Spectrometria de masa

Curs

Spectrometria de masa - fundamente

Metoda analitica care masoara masa moleculara sau masa atomica a unei probe.
Un spectrometru de masa produce particule incarcate (ioni).

NaCl + e- NaClNaCl NaCl+ + eAnalizeaza ionii pentru a obtine informatii despre masa moleculara a compusului
si structura sa chimica.
Spectrometrul de masa separa moleculele in functie de m/z, unde
m = masa si z = sarcina.
1 dalton = 1 unitate atomica de masa (1 amu)
Proteomica curs nr. 6 Spectrometria de masa

Spectrometrul de masa: fundamental

Prepararea
probelor

Sursa de
ionizare

Analizorul

Detector

Vaccum
10-8 torr

10-5

a. i .

600000

500000

400000

300000

Procesarea
datelor

200000

100000

0
1060. 0

1061. 0

/ j =/ ser vi ce/ 020701/ 1/ pdat a/ 1

Proteomica curs nr. 6 spectrometria de masa

1062. 0
Admi ni st r at or

Tue Jul

1063. 0
3 14: 34: 55 2001

m/ z

Componentele spectrometrelor de masa

proba

+
_

Sursa de ionizare

Analizorul de masa

magnetic sector

EI (electron ionization)
CI (chemical ionization)
FAB (Fast atom bombardment)
API (atmospheric pressure
ionization)
ESI (electrospray ionization)
MALDI (Matrix-assisted laser
desorption/ionization)

TOF (electron ionization)

FT-ICR (chemical ionization)
Quadrupole or triple quadrupole
Ion Trap
OrbiTrap

Proteomica curs nr. 6 Spectrometria de masa

Detector
Electron multiplier
Faraday cup

Metode de ionizare clasice - pioneers

Ionizarea electron impact (EI)
Un fascicol de electroni trece printr-o proba introdusa in faza gazoasa si se ciocneste cu molecula (analit)
neutrala (M) pentru a produce un ion incarcat pozitiv sau un ion fragment. In general sunt generati electronii cu
o energie de ~ 70 ev. Aceatsa metoda este aplicabila la toti compusii volatili (> 103 Da), are o reproductibilitate
mare si furnizeaza informatii structurale.

Ionizarea chemical (CI)

Ionizarea incepe cand un reactiv (R), gaz este ionizat prin impact cu
electroni si apoi reactioneaza cu molecula analit (M) pentru a
produce un ion. Aceasta metoda furnizeaza informatii despre masa
moleculara exacta si reduce fragmentatia in comparatie cu EI.

Proteomica curs nr. 6 Spectrometria de masa

Primul spectrometru de masa

Electron impact ionization

Proteomica curs nr. 6 Spectrometria de masa

&

Magnetic sector

Ionizarea prin electron impact

Probele sunt introduse in instrument prin incalzire pana
acestea se evapora
Proba in faza gazoasa este bombardata cu electroni proveniti
de la filamente de rhenium sau wolfram (energy = 70 eV)
Molecula este spulberata in fragmente care apoi sunt
trimise la analizorul de masa
Fragmentarea in EI
CH3OH

CH3OH+

CH3OH

CH2O=H+ + H

CH3OH

CH2O=H+
Proteomica curs nr. 6 Spectrometria de masa

CH3 + OH

CHO=H+ + H

De ce nu putem analiza proteine ionizate prin metoda

electron impact

EI fragmenteaza legaturile chimice

Orice proteina contine 20 amino acizi diferiti.

EI ar fragmenta proteina nu numai in amino acizi, ci si

sub-fragmente ale acestora si chiar in peptide formate
din 2,3,4 amino acizi.
Rezultatul ar fi de aprox. 10,000 diferite semnale pentru
o proteina de marime medie foarte complex pentru
interpretarea datelor.

Proteomica curs nr. 6 Spectrometria de masa

Metode de ionizare soft

337 nm UV laser
Fluid (no salt)

+
_
cyano-hydroxy
cinnamic acid

MALDI

Gold tip needle

ESI

Tehnicile de ionizare soft ionization pastreaza moleculele intacte

ESI a fost conceputa in 1960 de catre Malcolm Dole dar a fost pusa in
practica 1980 de catre John Fenn.

