Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Biologia Moleculara A Medicamentului Arad 2009
Biologia Moleculara A Medicamentului Arad 2009
BIOLOGIA MOLECULAR A
MEDICAMENTULUI
Arad 2009
PREFA
Biologia molecular este implicat major n cercetrile privind noile strategii terapeutice.
Astfel, dac se identific gena/proteina care se afl la originea unei maladii ereditare sau dobndite
exist posibilitatea descoperirii unor noi piste pentru concepia unor medicamente destinate s
reduc deficitele sau excesele de activitate a acestei gene/proteine. De exemplu,n cazul anomaliei
unui anumit receptor (protein a suprafeei celulare destinat s transmit mesajul extern la
structurile celulare interne) care determin o anumit maladie este posibil concepia i dezvoltarea
unor molecule ,viitoare medicamente, capabile s acioneze specific asupra receptorului sau s
suplineasc funcia deficitar a acestuia printr-o alt cale. Cercetrile efectuate asupra moleculelor
terapeutice se bazeaz acum pe tehnici de modelare a moleculelor asistate pe calculator, pe sinteza
unor analogi de sintez a acestor molecule i pe teste de selecie de nivel nalt ale acestor numeroi
analogi. Ansamblul acestor tehnici va permite ,n timp record, o selecie a eficacitii terapeutice a
unei anumite inte dintre numeroasele molecule candidate.
n prima parte a crii pe baza studiului molecular, mai precis al semnalelor moleculare,
sunt analizate diferite tehnologii de testare celular. i, cnd amintim de aceste tehnici ne referim
nu doar la simpla detectare a unui singur produs celular ci la urmrirea unei mari varieti de
procese metabolice avnd drept scop final caracterizarea fenotipic multidimensional a
comportamentului celular. Cel de al doilea capitol familiarizeaz cititorul cu modelele genelor
knock-out, o tehnic care ne permite s creem i s introducem un model de mecanism patologic
ntr-un organism complex urmrind astfel s obinem un instrument analitic cu relevan crescut
n biologia molecular a medicamentului. Urmtorul capitol prezint detaliile unei tehnici de
analiz molecular axat pe aa-numitele "gene reporter".
Descifrarea recent a genomului uman a oferit un nou sprijin ntregii arii de cercetare. Dintro dat un numr mare de inte moleculare puteau fi supuse analizei. Mai nti trebuie s rspundem
la ntrebarea: ce realizeaz aceast molecul int la nivelul proceselor biochimice celulare i cum
este ea controlat? Acestei ntrebri i propune s raspund capitolul 4, care se ocup de receptorii
"orfani" cuplai cu proteina G (GPCR) i ncearc implicit s prezinte noi provocri i oportuniti
n gsirea unor noi liganzi cu efecte biologice nc necunoscute.
Cea de-a doua parte a acestei cri este dedicat n ntregime procesului de sintez a
medicamentelor. Dou arii de interes major pot beneficia enorm n urma cercetrii procesului de
sintez n cadrul biologiei moleculare i utilizrii n acest scop a tehnicilior corespunztoare:
elucidarea sintezei stereoselective a compuilor naturali i analogilor lor i sintetizarea compuilor
2
farmacologici derivai din ADN sau proteine. Primul capitol al acestei pri secunde ofer o privire
de ansamblu, cuprinztoare, despre utilizarea enzimelor n sinteza stereoselectiv, implicnd
utilizarea tehnicilor de recombinare genetic. Domeniul fascinant al produilor farmacologici care
interacioneaz cu acizii nucleici, structura i sinteza acestora, agonitii lor i mecanismele de
aciune fac obiectul capitolului 6.
Partea a treia prezint metodele analitice implicate n determinarea interaciuni medicamentint. n acest sens se discut utilizarea proteinelor n cromatografia de afinitate i enantioseparare a
enantiomerilor (molecul parte a unui compus alctuit din dou molecule din care una este imaginea
n oglind a celeilalte fr s fie identic cu ea). Utilizarea rezonanei magnetice nucleare (NMR) i
a tehnicilor nrudite n studiul structurilor moleculare este un alt subiect din aceast parte a crii.
Elementele de cinetic, metabolism,i toxicologie implicate n domeniile farmacogenomicii
i toxicogenomicii constituie partea final a acestei cri.
Acum tim c o maladie este rezultatul combinat a sute de proteine i n acest context este
dificil s sperm c vom gsi un principiu unic activ capabail s vindece boala. ntr-adevr, din 100
de medicamente care depesc stadiul de testare pe om , numai trei ajung pe pia. Celelalte se vor
dovedi a fi toxice sau ineficiente. Probabil c toate intele bune asupra crora un medicament
poate s exercite un efect au fost deja gsite. Ceea ce presupune c pentru a produce noi
medicamente trebuie s se revin la cele vechi, care vor fi altfel reutilizate. Ca i natura, cercettorii
vor face cu ajutorul biologiei moleculare, noul din vechi.
Autorii
CUPRINS
CUVNT NAINTE .......................................................................................................................... 7
PARTEA I: CARACTERIZAREA MOLECULAR A INTERACIUNILOR
MEDICAMENT-INT .................................................................................................................10
1. TESTELE CELULARE: UTILIZAREA I IMPACTUL LOR N DESCOPERIREA
MEDICAMENTELOR ..................................................................................................................10
1.1. Introducere ..............................................................................................................................10
1.2. Proteinele membranare i rspunsurile celulare rapide...........................................................16
1.3. Evaluarea expresiei genelor i proteinelor n cadrul unor sisteme de analiz de mare
capacitate........................................................................................................................................27
1.4.Reaciile celulare spaio-temporale i analizele subpopulaiilor..............................................37
1.5. Analizele fenotipice ................................................................................................................49
2. IMPLICAREA GENELOR KNOCKOUT N NELEGEREA MECANISMELOR BOLII I
DEZVOLTAREA UNOR NOI STRATEGII TERAPEUTICE .....................................................58
2.1. Introducere ..............................................................................................................................58
2.2. Gene knockout la oareci ........................................................................................................59
2.3. Expresia genelor esut specifice..............................................................................................70
2.4. oareci transgenici ..................................................................................................................77
2.5. Lezarea genelor int la Drosophila ........................................................................................79
2.6. Inactivarea genelor int la petele zebr ................................................................................81
2.7 . Deleia tulpinilor int de Caenorhabditis elegans .................................................................82
3. SISTEME DE TESTE BAZATE PE GENE REPORTER CARE INVESTIGHEZ
RECEPTORII CUPLAI CU PROTEINA G IMPLICAI N DESCOPERIREA DE NOI
MEDICAMENTE ..........................................................................................................................84
3.1. Receptorii i comunicarea celular .........................................................................................84
3.2. Afinitatea i activitatea liganzilor GPCR................................................................................90
3.3. Rolul factorilor de transcripie n expresia genelor.................................................................91
3.4. Genele reporter.......................................................................................................................94
3.5. Sisteme de teste bazate pe gene reporter pentru investigarea GPCRs ..................................102
4. DE LA GENOMUL UMAN LA NOILE MEDICAMENTE: POTENIALUL
RECEPTORILOR ORFANI CUPLAI CU PROTEINELE G ..................................................109
4.1.Introducere .............................................................................................................................109
4.2. GPCRs i genomul uman ......................................................................................................111
4.3. Investigarea liganzilor...........................................................................................................116
4.4. Screeningul pentru liganzi oGPCR folosind teste funcionale.............................................124
4.5. Perspective ............................................................................................................................137
PARTEA A II-A: SINTEZA MEDICAMENTELOR PE BAZA ENZIMELOR I ACIZILOR
NUCLEICI...................................................................................................................................... 140
5.SINTEZA STEREOSELECTIV A MEDICAMENTELOR CU AJUTORUL ENZIMELOR
RECOMBINANTE......................................................................................................................140
5.1. Sinteza stereoselectiv nainte de apariia ingineriei genetice ..............................................140
5.2. Metode clasice de mbuntire a tulpinilor pentru sinteza stereoselectiv ..........................144
5.3. Ingineria genetic i apariia enzimelor recombinante pentru sinteza stereoselectiv..........146
5.4. Antibioticele -lactamice ......................................................................................................149
5.5. Antibioticele poliketide.........................................................................................................157
5.6. Vitaminele.............................................................................................................................160
5.7.Steroizii...................................................................................................................................167
5.8. Alte medicamente .................................................................................................................168
4
CUVNT NAINTE
Progresul uria nregistrat de biologia molecular de-a lungul ultimelor decenii a condus la
dezvoltarea a numeroase metode de cercetare inovatoare cu impact implicit asupra descoperirii i
dezvoltrii de noi ageni farmacologici.
Tehnicile moderne de identificare i validare a unor molecule inte pe de o parte i
descoperirea i ulterior descrierea de noi medicamente i mecanisme de aciune pe de cealalt parte
necesit un spectru extrem de larg de metode i tehnici care depete cu mult repertoriul
metodologiilor clasice . Descrierea molecular detaliat a interaciunii medicament - molecul int
este la fel de important i solicitant ca i cunoaterea interaciunii medicament ntregul sistem
fiziologic. Acum ne sunt la ndemn conceptele i informaiile despre transportul medicamentelor,
metabolismul i stabilitatea acestora. De asemenea, putem s prezicem i s determinm
modalitatea de reacie a ntregului sistem la administrarea unui medicament, chiar dac se tie c
acest medicament ar aciona doar la nivelul unei inte specifice. Metodele i conceptele moderne
care fac obiectul farmacogenomicii i toxicogenomicii au demonstrat clar acest principiu.
Lucrarea are patru pri: (1) Caracterizarea molecular a interaciunii medicament-int (2)
Sinteza medicamentelor pe baza enzimelor i acizilor nucleici , (3) Metode analitice implicate
implicate n producerea i utilizarea medicamentelor i n final, (4) Cinetic, metabolism,
toxicologie i dezvoltarea agenilor farmacologici.
Cel dinti capitol al primei pri prezint contextul biologic oferind o descriere la zi a
testelor celulare care ne sunt la ndemn, aplicabilitatea i impactul lor asupra descoperirii
agenilor farmacologici. Se analizeaz testele implicate n studiul proteinelor membranare, a
rspunsurilor celulare rapide, testrile pentru cercetarea expresiei proteice i genice celulare ,
analiza spaio-temporal i a subpopulaiilor celulare i nu n ultimul rnd determinarea fenotipului.
n capitolul doi al primei pri, se descriu elemente referitoare la oareci "knock-out" (oareci
transgenici obinui prin recombinare omolog, cu modificri genetice care pot conduce la
eliminarea funciei unei gene) i la tehnicile necesare generrii unor asemenea animale.
Receptorii cuplai cu proteina G fac obiectul capitolelor trei i patru. n primul dintre ele
accentul este pus pe caracterizarea receptorilor cuplai cu proteina G i aplicabilitatea genelor
"reporter" ca sisteme de transcriere, n timp ce capitolul urmtor fcnd referire la etapa postgenomic ofer strategii de identificare a liganzilor pentru receptorii "orfani" cuplai cu proteina G.
7
Partea a-IIa a crii se ocup de diferite aspecte ale sintezei medicamentelor.Se ofer o
combinaie clasic ntre elemente de sintez organic i biotehnologie realiznd tabloul sintezei
stereoselective a medicamentelor cu ajutorul enzimelor recombinante. Prima parte a acestui capitol
ne prezint o imagine de ansamblu asupra acestor elemente i ofer numeroase exemple evalund
rezultatele unor asemenea strategii.
n perspectiv vor fi utilizai ageni farmacologici care interacioneaz cu acizii nucleici .
Atractivitatea lor ca i liganzi cu specificitate mare a intrat mereu n conflict cu numeroase
probleme de farmacocinetic. Cu toate acestea, numeroase concepte cu privire la stabilizarea
acestor molecule, potenialul fascinant de a interaciona cu ARN-ul (RNAi) au fcut ca primele
medicamente aprobate s fie extrem de similare acestor molecule, spre exemplu manipulatorii
semnalizrii celulare. Capitolul 6 discut mai multe aspecte, incluznd sinteza i aplicabilitatea
unor asemenea tipuri de compui, incluznd tehnica interaciunii cu ARN (RNAi).
Partea a-IIIa se ocup de aspecte analitice. Separarea enantiomerilor (enantiosepararea)
medicamentelor chirale i cromatografia de afinitate sunt instrumente importante ale dezvoltrii
medicamentelor i elementele lmuritoare asupra acestor aspecte sunt prezentate n capitolele 7 i 8.
Metode analitice bazate pe tehnici de biologie molecular sunt incluse ntr-o serie de trei
capitole. Dou dintre acestea se axeaz pe descrierea tehnicilor RMN care au cunoscut o dezvoltare
deosebit n ultimele decenii. Aceast dezvoltare a condus ulterior la definirea tehnicii RMN ca un
instrument de baz n determinarea att a structurilor macromoleculare dar i a detectrii i
caracterizrii interaciunilor dintre ligand i molecula int. Capitolele 9 i 10 analizeaz
aplicabilitatea tehnicii RMN n descoperirea agenilor farmacologici i descrie tehnici de marcare a
proteinelor cu izotopi radioactivi de C13 i N15.
Realizarea unor modele de structuri medicamentoase realiste are la baz cunotine exacte
obinute prin cristalografie cu raze X. n ciuda, mbuntirilor evidente pe care le-a suferit
metodologia n acest domeniu de cercetare, structurile receptorilor membranari, care reprezint de
fapt intele cele mai importante ale medicamentelor, sunt nc neelucidate. Un pas uria ctre
rezolvarea acestei enigme l-ar putea constitui utilizarea fragmentelor de anticorpi drept elemente de
potenare ale cristalizrii. Detalii despre aceast nou i captivant tehnic sunt oferite cititorului n
capitolul final al prii a-IIIa .
Farmacogenomica i toxicogenomica sunt domenii noi cu un considerabil impact asupra
viitoarei dezvoltri a agenilor farmacologici. Ultima parte a crii se ocup de aceste subiecte noi,
care vor reui probabil cu timpul s genereze schimbri, renunndu-se la concepiile iniiale
"aceeai doz este recomandat pentru toi pacienii care au aceeai boal". Direciile moderne se
vor baza pe ideea "medicamentul adecvat, doza adecvat, persoana adecvat".
Pe de o parte, medicamentele vor aciona de manier mai intit i vor antrena mai puine
efecte nedorite, iar eficacitatea lor va crete.Pe de alt parte, medicii vor fi n msur s decid
plecnd de la profilul genetic al pacientului, dac un tratament are anse s reueasc i dac nu s
opteze pentru un alt tratament. Riscurile personale ascunse n genele unui anumit pacient vor
putea fi identificate de ctre medic i innd cont de specificitatea i individualitatea lor se va alege
strategia pentru prevenie i tratament.Totalitatea medicamentelor cunoscute sunt dirijate asupra
400 de biomolecule diferite ale organismului nostru ,molecule cunoscute sub numele de inte
terapeutice (drug targets) dintre care menionm:enzime,receptori,i alte biomolecule care sunt
inhibate sau asupra crora acioneaz ntr-o manier sau alta. Datorit decriptajului genomului
uman se vor descoperi ntre 3000 -10000 de biomolecule noi care vor fi utilzate ca situsuri de atac
molecular.
Terapia genic este o cale nou de cercetare ,care suscit un foarte mare interes. Ea i
propune s vindece sau s atenueze efectul unei maladii reparnd o gen defect sau activnd
sute de gene utile.Strategia introduce n celulele umane(cu excepia celulelor sexuale sau gamei) o
gen corectoare sau terapeutic destinat s reduc defectele genei afectate, n cazul maladiilor
genetice ,sau s acioneze ntr-un alt mod , de exemplu s ajute sistemul imunitar s elimine
cancerul.n aceste cazuri se acioneaz asupra genomului pentru ca organismul s produc o
protein de interes terapeutic , ceea ce presupune implicarea ADNului ca medicament. Dei sunt
puine maladii care pot fi tratate pe baza terapiei genice aceast strategie ne d numeroase sperane,
chiar dac ea nu poate fi utilizat curent avnd n vedere dificultile pe care trebuie s le
depeasc.
intele farmacologice rmn n mediul lor natural atunci cnd este analizat
modularea , astfel ca datele s aib o valoare predictiv nalt (Fig 1.1).
Cu toate acestea, mai trebuie spus c, pentru a utiliza experimentele celulare,
celulele trebuie scoase din mediul lor natural i crescute n culturi. Acest lucru va
conduce inevitabil la alterri ale repertoriului genelor i ale expresiei proteice i deci
ale fenotipului. Celulele utilizate n astfel de experimente trebuie deci s fie
caracterizate din punctul de vedere al funciilor reelelor intracelulare, rspunsului la
stimuli externi - cel puin pentru calea de semnalizare de interes - i comparate cu
rspunsul i evenimentele ce au loc la nivelul esutului sau organului. n multe cazuri,
acest lucru nu este nc pe deplin realizabil.
Fig. 1.1 Selecia intelor farmaceutice. Numrul mare al intelor farmaceutice poteniale
necesit un proces eficient de selectare a acelor inte pentru modularea cilor i fenotipurilor
relevante pentru anumite afeciuni. Experimentele celulare, care sunt strns legate cu intele de
interes, permit calificarea modulatorilor cu molecul mic identificai n experimentele celulare sau
biochimice de nalt capacitate, n conformitate cu funcionalitatea ntr-un mediu fiziologic relevant.
