Sunteți pe pagina 1din 9

ECOLOGIA PATOGENILOR AGROECOSISTEMELOR

Fitopatogenii, mai ales n zonele temperate, au un ciclu de via discontinuu, o faz cu


activitate intens este succedat de o laten n care, datorit condiiilor neprielnice, i reduc
total activitatea metabolic sau se transform n diferite forme de rezisten pn la apariia
condiiilor favorabile.
Factorii ecologici care acioneaz asupra fitopatogenilor sunt:
- nutriia mineral a plantelor (metabolismului unei plante poate fi modificat ca urmare a
influenei ngrmintelor i microelementelor);
-pH-ul;
- temperatura;
- umiditatea etc.
1. INFLUENA SUBSTRATULUI DE CRETERE ASUPRA UNOR AGENI
FITOPATOGENI
LUCRAREA PRACTIC NR.1: Pentru a se pune n eviden influena substratului
nutritiv asupra creterii i dezvoltrii la ciupercile fitopatogene, va fi montat o experien, dup
cum urmeaz:
Cte un izolat fungic apartinnd speciilor Alternaria sp. i Botrytis cinerea va fi cultivat
pe mai multe medii de cultur cu compoziie diferit (tabelul 1).
Tabelul 1
Compoziia mediilor de cultur ce pot fi utilizate pentru a determina influena substratului
de cretere asupra unor ageni fitopatogeni
Nr. crt.
Mediul de cultur
Compoziie mediu de Pt. 100ml de mediu
cultur
1
PDA
39g PDA
3,9g PDA
1000ml ap
100ml ap
2
Mal-Agar (MA)
20g extract de mal 2g extract de mal
20g agar
2g agar
1000ml ap
100ml ap
3
Mal-Dextroz-Pepton-Agar 15-20g extract de
2g extract de mal
(MDPA)
mal
2g dextroz
20g dextroz
0,1 g pepton
1g pepton
2g agar
20g agar
100ml ap
1000ml ap
4
Ap-Agar (AA)
15-25g agar
2g agar
1000ml ap de
100ml ap de robinet
robinet
5
Corn Meal Agar (CMA)
17g CMA
1,7g CMA
1000ml ap
100ml ap
Lima Bean Agar (LBA)
23g LMA
2,3g LMA
1000ml ap
100ml ap
6
Sabouraud
30-40g dextroz
3-4g dextroz
10g pepton
1g pepton
15-20g agar
2g agar
1000ml ap distilat 100ml ap distilat
7
Fin de porumb-Agar (FP-A) 50g fin de mlai 5g fin de mlai
20g agar
2g agar
1000ml ap
100ml ap

Metod: incubare pe diferite medii de cultur (in punct central)


1

Mod de lucru: Dup topire mediile de cultur se repartizeaz n vase Petri


(diametrul = 5 cm), n medie 5ml/ vas. Vasele Petri, astfel pregtite, sunt nsmnate
central cu inoculul patogen, reprezentat de discuri miceliene cu diametrul = 8mm,
prelevate de la periferia culturilor pure, n vrst de o sptmn, i apoi sunt introduse n
termostat la 24 0C.
Atenie! Discul micelian va fi depus pe mediul de cultura cu partea cu miceliu n
jos.
Influena substratului de cretere asupra creterii miceliene a izolatului patogen
testat se estimeaz n comparaie cu un martor stabilit la nceperea experienei (mediu
PDA).
Observaiile se efectueaz la 3, 5 i 7 zile de la nsmnare, experiena se poate
considera ncheiat i mai devreme de 7 zile, n momentul n care la una din variante
miceliul s-a dezvoltat n tot vasul.
Pentru fiecare izolat patogen i pentru fiecare mediu de cultur se realizeaz cte 3
repetiii.
De exemplu: Pentru 2 izolate fungice i 4 medii de cultur, experiena se
monteaz n 24 vase Petri (2 izolate patogene x 4 medii de cultur x 3 repetiii = 24 vase
Petri).
Observaii: creterea micelian (diametrul coloniei); morfologia coloniei (miceliu
aerian/ras; prezen/absen de spori...etc)
Rezultate: cretere micelian, rata de cretere/zi
Interpretarea rezultatelor
Influena compoziei mediului de cultur asupra creterii i dezvoltrii agenilor
patogeni se evalueaz prin msurarea creterii miceliene (diametrul coloniilor).
Diametrele medii ale celor 3 repetiii sunt comparate cu cele ale martorului (un mediu
standard), calculndu-se astfel procentul de inhibare a creterii miceliene (sau) dup
formula:
IC [%] inhibare a creterii = (Dmt - Dvar) / Dmt x 100, unde:
Dmt = diametrul coloniei miceliene a martorului;
Dvar = diametrul coloniei miceliene a variantei test.
2. INFLUENA TEMPERATURII ASUPRA CRETERII UNOR AGENI
FITOPATOGENI
LUCRAREA PRACTIC NR.2: Pentru a se pune n eviden influena temperaturii
asupra creterii i dezvoltrii la ciupercile fitopatogene, va fi montat o experien, dup cum
urmeaz:
Cte un izolat fungic apartinnd speciilor Alternaria sp. i Botrytis cinerea va fi cultivat
pe mediile de cultur (PDA, MA, AA, CMA), n condiii diferite de temperatur (respectiv la
30C, 150C i 240C).