MALDI a fost introdus in 1985 de catre Franz Hillenkamp and Michael Karas
(Frankfurt)

Proteomica curs nr. 6 Spectrometria de masa

Ionizarea Electrospray (ESI)

Siringa /spray

Conul
Taylor

Picatura
multiplu
incarcata

Solvent

Explosia

evaporation

Coulombica

Molecula
analit

Limita
Rayleigh
este atinsa

Picatura
cand tensiunea
multiplu
superficial a picaturii incarcata
nu mai poate susine
incarcarea

diferenta de potential (2.5 to 4 kV).

In ESI se formeaza ioni simplu incarcat cat si multiplu incarcat !

Proteomica curs nr. 6 Spectrometria de masa

Ionul
analit

Spectrometru de masa ESI a myoglobinei (16955 Da)

Poate fi modificat la nanospray sistem cu flow < 1 mL/min

Tehnica foarte senzitiva (picomole )

Foarte afectata de prezenta sarurilor & detergentilor in proba.

Masurare in positive ion mode (M + H)+ (adaugare de acid formic ca solvent)

Masurare in negative ion mode (M - H)- (adaugare de ammoniac ca solvent)

Positive or Negative Ion Mode?

Daca proba are grupuri functionale care mai

usor accepta un H+ (grupari amide and amino
precum cele gasite in peptides and proteins)
atunci alegem detectia in positive ion mode.

Daca proba are grupuri functionale care mai

usor pierde un H- (grupari carboxylice and
hidroxil precum cele gasite in nucleic acids si
zaharuri) atunci alegem detectia in negative ion
mode.

Proteomica curs nr. 6 Spectrometria de masa

Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization

Mecanismul ionizarii MALDI:
(i) Formarea unei 'Solid Solution omogen : Proba
este in prealabil amestecata cu un UV-absorbant
matrix (acid sinapinic pentru proteine, acid 4hydroxycinnaminic pentru peptides).
(ii) Excitarea Matrix-lui: fascicolul laserului este
focusat pe suprafata solutiei-solide matrix-analit.
Chromophor-ul matrixului se cupleaza cu frecventa
laserului rezultand o rapida excitare vibrationala
care dezintegreaza solutia solida. Clusterii ejectati
contin molecule de analit inconjurate de matrix.
Moleculele de matrix se evapora lasand analitul liber
in faza gazoasa.
(iii) Ionizarea analitului: excitatrea moleculelor de
matrix este stabilizata prin transfer de protoni la
analit. Atasamentul cationilor la analit este
deasemenea posibil deoarece metoda are o
toleranta la prezenta sarurilor mai mare decat ESI.
Ionii analit sunt de tipul [M+X]+ (X= H, Na, K etc.)
Aceste reactii de ionisation au loc in norul de
matrix-analit desorbit chiar deasupra tragetului.
Ionii sunt apoi extrasi in MS.

Proteomica curs nr. 6 Spectrometria de masa

MALDI tipuri de targets

Proteomica curs nr. 6 Spectrometria de masa

Primul analizor de masa: magnetic sector

Proteomica spectrometria de masa

Principiul Time-of-Flight timp de zbor

Ionii care parasesc sursa sunt accelerati cu aceeasi energie. Ionii

cu diferite mase au diferite viteze, dea aceea ajung la detector in
timpi diferiti.
Proteomica spectrometria de masa

Linear matrix-assisted laser desorption & time-of-flight

MALDI-TOF

m/z - masa / sarcina a ionului

e - sarcina pe un electron
E - potentialul pulsului de extractie
S - distanta tubului de zbor peste care este aplicat E
d - distanata campului free drift zone
t - timpul de zbor al unui tip de ion

Proteomica Spectrometria de masa

Liniar MALDI - Tof

Proteomica Spectrometria de masa

Microflex MALDI-Tof

Proteomica Spectrometria de masa

Reflectron Tof mode imbunatateste rezolutia in MALDI Tof MS

H2N-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met- CONH2

Substanta P

Mr : 1347,65 Da

M+H : 1347,7354 Da

Delayed Ion Extraction in Linear TOF-MS

Extractia intarziata a ionilor

Melittin peptide

Performantele spectrometrului de masa

Rezolutia (acuratetea masuratorii) prin spectrometrie de masa este un concept
fundamental pentru Proteomics. Rezolutia este puterea de rezolvarea (resolving
power) observata experimental la un instrument MS.
resolving power a unui instrument de tip Tof este abilitatea lui de a separa ioni cu
un timp de zbor similar in semnale separate.

m = (2eV / d2) * t2
m - masa ionului
d - distanta
t - timpul
V - viteza

dm = (2eV / d2) * 2t dt

m / m = t / 2t

t = latimea peak-lui la jumatte din inaltime

FWHM (full width at half maximum)

Rezolutia afecteaza abilitatea instrumentelor MS de a determina cu o mare

acuratete m/z.