Experimentele celulare care nu sunt strns legate cu inta vor indica efectele sistemice ale
componenilor i pot fi interpretate ca i clasificare celular de siguran. Testele celulare pot fi
utilizate pentru prioritizarea intelor i a componenilor.
permite o
Fig. 1.2. Circuitul celular schematic i conceptul analizei sistemelor celulare. Celulele se
conecteaz cu mediul nconjurator printr-o varietate de receptori, canale i transportori.
Semnalizarea intracelular ,cile i reelele metabolice reacioneaz la stimulii intra- i extracelulari
ntr-o manier dependent spaio-temporal. Diferitele tipuri de celule reacioneaz diferit la acelai
stimul. Diferite tipuri de celule ale esuturilor normale i patologice sau celule manipulate genetic
pot fi expuse la stimuli diferii n prezena i n absena medicamentelor i reaciile celulare pot fi
13
evaluate. Analizele multiparametrice identific compuii cu efecte asupra homeostaziei celulei care
pot fi specifice intei, nelegate de int, reversibile sau ireversibile.
1.1.4.
Progrese
ale
mijloacelor
tehnologiilor
pentru
profilul
componentelor celulare
Perfecionarea sistemelor analitice [Straub i colab., 2001] i a sistemelor de
citire permite cercettorilor s obin aspecte clare ale alterrilor expresiilor genice i
proteice [Celis i colab., 2000], precum i a metaboliilor [Glassbrook i colab., 2000,
Nicholson i colab., 2002]. n afara situaiei n care este necesar o analiz pe scar
larg, tehnologiile curente permit obinerea unor rezultate convenabile pentru profilul
medicamentelor. Pentru studiile expresiei genice, experimentele care utilizeaz sonde
fluorescente pot substitui sistemele bazate pe cipuri cel puin pentru unele cazuri
bine selecionate [Broach, Thorner, 1996; Goetz i colab, 2000].
Actual sunt disponibile cteva sisteme de imagistic celular sau microscopie
de mare capacitate i scanare laser, precum i dezvoltarea unor noi markeri
fluoresceni i anticorpi specifici. Aceste combinaii permit studiul traficului
proteinelor n celule. Studiile dinamicii i interaciunii proteinelor a fost facilitat de
identificarea proteinelor florescente [Raamdonk i colab., 2000, Remington, 2002;
15
18
Antagonist
20
transport carrier sunt divizate n dou clase, transportori uniport (sisteme uniport),
respectiv transportori cuplai (sisteme de transport cuplat), primii transportnd un
singur tip de molecul de pe o fa pe alta a membranei, iar transportorii cuplai
transfer o molecul n funcie de transportul simultan sau secvenial al celei de-a
doua [Ardelean, Tripa, 2001].
Sistemele de transport cuplat sunt la rndul lor divizate n transportori simport,
care transport simultan moleculele n aceeai direcie i transportori antiport, care
transport moleculele n direcii opuse. Unii transportori specifici acioneaz ntr-o
manier pasiv, transfernd moleculele n funcie de gradientul de concentraie;
acesta este cazul multor nutrieni precum glucoza, gsit n concentraii mari n
spaiul extracelular. O situaie similar este reprezentat de canalele ionice cu poart
comandat de ligand sau de voltaj din sistemul nervos, care elibereaz ionii dup
stimularea de ctre neurotransmitori, respectiv depolarizarea membranar. n
schimb, transportorii activi sunt dependeni de hidroliza ATP-ului i ei transfer
moleculele mpotriva gradientului de concentraie.
Cel mai bine cunoscut i variat grup de proteine de transport activ l constituie
super-familia de transportori ABC (caset legat la ATP) [Dean i colab., 2001]. Au
fost descrise peste 50 de transportori ABC, substraturile transportate fiind foarte
variate: aminoacizi, monozaharide, ioni anorganici, polizaharide, peptide i chiar
proteine mari. Unul dintre cei mai studiai transportori ABC, proteina de rezisten la
mai multe medicamente - MDR1 (multi-drug resistance) [Brinkmann, Eichelbaum,
2001], a fost n centrul ateniei multor eforturi de descoperire a medicamentelor n
ultimii ani deoarece supraexpresia acestei proteine n celulele canceroase umane
poate determina rezistena simultan a acestor celule la o varietate de chimioterapice
din clase diferite.
Alte procese importante n care se implic transportorii ABC includ rezistena
la clorochin n malarie, prezentarea peptidelor antigenice celulelor imune n maladia
genetic fibroza chistic [Hwang i colab., 2001].
22
care
moduleaz
activitatea
canalelor
ionice
este
imperativ
Fig 1.4 Activitatea canalelor ionice n miotuburi difereniate. Linia celular de celule
musculare murine C2C12 a fost utilizat pentru validarea colorantului FMP. Celulele C2C12 au fost
adugate n plci i difereniate n miotuburi prin expunerea la ser de cal. Celulele C2C12
difereniate exprim nAchR, iar depolarizarea celulelor poate fi indus cu un agonist specific pentru
receptor, precum carbacol. Exemple de agonist i antagonist sunt reprezentate n graficele mrite.
29
Media a 8 godeuri
6364
6347
9028
12006
20436
31292
38343
SD
641
314
458
509
1476
1181
2027
Factorul Z
n.d.
-0,238
0,389
0,549
0,781
0,750
Fig 1.5 Inducia dependent de doz a genei reporter a luciferazei de ctre o substan
inductoare utilizat ca i control agonist n HTS. Fiecare valoare reprezint media a 8
determinri separate, barele de eroare indic 1 SD. Media determinrilor luminometrice msurate cu
TopCount NXT (PerkinElmer Life Science) este reprezentat mpotriva concentraiei substanei
inductoare (mM). Valorile obinute n absena compusului se refer la expresia bazal a genei
reporter a luciferazei i constituie fundamentul reaciei.
32
Utilizarea genelor reporter din liniile celulare pentru profilurile expresiei a fost
mai profund documentat de Farr i Todd (1998), care au stabilit un model de linii
celulare ce conin gena reporter pentru N-acetiltransferaza cloramfenicolului (CAT)
sub controlul promotorilor indicatori pentru rspunsurile la stresurile celulare.
Inducia unor construcii de reporteri de ctre compuii chimici poate oferi indicaii
cu privire la aciunea compuilor la nivel subcelular. Astfel, construciile promotorgen reporter exprimate n linii celulare bine caracterizate pot oferi sisteme utile
pentru profilul compuilor innd seama de activarea cilor de transducie a
semnalului recunoscut care se asociaz cu anumite fenotipuri. Sistemul de analiz va
detecta compui care moduleaz direct expresia genei reporter i pe aceia care
interfer cu expresia provocat prin stimuli externi cum ar fi factorii de cretere i
citokinele. Cnd un tablou de analize ale genelor reporter este utilizat pentru profilul
compuilor, modele de expresie similar pot demonstra mecanisme comparabile de
aciune ale compuilor testai n celule intacte. Modificri ale modelelor expresiilor
ca rspuns la ci de semnalizare specifice i n linii celulare diferite pot aduce
informaii cu privire la specificitatea compuilor testai. Aceste sisteme pot fi uor
adaptate pentru HTS i pentru analiza n dinamic i a dependenei de doz a
induciei. n consecin, crearea profilului modulatorilor identificai sau a seturilor de
compui rezultai din optimizarea modulrii compuilor activi farmacocinetici poate
permite organizarea compuilor n grupe cu rspunsuri farmacologice similare. De
exemplu, activarea genelor reporter cuplate la elementul p53-responsiv (p53RE) va
arta c acel compus testat conduce la lezri ale ADN; activarea reporterilor sub
controlul elementului de rspuns la xenobiotice (XRE) va conduce la inducia
transcripionala a enzimelor ce catalizeaz metabolismul medicamentelor, precum
citocromul P450 i altele. Astfel, realizarea profilului genelor reporter in vitro cu un
set de gene bine definite i validate poate contribui nu numai la clasificarea
compuilor, dar i la identificarea unor posibile efecte adverse ale compuilor testai.
Recent, cu ajutorul unor tehnici mai sensibile de monitorizare a expresiei
genice, a fost raportat un nou set de analize. n timp ce analizele genelor reporter au
fost coroborate cu ideea vizualizrii unui eveniment particular al expresiei genice prin
35
Metodologia
transcriptul capturat prin amprenta SAGE,
identificarea
i
cuantificarea
prin
secvenierea concatemerelor seriate
GeneCalling
amprentarea prin endonucleaze de
(profilarea
restricie a ADNc, confirmare prin PCR
transcriptului)
competitiv
TOGA
PCR bazat pe ADNc, identificarea ARNm
cu capt 3poli(A) prin secveniere
Microarray/
hibridizarea ARN total la sonde ale
oligoarray ADN
genelor aranjate pe chip-uri de silicon sau
lame de sticl
RT-PCR Cantitativ eliberarea mediat prin PCR a unor sonde
(TaqmanTM)
fluorogenice specifice genelor; limita de
detecie este invers proporional cu
concentraia
ADN
ramificat detecia direct a ARNm prin hibridizarea
(branched
DNA) cu un linker specific genei i amplificarea
(QuantigeneTM)
sondei
TM
HPSA
detecia direct a ARNm prin hibridizarea
cu captur specific genei i amplificarea
sondei
Gene int
HTcompatibil
Probe
puine
96 de reacii
puine
256 de reacii
puine
HTcompatibil
puine
puine sonde
format cu
96
de
godeuri
1 sond
format
96
godeuri
format
96
godeuri
2 sonde
cu
de
cu
de
genele induse de un compus particular pot fi detectate. Sistemele deschise pun sub
semnul ntrebrii tehnologia ADN microarray, oferind o alternativ la costurile nalte
i la necesarul nalt al materialului iniial asociate cu aceste tehnici. n practic, ele se
vor dovedi utile dac trebuie analizate doar cteva probe pentru detecia produilor
mai multor gene diferite.
Reacia de polimerizare n lan cantitativ (RT-PCR), tehnologia ADN
ramificat (branched DNA) promovat de Bayer (Emeryville, CA) i amplificarea de
nalt performan a semnalului (high-performance signal amplification - HPSATM)
promovat de Chromagen (San Diego, CA) pot detecta moleculele de ARNm.
Acestea sunt denumite sisteme nchise deoarece pot fi aplicate numai genelor cu
secven cunoscut. Totui, aceste metode pot fi utilizate pentru HTS deoarece
reaciile pot fi realizate n plci, permind procesarea simultan a mai multor probe.
Mai mult, au avantajul de a fi mai flexibile i pot fi realizate pe orice surs i detecia
noilor gene necesit doar design-ul i sinteza unor sonde specifice genelor. Aceste noi
tehnologii promit o cretere a sensibilitii, cu rezultate necompromise de efectele
secundare datorate genelor reporter, dar nc nu sunt att de larg utilizate ca sistemele
genelor reporter.
37
39
Fig 1.6 Translocaia nuclear a NF-B n dinamic. Celulele HeLa au fost stimulate cu 1
ng/ml de IL-1a la 37oC. Sunt reprezentate valorile medii a 100 de celule msurate n fiecare godeu
n dou experimente separate (Exp 1 si Exp 2). Nuc-CytoInten = intensitatea fluorescenei nucleare
minus intensitatea fluorescenei citoplasmatice.
Fig 1.7 Relaia doz-rspuns a translocaiei nucleare a NF-B indus de IL-1a. Celulele
HeLa au fost stimulate cu concentraiile indicate de IL-1a pentru 30 de minute la 37oC. Sunt
reprezentate valorile medii a 100 celule msurate per godeu n dou experimente separate (Exp 1 si
Exp 2). Nuc-CytoInten = intensitatea fluorescenei nucleare minus intensitatea fluorescenei
citoplasmatice
41
Fig. 1.8 Translocaia NF-B indus de IL-1a n celulele HeLa. Celulele au fost marcate
cu anticorp de iepure antip65 pentru NF-B i anticorp de capr anti-anticorpul de iepure Alexa
Fluor 488. ADN-ul nuclear a fost marcat cu Hoechst 33342. NF-B este cuantificat prin msurarea
intensitii fluorescenei verzi; nucleii apar albatrii. Celulele nestimulate (stnga) prezint
fluorescena verde mai ales n citoplasm, pe cnd celulele stimulate cu IL-1a 2ng/ml 30 de minute
la 37oC (dreapta) prezint translocaia NF-B n nucleu.
43
44
Fig 1.9 Consumul de oxigen de ctre celulele HeLa n urma expunerii la trinitrat de
sodiu. Celulele (1x105), au fost adugate n godeuri separate ale unei plci cu biosenzori pentru
oxigen i tratate cu trinitrat de sodiu n concentraiile indicate. Celulele au fost cultivate i
fluorescena a fost msurat la momentele indicate. Concentraiile micromolare mici ale trinitratului
nu au influenat creterea celulelor HeLa. n schimb, concentraiile micromolare ale trinitratului de
Na sunt toxice i fluorescena relativ este meninut la un nivel constant. Descreterea consumului
de oxigen la 126 de ore dup adugarea medicamentului indic faptul c celulele au confluat i au
ncetat s prolifereze.
50
1.5.2. Apoptoza
Apoptoza, sau moartea celular programat, este unul dintre cele mai complexe
procese celulare. Evenimentele timpurii i tardive care apar n celulele supuse
apoptozei cuprind activarea diferitelor caspaze, modificri ale citoscheletului,
modificri ale potenialului membranei mitocondriale i a masei mitocondriale,
condensarea sau fragmentarea nuclear, micarea de flip a fosfatidilserinei pe faa
extern a membranei celulare i dezorganizarea membranei plasmatice.
Modificri ale morfologiei nucleare, reorganizarea actinei i a potenialului i
coninutului mitocondriei pot fi detectate i cuantificate prin analiza multiparametric
a apoptozei [Woo i colab., 1999]. Mrirea sau ngustarea ariei nucleare i distribuia
cromatinei n interiorul nucleului este analizat prin colorarea celulelor cu un colorant
ADN fluorescent, precum DAPI sau Hoechst 33342.
Gruparea filamentelor intracelulare de actin F i mrirea coninutului n actin
a celulelor apoptotice sunt detectate cu ajutorul faloidinei fluorescente. Aceast
falotoxin, izolat din ciuperca Amanita phalloides, se leag foarte nalt specific la
actina F i poate fi marcat cu un colorant fluorescent. Cu toate acestea, creterea
coninutului de actina F nu este observat n toate cazurile n celulele apoptotice,
depinznd de tipul de celul sau de inducator.
Colorantul cationic specific mitocondriilor, MitotrackerR Red, care se
acumuleaz n mitocondriile active, este utilizat pentru a estima potenialul
membranar i coninutul mitocondrial [Camilleri-Broet i colab., 1998]. n ambele
cazuri, cantitatea de colorant de la nivelul mitocondriei este o masur a nivelului
apoptozei. n cazul aplicaiei multiparametrice a apoptozei, algoritmul ArrayScan II
nu numai c cuantific marcajul, dar ia n considerare distribuia colorantului
fluorescent n compartimentele celulare i calculeaz fragmentarea nuclear i
creterea coninutului mitocondial.
Acest algoritm a fost aplicat cu succes n detecia apoptozei induse de anumii
compui i poate fi utilizat pentru HTS.
51
1.5.3. Diferenierea
Celulele stem umane de diferite tipuri au capacitatea de a se diferenia ntr-un
numr de tipuri de celule mature.Asemenea celule stem fiind n mod curent utilizate
n transplantul de mduv osoas i n cercetarea medicamentelor. Noi medicamente,
precum factorul stimulator al coloniilor de granulocite i eritropoietina au fost create
pentru a aciona direct asupra acestor celule, fiind eseniale pentru succesul
transplantului de maduv osoas. Expansiunea progenitorilor din maduva osoas este
extrem de sensibil la o varietate de chimioterapice i ali agenti toxici. n unele
cazuri, efectele adverse toxice ale medicamentelor sunt specifice pentru liniile
hematopoietice.
n trecut, utilizarea progenitorilor hematopoietici pentru descoperirea
medicamentelor pe baza analizelor de mare capacitate i screening-ul toxicologic era
limitat de disponibilitatea esutului. innd seama de disponibilitatea actual a
progenitorilor hematopoietici umani de nalt calitate, impasul curent l constituie
utilizarea acestor celule n reaciile fenotipurilor lor de difereniere.
Cea mai utilizat reacie in vitro pentru a determina rspunsul diferenierii
celulelor progenitoare hematopoietice este reacia coloniei [Eaves, 1995]. Aceast
reacie utilizeaz populaii progenitoare selectate din mduva osoas uman, cordonul
ombilical sau sngele periferic mobilizat n reacii clonogenice ntr-un mediu semisolid. Dup o perioad de 14 zile apar colonii ale diferitelor tipuri de celule sanguine
difereniate care sunt numrate manual. Diferite tipuri de colonii sunt identificate
datorit morfologiei lor (mieloide sau eritroide) sau prin tehnici de colorare
citochimic (megacariocite). Dei parametrii acestei reacii au fost optimizai pentru a
obine date cantitative, rezultatele extrem de reduse i natura subiectiv a acestei
reacii determin anumite probleme atunci cnd reacia este utilizat pentru
screening-ul bibliotecii de compui chimici, descoperirea iniiala a medicamentelor i
screening-ul toxicitii prin analize de mare capacitate.