Metod: incubare pe diferite medii de cultur (in punct central) i n condiii


diferite de temperatur
2

Mod de lucru (similar celui de la lucrarea practic nr.1) : Dup topire mediile
de cultur se repartizeaz n vase Petri (diametrul = 5 cm), n medie 5ml/ vas. Vasele
Petri, astfel pregtite, sunt nsmnate central cu inoculul patogen, reprezentat de discuri
miceliene cu diametrul = 8mm, prelevate de la periferia culturilor pure, n vrst de o
sptmn, i apoi sunt introduse n termostat la 30C, 150C i, respectiv, 240C .
Atenie! Discul micelian va fi depus pe mediul de cultura cu partea cu miceliu n
jos.
Influena temperaturii asupra creterii miceliene a izolatului patogen testat se
estimeaz n comparaie cu rezultatele obinute n experiena nr.1 (incubarea i creterea
la 24oC, to optim de dezvolatare a ciupercilor fitopatogene).
Observaiile se efectueaz la 3, 5 i 7 zile de la nsmnare, experiena se poate
considera ncheiat i mai devreme de 7 zile, n momentul n care la una din variante
miceliul s-a dezvoltat n tot vasul.
Pentru fiecare izolat patogen, pentru fiecare mediu de cultur i pentru fiecare
temperatur se realizeaz cte 3 repetiii.
De exemplu: Pentru 2 izolate fungice, 4 medii de cultur i 3 valori ale
temperaturii, experiena se monteaz n 72 vase Petri (2 izolate patogene x 4 medii de
cultur x 3 valori temperatur x 3 repetiii = 72 vase Petri). 24 vase Petri nsmnate sunt
cele din experiena nr 1.
Prin urmare, pentru experiena 1 i 2 vom pregti cte 100ml mediu de cultur
(PDA, MA, AA, CMA).
Mod de calcul: Total 72 vase Petri : 4 medii de cultur x 5 ml mediu/vas = 90ml
mediu + o marj de 10%
Observaii: creterea micelian (diametrul coloniei); morfologia coloniei (miceliu
aerian/ras; prezen/absen de spori...etc)
Rezultate: cretere micelian, rata de cretere/zi
Interpretarea rezultatelor
Influena compoziei mediului de cultur asupra creterii i dezvoltrii agenilor
patogeni se evalueaz prin msurarea creterii miceliene (diametrul coloniilor).
Diametrele medii ale celor 3 repetiii sunt comparate cu cele ale martorului (un mediu
standard) la o temperatur de 240C, calculndu-se astfel procentul de inhibare a creterii
miceliene (sau) dup formula:
IC [%] inhibare a creterii = (Dmt - Dvar) / Dmt x 100, unde:
Dmt = diametrul coloniei miceliene a martorului;
Dvar = diametrul coloniei miceliene a variantei test.