Proteomica Spectrometria de masa

TOF : Rezolutia si acurateatea masuratorilor

Proteomica Spectrometria de masa

Rezolutia si distributia monoizotopica a ionului masurat

suma izotopului 13C ce contribuie la formula

moleculara a bradykinin-ei

Contributia izotopului
semnale distincte

13C

este separta in

H2N- Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-COOH

Mr = 1061.22 Da

Proteomica Spectrometria de masa

[M+H]+ : 1060.5687 Da

Contributia izotopilor in spectrometria de masa de inalta rezolutie

Izotopii sunt specii de atomi ai aceluiasi element chimic dar cu mase diferite. Au acelai numr
de protoni si neutroni dar un numar diferit de electroni,. Principalele elemente care apar n
proteine sunt CHNOPS.
Izotopii ce apar n mod natural:

34S

ar putea avea cel mai mare impact asupra distributiei izotopice; dar nu este ntotdeauna
prezent ntr-o peptida (Cys, Met). 13C este cel mai abundent , urmat de 15N
(+1), 18O i 34S
(+2). 17O i 2H sunt foarte rari.

Proteomica Spectrometria de masa

Distributia monoisotopica versus rezolutia de masa

Prezentarea maselor identificate prin spectrometria de masa: Rigurozitate / Diferentiere

- masa nominala
- monoizotopica
- cea mai abundenta masa
- masa moleculara medie (average)

Proteomica Spectrometria de masa

Ionizarea Electrospray (ESI)

Proteomica Spectrometria de masa

Analizorul de masa Quadrupol

Un filtru de masa quadrupol este format din 4 tije metalice paralele dintre care doua au un potential
(U+Vcos(wt)) si celelalte doua un potential de -(U+Vcos(wt)) unde U este un curent direct (DC) si Vcos(wt)
este un curent alternativ (RF de amplitudine V si frecventa w). Aplicarea voltajelor afecteaza traiectoria
ionilor prin canalul folmat de cele 4 tije. Pentru un anumit voltaj dat, numai anumiti ioni m/z vor trece prin
quadrupol. Un spectru de masa este obtinut prin monitorizarea ionilor care trec prin filtru quadrupol cand
voltajul pe tije variaza. Aceasta se face in doua moduri: variind w si pastrand U si V constant, sau variind U
si V (U/V) pentru w constant.

Proteomica Spectrometria de masa

LC-MS/MS : LC- Tandem MS

Proteomica Spectrometria de masa

Exemple de spectre de masa

Proteomica Spectrometria de masa

Folosirea analizorului de masa Quadrupol in instrumete complexe

Proteomica Spectrometria de masa

Schema teoretica a analizor de masa Q TOF

NANOSPRAY
TIP

MCP
DETECTOR

PUSHER
HEXAPOLE

QUADRUPOLE
ION
SOURCE

HEXAPOLE
COLLISION
CELL

REFLECTRON

SKIMMER

Proteomica Spectrometria de masa

TOF

HEXAPOLE

Analizorul de masa - Ion Trap

Analizorul de masa ion-trap foloseste un electrod circular si doua capete

pentru a capta ionii de un volum mic in interiorul sau printr-un camp
electromagnetic. Avantajele lui sunt: marime medie compact si abilitatea de a
capta si acumula ionii pentru a creste raportul semnal- zgomot (signal-to-noise
ratio) al instrumentului. Un spectru de masa este obtinut prin schimbarea
voltajului la electrozi pentru a elibera ionii captati.
Proteomica Spectrometria de masa

Diferentierea unor octa-peptide similare

Proteomica Spectrometria de masa

ESI- Ion Trap : spectru de masa

3+
Enhanced MS
500 fmol/mL Angiotensin I

2+

Proteomica Spectrometria de masa

Celula FT-ICR

Fourier-transform mass spectrometry are avantajul de a selecta si detecta un ion intrat in rezonanta
ciclotronica (ICR= ion-cyclotron resonance).
Ionii in camp magneti vor fi miscati cu o directie circulara in functie de raza lor.
r = mv/eB si cu o frecventa data de: f = eB/m
Ionii ce intra in camera trap sunt captati intr-o miscare circulara de puternicul camp magnetic si electric.
Cand ionii sunt excitati de o RF ( frecventa radio) genereaza un curent time-dependent. Acest curent
este convertit prin transformarea Fourier in frecvente orbitale care corespund cu m/z.

