Integrantes:

Andrea Ardila
David Cceres
Jenny Bohrquez
Daniela Bernal
Separacin y cuantificacin de protenas de la leche
Objetivos:
1. Evidenciar el efecto del pH sobre la solubilidad de las protenas
hidrosolubles.
2. Evidenciar el proceso de separacin de protenas por precipitacin salina.
Introduccin:
Desnaturalizacin mediante pH
Los iones H+ y OH- del agua provocan efectos parecidos, pero adems de afectar
a la envoltura acuosa de las protenas tambin afectan a la carga elctrica de los
grupos cidos y bsicos de las cadenas laterales de los aminocidos. Esta
alteracin de la carga superficial de las protenas elimina las interacciones
electrostticas que estabilizan la estructura terciaria y a menudo provoca su
precipitacin. La solubilidad de una protena es mnima en su punto isoelctrico,
ya que su carga neta es cero y desaparece cualquier fuerza de repulsin
electrosttica que pudiera dificultar la formacin de agregados.
Casenas
Las casenas son las principales protenas de la leche. Se sintetizan
exclusivamente en la glndula mamaria, y en la leche se encuentran en su mayor
parte formando agregados multimoleculares conocidos como micelas de
casena. En la leche de vaca, las casenas representan alrededor del 80% del
total de protenas, es decir, de 25 a 28 gramos por litro de leche. En la leche

humana la presencia de protenas del lacto suero es mucho mayor, de tal forma
que las casenas son solamente del orden de la mitad de las protenas totales,
entre 5 y 8 gramos por litro.

Reactivo de Biuret
El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de protenas, pptidos
cortos y otros compuestos con dos o ms enlaces peptdicos en sustancias de
composicin desconocida.
Est hecho de hidrxido potsico (KOH) y sulfato cprico (CuSO4), junto con
tartrato de sodio y potasio (KNaC4O64H2O). El reactivo, de color azul, cambia a
violeta en presencia de protenas, y vira a rosa cuando se combina con
polipptidos de cadena corta.
Absorbancia
La absorbancia, es la cantidad de intensidad de luz que absorbe la muestra. Est
definida como:
Siendo la

as se cambia una informacin. El log no el menos logaritmo,

intensidad despus de haber habido la absorcin la intensidad de la

luz que se hace incidir en la muestra. Se suele emplear en la qumica analtica ya

que se cumple, la llamada, Ley de Beer-Lambert:

Siendo

el coeficiente de

extincin molar, la concentracin y distancia de la celda. La ley de Beer es una ley

aditiva en un determinado rango de concentraciones, y por tanto si se tienen
diferentes sustancias en una muestra la ley de beer se tiene como:

La absorbancia es una medida de la cantidad de luz con una longitud de onda

especfica que un determinado material impide que pase a travs de l. No
necesariamente mide la cantidad de luz que el material absorbe. Por ejemplo, la
absorbancia debera incluir tambin la luz que se dispersa por la muestra. Podra

calcularse a partir de la transmitancia, que es la fraccin de luz que pasa a travs

del material a prueba.
Separacin de protenas por soluciones salinas
La precipitacin salina es uno de los mtodos de separacin de protenas de
estado natural (actividad biolgica).
El sulfato de amonio es una de las sales ms utilizadas para la precipitacin salina
de protenas. Es muy soluble (760 g de sulfato de amonio/1000 mL de agua a una
temperatura de 20 C) y el in sulfato divalente permite alcanzar altas fuerzas
inicas.
Las protenas en solucin son menos solubles cuando se aumenta la fuerza inica
y esto se puede lograr adicionando sales solubles como el sulfato de amonio
((NH4)2SO4). Sin embargo, la concentracin para precipitar diferentes protenas
es variable. Esta diferencia en sensibilidad se ha utilizado para separar y purificar
protenas, por ejemplo las albminas y globulinas a, b, g de la clara de huevo. En
esta determinacin la protena blanca del huevo (clara) ser separada en
fracciones de globulina y albmina.
Sobrenadante:
Fraccin homognea que no ha sedimentado luego del proceso de centrifugacin
diferencial en una muestra.
Solubilidad de las protenas:
Las protenas son solubles en agua cuando adoptan una conformacin globular.
La solubilidad es debida a los radicales (-R) libres de los aminocidos que, al
ionizarse, establecen enlaces dbiles (puentes de hidrgeno) con las molculas de
agua. As, cuando una protena se solubiliza queda recubierta de una capa de
molculas de agua (capa de solvatacin) que impide que se pueda unir a otras
protenas lo cual provocara su precipitacin (insolubilizacin). Esta propiedad es
la que hace posible la hidratacin de los tejidos de los seres vivos.