STRESSUL OSMOTIC I STRESSUL OXIDATIV LA CIUPERCILE


FITOPATOGENE
3

In timpul ciclului lor evolutiv, ciupercile fitopatogene sunt confruntate cu diferite tipuri
de stress, ca de exemplu, stressul osmotic i stressul oxidativ i pentru a coloniza cu succes
planta gazd ele trebuie s-i dezvolte rspunsuri de adaptare eficace.
Stressul osmotic este, de obicei, indus de mediul extern sau de substane xenobiote n
timp ce stressul oxidativ este generat n principal n timpul interaciunii patogen-plant gazd. Ca
rspuns la aceste dou tipuri de stress, ciupercile dezvolt mecanisme de protecie care implic,
n principal, sinteza i acumularea de polioli (alcooli, precum glicerolul). Pe de o parte, glicerolul
constituie un osmoprotector implicat n rspunsul ciupercilor la stressul osmotic.

3. INFLUENA STRESSULUI OSMOTIC


MICELIENE A UNOR AGENI FITOPATOGENI

ASUPRA

CRETERII

LUCRAREA PRACTIC NR.3: Pentru a se pune n eviden influena stressului osmotic


asupra creterii i dezvoltrii la ciupercile fitopatogene, va fi montat o experien, dup cum
urmeaz:
Cte un izolat fungic apartinnd speciilor Alternaria sp. i Botrytis cinerea va fi cultivat
pe mediul de cultur PDA n care se include o substan test generatoare de stress osmotic, la o
temperatur optim de cretere de 240C.
Molecule test generatoare de stress osmotic: NaCl, sorbitol
Concentraii test:

NaCl: 2 4 [%] solutie stoc 10%


Sorbitol: 0.4 -0.8 [M] solutie stoc 5M

Metod: includerea moleculelor test generatoare de stress osmotic n mediul de

cultur PDA
Mod de lucru: se pregtesc solutii stoc (concentraia 10% sau 5M). Se stabilesc
concentraiile ce urmeaz a fi testate i se calculeaz ct din soluia stoc trebuie
ncorporat n mediul de cultur (rcit, n prealabil, la 45 0C) pentru a se obine
concentraiile respective. Dup omogenizare mediul se repartizeaz n vase Petri
(diametrul = 5 cm), n medie 5ml/ vas. Vasele Petri, astfel pregtite, sunt nsmnate
central cu inoculul patogen, reprezentat de discuri miceliene cu diametrul = 8mm,
prelevate de la periferia culturilor pure, n vrst de o sptmn, i apoi sunt introduse n
termostat la 24 0C.
Atenie! Discul micelian va fi depus pe mediul de cultura cu partea cu miceliu n
jos.
Pentru fiecare molecul test, pentru fiecare izolat patogen i pentru fiecare
concentraie se realizeaz cte 3 repetiii.
Calcul: 2 izolate fungice, 2 molecule test a cte 2 concentraii, i n 3 repetiii
rezult c experiena se monteaz n 24 vase Petri. A nu se uita varianta martor cu 3
repetiii pentru fiecare izolat fungic, respectiv 6 vase Petri. Total: 30 vase Petri.
Mediu de cultur PDA : 30 vase Petri x 5 ml/ vas = 150 ml
Efectul moleculelor test generatoare de stress osmotic asupra creterii miceliene a
izolatului patogen testat se estimeaz n comparaie cu un martor cultivat pe mediu PDA.
4

Observaiile se efectueaz la 3, 5 i 7 zile de la nsmnare, experiena se poate


considera ncheiat i mai devreme de 7 zile, n momentul n care la varianta martor
miceliul s-a dezvoltat n tot vasul.
Observaii: creterea micelian (diametrul coloniei)
Rezultate: inhibarea creterii miceliene [%]

Materiale necesare:
Pentru calculul volumului de soluie stoc ce trebuie ncorporat n mediul de
cultur PDA, se va folosi formula:

