.00% 3.00%

1
2
3
4
5
6

Numrul de geluri
0.5M TrisHCl pH 6.8
30% Acrilamida
0.8% bis acrilamida
H2O
10% SDS (l)
10% APS (l)
TEMED (l)
TOTAL
%
Numrul de geluri

0.75

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

0.30
1.90
30
15
3
3

0.40
2.54
40
20
4
4

0.60
3.80
60
30
6
6

0.80
5.07
80
40
8
8

1.00
6.34
100
50
10
10

1.20
7.61
120
60
12
12

4.00% 4.00% 4.00% 4.00% 4.00% 4.00%

1
2
3
4
5
6

0.5M TrisHCl pH 6.8

30% Acrilamida
0.8% bis acrilamida
H2O
10% SDS (l)
10% APS (l)
TEMED (l)
TOTAL
%
Numrul de geluri

0.75

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

0.40
1.80
30
15
3
3

0.53
2.40
40
20
4
4

0.80
3.60
60
30
6
6

1.07
4.81
80
40
8
8

1.33
6.01
100
50
10
10

1.60
7.21
120
60
12
12

5.00% 5.00% 5.00% 5.00% 5.00% 5.00%

1
2
3
4
5
6

0.5M TrisHCl pH 6.8

30% Acrilamida
0.8% bis acrilamida
H2O
10% SDS (l)
10% APS (l)
TEMED (l)
TOTAL

0.75

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

0.50
1.70
30
15
3
3

0.67
2.27
40
20
4
4

1.00
3.40
60
30
6
6

1.33
4.54
80
40
8
8

1.67
5.67
100
50
10
10

2.00
6.81
120
60
12
12

* Zonele gri sunt iniiatorii de polimerizare Se adaug dup

amestecarea completa a celorlali reactivi
* nainte iniierii polimerizrii amestecul pate fi degazat
Loc pentru note

Electroforeza n gel de poliacrilamid

ACTORI
Soluie stoc acrilamid (30%T 2.7%C))
Acrilamid

(C3H5NO)

Policrilamid

Bisacrilamid

TEMED (Tetrametil etilen diamina)

APS (persulfat de amoniu)
Tampon de migrare X10 (0.25M Tris, pH 8.3, 1% SDS, 1.92M Glicina)
Tris

(Tris hidroxi amino etan)

Glicin

SDS

Sodium dodecyl sulfate