Rspunsuri difereniate pot fi obinute i prin transfecia unei celule int cu o
gen pentru un receptor legat de expresia unui marker specific de difereniere.
52
senzorilor
microelectronici
biochip-uri
miniaturizate
pentru
adaosuri sau markeri i poate fi realizat n orice mediu, de la soluii apoase simple la
mixturi foarte complexe (celule), permind o abordare direct pentru determinarea
modificrilor n fenotipul celular (difereniere).
Proteinele izolate n soluii tampon fiziologice expuse la o serie de frecvene
ale microundelor, demonstreaz dou proprieti: rspunsul spectral (semntura
proteinelor) i profilul biofizic. Prima proprietate determin un rspuns natural al
fiecarei proteine ntr-un interval de frecvene. Profilul biofizic descrie modul n care o
protein interacioneaz cu mediul volumul molecular, complexarea cu apa,
interaciunea cu ali compui/proteine precum i modul n care se compar cu alte
proteine aparinnd unor clase similare. Prin scanarea unui interval de frecvene i
evaluarea diferitelor medii (condiiile de tamponare, prezena cofactorilor), aceast
analiz definete o semntur multidimensional pentru fiecare protein chiar i n
medii complexe (celulare). Aceasta ar putea permite dezvoltarea unor reacii cellbased prin care profilul biofizic al proteinelor int s poat fi analizat ntr-un mediu
care mimeaz situaia din esuturile primare afectate de boal.
57
CAPITOLUL 2
IMPLICAREA GENELOR KNOCKOUT N NELEGEREA
MECANISMELOR BOLII I DEZVOLTAREA UNOR NOI
STRATEGII TERAPEUTICE
2.1. Introducere
Lezarea genelor int la oareci reprezint a nou tehnologie care
revoluioneaz cercetarea biomedical, constituind un puternic instrument pentru
producerea modelelor animale pentru studiul dezvoltrii umane i a bolilor ereditare.
Chiar dac proiectul genomului uman a ajutat la stabilirea celor aproximativ 35000
de gene candidate, doar o mic parte din aceste gene au fost caracterizate precis
pentru funcia lor in vivo.
Genele int au un mare impact n ncercrile de a elucida rolul funcional al
acestor gene. Beneficiul major al acestei tehnologii este acela de a permite analiza
funciei proteinei produs de o anumit gen in vivo. Astfel funcia genei poate fi
determinat n toate tipurile de celule normale, lund n considerare i interaciunile
complexe ntre molecule sau celule. Este astfel posibil determinarea produsului
genei n condiii de repaus al corpului, dar i n diferite situaii patologice i
fiziologice.
Multe modele de gene knockout la oareci simuleaz fenotipul bolilor umane.
Modelele de oareci modificate genetic reprezint oportuniti unice pentru
dezvoltarea i testarea diferitelor strategii terapeutice nainte ca acestea s fie
introduse n clinic.
n viitor, ingineria genetic pe modele animale va fi indispensabil pentru
realizarea unor descoperiri importante n ceea ce privete mecanismele moleculare
care stau la baza semnalizrii celulare, dezvoltrii, dar i a patogenezei,
diagnosticului, prevenirii i tratamentul bolilor.
58
Deoarece aceste celule provin din stadii timpurii ale dezvoltrii ele sunt celule
pluripotente. Toate genele lor pot fi activate i toi produii lor genici pot fi sintetizai.
De asemenea ES pot fi subcultivate cu o eficien rezonabil, permind ca un numr
crescut de celule s fie folosite n procese ca transfecia i recombinarea secvenelor
omooage. n plus, celulele ES ale oarecilor pot fi meninute ntr-un stadiu
nedifereniat, n monostraturi de tip fibroblastic i cnd mediul de cultur este
mbogit cu factor inhibitor leucemic.
n ciuda acestui tratament, celulele ES pstreaz capacitatea lor de a contribui
la toate tipurile de esuturi i toate liniile celulare cnd sunt reintroduse ntr-un
blastocist gazd [Nagy, i colab., 1993].
2.2.2. Vectori int
Pentru a stabili modelul de oarece knockout, este realizat o construcie de
ADN, numit vector int ce conine forma mutant a genei de interes (fig. 2.2). Iniial,
primii vectori int utilizai pentru a leza funcia genei int prin deleia de secvene
specifice i nlocuirea lor cu ADN heterolog, erau o gen de selecie pentru
medicamente sau o gen marker pentru analiza expresiei genei int [Zhang i colab.,
1994].Cum este artat n figura 2.2 vectorul int cuprinde trei elemente principale
ordonate specific: i) o regiune 5' omoloag genei int, ii) o gen marker de rezisten
la medicamente pentru selecia pozitiv a celulelor care integreaz vectorul int, iii)
o regiune 3' omoloag genei int.
Secvenele ADN de la nivelul regiunilor 3' i 5' din vectorul int reprezint
substratul pentru crossing-overul reciproc sau pentru
mecanismul de conversie
62
tehnica Southern blot care utilizeaz sonde specifice pentru locusul int n celulele
ES (fig. 2.2), motiv pentru care acestea, ar putea conine gena marker de selecie
negativ care dobndete mutaii de inactivare, nainte de integrarea aleatorie a
vectorului int n genomul celulei ES.
construirii unui cmp electric. Cmpul electric deschide porii membranei celulelor ES,
permind intrarea vectorului int. Cnd curentul electric este ntrerupt , membrana
celulelor ES revine la situaia normal.
64
medicamentelor
permite
mbuntirea
recuperrii
celulelor
ES
Figura 2.4.
Figura de sus. Clone celulare multiple de celule stem embrionare ce cresc
formnd monostraturi de fibroblati. Fibroblatii provin de la embrioni de oareci transgenici
purttori ai casetei de selecie Neo, conferind rezisten la geneticin pentru selecia pozitiv.
Fibroblatii sunt iradiai pentru a preveni proliferarea lor ulterioar, dup pregtirea acestora din
embrioni,
Figura de jos. Injectarea celulelor ES n blastocist. Celule ES individualizate sunt
ncrcate ntr-o pipet de injectare. (1), vrful ascuit al pipetei ptrunde n cavitatea blastocistului
(2) cu grij i ncet se mpinge vrful de injecie al pipetei n embrion fr ruperea sau neparea
peretelui opus(3), celulele ES sunt expulzate prin presiune pozitiv, (4), acul este retras din
embrion (5), i blastocitii injectai sunt colectai pentru transferul la femele recipient( surogat) (6).
66
n cele din urm, lipsa produsului genei la homozigoii mutani este evideniat
prin anticorpi specifici prin tehnica Western blot folosind esut unde proteina este, de
obicei, exprimat.
Figura 2.5. mperecherea oarecilor himer, cu oareci de tip slbatic( wild type)
pentru obinerea de heterozigoi mutani. Clonele de celule stem embrionare puttoare a unei
alele de tip slbatic i unei alele mutante (+/-) sunt injectate n blastociti.Se observ analiza
Southern blot caracteristic pentru clonele de celule ES. Blastocitii injectai sunt transferai la
femele recipient care vor da natere la himere. De obicei celulele ES purttoare de mutaii
dominante care determin culoarea maroniu-glbuie a blnii (rasa SV129), sunt injectate la
blastociti de la oareci de ras neagr (rasa C57B16). Prin urmare, gradul de hibridizare poate fi
uor recunoscut prin contribuia culorii maroniu/glbuie la culoarea blnii. Himerele sunt apoi,
mperecheate cu oareci C57B16 de culoare neagr. n cazul transmiterii mutaiei pe linie germinal,
oarecii heterozigoi F1 (+/-) vor fi cu blana maroniu-glbuie.Ca urmare a mperecherii oarecilor
heterozigoi ntre ei, un sfert din oareci vor fi homozigoi F2, dac viabilitatea nu este
compromis de mutaii.
68
70
Figura 2.7. Knockout condiional utiliznd LoxP/ CRE. Locusul de tip slbatic i
construcia int condiional prezint trei situsuri LoxP ce flancheaz caseta marker de selecie a
tandemului Neo/Tk i exonul care va fi deletat. O prima int este recombinarea dintre aceast
construcie i locusul ales. O clon recombinat pozitiv este aleas pentru a doua faz , ce cuprinde
trasfecia cu vectorul ADNc - recombinaza CRE . Dup expunerea la CRE sunt posibile 3
evenimente recombinatorii. Populaia celular A prezint excizia complet i poate fi utilizat
pentru injectarea blastocitilor pentru a genera knockout total la oareci. Populaia de celule B este
forma n care caseta de selecie a fost eliminat, dar gena nu este nc deletat. Aceste celule ES
sunt preluate pentru a stabili knockoutul condiional, unde exonul flancat este deletat mai trziu,
adic dup ncruciarea animalelor rezultate cu oareci transgenici ce exprim recombinaza CRE
sub un promotor esut specific. Secvena palindromic parial de nucleotide a situsurilor LoxP este
prezentat n partea inferioar.
71
Astfel, situsurile LoxP trebuie s fie poziionate pentru a nltura exonii care
codific un important domeniu funcional i ca rezultat ar avea loc schimbarea
cadrului de citire. Genele de rezisten incluse pentru selecia clonelor int conin de
obicei mai multe kilobaze de ADN strin, care are potenialul de a influena expresia
genei int nainte de recombinare. Pentru a minimaliza aceast potenial influen
asupra expresiei genei, este posibil s se nlture gena de rezisten din clonele
celulelor ES int in vitro, nainte de microinjectarea blastocitilor. Pentru a elimina
genele de rezisten, un situs suplimentar LoxP trebuie s fie inclus pentru a flanca
gena de rezisten (fig. 2.7). ADN-ul genomic modificat ar include, astfel, trei situsuri
LoxP, dou poziionate pe flancuri, nsoind gena de rezisten, precum i cel de-al
treilea situs situat pentru producerea deleiei dorite, atunci cnd apar recombinari.
Transfecia clonelor celulare int de celule ES cu un vector care conine ADNc al
recombinazei CRE produce celule ES cu trei configuraii genomice alternative n
plus fa de clonele non-recombinate (fig. 2.7).
Pentru a limita numrul evenimentelor de recombinare i pentru a facilita
selecia dorit de clone, o selecie negativ poate fi realizat prin adugarea
ganciclovirului n celule ES. Aceast strategie necesit utilizarea unei casete marker
de selecie care conine att gena Tk ct i gena Neo de rezisten pentru selecie.
Adaosul de ganciclovir n culturile celulare de ES va permite creterea clonelor cu : i)
exonul de interes flancat de dou situsuri LoxP, i anume exonul delimitat pentru
knockout-ul condiionat i ii) clonele de celule ES cu un singur situs LoxP, gata de
utilizare pentru stabilirea knockout-ului general. Astfel, folosind trei site-uri LoxP i
caseta marker de selecie Neo/Tk introduse n genomul celulei ES se produc ambele
tipuri de clone clasice pentru: knockout-ul general i knockout-ul condiionat.
Selecia clonelor n care gena de rezistena a fost deletat i ADN-ul genomic, cu
modificri adecvate, a fost lsat intact, poate fi realizat prin screening folosind
tehnica Southern blot. Cnd injectarea
blastocitilor
i transmiterea pe linie
n genomul
mamiferelor.
2.3.1. Recombinaza CRE ligand activatoare
n ultimii ani, au fost dezvoltate tehnologii, care permit noi abordri n scopul
de a controla temporal i esut specific mutaia dorit pentru expresia genelor
inductibile la oareci transgenici i care pot fi combinate cu mai multe gene int
convenionale. De exemplu, o metod pentru genele int condiionate este bazat pe
supraexpimarea recombinazei CRE care ar putea permite inactivarea genei int
flancat, esut-specific, n orice moment din timpul dezvoltrii i la oarecele adult
(fig. 2.8., figura de jos).
Fuziunea domeniului de legare la ligand (LBD) al receptorilor de estrogen cu
recombinaza CRE genereaz o recombinaz himeric a crei activitate este
dependent de prezena receptorilor de estrogen sau de tamoxifen modulator al
receptorilor de estrogen [Metzger , 2001]. Pentru a obine gene int condiionate la
oareci, n cazul n care estradiolul endogen este prezent, s-a indus fuziunea
recombinazei CRE cu LBD mutant al receptorilor de estrogen uman. LBD mutant al
receptorilor de estrogen nu este legat de estradiol, ntruct acesta se leag de ligandul
sintetic pentru tamoxifen.
73
Figura. 2.8.
Figura de sus. Strategie de reproducere pentru obinerea unor oareci cu knockout
celular specific. oarecii care prezint alele nule , i n plus sunt purttori ai alelei unde gena sau
exonul care vor fi deletai sunt flancai de dou situsuri LoxP ( exoni flancai) sunt fenotipic oareci
heterozigoi. Cnd sunt mperecheai cu oareci transgenici care exprim recombinaza CRE (C) sub
un promotor esut specific aceti oareci devin homozigoi mutani nuli n ceea ce privete acest
esut.
Figura de jos. Strategie de reproducere pentru obinerea de oareci cu knockout
celular specific sub control temporal. Transgena-recombinaza CRE fuzionez cu ADNc
domeniului de legare al ligandului receptorului de estrogen. Activarea recombinazei CRE este
dependent de prezena tamoxifenului, care poate fi furnizat oarecilor n apa potabil. Adaosul de
tamoxifen permite knockoutul genei sau exonului de interes oricnd n punctul dorit.
74
promotorul tetO minimal i transcrierea este indus de mai multe mii de ori n
esuturile oarecilor transgenici. Dup cum este ilustrat (fig. 2.9), este necesar s se
genereze dou linii de oareci care sunt homozigoi pentru gena tTA i heterozigoi
pentru locii mutani ,,de tip sandwich", i homozigoi pentru transgena CRE i
respectiv, heterozigoi pentru pentru locii mutani ,,de tip sandwich". Prin
reproducerea celor dou linii de oareci, 25% dintre pui vor fi homozigoi pentru
locusul mutant condiional i heterozigoi att pentru transgena tTA ct i CRE.
nucleazic.
81
de
gene
knock-out
presupune
deseori
utilizarea
sporadic
de
trimetilpsoralen, care este mutagen pentru un numr foarte mare de viermi [Jansen ,
1997]. Expunerea la mutageni are ca rezultat mutaii aleatoare n celulele embrionare.
82
83
CAPITOLUL 3
SISTEME DE TESTE BAZATE PE GENE REPORTER CARE
INVESTIGHEZ RECEPTORII CUPLAI CU PROTEINA G
IMPLICAI N DESCOPERIREA DE NOI MEDICAMENTE
3.1. Receptorii i comunicarea celular
Organismele superioare, printre care, i omul, conin milioane de celule care au
un rol important n reglarea funciilor fiziologice. n consecin, celulele au
capacitatea de a comunica una cu cealalt i o disfuncie de comunicare celular
poate conduce la diverse boli. n controlul funciei celulare, o influen considerabil
o au moleculele de semnalizare extracelular i complementar acestora numeroase
proteine receptor [Uings, 2000]. Fiecare celul rspunde la un anumit set de semnale
care acioneaz n diverse combinaii pentru a regla comportamentul celulelor. Din
cauza structurii unice tridimensionale a proteinei receptor, numai cteva molecule de
semnalizare sunt capabile de a se lega de un anumit receptor. Prin urmare, fiecare
celul acioneaz ntr-un mod caracteristic i programat.
Cele mai multe molecule de semnalizare extracelular, cum ar fi adrenalina,
serotonina, dopamina i neuropeptidul Y sunt hidrofile, i pot activa receptorii
proteinelor numai la suprafaa celulelor int. n consecin, receptorii transmit
semnalul prin conversia evenimentelor extracelulare n semnale intracelulare care
modific comportamentul celulelor int.
Exist trei mari familii de receptori de suprafa celular, care aparin la
aceeai familie de proteine transmembranare: i) receptorii cuplai cu canale ionice, ii)
receptorii de suprafa cu activitate enzimatic i iii) receptorii cuplai cu proteine G.
Fiecare familie asigur o transducie specific a semnalelor extracelulare.
84
inclusiv
receptorii
nicotinici
pentru
acetilcolin,
receptorii
5-
85
de mesager secund
88
ligandului. Celule sau membranele care exprim receptorii sunt incubate n prezena
GTP-ului radiomarcat i ligandului cercetat. Radioactivitatea poate fi msurat dup
separarea celulelor sau membranelor de supernatant. Valorile radioactivitii sunt
corelate cu stimularea receptorilor care sunt asociai cu proteina G.