Proteomica Spectrometria de masa

Motion of a charged particle in a magnetic field

An ion of charge

q moving with velocity v

in a static magnetic field B is subjected to

a force
that is proportional to the magnitude of the charge
and the speed of the particle:

F = qv x B
positive ion

negative ion

in the presence of a constant magnetic field [

B]
36

If we apply Newton's second law to the particle:

F=q vxB
charge

m/q = m/z = rB/v

q ; velocity v

static magnetic field B

a frequency; a force F

37

Ions with lower m/q have higher cyclotron frequencies

lower m/q
higher frequency

higher m/q
lower frequency

The frequency of the cyclotron gyration of an ion is inversely

proportional to its mass-to-charge ratio (m/q) and
directly proportional to the strength of the applied magnetic
field B.

38

Ion motions in a cubic trap

All ions of given mass-to charge ratio

have the same ICR frequency.

Marshall, Hendrickson, and Jackson

Their ICR frequency is independent of

their kinetic energy
39

Spectrometru de masa FT ICR folosind ambele surse de ionizare MALDI si ESI

FT- MS opereaza la rezolutie foarte inalta (106),care este defapt si principalul avantaj
fata de alte instrumente MS.

Dr. Alan G. Marshall

Department of Chemistry & Biochemistry
Florida State University, USA

Proteomica Spectrometria de masa

Spectrometru de masa FT ICR folosind ambele surse de ionizare MALDI si ESI

Proteomica Spectrometria de masa

LTQ Orbitrap Operation Principle

The Orbitrap is an ion trap but there are no RF or magnet fields!
Moving ions are trapped around an electrode
1. Ions are stored in the Linear Trap
2. . are axially ejected
3. . and trapped in the C-trap
4. . they are squeezed into a small cloud and injected into the Orbitrap
5. . where they are electrostatically trapped, while rotating around the central electrode
and performing axial oscillation

The oscillating ions induce an image current into the two

outer halves of the orbitrap, which can be detected using
a differential amplifier

Ions of only one mass generate a sine

wave signal
Proteomica Spectrometria de masa

Whats the size of the Orbitrap?

The Orbitrap detector in full-scale

Proteomica Spectrometria de masa

MSn fragmentare
De ce este necesar fragmentarea?
Att ESI ct i MALDI produc doar ioni moleculari (sau aduci ai acestora)
n abordarea Bottom-Up (digestie nainte de analiz), informaii despre masa
exact a peptidelor este absolut necesar, dar nu ntotdeauna suficient
n abordarea Top-Down (sau Middle-Down), doar informaii despre masa (chiar i
exact) a proteinei intacte sunt total insuficiente
Fragmentarea automat n interiorul spectrometrului de mas permite obinerea
de ioni mici (peptide cu mase moleculare mici sau chiar aminoacizi), uor de
identificat
Cunoscnd mecanismele de fragmentare i avnd ionii mici identificai, putem
reconstitui structura peptidelor (Bottom-Up) sau direct a proteinei iniiale (TopDown)
Volumul de informaie obinut (spectrele de mas) este foarte mare, dar, n cazul
nostru foarte mare nseamn foarte bine (exactitatea reconstituirii structurii
proteinei este mai mare)
Singurul mod n care putem obine informaii despre modificrile posttranslaionale
Proteomica Spectrometria de masa

Fragmentarea peptidelor

Proteomica curs nr. 6 Spectrometria de masa

Tipurile de ionii formati in urma fragmenterii unui ion peptidic

Proteomica Spectrometria de masa

MS/MS fragmentation intr-un Ion Trap

Proteomica Spectrometria de masa

Collision Induced Dissociation CID

RF

ESI sau MALDI

RF

Disocierea indus prin coliziune

Proteomica Spectrometria de masa

1. Introducem n trap un gaz

inert (He)
2. Ionii se formeaz n sursa de
ionizare
3. Ionii sunt prini n trap i
oscileaz n interiorul ei
4. Prin ciocnirea elastic cu He,
ionii i pierd din energie
(rcirea ionilor)
4. Se izoleaz n trap doar ionii
de interes (izolarea ionului
precursor)
5. Se aplic o tensiune de
radiofrecven ce va induce
ionului precursor o energie de
rezonan mare (rezonan de
excitaie)
6. Prin ciocnirea ionului
precursor cu He, energia
cinetic este transformat n
energie vibraional, suficient
ca s disocieze ionul precursor