Ci xVi = Cf x Vf
Ex. Concentraia soluiei stoc este 10%, concentraia ce urmeaz a fi testat este
2%, iar volumul de mediu ce trebuie obinut este de 30 ml.
10% x Vi = 2% x 30ml
Vi = 2% x 30ml / 10% = 6ml n conc. 10% va fi ncorporat n 24 ml mediu de
cultur PDA
V mediu de cultur =Vf - V molecul test (6ml) = 30ml 6ml = 24 ml
TABEL CENTRALIZATOR
Tulpina
patogen

Molecula
test

Alternaria
Botrytis

NaCl

Conc.
Sol.
stoc
10%

Total
ml10%
NaCl
Sorbitol
5M
Total
ml5M
sorbitol

Concentraia Vol.
Necesar
(ml)
2%
6ml
4%
12ml

Nr.
vase
Petri
6
6

Mediu
MA
ml
24
18

18ml

0,4M
0,8M
-

2,4ml
4,8ml
7,2ml

6
6
-

27,6
25,2
-

Interpretarea rezultatelor
Aciunea moleculelor test generatoare de stres osmotic se evalueaz prin
msurarea creterii miceliene (diametrul coloniilor). Diametrele medii ale celor 3 repetiii
sunt comparate cu cele ale martorului, calculndu-se astfel procentul de inhibare a
creterii miceliene dup formula:
IC [%] inhibare a creterii = (Dmt - Dvar) / Dmt x 100, unde:
Dmt = diametrul coloniei miceliene a martorului;
Dvar = diametrul coloniei miceliene a variantei test.
Rezultatele se exprim sub forma concentraiei care inhib 50% din creterea
micelian (CI 50) prin regresia liniar a valorilor inhibrii creterii miceliene (% din
5

martor) la valorile concentraiilor testate. Aceast concentraie este un indicator care


permite aprecierea gradului de sensibilitate/rezisten al unui izolat fa de o substan
activ i este calculat pa baza valorilor medii, nefcnd obiectul unor teste statistice.
Ex.

4. INFLUENA STRESSULUI OXIDATIV ASUPRA CRETERII MICELIENE A


UNOR AGENI FITOPATOGENI
LUCRAREA PRACTIC NR.4: Pentru a se pune n eviden influena stressului
oxidativ asupra creterii i dezvoltrii la ciupercile fitopatogene, va fi montat o experien, dup
cum urmeaz:
Cte un izolat fungic apartinnd speciilor Alternaria sp. i Botrytis cinerea va fi cultivat
pe mediul de cultur PDA n care se include o substan test generatoare de stress oxidativ, la o
temperatur optim de cretere de 240C.
Molecule test generatoare de stress oxidativ:
menadiona (menadione sodium bisulfite MSB)
apa oxigenat (H2O2)
Concentraii test:

menadiona: 0,25 - 1 [mM] solutie stoc 100mM


apa oxigenat: 0,75 -1,5 [%] solutie stoc 3%

Metod: includerea moleculelor test generatoare de stress oxidativ n mediul de

cultur PDA
Mod de lucru: se pregtesc solutii stoc (concentraia 10mM (atenie la
transformri) sau 3%). Se stabilesc concentraiile ce urmeaz a fi testate i se calculeaz
ct din soluia stoc trebuie ncorporat n mediul de cultur (rcit, n prealabil, la 45 0C)
pentru a se obine concentraiile respective. Dup omogenizare mediul se repartizeaz n
vase Petri (diametrul = 5 cm), n medie 5ml/ vas. Vasele Petri, astfel pregtite, sunt
nsmnate central cu inoculul patogen, reprezentat de discuri miceliene cu diametrul =
8mm, prelevate de la periferia culturilor pure, n vrst de o sptmn, i apoi sunt
introduse n termostat la 24 0C.
Atenie! Discul micelian va fi depus pe mediul de cultura cu partea cu miceliu n
jos.
Efectul moleculelor test generatoare de stress oxidativ asupra creterii miceliene a
izolatului patogen testat se estimeaz n comparaie cu un martor cultivat pe mediu PDA.
Observaiile se efectueaz la 3, 5 i 7 zile de la nsmnare, experiena se poate
considera ncheiat i mai devreme de 7 zile, n momentul n care la varianta martor
miceliul s-a dezvoltat n tot vasul.
Pentru fiecare molecul test, pentru fiecare izolat patogen i pentru fiecare
concentraie se realizeaz cte 3 repetiii.
6