Testele ELISA convenionale pot fi utilizate pentru a msura mesagerii secunzi
ca: AMPc, GMPc, diacil glicerol sau IP3. Concentraia de AMPc mesager secund
depinde de tipul de protein G activat i poate duce fie la creterea (Gs,) sau fie la
scderea (Gi ) mesagerului secund. Determinarea semnalului de la nivelul celui deal doilea mesager este uneori foarte dificil pentru c nu toate celulele exprim optim
proteine G sau mesagerul secund care este imediat degradat. Prin urmare, genele
reporter n combinaie cu promotori speciali i elemente intensificatoare sunt folosite
pentru a genera un set nou de tehnici. Dup legarea ligandulului la GPCR, este
modulat concentraia de mesager secund, activitile enzimelor, i prin urmare
legarea factorilor de transcriere de elementele intensificatoare. n consecin, expresia
genelor reporter este dependent direct de activarea GPCR i de calea de transducie a
semnalului activat. Semnalul rezultat este mai stabil i mai uor de cuantificat.
specifice pentru un singur factor de transcripie sau pentru un membru al unei singure
familii de factori de transcripie. Factorii de transcripie se pot lega ca monomeri,
homodimeri sau heterodimeri la secvenele repetitive specifice. Dup legarea de
situsul lor specific de legare, factorii de transcripie interacioneaz ntre ei, cu ARN
polimeraza II i cu ali factori bazali pentru a regla expresia genei.
n prezent, mai mult de 300 de factori de transcriptie au fost identificai n
genomul vertebratelor. Activitatea unor factori de transcriere este modulat de
fosforilarea lor. Dintre factorii de trascripie bine nelei i studiai menionm:
proteina de legare a elementului de rspuns la AMPc (CREB), factorul de legare a
elementului de rspuns seric, factorul nuclear al celulelor T activate (NF-AT),
proteinele c-Jun i STAT. Situsurile de recunoatere a acestor factori de transcripie
sunt adesea folosite n promotori pentru realizarea de sisteme de teste care utilizeaz
genele reporter pentru investigarea GPCRs (fig. 3.1).
3.3.1. CREB (proteina de legare la elementul de rspuns la AMPc)
CREB este implicat n calea AMPc. Dup activarea receptorilor cuplai cu
proteina Gs, care regleaz pozitiv AC, nivel intracelular de AMPc este crescut.
AMPc activeaz proteina kinaza A (PKA), care permite unitii catalitice a PKA s
intre n nucleu unde fosforileaz CREB, pe serin n poziia 133.
CREB fosforilat se leag de elementul intensificator al elementului de rspuns
la AMPc (CRE). Transcrierea genelor linkate este activat dup legarea proteinei de
legare CREB (CBP) la CREB. Stimularea GPCRs cuplai cu Gi scade AMPc
intracelular i determin o reducere a transcripiei genei reporter CRE-linkat.
3.3.2. SRF
Calea MAPK este o cale foarte important de semnalizare pentru receptorii
tirozin kinazici i este necesar pentru fosforilarea SRF. SRF se leag la elementul de
rspuns seric, la situsul de legare ADN prezent, de exemplu, n promotorul c-FOS,
care conduce la transcrierea c-FOS, un alt factor de transcriere. Numai n combinaie
cu factorul complexului ternar (TCF/Elk1), SRF se poate lega la SRE i activa
92
transcripia genei. Ambii factori de transcripie, SRF i TCF sunt activai prin
fosforilarea MAPK. S-a artat c subunitile ale proteinelor Gi activeaz aceast
cale, via activarea MAPK RAS-dependent. Stimularea MAPK via receptori cuplai
cu Gq are n principal ca rezultat activarea protein kinazei C (PKC) [Cruce i colab.,
2004].
3.3.3. Proteinele STAT
Proteinele care sunt factorii de transcriere STAT sunt activate dup stimularea
receptorilor de citokine i receptorilor tirozin kinazici. n prezent, sunt cunoscute 6
proteine STAT (STAT1-STAT6).
Dup activarea receptorilor prin legarea ligandului aceti receptori se asociaz
cu tirozin kinaza JAK , care, la rndul su este fosforilat. Ulterior, JAK kinazele
activate pot activa din nou proteinele STAT prin fosforilare, urmate de formarea
dimerilor. Dimerii sunt translocai n nucleu i se leag de situsurile de legare ADN
ale elementului de rspuns stimulate de interferon (ISRE), i este iniiat transcrierea
genelor. Studii recente demonstreaz activarea i implicarea cii STAT3 n cile Gi
i Go protein mediate [Ram , 2001].
3.3.4. c-Jun
Factorul de transcripie c-Jun este fosforilat de o protein kinaz, JNK (c-Jun-Nterminal kinaza), care este un membru nou al familiei MAPK. De asemenea aceast
kinaz, fosforileaz factorul de transcripie ATF2. ATF2 i c-Jun constituie
un
94
Avantaje
- fr expresie endogen n
celule mamiferelor
- confirmarea vizual a activitii
enzimei
-Galactosidase
( -Gal)
-Glucuronidaza
Fosfataza alkalin
secretat (SEAP)
Luciferaza
Proteina fluorescent
verde
(GFP)
- protein secretat
- formate de teste variate
- sensibil (teste fluorimetrice)
- rapid i uoar
- de mare sensibilitate
- fr activitate endogen
- variante GFP pot fi detectate n
aceeai celul
- investigaii n celule vii
- autofluorescen (nu necesit
substrat)
96
Dezavantaje
- costuri ridicate pentru
izotopi i sisteme TLC
- radioactivitate
- liz celular
- substraturi suplimentare
- teste colorimetrice nu
foarte sensibile
- activitate endogen n
anumite tipuri de celule
- liz celular
- activitate endogen n
celulele mamiferelor
- liz celular
- activitate endogen n
celulele mamiferelor
- teste colorimetrice nu
foarte sensibile
- liz celular
- adiie de substrat
- liz celular
- adiie de substrat
- protein relativ stabil
- cititor fluorescent sensibil
3.4.2. -Gal
-Gal este o enzim bacterian bine caracterizat i este compus din patru
subuniti, fiecare cu o greutate molecular de 116 kDa. Cataliza hidrolizei
zaharurilor de -Gal cum ar fi lactoza este raportat ca un test funcional. Activitatea
enzimatic din extractele celulare poate fi analizat cu diferite substraturi speciale,
care s permit cuantificarea activitii enzimei cu un spectrofotometru, fluorimetru
sau luminometru.
De asemenea, au fost dezvoltate metode de colorimetrie simpl cu o-nitrofenilBD-galactopiranozid (ONPG) sau clorofenol rou BD-galactopiranzoid (CPRG)
[Eustice i colab., 1991]. Metodele colorimetrice, care nu sunt foarte sensibile i au
doar o gama dinamic ngust, au fost nlocuite n mare parte cu metode fluorescente
sau luminiscente mai sensibile. Substraturi, cum ar fi -metil umbeliferil galactozidul
i fluorescein digalactozidul (FDG) pot fi folosite pentru teste bazate pe fluorescen,
iar 1,2-dioxetanul pentru teste pe baz de luminescen. Testele reporter cu
galactozidaz sunt larg utilizate, n special pentru a monitoriza eficiena transfeciei.
3.4.3. -Glucuronidaza
-Glucuronidaza este o glicoprotein tetrameric de la E. coli, format din
patru subuniti identice de 68 kDa, localizate n special n mediul acid al lizozomilor.
Enzima nltur rezidurile de acid -glucuronic terminale de la captul neredus al
glicozaminoglicanilor i altor glicoconjugai. Teste colorimetrice ce pot fi detectate
prin spectrofotometrie, au fost elaborate cu scopul de a msur activitatea acestei
enzime. Metodele chemiluminescente au fost create pentru mbuntirea sensibilitii.
-glucuronidaza este de cele mai multe ori folosit pentru investigaii la plante
superioare, i din cauza activitii sale endogene n unele celule de mamifere [Paigen,
1989].
3.4.4. AP (fosfataza alcalin)
AP este o protein relativ stabil i care la pH alcalin defosforileaz o gam
larg de substraturi . Metode spectrofotometrice standard se bazeaz pe hidroliza p97
nitrofenil fosfatului (PNPP) de AP. Acest test este ieftin, rapid i simplu, dar i
lipsete sensibilitatea obinut prin alte metode. O metod bioluminescent n 2 trepte
a fost elaborat cu scopul de a mbunti sensibilitatea. n aceast abordare cu dou
etape, mai nti AP hidrolizeaz d-luciferin-O-fosfatul la d-luciferin, care servete n
cea de a doua etap ca un substrat pentru luciferaz. Dei sensibilitatea este mult mai
mare, manipularea este mai puin convenabil. Ca o alternativ a fost dezvoltat o
metod chemiluminescent pentru detecia AP ntr-o singur etap [Schaap , 1989].
3.4.5. SEAP (fosfataza alcalin secretat)
SEAP este o form mutant de AP placentar uman, creia i lipsesc 24 de
aminoacizi la captul C-terminal al proteinei. Eliminarea acestor aminoacizi
mpiedic ancorarea enzimei la membrana plasmatic, i, n consecin, este secretat
de celule i poate fi detectat prin prelevarea de probe din mediu de cultur [Berger
i colab., 1988]. Celule rmne intacte i viabile pentru experimente ulterioare. SEAP
poate fi uor detectat prin hidroliza p-nitrofenol fosfatului, care determin o
schimbare de culoare. Aceast modificare poate fi cuantificat.
Metodele chemiluminescente pot fi, de asemenea, utilizate n plus fa de
metodele colorimetrice. Un avantaj major al SEAP este stabilitatea la cldur a
enzimei i la L-homoarginina fosfataz inhibitoare. Prin urmare, celulele lizate pot s
fie tratate cu cldur sau L-homoarginin pentru a inactiva activitatea bazal a AP , n
celule n care poate a intrat n mediul de cultur. Astfel, activitatea bazal observat
cu sisteme reporter AP este, n principal, eliminat cu sistemul SEAP. Asocierea de
proteine reporter secretate, cu activitate de fond puin endogen, precum i cu o
varietate larg de teste uoare i sensibile fac din SEAP un sistem convenabil i
flexibil.
3.4.6. -lactamaza
Proteina lactamaza (penicilin amido- -lactamhidrolaza) este o protein
monomeric de 29-kDa, izolat din E. coli. Aceast enzim are activitate esterazic i
funcia sa natural este clivarea ampicilinei i altor antibiotice, de exemplu, penicilina
98
fluorescena cu transfer de energie prin rezonan (FRET) apare ntre cei doi
fluorofori [Zlokarnik i colab., 1998]. n cazul n care substratul este de clivat de
ctre -lactamaz, cele dou pri fluorescente ale moleculei sunt separate i efectul
FRET este ntrerupt. Schimbarea lungimi de und rezultat este detectabil n
suspensie celular folosind sortarea celular pe baz de fluorescen, n
monostraturile celulare utiliznd cititoare de plci conveninale iar n celule
individuale utiliznd microscopia confocal. Tehnicile de gene reporter cu lactamaz sunt foarte sensibile, la utilizarea acestui substrat fluorogenic, dar i
costisitoare.
3.4.7. Luciferaza
Luciferaza se refer la o familie de enzime care catalizeaz oxidarea de
substraturi diferite ca luciferina i coelenterazina, ceea ce conduce la emisie de
lumin. Lucifereazele cunoscute sunt luciferaza bacterian, luciferaza Firefly
(Photinus pyralis) (firefly = gndac nocturn din America tropical care produce
lumina, corpul este luminiscent datorita organelor abdominale), i mai recent,
luciferaza renilla din panseaua de mare bioluminiscent, Renilla reniformis.
99
100
101
popular gen reporter pentru investigarea GPCRs. n plus, punerea n practic a lactamazei i SEAP este, de asemenea, posibil.
Recent, a fost prezentat o GFP ca gen reporter pentru investigarea GPCRs ,
care prezint unele avantaje fa de alte gene reporter menionate.
3.5.1. Aplicarea luciferazelor ca gene reporter
Luciferaza firefly (vezi 3.4.7) este cea mai utilizat
investigarea GPCRs [Stratowa i colab., 1995]. Gena pentru luciferaz este asociat
cu diferite elemente promotor cum ar fi: elementele CRE, elementele TRE,
promotorul c-FOS i elementul intensificator NF-AT. Elementul intensificator CRE
este folosit pentru investigarea receptorilor cuplai cu Gs i Gi. Prin urmare,
expresia luciferazei este reglat de creterea sau scderea AMPc. Dup stimularea
receptorilor cuplai cu Gs, urmeaz o cretere a nivelului de AMPc. AMPc
determin fosforilarea CREB urmat de creterea expresiei luciferazei. n scopul de a
efectua teste cu receptori cuplai cu Gs, testele sunt de obicei, efectuate n prezen
de forskolin, un stimulator al AC, care crete nivelul de AMPc, astfel nct inhibiia
este mai uor detectabil. Stimularea forskolinei este msurat n paralel (fig. 3.2).
Himmler i colab. (1993) a utilizat sisteme de teste pe baz de gene reporter cu CRE
i luciferaza pentru a investiga receptorii dopaminergici D1 i D5 la om, ambii
receptori fiind cuplai cu Gs. Ei au observat o cretere a expresiei luciferazei dup
stimularea cu forskolin sau cu agoniti ai dopaminei.
Identificarea compuilor agoniti sau antagoniti a fost o reuit. Un test
similar a fost aplicat pentru investigarea comportamentului de legare a diferiilor
liganzi de serotonin, receptori 5-HT1B i receptori C1A de calcitonin [George i
colab., 1997].
De asemenea, luciferaza n asociere cu CRE este folosit n industria
farmaceutic pentru realizarea unor screeninguri de mare capacitate (HTSs). Punerea
n aplicare a acestui sistem a fost raportat de diferite grupuri care au stabilit teste
pentru investigarea rapid i sensibil a receptorilor cuplai cu Gi i Gs. Testele
103
pentru screeningurile de mare capacitate sunt realizate de cele mai multe ori n
microplci.
Fig. 3.2. Sisteme de teste bazate pe gene reporter ce utilizeaz elemente CRE i
luciferaza pentru investigarea GPCRs. Celulele ce coexprim GPCR, cuplai fie cu Gs, fie cu
Gi au fost incubate cu ligandul. Dup ce are loc stimularea sau inhibarea AC se produce o cretere
sau respectiv, o scdere a AMPc. O cretere a nivelului de AMPc conduce la activarea PKA, care
activeaz prin CREB fosforilarea. Forma fosforilat a CREB interacioneaz cu elemente CRE.
Ulterior, este iniiat transcripia luciferazei. Pentru investigarea receptorilor cuplai cu Gi, celulele
trebuie s fie incubate cu ligandul n prezena forskolinei. Luciferaza este exprimat n citoplasm,
i activitatea poate fi msurat dup liza celulelor i adugarea substratului, de exemplu luciferin
luciferaza. O activitate mare a luciferazei cauzeaz o luminiscen puternic. Activitatea luciferazei
poate fi corelat cu activitatea ligandului care activeaz GPCR. (AC, adenilil ciclaza; CRE,
elementul de legare AMPc; CREB, proteina de legare CRE; G, proteina G.)
celulelor sensibile. n
Fig. 3.3. Sisteme de teste bazate pe gene reporter utiliznd GFP i CREs pentru
investigarea GPCRs. Cu ajutorul vectorului de gen reporter ce conine GFP i CRE are loc
transfecia n celulele care exprim o GPCR, fie o Gs sau Gi cuplat. Dup legarea ligandului
este indus stimularea sau inhibarea AC, ceea ce determin o cretere sau o scdere a AMP. O
cretere a nivelului de AMPc duce la activarea PKA care activeaz CREB prin fosforilare. Forma
fosforilat a CREB se leag acum la elementele CRE. n consecin, transcripia GFP este iniiat.
Pentru investigarea receptorilor cuplai cu Gi, celulele trebuie s fie incubate cu un ligand n
prezena forskolinei. GFP este exprimat n citoplasm i poate fi msurat n mod direct n celule
n via, folosind un cititor de fluorescen. Liza celulelor sau adiia substratului nu este necesar
(AC, adenilil ciclaza; CRE, elementul de legare AMPc; CREB, proteina de legare CRE; G, proteina
G; GFP, proteina verde fluorescent)
106
108
CAPITOLUL 4
DE LA GENOMUL UMAN LA NOILE MEDICAMENTE:
POTENIALUL RECEPTORILOR ORFANI CUPLAI CU
PROTEINELE G
4.1.Introducere
Secvenierea iniial a genomului uman, completat de Proiectul Genomului
Uman i Celera [Venter i colab., 2001] a stimulat comunitatea biomedical oferind
numeroase oportuniti pentru nelegerea bolilor umane i pentru dezvoltarea de
terapii medicamentoase inovatoare. Funcionarea anormal a anumitor celule n unele
pri ale corpului uman determin apariia unor maladii. Funcionarea celulelor este
n principal reglat de o varietate de semnale chimice care sunt eliberate de ctre
diferite tipuri de celule care controleaz funciile organismului uman. Dup legarea
mesagerilor chimici la receptori specifici exprimai de celulele int, receptorii vor fi
activai i vor iniia diferite semnale n celule, determinnd modificri n funcionarea
lor. Medicamentele afecteaz funcia celular prin interaciunea cu receptorul,
mimnd sau blocnd legarea receptorului de ligand i, prin urmare, controlnd
procesul bolii. n acest capitol, pentru a nelege importana secvenializrii
genomului uman n descoperirea medicamentelor, ne vom focaliza pe producerea
medicamentelor legate de receptorii cuplai cu proteina G (GPCRs).
Programele pentru descoperirea medicamentelor, a mai multor companii
farmaceutice, s-au concentrat asupra superfamiliei GPCR. De ce ? pentru c aceti
receptori sunt o clas foarte util pentru intele medicamentelor i aproximativ 50%
dintre produsele farmaceutice comercializate n prezent au ca int GPCRs. n multe
boli, GPCRs sunt cunoscui sub numele de ''inte validate'', de exemplu liganzii ce
interacioneaz cu GPCR sunt cunoscui pentru c pot induce anumite boli la om. n
tabelul 4.1. se prezint cteva exemple de medicamente ce au int GPCRs i se
subliniaz importana i frecvena utilizrii lor.