7. Ionii fiic formai sunt trimii

spre sistemul de detecie

Spectru de masa CID : ionul patern 623.47 Da

Proteomica Spectrometria de masa

Disociere indus prin coliziune aspecte

Cea mai simpl i des utilizat tehnic de fragmentare

Fragmentarea se realizeaz n trapa ionic, nu necesit modificri / adaugri
hardware
Disociaz legturile cu energii mai mici, cu formare preponderent a ionilor b i y
Modificrile post-translaionale sunt i ele disociate, nu poate fi folosit pentru
studii PTM (modificare sau poziie)
Energia de rezonan este suficient de mare nct ionii formai care au m/z mai
mic dect 1/3 din masa ionului precursor s nu mai poat fi reinui n trap

Proteomica Spectrometria de masa

LTQ Orbitap XL ETD

Principiul de operare:

Acumularea i izolarea ionilor n trapa linear LTQ

Formarea i introducerea ionilor de fluoranten n trapa linear LTQ

Reacia cu transfer de electroni n trapa ionic linear LTQ

Detecia ionilor produi prin ETD

Proteomica Spectrometria de masa

Electron Transfer Dissociation (ETD) folosind fluoranten

Fluoranten

Proteomica Spectrometria de masa

Generarea ionilor negativi de fluoranten

Electronii de energie nalt (70 eV) emii de filamentul sursei
reacioneaz cu gazul de ionizare chimic (azot ~ 0.3 Torr)
e-

eee-

N2

N2

Procesul de ionizare creaz ioni de azot i electroni termici (>1

eV)
Ionizare

e-

e-

Electron termic
Fluoranten

N2
N2+
Proteomica Spectrometria de masa

Ion de azot

Fragmentele de ioni formati in Electron Transfer Dissociation

[M + 3H]3+ + A[M + 3H]2+

[M + 3H]2+ + A
[C+2H]1+ + [Z+H]1+
C

Z
R

Proteomica Spectrometria de masa

Electron Transfer Dissociation(ETD) - aspecte

Disociere complementar celorlalte tehnici

Nu afecteaz PTM (proteomic)
PTM pot fi evideniate i localizate (proteomic)
Simpl, uor de operat
Necesit hardware special
Eficien de fragmentare mare pentru ioni cu z > 2. Pentru ioni cu z = 2, poate fi
necesar energie de activare suplimentar. Pentru ioni cu z = 1 nu se produce
fragmentare

Proteomica Spectrometria de masa

HCD: Higher Energy Collisional Dissociation

Celul de coliziune

Proteomica Spectrometria de masa

HCD etape
mTorr

Proteomica Spectrometria de masa

HCD Formarea ionilor de imoniu (Proteomic)

Ioni de imoniu = fragmente de ioni din interiorul secvenei cu o singur caten lateral
Ionii de imoniu sunt formai printr-o fragmentare de tip y urmat de o fragmentare de
tip a
Identificarea ionilor de imoniu duce la o crestere semnificativ n elucidarea secvenei
unei proteine (de cteva ori!!!)
Ionii de imoniu conin informaii despre PTM. Localizarea PTM nu este distrus prin
HCD
Proteomica Spectrometria de masa

CID versus HCD

Permite aplicarea de presiuni mai mari n celula de coliziune => mai multe coliziuni intre gazul
inert i ionii precursori => eficien de ionizare nalt
Nu apare fenomenul de pierdere al ionilor cu mase mici (low mass cutoff)
Fragmentare eficient a ionului precursor (ionul precursor nu se mai gsete n spectrul de
mas al ionilor produs)
Fragmente din interiorul secvenei ionii de imoniu (Proteomic)
Permite studii ale PTM (Proteomic)

Proteomica Spectrometria de masa

Influenta pH-lui solutiei in care se afla analitul (lizozim)

Proteomica Spectrometria de masa

Deconvolutia spectrelor de masa

Proteomica Spectrometria de masa

Proteomica Spectrometria de masa