Punto Isoelctrico
El Punto Isoelctrico (IEP) est definido como el pH en el cual las cargas positivas
igualan a las cargas negativas y no existe movimiento en un campo elctrico.
En su calidad de protena, la gelatina exhibe una conducta anfotrica debido a la
presencia de grupos funcionales de aminocidos y grupos amino y carboxilo
terminales. En medios acdicos, es decir en presencia de altas concentraciones
de iones H+, la gelatina tiene carga positiva. En medios alcalinos, es decir en
presencia de iones OH-, la gelatina tiene carga negativa. En el punto isoelctrico
(IEP) las cargas positivas de los radicales NH3+ igualan a las cargas negativas de
los radicales COO-.
El IEP es una propiedad intrnseca de la gelatina, determinada por los tratamientos
de las materias primas y el tipo de proceso:

Las gelatinas Tipo A (cidas) presentan un IEP que oscila entre 6 - 9.5. Sin

embargo, el tratamiento previo de ciertas materias primas (como por ejemplo el

proceso de depilado del cuero o piel) pueden bajar el IEP a menos de 6.

Las gelatinas Tipo B (alcalinas) tienen un IEP que oscila entre 4.5 5.6.

La gelatina con un IEP bajo se debe al fenmeno de deamidacin de aminocidos.

Las gelatinas de Tipo A y B provenientes de materias primas tratadas o pre
tratadas con sustancias alcalinas que eliminan los grupos de amidas, presentan un
IEP bajo.

Las funcionalidades de las protenas se ven afectadas cuando se aproximan al

IEP, debido a la atraccin electroesttica de los grupos con carga opuesta. De
esta manera, en el IEP las propiedades de la gelatina coinciden con los valores
mximos o mnimos. Mnimos: hidratacin, viscosidad y gelificacin; mximos:
turbidez, fuerza de gel, poder de espumado y sinresis-

El IEP es til para explicar las posibles interacciones de la gelatina con otros
ingredientes, en particular los polmeros aninicos. Por ejemplo, una gelatina Tipo
B interacta mejor con un polmero aninico (ej. Carrageninas en el mousse de
chocolate) para evitar la precipitacin por incompatibilidad, que depende de las
condiciones de pH.

Metodologa

Se realizaron dos experimentos, en el primero se agreg en un tubo agua

destilada y reactivo de biuret se mezcl, despus

se calibr en el

espectrofotmetro, en otro tubo de ensayo se adiciono leche y reactivo de biuret,

se mezcl y se midi la absorbancia. En el segundo se agreg leche a un vaso
precipitado y se midi el pH, se agreg lentamente en pequeas cantidades HCl,
se agit magnticamente hasta obtener un pH de 4, 7, se filtr al vaco para poder
determinar el peso de las casenas, luego se tom el sobrenadante con reactivo
de biuret se mezcl y se midi la absorbancia, se tom otra parte de la
absorbancia con sulfato de amonio saturada y se mezcl por ltimo se centrifug y
se observ la presencia de precipitado.

Resultados:

Curva de calibracion
1.4
1.2
f(x) = 0.21x + 0.7

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0.2

0.4

0.6

0.8

1.2

1.4

1.6

1.8

2.2

Y =0,211 X +O ,6985

Clculos para determinar la concentracin de las protenas totales de la

leche.