109
Adrenoreceptor
Terapie
Diciclomin (Bemote)
Indicaie
Sindrom de intestin
iritabil
Ipratropium (Atrovent) COPD
Tiotropium (Spiriva)
COPD
Atenolol (Tenormin)
Timolol (Timuptol,
Inderal)
Salmeterol (Albuterol)
Albuterol (Ventolin)
Doxazosin (Cardura)
Carvedilol (Coreg)
Clonidina
Propranolol (Inderal)
Terazosin (Hytrin)
Receptorul
angiotensinei II
Receptor pentru
histamin
Receptorul
pentru
leukotriene
Receptor opioid
Losartan (Cozaar)
Eprosartan (Teveten)
Cetirizin, Loratadin
Cimetidin, Ranitidin
Pranlukast (Onon)
Zafirlukast (Accolat)
Buprenorfin
Butorfanol
Alfentanil (Alfenta)
Morfin (Roxanol)
Subtip GPCR
Antagonist M1
Antagonist M3
Antagonist M1/M3
Hipertensiune
Antagonist 1
Glaucom/Hipertensiune Antagoniti
amestecai
Astm
Agonist 2
Astm
Agonist 2
Hipertrofie de prostat Antagonist 1
Antihipertensiv
Insuficien cardiac
1/2/1
congestiv,
Antihipertensiv
Antihipertensiv
Agonist 2
Antiaritmic,
Antagonist
antihipertensiv, angin,
anxietate
Hipertrofie de prostat Antagonist 1
Antihipertensiv
Hipertensiune
Antagonist AT1
Hipertensiune
Antagonist AT1
Alergii
Antagonist H1
Ulcere
Antagonist H2
Astm, rinite alergice
Antagonist CysLTR1
Astm
Antagonist CysLTR1
Analgezic narcotic,
combaterea durerii
Analgezic narcotic,
combaterea durerii
Analgezic narcotic,
combaterea durerii
Analgezic narcotic,
combaterea durerii
110
Agonist /antagonist
Agonist /antagonist
Agonist
Agonist
Receptor
prostanoid
Somatostatin
Receptor pentru
serotonin
Receptorul
factorului de
eliberare al
gonadotropinei
Receptor pentru
dopamin
Epoprostenol (Flolan)
Hipertensiune
pulmonar primar
Misoprostol (Cytotec)
Ulcere
Octreotid
(Sandostatin)
Sumatriptan (Imitrex)
Buspiron (Buspar)
Olanzapin (Zyprexa)
Ritanserin (Tisterton)
Cisaprid (Prepulsic)
Trazodon (Desyrel)
Clozapin (Leponex)
Goserelin (Zoladex)
Boli abdominale,
tumori intestinale
Migren
Anxietate
Psihoze
Antidepresiv
Arsuri gastroesofagiene
nocturne
Antidepresiv
Schizofrenie
Cancer
Ropinerol (Requip)
Boala Parkinson
Agonist al
receptorului pentru
prostaciclin
Agonist al
receptorului pentru
prostaglandin
Agonist sst2 i sst5
Agonist 5HT1B/1D
Agonist 5HT1A
Antagonist 5HT2/D2
Antagonist 5HT2
Agonist 5HT4
Amestec antagoniti
5HT2
Agonist
GnRHR/LHRHR
Agoniti D2, D3, D4
Fig. 4.1. Semnalizarea prin GPCR. GPCR sunt alctuii dintr-un domeniu extracelular Nterminal, trei bucle extracelulare i trei bucle intracelulare, care sunt conectate prin apte domenii
helicoidale transmembranare. GPCR este situat la nivelul membranei plasmatice i poate fi activat
prin liganzi extracelulari. Activarea receptorilor are ca rezultat activarea intracelular a proteinelor
G heterotrimerice prin promovarea i favorizarea schimbrii GDP-GTP la nivelul subunitii G.
Odat cu activarea proteinei G heterotrimerice, proteina G se disociaz n subunitile G i G,
care pot activa proteine (E) efectoare n celule pentru a genera mesageri secunzi.
schimb echilibru, astfel c GPCR este stabilizat n starea activ. Multe dintre
medicamentele existente pe pia n 2009 acioneaz asupra funciei GPCRs,
mpiedicnd aciunea moleculelor de semnalizare endogene ce au int GPCR. Aceti
liganzi, cunoscui anterior sub denumirea de antagoniti, pot fi clasificai acum ca
agoniti inveri, care, stabilizeaz GPCR ntr-o conformaie inactiv, i
antagoniti neutri, care nu schimb echilibrul conformaional, dar mpiedic
interaciunea cu agonitii endogeni prin legarea la GPCR.
deja identificai. Timp de mai muli ani diverse grupuri academice i industriale au
ncercat, de exemplu, s cloneze receptorul pentru histamina H3, care este definit
farmacologic. n ciuda disponibilitii genelor ce codific receptorii umani H1 i H2,
nc de la nceputul anilor 1990, pana n 1999 clonarea nu a reuit. Dar, Lovenberg i
colab., (1999) au reuit n cele din urm s cloneze gena receptorului uman H3
histaminic folosind informaii din baza de date Incyte referitor la expresia secvenelor
scurte.
Analiza filogenetic indic faptul c, gena ce codific receptorul uman H3 nu
este strns legat de genele care codific receptorii umani H1 sau H2 (omologia total
este de aproximativ 22%); de fapt, gena receptorului H3 seamn mai mult cu genele
care codific 2 adrenoreceptorii. Aceste trei gene diferite ale receptorilor pentru
histamin, au evoluat de la diferii strmoi i se pare c toate cele trei au dobndit
elemente de o importan deosebit pentru recunoaterea de ctre histamin.
Asemnarea slab a genei receptorului H3 cu genele ce codific alte dou subtipuri
de receptori pentru histamin explic de ce nu au reuit diferite abordri bazate pe
omologie pentru clonarea genei receptorului H3 [Leurs i colab., 2000].
Succesul clonrii genei receptorului H3 a fost urmat imediat de clonarea genei
ce codific receptorul H4 pentru histamin, pentru care au fost disponibile puine
dovezi farmacologice. Gena receptorului H4 a fost clonat de mai multe grupuri,
concomitent, pe baza secvenei receptorului H3, care a devenit disponibil [Liu i
colab., 2001]. Noul receptor pentru histamin prezint o exprimare foarte restrns n
sistemul imunitar i n prezent este considerat ca o potenial int pentru
medicamente n condiii inflamatorii.
va
Fig. 4.2 . Analiza arborelui filogenetic a mai multor GPCRs aminergici plaseaz AXOR
35 aproape de receptorul H3 pentru histamin. Analiza farmacologic ulterioar a confirmat c
AXOR 35 reprezint un nou receptor uman pentru histamin, receptorul H4 (dup Dingermann i
colab., 2004).
hibridiza cu molecule ARN codificatoare pentru noi GPCRs care prezint suficiente
secvene omoloage cu sonda. n prezent, bloturi cu diferite esuturi umane pot fi
obinute comercial.
De asemenea expresia ARNm tisular poate fi obinut printr-o variant a
tehnicii PCR. Utiliznd enzima revers transcriptaza, ARNm de la nivelul esutului
este transcris n ADNc, unde apoi moleculele de ADNc din oGPCR sunt amplificate
printr-o reacie PCR cu dou oligonucleotide specifice oGPCR.
119
Datele cele mai detaliate despre expresia ARNm pot fi obinute prin hibridizare
in situ. Fragmentele de esut sunt incubate n condiii adecvate cu oligonucleotide
radioactiv sau fluorescent marcate sau sonde ADN, care se bazeaz pe secvena ADN
a oGPCR de interes. Dup splare, citirea ofer informaii detaliate cu privire la
variaiile nivelurilor expresiei n esuturi complexe, cum ar fi creierul.
Cum expresia ARNm nu reflect real expresia proteinei, poate c ar trebui
ncercat s se msoare nivelurile de expresie a proteinelor n loc de expresia ARNm.
Cu toate acestea, pentru profilul expresiei proteinelor este nevoie de un anumit
anticorp pentru analiza Western blot sau analiza imunohistochimic. Dei generarea
de anticorpi pentru oGPCRs nu este imposibil, deseori necesit resurse substaniale
i de aceea nu este foarte atractiv.
Informaiile despre expresia GPCR sunt fundamentale pentru ntregul proces
de farmacologie invers, abordri anatomice moleculare la scar mare, cartografierea
nivelului expresiei (profilul expresiei) tuturor GPCRs cunoscui, inclusiv a
receptorilor orfani, permind descoperirea timpurie a acelor GPCRs care se pot
dovedi utili n descoperirea medicamentelor.
4.3.4 .Expresia oGPCR de interes
Pentru a identifica ligandul endogen pentru un oGPCR de interes, trebuie
stabilizate liniile celulare care exprim receptori orfani i folosirea acestor linii
celulare pentru screening-ul potenialilor liganzi. Multe linii de celule de mamifere
sunt n prezent disponibile pentru aa numita expresie heterolog a oGPCRs.
Pentru a exprima un oGPCR de interes, secvena ADNc a oGPCR este mai nti
clonat dintr-un esut relevant sau ADNul genomic, un epitop tag, cum ar fi un
FLAG, c-myc, V5 sau hemaglutinin este adesea ncorporat n domeniu N-terminal al
receptorilor, pentru a permite detectarea proteinelor receptor de la suprafaa celulelor
folosind anticorpi ndreptai mpotriva epitopilor tag. ADNc al oGPCR se insereaz
n vectori ADN speciali, care sunt transferai (transfecie) n celule mamiferelor
(fig. 4.3). O varietate de tehnici (transfecia chimic, electropermeabilizarea,
utilizarea tehnicilor de infecie i lipofecie, de exemplu, baculovirusul, adenovirusul
120
sau Virusul Semliki Forest) sunt disponibile n prezent, pentru a transfera n mod
eficient ADN-ul ntr-o varietate de celule. Exemple de linii de celule frecvent
utilizate pentru exprimarea GPCRs includ celulele HEK 293 (human embryonic
kidney) i celulele CHO (Chinese hamster ovary ).
Fig. 4.3. ADNc ce codific GPCRs provenii din genom sunt clonai n vectori de
expresie adecvai cu scopul de a obine o expresie adecvat a receptorului n celulele utilizate
n procesele de identificare a liganzilor. n cazul n care celulele exprim receptorii de interes,
celule pot fi stimulate prin liganzi care pot fi obinui din biblioteci compuse sau extracte tisulare i
celulele sunt apoi monitorizate de exemplu, pentru schimbri n activitatea celular prin efectuarea
de teste funcionale (a se vedea seciunea 4.3.5). Prin repetarea acestei strategii, GPCRs pot s
induc rspunsuri specifice pentru anumite perechi GPCR-ligand .
123
Ligand
5-HT
5-HT1A
Adenozina
Adenozina
5-HT
Peptide nrudite cu bombesina
Nociceptina/orfanina FQ
Neuropeptidul Y
A2A
A1
5-HT1D
bombesina
ORL-1
Y2
AZ3B
Factorul 1 derivat din celule
stromale
CIRL
C3a
CXCR4 (LESTR,
fusin)
laurotoxina
Receptorul
CGRP; CRLR
GHS-R
BLTR
Hipocretina/orexina
Hormonul de eliberare al
tirotropinei
Peptidul de eliberare al
prolactinei
Apelin
Orexina A i B
THR2
CRLR
Chemoatractantul pentru
limfocite B
1 fosfat sfingozina
GPR10 (hGR3)
APJ
CGRP
BLR1
EDG 1, 3, 5, 6 i
8
125
Legare a
radioligandului
AMPc
AMPc
AMPc
Ovocite
AMPc
Legare a
radioligandului
[Ca2+]i, ovocite
[Ca2+]i
Anul
identificrii
1988
1990
1991
1991
1993
1995
1995
1996
1996
Legare a
radioligandului
AMPc
1997
[Ca2+]i
Legare a
radioligandului
[Ca2+]i
Legare a
radioligandului
Acid arahidonic
1996, 1999
1997
Ext.pH
(citosenzor)
ovocite
Activitate
chemotactic
[Ca2+]i, AMPc,
ovocite
1996, 1998
1998
1998
1998
1998
1998
1998
1998-2000
Acidul lizofosfatic
EDG 2, 4 i 7
CIRL-2
-laurotoxina
Histamina
H3 (GPCR97)
Hormonul de concentrare al
melaninei
Urotensina II
SLC-1 (MCH1,
GPR24)
UII (GPR14,
SENR)
Motilina
Motilina GPR38)
Leukotriena D4
Cys-LT1R
(HG55,
HMTMF81)
BLT2 (GPR16)
Leukotriena B4
Neuromedin U
Neuromedin U
Prostaglandina D2
Neuropeptidul FF i AF
Neuropeptidul FF
Sfingozilfosforilcolina
Histamina
UDP-glucoza
NMU1R (FM-3,
GPR66)
NMU2R (FM-4,
TGR-1)
PGD2 (CRTH2)
NPFF2
(HLWAR77)
NPFF1
(OT7T022),
NPFF2
SPC (OGR-1)
H4 (AXOR35)
-PEA i triptamina
P2Y14
(KIAA0001,
GPR105)
Cys-LT2R
(PSECO146,
AXOR54)
CCR10 (GPR2)
BONZO,
STRL33,
TYMSTR
(CXCR6)
TA1, TA2
Hormonul de con-centrare al
melaninei
ADP
Amine biogene, trace amine
Psicozin
MCH2
(AXOR21)
P2Y12 (SP1999)
TA1, TA2
TDAG-8
Leukotriena C4 i D4
Eskina
CXCL16
126
[Ca2+]i, AMPc,
drojdia de bere
Legare a
radioligandului
AMPc, legare a
radioligandului
[Ca2+]i
1998-2000
[Ca2+]i,
1999
[Ca2+]i,
aequorina
[Ca2+]i
1999
AMPc, legare a
radioligandului
[Ca2+]i
2000
[Ca2+]i
2000
[Ca2+]i
2000
[Ca2+]i
2000
Ovocite
2000
[Ca2+]i
AMPc, legare a
radioligandului
Drojdia de bere
2000
2000
[Ca2+]i, ovocite
2000
[Ca2+]i
Analiz prin
flowcitometrie[Ca
2+
]i
2000
2000
Ovocite, AMPc,
legare a
radioligandului
[Ca2+]i
2001
Ovocite
Ovocite
AMPc
2001
2001
2001
1999
1999
1999
1999
2000
2000
2001
Lizofosfatidil colina
KISS-1
Sfingozilfosforilcolina i
lizofosfatidilcolina
G2A
metastatin
(GPR54,
hOT7T175,
AXOR12)
GPR4
NPAF
NPFF
Relaxina
Relaxina
Anioni de acid carboxilic cu
lan scurt
Fragmente complement
mrgA4
mrgA1
LGR7
LGR8
GPR41, GPR43
Neuropeptidul W
Acizi biliari
5,8,11 Acid eicosatrinoic
GPR7 i GPR8
M-bar (BG37)
GPR40
Adenina
Acid nicotinic
Receptor pentru
adenin la
obolan
GPCRs (SNSRs)
specifici
neuronilor
senzoriali
HM74 (GPR109)
Acid nicotinic
Sfingozilfosforilcolina
HM74A
GPR12
C5L2
[Ca2+]i
[Ca2+]i
2001
2001
Legarea
radioligandului,
Teste de gene
reporter
[Ca2+]i
[Ca2+]i
AMPc
AMPc
Drojdie de bere
2001
2001
2001
2001
2001
2002
Legarea
radioligandului
GTPS
AMPc
[Ca2+]I,
Teste de gene
reporter
[Ca2+]i
2002
[Ca2+]i
2002
[Ca2+]i,
aequorina, AMPc,
GTPS
GTPS
[Ca2+]i, aequorina
2003
2002
2002
2002
2002
2003
2003
127
2000]. Unul dintre cei mai cunoscui cititori de plci pentru msurarea [Ca2+]i este
cititorul de plci cu imagine fluorometric (FLIPRTM), care a fost, de asemenea,
utilizat pe scar larg pentru deorfanizarea oGPCRs. Sistemul FLIPR monitorizeaz
rspunsul populaiilor celulare n plci (godeuri) la medicamente potenial candidate.
Unul dintre ultimii oGPCRs care au fost deorfanizai folosind FLIPR este GPR40, un
GPCR pentru lanul lung al acizilor grai, cum ar fi acidul eicosatrinoic [Briscoe i
colab., 2002]. Un alt test de sistem de monitorizare a [Ca2+]i se bazeaz pe
fotoproteina aequorina prezent la petele Aequorea Victoria. Legarea Ca2 la
aequorin determin oxidarea substratului coelenterazina pentru producerea de fotoni,
care pot fi detectai cu luminometru (fig. 4.4).