Calcul: 2 izolate fungice, 2 molecule test a cte 2 concentraii, i n 3 repetiii


rezult c experiena se monteaz n 24 vase Petri. A nu se uita varianta martor cu 3
repetiii pentru fiecare izolat fungic, respectiv 6 vase Petri. Total: 30 vase Petri.
n cazul nostru putem folosi martorul din experiena precedent.
Mediu de cultur PDA : 24 vase Petri x 5 ml/ vas = 120 ml
Total mediu de cultur PDA (pt. cele 4 experiene): 100ml +150ml+120ml =
370ml, vom pregati 400ml
Pentru calculul volumului de soluie stoc ce trebuie ncorporat n mediul de
cultur PDA, se va folosi formula:

Ci xVi = Cf x Vf
Ex. Concentraia soluiei stoc este 10mM, concentraia ce urmeaz a fi testat este
1mM, iar volumul de mediu ce trebuie obinut este de 30 ml.
10mM x Vi = 1 mM x 30ml
Vi = 1mM x 30ml / 10mM = 3ml n conc. 10mM va fi ncorporat n 27 ml mediu
de cultur PDA
Avem nevoie de 3, 75 ml menadion 10mM (dar noi vom prepara 5 ml).

100mM x Vi = 10 mM x 5ml
Vi = 10mM x 5ml / 100mM = 0,5ml n conc. 100mM vor fi adugai peste 4,5 ml
ap steril n vederea obinerii celor 5 ml menadion n conc.- de 10mM.
Pentru experien vom pregti 10 ml menadion 10mM (9ml ap steril + 1ml menadion
100 mM).
Observaii: creterea micelian (diametrul coloniei)
Rezultate: inhibarea creterii miceliene [%]

Tabel centralizator
Tulpina patogen Molecula test Conc. Sol.Concentraia Vol.
stoc
Necesar
(ml)
menadiona
Alternaria
10mM
0,25 mM
0,75ml
Botrytis
1 mM
3ml
Total

ml10mM

menadiona
apa oxigenat

3%

Total ml apa3%

Nr. vaseMediu
Petri
MA
ml
6
29,25ml
6
27ml

3,75ml

0,75%
1,5%
-

7,5ml
15ml
22,5ml

6
6
-

22,5
15
-

oxigenat
Structura raportului
1

scop
7

material i metod (material biologic fungic, material biologic vegetal, molecule test,
concentraii)

rezultate obinute (grafice sau tabele)

discuii (interpretarea rezultatelor)

concluzii

Bibliografie

Rezultate
Rezultate privind influena substratului nutritiv asupra creterii miceliene a unor ageni
fitopatogeni
Data nsmnrii:
Data notrilor:
Mediul de
cultura

Compoziie

Patogen test

Cretere miceliana
[mm]

Rata cretere
[mm/zi]

Rezultate privind influena temperaturii i a substratului nutritiv asupra creterii miceliene a unor
ageni fitopatogeni
Mediul de
cultura

Compoziie

Patogen test Temperatura

Cretere
miceliana
[mm]

Rezultate privind influena stressului osmotic asupra creterii miceliene a


fitopatogeni

Tulpina patogen Molecula test Concentraia

Alternaria

NaCl

Sorbitol

Rata cretere
[mm/zi]

unor ageni

Diametrul Inhibare
coloniei
cretere
[mm]
micelian
[%]

1%
2%
4%
8%
0,4M
0,8M

Martor
Botrytis

NaCl

1%
2%
4%
8

Sorbitol

8%
0,4M
0,8M

Martor

Inhibare cretere micelian ICm [%]


ICm [%] = (D colonie martor D colonie varianta test)/D colonie martor x 100
Unde D = diametrul coloniei
Rezultate privind influena stressului osmotic asupra creterii miceliene a
fitopatogeni

Tulpina patogen Molecula test Concentraia

unor ageni

Diametrul Inhibare
coloniei
cretere
[mm]
micelian
[%]

Alternaria

Martor
Botrytis

Martor