( y0,6985)
=x
0,211

Absorbancia en blanco:
(0,0110,6985)
=x
0,211
x=3,26

Absorbancia de la leche:

(0,1490,6985)
=x
0,211
x=2,60

Determinar el porcentaje de las casenas

p
=
v
1,027 g
=0,05135 x 100=5,135
20 mL

Clculos para determinar la concentracin de las proteinas solubles en la

leche:

(0,2180,6985)
=x
0,211
x=2,28

Anlisis:

Al adicionarle sal a una protena hidratada se elimina el agua, dejando las

regiones hidrofbicas en libertad de combinarse intermolecularmente,
desnaturalizndola y hacindole perder diferentes enlaces dependiendo de
la estructura que cada protena. La solubilidad se ve afectada por la
concentracin y numero de cargas que aporte, lo que se conoce
generalmente como fuerza inica. Las sales modifican la estructura del
agua he influyen tambin en la conformacin de protenas mediante
interacciones electrostticas como funcin de la fuerza inica, las sales
puedan solubilizar o precipitar las protenas.

Al desnaturalizar una protena se modifica la estructura tanto secundaria,

terciaria y cuaternaria haciendo que la protena quede en estructura
primaria. Algunos factores que influyen en la desnaturalizacin de las
protenas son los cambios de temperatura, Ph y radiaciones. Al
desnaturalizarse una protena los cambios de la misma generan la
eliminacin el agua volvindola hidrofbica y as rompiendo enlaces

dejando una estructura primaria de la protena.

La leche es una mezcla de protenas, lpidos y glcidos en un medio acuoso
adems de contener vitaminas y sales minerales, dichas protenas estn
formadas por aminocidos en cadena. Segn la combinacin y proporcin
de estos aminocidos existen varios tipos de protenas (casena, betalactoglobulina,
inmunoglobulinas,

alfa-lactoalbumina,
lisozima),

que

lactoferrina,
cumplen

lactoperioxidasa,

determinadas

funciones

especializadas.
-Casena: comprende varios tipos de molculas que son partculas slidas
que permanecen en suspensin, cubre el mayor porcentaje de protena en
la leche dependiendo de donde provenga, esta protena se encuentra en un
medio acido o alcalino y se produce su desnaturalizacin, se produce una
reaccin qumica alterando su estructura por lo que deja de ser soluble en

agua provocando que se precipite en forma de grumos.

Las protenas necesitan del equilibrio de un campo elctrico para
neutralizarlo es por esta razn que la composicin de la protena al ser
variada puede necesitar de un PH alto o bajo segn la necesidad de una
base o un cido. Un ejemplo de esto es el punto isoelctrico de la lisozima

que es de 11.3, demostrando que precipita a un PH bsico.

Para una alimentacin especial, la casena sirve para la elaboracin de
preparados mdicos y concentrados proteicos destinados a la alimentacin
de los deportistas, especialmente despus de su entrenamiento. As, se ha
observado que la digestin de las casenas es ms lenta que la de las lacto
protenas solubles (tambin denominadas seroprotenas) y, por ello, ms
apropiada para reparar el anabolismo de los aminocidos durante el
perodo que sigue a una comida

Conclusiones:
el proceso de separacin de protenas se puede dar por la presencia de
sales pues estas son las que ayudan a desnaturalizar las protenas y de
esta manera saber cul es la concentracin, si no hay sales suficientes
sales no es posible saber con exactitud la concentracin de las protenas,
pero gracias a los clculos realizados se pudo evidenciar esta separacin

correctamente.
se puede decir que el pH

en las protenas hidrosolubles si puede ser

modificado esto se pudo evidenciar con las sales, pues estas modificaron
el aguad donde se encontraban las protenas solubles y se crearon n
interacciones electrostticas que

precipitaron o solubilizar las protenas

presentes.

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