129
130
care induce transcripia genei mediat de SRE [Zhu i colab., 2001] i receptorul H4
pentru histamin.
n plus, genele reporter pot fi utilizate ca gene marker pentru a cuantifica
rspunsurile proliferative celulare sau formarea AMPc. n aceste cazuri, genele
reporter nu se afl sub control transcripional direct ca n cazul testelor bazate pe gene
reporter. O platform de tehnologie bazat pe celule pentru evaluarea funcional a
familiilor genelor pentru medicamente, inclusiv GPCRs, se numete Tehnologie de
Amplificare i Selecie de Receptor (R-SATTM) i utilizeaz o astfel de gen marker
ca o citire funcional [Croston i colab., 2002]. Acest test a fost recent utilizat pentru
dezvoltarea de liganzi nonpeptidergici pentru receptorul pentru urotensin II i a
artat c aplicarea de teste pe baz de celule poate produce liganzi cu situsuri de legare
pentru receptori care sunt diferite de situsurile de legare care sunt utilizate de liganzi
receptorilor nativi [Spalding i colab., 2002].
4.4.6. Cuplarea proteinelor G cu GPCR
Pentru a crete probabilitatea de a identifica un ligand nativ pentru un receptor
orfan, screeningul funcional care este utilizat trebuie s fie adaptat pentru o gam
larg de GPCRs. Astfel, activarea GPCRs care se cupleaz cu membrii din familii
distincte de proteine G heterotrimerice necesit un rspuns uniform.
Receptorii au o eterogenitate n specificitatea cuplrii fa de legarea lor i de
activarea proteinelor G, i, ca rezultat un receptor poate activa proteine G care aparin
de diverse familii de proteine. Dei unii GPCRs se cupleaz cu membrii de la toate
familiile de proteine G heterotrimerice, cei mai muli GPCRs se cupleaz cu o
anumit specificitate la diferite proteine G. Cu toate acestea, contextul celular, va
determina, de asemenea, care proteine G sunt activate n cele din urm odat cu
activarea anumitor GPCR. Astfel n afar de afinitatea anumitor GPCRs pentru
diferite proteine G, cantitile specifice de proteine G exprimate au un rol important.
Pe baza acestui principiu, proteinele G specifice pot fi coexprimate mpreun cu
GPCRs pentru a promova activarea acestor proteine G ca s fie direcionate pentru
transducia semnalului prin ci comune. Aceasta tehnic s-a dovedit funcional n
131
special pentru G16 i omologul su murin G15, proteine G care afieaz un model
de expresie foarte restrns al exprimrii endogene. Aceste proteine G eterogene
aparin familiei Gq de proteine G, a cror activare are ca rezultat activarea PLC, care
duce la producerea de diacilglicerol i inositolfosfat, i crete concomitent nivelul
intracelular de Ca2+ i al efectoriilor lor din aval, i prin urmare, este ideal pentru
diferite screeninguri (a se vedea seciunea 4.4.3) [Offermanns i colab., 1995].
Avnd n vedere faptul c expresia att a receptorilor ct i a proteinelor G este
adecvat, variabilitatea receptorilor, n principiu, ar trebui virtual s permit oricrui
receptor s semnalizeze prin proteine G specifice pentru a activa o anumit cascad
de transducie a semnalului. Cu toate acestea, nu toi receptorii par a interaciona cu
proteinele G cu aceeai afinitate i pentru unii receptori nu este foarte evident c sunt
pregtii pentru teste de screning funcional.
Domeniul C-terminal al proteinei G este un domeniu cheie n interaciunea
GPCR- protein G [Hamm i colab., 2001]. Proteine G himerice, n care ultimii dintre
aminoacizi au fost nlocuii cu aminoacizi corespunztori care sunt prezeni n alte
familii de proteine G, au fost utilizate pe scar larg n teste de screening pentru a
facilita o cuplare funcional a receptorilor, care s permit un screening funcional
pentru liganzii care modific activitatea receptorilor. Probabil, cele mai frecvent
utilizate proteine G himerice sunt cele n care n ultimii cinci aminoacizi ai Gq au
fost nlocuii de ctre cei ai Gi, Go sau Gz, i sunt n mod obinuit numii Gqi5,
Gqo5 i Gqz5. Aceste proteine himerice Gq au o eterogenitate crescut n
legtur cu receptorii cuplai cu Gi/o, permind receptorilor cuplai cu Gi/o s se
cupleze cu creterea nivelului de intracelular Ca2+; ele sunt de obicei utilizate n teste
de screening, folosind FLIPR (a se vedea seciunea 4.4.3) [Coward i colab., 2000].
Alternativ, un amestec de proteine G, inclusiv proteine G himerice, pot fi
coexprimate mpreun cu oGPCR de interes pentru a crete probabilitatea oGPCR
cuplai cu proteine G adecvate s produc un rspuns biologic i astfel, s creasc
probabilitatea de a identifica un ligand nativ pentru oGPCR.
Eterogenitatea receptorilor poate fi prelungit prin forarea receptorilor de a se
cupla cu o protein G proiectat care se leag fizic de proteine GPCR, cu sensul de
132
133
134
4.5. Perspective
Completarea secvenializrii genomului uman va permite dezvoltarea de
poteniale molecule terapeutice candidate ndreptate mpotriva intelor noi, derivate
din utilizarea datelor despre genom. Speranele genomice sunt legate de identificarea
de noi medicamente int incluznd GPCRs [Venter i colab., 2001]; cu toate acestea,
genomica este insuficient pentru a stabili dac o gen anume corespunde la un
medicament int optim. Revoluia genomicii a propulsat progresul tehnologic, care
promite s aib ca rezultat un proces rapid de validare a intei pentru etiologia bolii.
n absena unor medicamente int viabile, identificarea intelor tradiionale a fost
eludat prin cutarea iniial de molecule eficace n sistemele model pentru boal. n
acest sens, dei acidul nicotinic a fost folosit zeci de ani pentru tratamentul
dislipidemiei producnd o normalizare dorit a factorilor de risc cardiovascular,
mecanismul de aciune a rmas necunoscut. Tunaru i colab. (2003) i Wise i colab.,
(2003) au identificat doi oGPCRs ca GPCRs cu afinitate mare i mic pentru acidul
nicotinic, oferind posibilitatea de a dezvolta noi terapii. n mod similar au fost
identificai LGR7 i LGR8 [Hsu i colab., 2001], receptori pentru hormonul relaxina,
unul dintre primii hormoni de reproducere identificai [Civelli i colab., 1999].
Acetia sunt GPCR care aparin la o familie bogat n domenii de leucin care se
repet. n ceea ce privete oportunitile pentru descoperirea medicamentelor,
receptorii orfani arat un incredibil potenial ca inte n descoperirea medicamentelor.
Multe proiecte care au ca scop descoperirea medicamentelor int utilizeaz genomul
GPCR uman pentru abordarea genomic funcional cu scopul de a descoperi noi
medicamente int. Legturile anticipate ntre validarea intelor bazate pe genomic i
procesele de identificare de mare capacitate a liganzilor vor defini cile de exploatare
farmacologic a datelor genomului.
Cutarea de liganzi nativi pentru receptori orfani a fost iniiat pentru a
permite descoperirea de numeroase neuropeptide noi care sunt propuse pentru a
deveni punctul central al programelor implicate n descoperirea de noi medicamente.
ntr-adevr, numeroase programe pentru deorfanizarea receptorilor au
identificat de exemplu orfanina FQ/nociceptina [Meunier i colab., 1995],
137
139
Nume
Structur chimic
Observaii
cu
necesitile
reglatorii.
FDA
(Food
and
Drug
Enantiomer D
inactiv
antiartritic
analgezic
antitusiv
activitate bronhodilatatoare
puternic
Enantiomer L
antihipertensiv
foarte toxic
Antitusiv
analgezic
activitate bronhodilatatoare slab
142
143
Substratul
Simvastatina
Dezaminare
oxidativ
Hidroxilare
cefalosporina C
Produsul
6-
hidroximetilsimvastatina
-ceto-adipinil-7-ACA
Benzen
1,2-cis-dihidroxicatecol
Benzaldehida
(1R)-fenilacetilcarbinol
acid trimetilpiruvic
L-tert-leucina
acid 3-benziltio-2-metil
propanoic
(S)-ibuprofen metoxietil ester
Glucoza
N-acetilmanozamina
catena lateral a
zofenopril
ibuprofen
Aminare
reductiv
Esterificare
D-aminoacid
oxidaza
benzoatdioxigenaza
piruvatdecarboxilaza
leucin
dehidrogenaza
Lipaza
Hidroliza
Lipaza
Izomerizare
Condensarea
aldolilor
Izomeraza
Aldolaza
Reducere
D-fructoza
Acid N-acetilneruaminic
esterificare), modificri ale parametrilor reaciei, etc. Din acest motiv, modificarea
microorganismului este foarte util pentru dezvoltarea procesului. mbuntirea
tulpinilor prin evoluie direct, ca n cazurile mbuntirii prin mutaie i selecie, a
fost muli ani utilizat cu succes n multe aplicaii microbiologice industriale.
Succesul obinut cu metoda mutaiilor genetice aleatorii i recombinarea cauzat de
evoluia direcionat in vitro a fost semnificativ. Screening-ul sau selecia ulterioar
pentru proprietile dorite conduce la identificarea enzimei necesare. Atunci cnd
procesele evolutive sunt realizate n laborator, aceast aa-numit microevoluie ce
apare n culturile bacteriene crescute n chemostat d natere la o specificitate
enzimatic alterat. Rata produciei enzimelor existente i exprimarea genelor
anterior dormante sunt fenomene tipic afectate de ctre microevoluie.
Metodele clasice de mbuntire a tulpinilor s-au bazat pe utilizarea
mutagenilor chimici i pe tehnici de selecie creative pentru identificarea tulpinilor
superioare pentru atingerea unui anumit obiectiv. Aceste metode au fost utilizate cu
succes n producia industrial a antibioticelor, vitaminelor i aminoacizilor. Cu toate
acestea, profilurile genetice i metabolice ale tulpinilor mutante au fost foarte puin
caracterizate, iar mutageneza a rmas un proces aleatoriu [Stephanopoulus i colab.,
1998].
Metodele clasice ale mbuntirii tulpinilor pot fi sumarizate dup cum
urmeaz:
tehnici de screening;
colectarea tulpinilor prin culturi mbogite;
mutaii genetice aleatorii;
evoluia direcionat in vitro;
mutageneza chimic.
Mutageneza tradiional nu are capacitatea de a nzestra o celul cu gene de la
alt microorganism i nici nu poate s transfere funciile. Asemenea posibiliti au
devinit realizbile odat cu implementarea tehnologiei ADN-ului recombinant.
145
sexual- este o metod prin care se propag rapid mutaii genetice benefice ntr-un
experiment direcionat ctre evoluie, presupunnd recombinarea omolog in vitro a
genelor mutante selectate printr-o fragmentare ntmpltoare i reasamblare prin
PCR .Aceast metod care mimeaz evoluia natural este implicat n recombinarea
artificial a ADN i o banc de peptide cu un numr mic de secvene (1-200) de la
fagi (care este disponibil n comer) permite selecia rapid a proteinelor exprimate
de gene mutante.
Progresul rapid al ingineriei genetice i dezvoltarea mai multor tehnici noi ale
ADN recombinant ne ofer mijloacele necesare pentru design-ul, modificarea i
proiectarea biomoleculelor naturale. Pentru aplicaii industriale, biomoleculele
proiectate trebuie s fie stabile i active pentru utilizare mai ndelungat n condiii
neobinuite, n intervale largi de temperatur, pH i mediu de reacie. Activitatea i
stabilitatea susinute pot fi necesare n prezena solvenilor puternici, substraturilor
nalt reactive, concentraiilor nalte de sruri sau pH-ului extrem. Din acest motiv,
eforturile sunt direcionate spre ingineria fiziologiei celulare pentru a obine
mbuntirea procesului. Obiectivul final al ingineriei metabolice este design-ul i
crearea unor biocatalizatori potrivii, care sunt capabili s produc cantiti maxime
ale produilor dorii. De asemenea, un obiectiv important este eliminarea sau
reducerea formrii produilor secundari. Selecia genetic ne permite alterarea
selectivitii biocatalizatorilor, mrirea tipurilor de substraturi i termostabilitatea, i
conferirea de noi funcii proteinelor existente. De asemenea ne permite optimizarea
proceselor n mai multe etape, i identificarea noilor peptide ligand pentru receptorii
biologici i caracterizarea interaciunilor ligand-receptor in vivo [Taylor i colab.,
2001].
Pentru a ncerca rezolvarea problemelor industriale relevante ale proceselor
enzimatice, s-au fcut ncercri pentru a crea enzime care vor conferi sau mbogi
proprieti utile prin utilizarea tehnicilor biomoleculare. Dei o abordare raional a
modelului bazat pe relaia structur-funcie este larg utilizat, abordarea evoluiei
direcionate este n general preferat pentru multe enzime industriale datorit
dificultilor de a lega aplicaiile dorite de proprietile solicitate. Genomica
147
(ACV)
sintetaza.
ACV
este
L--
intermediarul
5.4.2. Cefalosporinele
A fost dezvoltat i patentat o tulpin supus ingineriei genetice de
Pseudomonas cepacia BY21 (KCTC 8922F), care este capabil s produc o
cantitate mare de acid glutaril 7-aminocefalosporanic. Aceast acilaz catalizeaz
reacia care produce acidul 7-aminocefalosporanic (7-ACA) 21, care este materia
prim pentru antibioticele cefalosporinice semisintetice.
Kim i colab., (2001) au clonat i exprimat gena care codific acilaza glutaril
7-ACA de la Pseudomonas diminuta KAC-1 n E. coli. Precizm c E. coli BL 21
care poart pET2B, construcia plasmidic pentru expresia nalt a genei acilazei
glutaril 7-ACA, produce aceast enzim n procent de aproximativ 30% din
proteinele totale, cu 3,2 U/mg de proteine. Creterea la o temperatura sub 31oC i
deleia peptidului semnal au jucat un rol major n exprimarea nalt a genei acilazei
333 a P. dimunita KAC-1 n celulele recombinante de E. coli.
Acilazele cefalosporinelor sunt un grup important de enzime industriale care
hidrolizeaz cefalosporina C (CPC) 22 i/sau GL-7-ACA 23 la 21 (fig. 5.5). Zheng i
colab., (2001) au obinut prin inginerie dou bacterii ce pot exprima gena care
codific acilaza GL-7-ACA a Pseudomonas sp. 130 cu activitate nalt. Cea mai
specific activitate a acilazei GL-7-ACA a fost prezent n celulele intacte
comparativ cu cea a construciilor transformante.
152
153
Etapa 2:
Etapa 3:
Etapa 4:
Condensarea
enzimatic
7-ADCA
cu
D-
eficient, face ca ruta chimic s fie inutil. Ca urmare, compuii chimici toxici
precum acidul peracetic, diclormetanul, pentacloridul fosforic, clorura de trimetilsilil,
trimetilamina clorhidric, bis(trimethyulsilil) ureea, acidul fenilacetic i n-butanolul,
care erau necesare pentru sinteza chimic, nu mai sunt utilizate.
Procesul ce const din dou etape pentru 7-ADCA conduce la o reducere a
consumului de solvent cu aproximativ 90%, a reactivilor auxiliari cu 100%, a
energiei cu aproximativ 40% i a deeurilor cu aproximativ 15%. Recent, BristolMyers Squibb a patentat un proces pentru producia direct a dezacetilcefalosporinei
C prin cultivarea unei tulpini de Acremonium chrysogenum care conine acid nucleic
recombinant ce codific esteraza cefalosporinei Rhodosporidium toruloides.
Producia 7-ACA a fost facilitat prin utilizarea tehnicilor de inginerie genetic.
D-aminoacid
155
156
Produsul, observaii
producie crescut de daunomicin
producie mbuntit de eritromicin
producie crescut de avermectin
biosinteza eficient a agentului
anticanceros epotilona
biosinteza antrachinonelor
aloesaporanina II i dezoxi-eritrolacina
157
158
5.6. Vitaminele
Tehnicile de inginerie genetic au influenat metodele de producie a diferitelor
vitamine.
5.6.1 Acidul L-ascorbic (vitamina C)
Microorganismele au jucat ntotdeauna un rol important n obinerea industrial
a vitaminei C 38. nc din 1923 s-a descoperit c bacteria Acetobacter suboxydans
avea abilitatea s realizeze oxidarea regiospecific a D-sorbitol 32, care a fost obinut
prin reducerea chimic a
D-glucozei
31 la
L-sorboz
L-sorboza
este un
160
161
transformare
cepacia 3/27
D-sorbitolului
microbian
cu
163
microorganism a
D-aminolevulinic
165
5.6.7. Vitamina A
Un alt exemplu de aplicaie a ingineriei metabolice pentru a converti
intermediarii metabolici nativi la produii finali este producia -carotenului
precursor al vitaminei A. Transformarea genetic a Zymomonas mobilis i
Agrobacterium tumefaciens cu patru gene ale -carotenului a condus la formarea
coloniilor galbene pe placa de agar. Aceste colonii conineau cantiti suficiente de
precursor [Misawa i colab., 1990].
5.6.8. Vitamina K (Menaquinona)
Un factor antihemoragic larg utilizat n medicin pentru variate tipuri de
simptome hemoragice, vitamina K este produs prin sinteza chimic. Vitamina K2
este prezent numai la bacterii (nu i la fungi i drojdii). Bacteriile facultativ
anaerobe conin n particular vitamina K2 i omologii si. Flavobacterium
meningosepticum a fost identificat ca un productor important al metabolitului. Un
mutant al acestui microorganism, care a fost rezistent la inhibitorul biosintezei
vitaminei K2, 1-hidroxi-2-naftoat (HNA) a fost selecionat. Acest mutant produce o
cantitate mare de vitamina K2 intracelular ntr-un mediu ce conine
-tirozin i
au produs noi tulpini care au fost utilizate n sinteza compuilor steroizi. Dumas i
colab., (2002) au produs tulpini cu activitate 20 -hidroxisteroid dehidrogeneza
sczut. Astfel, cantitatea i selectivitatea proceselor de biotransformare a steroizilor
sunt mbuntite. Mai mult, produsul obinut este de puritate nalt.
L-tirozina
are o grupare
hidroxil fenolic mai puin dect L-DOPA, eforturile s-au ndreptat ctre hidroxilarea
cu ajutorul biocatalizatorilor. Pn recent acest lucru nu era posibil datorit faptului
c hidroxilarea subsecvent conducea la formarea contaminanilor trihidroxilai.
Kramer i colab., (2001) au clonat genele pentru constituirea 4-hidroxifenilacetat-3hidroxilazei, monooxigenazei i FADH2-NADH oxidoreductazei, ntr-un vector
pentru E. coli. Genele corespunztoare hpaB i hpaC au fost exprimate funcional i
s-a produs sinteza direct a L-DOPA din L-tirozina.
5.8.2 Crixivan
Compusul cis-(1S2R)-indandiol 47 este un precursor al unei ci biosintetice
pentru producia inhibitorului proteazei virusului imunodeficienei umane Crixivan,
care este forma sulfat a indinavirului 48 (fig. 5.14). Cu ajutorul mutagenezei aleatorii
genei care codific dioxigenaza toluenului din Pseudomonas putida, Zheng i
colab.,(2000) au mbuntit obinerea de indinavir.
reductaza
NADPH-dependent
Candida
magnoliae,
aceeai
5.8.5. Omapatrilat
Omapatrilat (BMS-186716) 55 este un nou inhibitor de vasopeptidaze n
dezvoltare, n care compusul BMS-199541-01 54 este un intermediar chiral. Pentru a
sintetiza BMS-199541-01, a fost izolat o tulpin de Sphingomonas paucimobilis SC
16113 care avea o
5.8.6 Hidromorfona
Sinteza drogului opiaceu semisintetic hidromorfona implic oxidarea
microbian a morfinei 56 la morfinona 57 de ctre o dehidrogenaz, urmat de
reducerea dublei legturi printr-o transhidrogenaz pentru a obine hidromorfona 58.
Transhidrogenaza nucleotidelor piridinice solubil (STH) a P. fluorescenes a fost
supraexprimat la E. coli, i aplicat pentru regenerarea NADH i NADPH n
producia hidromorfonei (fig. 5.18).
171
5.9. Concluzii
Recunoaterea importanei chiralitii moleculelor de medicamente n ceea ce
privete activitatea farmacologic i dezvoltarea unor tehnici noi i mai eficiente
pentru ingineria genetic a condus la o nou abordare a sintezei medicamentelor
chirale. Cercetrile intensive n cteva arii ale biologiei moleculare creaz o mai bun
nelegere a metodelor naturale de biotransformare, pe lng faptul c ajut la
elucidarea cauzelor unor boli. Sintezele stereoselective cu ajutorul microorganismelor
recombinante sau biocatalizatorilor izolai de la acestea au oferit un suport excelent
pentru eforturile chimitilor de a sintetiza molecule de medicamente chirale. In 2001,
aproximativ 36% din vnzrile mondiale de produse farmaceutice n valoare de 410
miliarde de dolari au fost efectuate pentru medicamente cu un singur enantiomer.
172
CAPITOLUL 6
MEDICAMENTE PE BAZ DE ACIZI NUCLEICI
6.1. Introducere
Acizi nucleici conin toate informaiile despre viaa fiecrei plante i fiecarui
animal. Acizi nucleici sunt parte a fiecrei celule sau fiine vii. Acidul
dezoxiribonucleic (ADN) este format din dou lanuri dublu catenare de nucleotide.
Nucleotidele sunt compuse dintr-o parte glucidic (riboza pentru acidul ribonucleic
(ARN) i 2-dezoxiriboza pentru a ADN), o grupare fosfat i o baz azotat. n general,
doar patru baze azotate diferite pot fi gsite n ADN i ARN. Acestea sunt adenina,
guanina, citozina i timina n ADN, i uracil n loc de timin n ARN. Lanurile de
nucleotide, numite oligonucleotide sunt dublu catenare n nucleu. Aceste lanuri
dublu catenare sunt meninute mpreun n principal, datorit legturilor de hidrogen
dintre bazele azotate. Perechile de baze sunt ntotdeauna guanin-citozin i adenintimin (uracil) (fig. 6.1) [Saenger i colab., 1984].
Informaiile nmagazinate n ADN trebuie s fie traduse n proteine. Prin
urmare ADN-ul, trebuie mai nti s fie transcris n ARN mesager (ARNm), care
prsete nucleul.
ARNm va fi tradus n proteine la nivelul ribozomilor. Toate aceste procese sunt
posibile puncte de atac ale medicamentelor bazate pe acizi nucleici. Mai multe
concepte sau mecanisme de aciune ale medicamentelor pe baz de acizi nucleici sunt
acum n curs de investigare.
Cel mai important este conceptul antisens (vezi subcapitolul 6.4.1). Alte
concepte n curs de investigare sunt conceptul triplului helix (triplex), conceptul
ARN-ului de interferen (ARNi) i conceptul ribozimelor ca medicamente.
173
acoperire
Toate
grupurile
de
protecie,
sunt
clivate
dup
sfritul
sintezei
scheletul de susinere al
acizii nucleici peptidici (ANPs) sau acizi nucleici inaccesibili (ANLs). n ultimii ani
toi aceti acizi nucleici modificai au fost sintetizai i testai.
Oligonucleotidele nemodificate sunt larg utilizate ca instrumente n biologia
molecular. Cu toate acestea, n experimentele celulare i animale s-a observat c
oligonucleotidele cu un fosfodiester natural internucleozid legat sunt degradate n ser
n decurs de cteva ore, n principal, prin aciunea rapid a 3' exonucleazelor de
clivare care sunt nsoite de endonucleaze de clivare lente. De asemenea, n anumite
esuturi a fost observat o activitate semnificativ 5'-exonucleazic. Oligonucleotidele
modificate chimic vor fi descrise n urmtoarele seciuni.
depinde clar de natura gruprii 2'-O-alchil i crete n ordinea 2'-O-dimetilalil <2'-Obutil <2'-OH <2'-O-alil <2'-O-metil <20-metoxietoxi. Anterior anului 1987, s-a
raportat c 2'-O-metil ARN formeaz un duplex mai stabil, cu o caten
complementar de ARN dect cu ADN nemodificat sau chiar ARN [H Inoue i colab.,
1987]. 2'-O-alkilribonucleotidele prefer endo conformaia C (3') ntr-un duplex cu
ARN. Acest glucid pliat a fost considerat un element structural cheie n duplexurile
ARN-ARN, care sunt, n general, mai stabile dect duplexurile ADN-ADN ale
aceleai secvene.
[Kawasaki i colab., 1993; Aurup i colab., 1994]. Cu toate acestea sunt necesare
modificri suplimentare, cum ar fi punile de fosforotioat, pentru a produce derivai
oligonucleotidici suficieni de stabili la nucleaze.
Introducerea constant a
179
pentru
oprirea
efectiv
translaiei
experimente
antisens.
din
nucleozid-3'-fenilfosfonamidai
corespunztori
[Dingermann
legai
cu
chiralitate
stereoregular sau
Aceast
modificare
sporete
stabilitatea
oligonucleotidelor
mpotriva
6.3.5. Morfolino-oligonucleotidele
Morfolino-oligonucleotidele sunt foarte stabile la nucleaze i nu sunt sensibile
la RNaza H. Ele au fost studiate n special n cercetrile privind dezvoltarea
embrionar a petelui zebr i a lui Xenopus, unde ambele sisteme de compui pot fi
administrate (injectate) la embrion.
182
Conformaia glucidic a acestui derivat este blocat la conformaia tip N (3'endo) [Koshkin i colab., 1998]. O cretere fr precedent de +3 pn la +8 K pe
modificare n stabilitate termic a duplexurilor cu privire att la ADN ct i la ARN a
fost raportat cnd s-a realizat evaluarea secvenelor amestecate ale ANL codificate
parial sau total.
6.3.8. Oligonucleotide conjugate
De asemenea ataamentul covalent al moleculelor nonnucleozidice fie la
captul 3' sau 5' al oligonucleotidelor poate modula proprietile oligonucleotidelor
antisens. Acest tip de derivaie este chimic simplu i permite modularea stabilitii
nucleazei, asimilarea celular i distribuia n organe a oligonucleotidelor.
6.3.8.1. Conjugaii 5'terminal
Conjugarea moleculelor la captul 5' al oligonucleotidelor se poate face simplu
prin cuplarea fosforamiditei sau a unui derivat fosfonat H al moleculei dorite la
gruparea 5'-hidroxi a oligomerului, ce rezult dup elongarea lanului prin sintez n
faz solid. O gam larg de liganzi derivai din fosforamidite, cum ar fi fluoresceina,
biotina, colesterolul, dinitrofenolul, acridina i derivaii de psoralen sunt disponibili
comercial. Alternativ, gruparea terminal 5'- hidroxi a oligonucleotidelor
reacioneaz cu o fosforamidit aminoalkil legat, care dup descoperire are ca
rezultat un aminoalkil nefuncionabil. Funcia amino a oligonucleotidelor poate fi
apoi reactivat post-sintez n soluie cu derivai ai moleculelor activate
corespunztor, cum ar fi esteri, izotiocianai sau iodoacetamide.
6.3.8.2. Conjugaii 3' terminal
Conjugarea moleculelor la captul 3' al oligonucleotidelor este convenabil i
poate fi obinut prin utilizarea suporturilor solide funcionale n mod corespunztor,
care n plus poart o funcie hidroxil de la care lanul de oligonucleotide se
prelungete n timpul sintezei n faz solid.
185
triplu helix
helixurile CxGC nu sunt stabile n condiii fiziologice (fig. 6.11). Citozina n a treia
caten trebuie s fie protonat pentru a forma un triplu helix stabil. Pentru a protona
citozina a fost necesar un pH de 6.0. Legarea celei de a treia caten la helixul dublu
Watson-Crick este rezultatul legturilor de hidrogen Hoogsteen sau Hoogsteen
inverse (fig. 6.11 i 6.12).
189
Acizii nucleici n triplu helix pot fi utilizai pentru a regla expresia genei in
vivo. n conceptul triplu-helix (concept anti-gen), cea de-a treia caten a acidului
nucleic ar trebui s hibridizeze cu ADN-ul n dublu helix din nucleu inhibnd
translaia ADN-ului n ARNm corespunztor. Un avantaj major al conceptului de
anti-gen comparativ cu conceptul antisens l constituie faptul c fiecare celul are
doar un set diploid de cromozomi, astfel c ar trebui s fie inhibate numai dou
secvene egale de ADN per celul i nu sute sau mii de catene ARNm .
Exist patru mecanisme posibile de aciune a acizilor nucleici n triplu helix:
oligonucleotidele ce formeaz triplexuri pot interaciona cu poziia de
legare al unui component al transcripiei sau secven de replicare;
schimbarea conformaiei cauzat de formarea triplu helixului poate
perturba legarea unei enzime importante pentru translaie;
oligonucleotidele formatoare de triplex se leag n aval de o regiune
promotor a ARN polimerazei care ar putea inhiba iniierea transcripiei;
190
6.4.3. Ribozimele
Ribozimele sunt componente catalitice ale ARNs care apar n mod natural sau
au fost obinute prin selecie in vitro [34, 35]. De cele mai multe ori ribozimele care
apar natural catalizeaz clivarea ARN i reaciile de legare.
Vom analiza ribozimele de tip cap de ciocan i agraf de pr care aparin
clasei de ribozime mici (fig. 6.13-6.15) [Sigurdsson i colab., 1998; Carola i colab.,
1999]. Ribozimele s-au bucurat de o atenie considerabil, din cauza posibilei lor
sinteze chimice, i n special, pentru ncorporarea analogilor nucleotidelor.
191
Figura 6.14 Structura unei ribozime de tip cap de ciocan folosind raze X
192
n cele mai multe studii se arat c ribozimele sunt pregtite prin sintez
chimic s permit introducerea de nucleotide modificate n anumite poziii.
Ribozimele conin un miez central cu nucleotide neschimbate, un helix II care
stabilizeaz miezul i dou brae de legare cu substratul, care formeaz helixurile I i
III. Magneziu este necesar pentru o activitate optim i unul din rolurile ionilor metal
este de a induce modificri conformaionale pentru a mbogi structura catalitic.
Ribozimele catalizeaz o reacie fosforil de transesterificare a 3',5' fosfatului
internucleotidic al substratului la 2', 3' fosfat nucleozidul ciclic care are ca rezultat
clivarea legturii internucleotidice (fig. 6.16) [Kuimelis i colab., 1998]. Reacia este
specific de secven, n care clivajul se produce la nivelul 3' al tripletului din formula
general NUH n care N este orice nucleotid, U este uridin i H este orice nucleotid
cu excepia guanozinei. inta unui anumit triplet NUH de clivare n ARN este
determinat de succesiunea, secvena braelor de legare a ribozimelor care trebuie s
fie complementar cu secvenele din amonte i din aval ale tripletului pentru a forma
complexe ribozim-substrat.
193
stricte pentru U central. Cu toate acestea, ribozimele noi extind spectrul situsurilor
de clivare din ARN, lucru care este important pentru inhibarea expresiei genei.
6.4.3.3. Stabilizarea ribozimelor
Ribozimele sunt uor hidrolizate de RNaze care sunt deosebit de active n ser.
Cnd ribozimele sunt implicate exogen pentru inhibarea expresiei genei, ele vor veni
n contact cu serul i, prin urmare, stabilizarea lor mpotriva unei astfel de degradri
este o condiie esenial pentru producerea cu succes a medicamentelor. O protecie
simpl mpotriva RNazelor se realizeaz prin ndeprtarea gruprii 2' -OH, menindo n acele poziii, care sunt eseniale pentru activitatea catalitic a ribozimelor. ntradevr, schimbarea ribozei a nucleozidului pirimidin cu 2'-fluoro-2'-dezoxiriboz va
crete considerabil timpul de njumtire, cu o mic scdere a puterii catalitice
[Pieken i colab., 1991]. Acest lucru a fost mbuntit prin nlocuirea uridinei din
poziiile 4 i 7 cu 2'-amino-2'-deoxiuridina . Ulterior acest lucru a artat c gruparea
amino poate fi inclus n toate poziiile nucleozidului pirimidin cu efectul dorit
[Beaudry i colab., 1999]. De asemenea alkilarea gruprii 2'-OH asigur protecia
mpotriva degradrii i ea poate fi ncorporat n toate poziiile (n afara de
nucleozidele purinice din centrul regiunii), fr afectarea activitii [ Jarvis i colab.,
1996]. Degradarea de ctre exonucleaze poate fi prevenit, fie prin introducerea de
fosforotioai sau
ribozime dup un promotor potrivit ntr-un vector, fie o plasmid sau un vector
retroviral. Dup transfecie sau transducie, ribozima este transcris n celule pentru
a-i gsi ARNm int. Aceast abordare a fost adoptat de mai multe laboratoare i
avut succes, de exemplu, n interferena cu replicarea HIV [Muotri i colab., 1999].
Un avantaj al acestui mod de transmitere este c gena poate fi integrat stabil n
ADN-ul gazdei, ca ntr-un protocol de terapia genetic. De asemenea, odat integrat,
aprovizionarea ribozimelor devine permanent. Cu toate acestea, alegerea vectorului
este esenial, n special pentru om, unde sigurana vectorului este o preocupare
considerabil. Printr-un alt mod de distribuie exogen, ribozimele sunt pregtite, fie
prin sintez chimic, fie prin transcriere i sunt adugate n celule de la exterior.
6.4.3.5. Colocalizarea
Un aspect important pentru o interferen eficient cu expresia genei este
colocalizarea ribozimelor cu ARN-ul lor int. n acest sens, disitribuia endogen are
avantajul c ribozimele pot fi direcionate spre nucleu sau spre citoplasm, fie prin
alegerea promotorului sau prin combinarea cu semnale de localizare subcelular [Lee
i colab., 1999]. Colocalizarea ribozimelor i a intei n nucleol demonstreaz
convingtor acest punct de vedere [Michienzi i colab., 2000]. n prezent, ribozimele
sintetice concepute pentru distribuie exogen pierd aceste semnale i localizarea nu
poate fi dirijat. Cu toate acestea se sper c ataarea de peptide semnal, cele
importante pentru importul nuclear, ar putea ameliora aceast situaie. Modificarea
chimic poate influena aparent o anumit localizare. Astfel, grupuri de fosforotioaii,
introduse pentru a realiza stabilitatea nucleazelor, direcioneaz preferenial
ribozimele spre nucleu, cu toate c interferena cu expresia genei pare s aib loc n
citoplasm [Bramlage i colab., 1999].
6.4.4 ARN-ul de interferen ( ARNi)
O nou abordare pentru ARNm int este denumit silenionarea genei
postranscripionale sau ARNi [Fire i colab., 1998; Tuschl i colab., 2002] (fig. 6.17).
196
ARNi este un procedeu prin care ARN dublu catenar intete ARNm pentru
clivare ntr-un mod dependent de secven. Mecanismul ARNi implic iniial
prelucrarea ARN-ului dublu catenar de lungime mare (n jur de 500-1000 nucleotide)
n fragmente de declanare '' de 21 25 bp ' [Elbashir i colab., 2001] de ctre un
membru al familiei III de RNaze ale nucleazelor numite DICER [Hammond, 2001].
Cnd sunt ncorporate ntr-un complex de nucleaze larg, multicomponent numit
RISC (complex de silenionare ARN indus), catenele prelucrate formeaz ''o secven
ghid'' care are int RISC la secvena ARNm dorit i contribuie la distrugerea sa
[Ketting i colab., 2001]. ARNi a fost folosit cu succes pentru silenionarea genelor n
diferite sisteme experimentale, incluznd petunia, planta de tutun, neurospora,
Caenorhabditis elegans, insecte i petele zebr. Utilizarea de ARN dublu catenar
lung pentru silenionarea expresiei n celulele de mamifere a fost ncercat, n mare
msur fr succes [Yang i colab., 2001].
Mai multe lucrri recente, folosind interferena scurt ARN (ARNsi; a se vedea
de mai jos) par a fi mai promitoare [Paddison, 2002]. S-a observat c celulele de
mamifere mature, n comparaie cu celulele embrionare recunosc aceste secvene de
ARN dublu catenar lung
detectarea situsurile ARN accesibile. O astfel de abordare este scanarea ARN-ul int
marcat prin hibridizare pentru o banc de oligonucleotide cu secvena cunoscut prin
microarray [Sohail i colab., 2000].
O alt abordare este cea a renaturrii oligodeoxinucleotidelor randomizate la un
transcript al ARN i clivajul ulterior al acestui complex prin RNaza H. Situsurile de
clivare pot fi apoi scanate pentru triplei susceptibili pentru clivaj de ctre ribozime.
Analiza transcripilor nu este n ntregime satisfctoare pentru c structura secundar
a ARNm n celule ar putea fi destul de diferit de cea a transcriptului. n plus, o parte
din ARNm ar putea fi acoperit de proteine prevenind renaturarea oligonucleotidelor.
Astfel, extinderea unor astfel de analize pentru ARNm nativ este lucrul cel mai de
dorit, chiar dac experimental este foarte provocator din cauza stabilitii sczute a
produilor de clivaj. ntr-adevr, analiza la murine a ADN metiltransferazei ARNm n
extractul celular a fost realizat cu succes cu ajutorul oligonucleotidelor i RNaza H
[Scherr i colab., 2000]. Siturile, astfel, selectate au fost eficiente n mod egal pentru
inhibarea prin oligodeoxinucleotide i ribozime.
Metode computaionale au fost, de asemenea puse la punct pentru a identifica
astfel de situsuri [Patzel i colab., 1999]. O comparaie direct a demonstrat c
situsurile identificate prin metode computaionale i metode cu RNaza H au fost n
concordan. S-a constatat, c ribozimele cu brae randomizate de legare a
substratului au fost folosite pentru clivarea transcripilor de ribozime n agraf de pr
[Putlitz i colab., 1999].
Faza
Medicament
III
II
II
ICAM-1
ICAM-1
ICAM-1
Boal Crohn
Psoriazis
Colite
ulcerative
ISIS
ISIS
ISIS
ISIS2302/Alicaforsen
ISIS2302/Alicaforsen
ISIS2302/Alicaforsen
III
II
II
HCV
Factorul
de necroz
tumoral
Hepatit C
Boal
Crohn,
psoriazis
ISIS
ISIS
ISIS 14803
ISIS 104838
II
II
c-myc
Cancer,
restenozare
AVI-Biopharm
Resten-NG
III
Bcl
HIV
Adenozina
A1
Cancer
SIDA
Boli
respiratorii
Genta/Aventis
Enzo Biochem
EpiGenesis
Genasense
HGTV43
EPI2010
III
II
II
Hybridon
Gem 231
II
Ribonucleotid Cancer
reductaza
Lorus
Therapeutics
GTI2040
II
Factorul de
cretere 2
tansformant
Pharma antisens
AP 12009
I / II
Cancer
201
Receptorul 1
al factorului
de cretere
vascular
Cancer
Ribozyme
Angiozyme
Pharmaceuticals
II
HCV
hepatit C
Ribozyme
Heptazyme
Pharmaceuticals
HER2
Cancer
Ribozyme
Herzyme
Pharmaceuticals
6.8. Concluzii
Acizi nucleici, n special oligonucleotidele antisens, sunt acum considerate ca
fiind medicamente candidate. Compusul, Vitravene, este n prezent pe pia i mai
muli compui promitori sunt n prezent n studii clinice de faz III. Succesul lor va
defini potenialul impact al oligonucleotidelor antisens. n plus, utilizarea ribozimelor
pare s aib rezultate pozitive n aplicaii ale medicamentelor, cu toate c unele
obstacole nc mai trebuie s fie depite. Cel mai recent concept, ARNi, este n faz
incipient dar are un foarte mare potenial, deoarece presupune un concept natural.
Cele mai serioase limitri sunt determinate de asimilarea celular srac, i distribuia
nc ineficient n organe. Probabil c rezolvarea acestor impedimente va decide
viitorul oligonucleotidelor ca medicamente.
203
204
205
Cei 2 enantiomeri ai unui medicament chiral se pot identifica cel mai bine pe
baza configuraiei absolute a acestora sau pe baza rotaiei optice. Alte denumiri cum
ar fi D sau L sunt utile n cazul zaharurilor sau aminoacizilor dar ele sunt specifice
acestor molecule i nu sunt general aplicabile altor compui. Termenii dextro sau levo
sunt considerai nvechii i ar trebui evitai. n locul lor ar trebui folosit sistemul R/S
pentru configuraia absolut (R = rectus = dreapta, n sensul acelor de ceasornic
S=sinister= stnga, n sens invers acelor de ceasornic, din lb. latin) i sistemul +/
pentru rotaia optic, termeni ce in cont de reguli precise bazate pe numrul atomic i
mas pentru a determina dac centrul unei particule chirale are o configuraie R sau S.
Un medicament chiral poate avea mai mult dect un singur centru chiral, iar n
astfel de cazuri este necesar determinarea configuraiei absolute pentru fiecare
centru chiral. Rotaia optic este folosit deseori pentru c este mai uor de
determinat experimental dect configuraia absolut, ns ea nu ofer informaii
despre configuraia absolut a unui enantiomer. Pentru o pereche dat de enantiomeri,
unui enantiomer i poate fi alocat notaia (+) iar celuilalt ( ) pe baza direciei n care
ei rotesc planul luminii polarizate. Rotaiile optice au fost descrise ca fiind
dextrorotatorii (+) sau levorotatorii ( ). Amestecurile racemice sunt notate (R,S) sau
().
7.1.2 Medicamentele chirale n sistemele biologice
Enantiomerii aceluiai medicament chiral au proprieti fizice i chimice
identice n medii achirale, ns n medii chirale ele prezint comportamente chimice
i farmacologice diferite (fig.7.1). Deoarece sistemele vii sunt ele nsele medii chirale,
fiecare enantiomer ai unui medicament chiral se comport foarte diferit in vivo. De
aceea, pentru un medicament chiral dat, cei doi enantiomeri se consider a fi dou
medicamente diferite, dac nu este demonstrat contrariul.
n cazul ilustrat mai sus, unul din enantiomeri este activ biologic, iar cellalt
enantiomer nu este. Domeniile A,B i C ale medicamentului trebuie s interacioneze
cu regiunile corespunztoare ale situsului de legare a,b i c pentru ca medicamentul
s poat avea efectul farmacologic.
206
Fig.7.1 Diferena dintre doi enantiomeri ai unui medicament prin intermediul unei
interaciuni ipotetice ntre un medicament chiral i situs-ul su de legare chiral.
ntre acestea pot exista diferene de dozaj, eficacitate, efecte secundare i chiar de
indicaii. Decizia utilizrii formei de un singur-enantiomer IC sau a amestecului
de enantiomeri pentru un anumit medicament ar trebui luat pe baza datelor din
trialuri clinice i a experienei clinice.
Folosirea medicamentelor enantiomerice unice poate favoriza un profil
farmacologic mai simplu i mai selectiv, indici terapeutici mbuntii,
farmacodinamic mai simpl i scderea interaciunilor medicamentoase. n trialuri
clinice (S) albuterolul, agonist al receptorilor 2 adrenergici utilizat n tratamentului
astmului i (S) omeprazolul, inhibitor al pompei de protoni utilizat n tratamentul
refluxului gastroesofagian, s-au dovedit a fi superioare fa de formele de prezentare
racemice. n alte cazuri ns la efectele terapeutice contribuie ambii enantiomeri, iar
utilizarea unor enantiomeri singuri poate avea efecte mai reduse sau poate chiar s
fie duntoare fa de forma racemic, aa cum se ntmpl enantiomerului (-) al
sotalolului, cu activitate blocant i antiaritmic, n timp ce enantiomerul (+) al
acestuia are proprieti antiaritmice ns nu are efecte antagoniste adrenergice.
ingeniozitatea chimitilor au
Primul i cel mai important aspect care reprezint baza tuturor activitilor din
acest domeniu este reprezentat de diferena semnificativ ce se constat ntre
proprietile farmacologice i cele toxicologice ale enantiomerilor compuilor chirali
biologic activi. Se cunosc multe exemple i n numeroase cri, capitole de cri i
overview-uri s-a analizat acest subiect [Mehvar , Brocks , 2001; Vakily i colab.,
2002].
Al doilea aspect important este reprezentat de un mecanism de protecie care
permite companiilor farmaceutice s i prelungeasc drepturile de proprietate asupra
medicamentelor chirale, pe care anterior le-au comercializat sub forma racemic i
vor fi dezvoltate i patentate ca i entitate a unui singur-enantiomer. Exemple
recente de acest fel includ compusul enantiomer-singur al inhibitorului nalt potent
al secreiei acide gastrice omeprazol introdus pe piaa european
n 2001 de
Linezolid, care a fost aprobat de FDA n Aprilie 2000. Aceast list include i
medicamentul
chiral
cu
efect
asupra
sistemului
respirator
montelucast,
cromatografic
au
avut
contribuie
important
producia
212
214
216
cum este cataliza metalic heterogen, complexe omogene i acizii i bazele chirale
solubile.
S-au fcut studii mai vechi n acest domeniu al catalizei asimetrice heterogene
avnd ca scop nelegerea originii chiralitii. Pentru aceasta s-au folosit ca substrat
pentru cataliza metalic materiale solid chirale precum cuarul, mtasea, celuloza etc.
Procesul de sintez al L-dopa elaborat de Knowles i Sabacky la Monsanto n 1966
1968, a fost primul procedeu elaborat pentru producia la scar industrial a unui
medicament farmaceutic enantiomeric pur prin cataliz asimetric. n 1971, Kagan i
Dang au descris un catalizator de hidrogenare asimetric ce conine o difosfin chiral,
derivat din acidul L-tartaric. n anii '80, Noyori i colaboratorii a introdus aanumita serie BINAP a liganzilor chirali derivai din gruparea binaftil chiral axial
[Noyori , 2002].
Acum, hidrogenarea asimetric catalitic pe baza metodelor mai sus amintite i
cele nrudite cu acestea reprezint una din cele mai comune moduri de fabricare a
medicamentelor chirale enantiomeric pure. Ca exemple amintim (S)-naproxen, catena
lateral a vitaminei E, alcaloizi
morfinani precum antitusivul dextrometorfan, antibiotice carbapenemice, (R)-1,2propandiolul intermediar al levofloxacin-ului, carnitina, statinele, fosfomicina,
intermediari ai antraciclinelor, denopamina, fluoxetin, duloxetin, orfenadrin,
neobenodin, prostaglandinele, -blocantele, medicamentul antihelmintic (i antiinflamator) levamisol, etc.
Metodele oxidative asimetrice, incluznd epoxidarea, hidroxilarea i
aminoxidarea reprezint ci importante de obinere a produselor farmaceutice
enantiomeric pure la scar comercial [Sharpless , 2002]. Epoxidarea de precizie mai
mic este folosit pentru fabricarea (R)- i (S)-glicidolului, intermediari importani
n sinteza -blocantelor enantiomeric pure. Dihidroxilarea asimetric este folosit n
sinteza antagonistului canalelor de calciu cis-diltiazem.
Sulfoxidarea catalitic asimetric poate cpta importan n viitor datorit unei
creteri a cererii pe pia pentru inhibitorii chirali ai secreiei acide gastrice cu
structur sulfoxidic, precum omeprazol, pantoprazol, rabeprazol, peprazol i
217
Fig. 7.5 Reprezentare schematic a unei uniti SMB.[dup Francotte , Richert ,1997]
220
221
Numrul coloanelor din aceeai zon poate varia la sistemul VARICOL. Astfel
unitatea VARICOL este mai complex dect SMB, oferind o serie de avantaje: dac
este proiectat adecvat, fluxul de alimentare nu contamineaz cursul de extracie sau
rafinat, n zonele II, respectiv III numrul de coloane fiind temporar zero. Cnd
222
numrul de coloane din zonele I i IV este egal cu zero fluxul de eluent nu va face o
diluie suplimentar nedorit a componentei extrase sau rafinate.
Tabelul 7.2 Comparaie ntre procesele SMB i VARICOL (dup LudemannHombourger i colab.,2002)
Productivitate
(kgprod/kgCSP/zi)
Consum eluent
(m3eluent/kgprod)
0,604
0,922
0,664
0,888
0,725
1,050
0,906
1,392
demonstrat c deobicei capacitatea probei poate fi de cteva ori mai mare cnd se
execut o separare izotacoforetic n comparaie cu electroforeza capilar zonal
(CZE). n continuare, n sistemul experimental cu utilizarea unei combinaii de
0,1mm I.D. i 0,8mm I.D. capilare copolimer etilen-propilen fluorinate, au fost
separate cantiti de micrograme de 2,4-dinitrofenil-DL-norleucin cu puritate
enantiomeric mare i o recuperare de aproximativ 75% n 20 minute.
Chankvetadze i colaboratorii (2001), lucrnd la creterea selectivitii
separrii n electroforeza capilar bazat pe principiul contracurentului, a artat c
enantiosepararea continu n cantiti mici poate fi efectuat n format capilar prin
folosirea contrapresiunii, presiunea hidrodinamic, curgerea electro-osmotic (EOF)
sau proprietatea de carrier a unui selector chiral n contracararea mobilitii
mpotriva mobilitii electroforetice efective a enantiomerilor analizai. Aa cum s-a
artat experimental n studiul lor, contrapresiunea poate fi ajustat de aa manier
nct cei doi enantiomeri vor migra ctre electrozi opui sau doar un enantiomer va
migra din recipientul de intrare ctre recipientul de ieire. Glukhovsky i Vigh (1997)
au aplicat principiul migrrii contra-curent pe baza proprietii de carrier a unui
singur izomer al heptacis-(6-sulfato)--ciclodextrinei n combinaie cu mai sus
amintita unitate electroforetic Octopus i au raportat enantiosepararea terbutalinei cu
productivitate de 0,1mg/h (pentru fiecare enantiomer) i o puritate enantiomeric de
99,99%. Schneiderman i colaboratorii (2002) au raportat enantiosepararea
electroforetic n cantiti mici a medicamentului chiral Ritalina.
226
227
tabelul
7.3
sunt
prezentate
rezultatele
determinrii
barierei
de
1542
1503
210
1572
1543
220
1592
1553
reprezint
acum
cea
mai
important
tehnic
de
bioanaliz
229
pare
fi
de
real
interes
pentru
studii
bioanalitice
de
enantioselectivitate.
Cea mai recent direcie din domeniul materialelor pe baz de polizaharide o
reprezint imobilizarea covalent a acestora cu scopul de a lrgi sfera de aplicabilitate
a fazelor mobile ctre aplicaii la scar analitic (cantiti mici) i preparativ
(cantiti mari). Miniaturizarea a devenit o tendin major n HPLC n ultimii ani i
este intens promovat prin cele mai recente progrese n domeniile proteomicii,
genomicii, metabonomicii, sintezei combinative i a tehnologiilor cu circuite
integrate (cip-uri). Aceast tendin nu este nc suficient de puternic n HPLC
chiral. Doar cteva grupuri ce lucreaz n domeniul CEC chirale fac cercetri i n
LC capilar. Aceast direcie de dezvoltare ar merita mai mult atenie deoarece, cele
mai recente progrese din domeniul cercetrii proteomicii i sintezei combinative vor
pune n discuie aceleai necesiti viznd rapiditatea, economia, eficiena, nalta
sensibilitate i poluarea redus a mediului pentru separarea chiral, deoarece multe
dintre substanele candidate pentru a deveni medicamente sintetizate prin procedee
combinative, ca i compuii de origine biologic, sunt chirale. Metodele de separare
capilare combinate cu interfee nanospray par a fi mai sensibile dect cele cu coloane
de dimensiuni obinuite.
Tendinele actuale ale bioanalizei enantioselective cuprind combinaii ale
HPLC i MS, detectori fluoresceni laser ultra-sensibili i polimeri imprimai
molecular pentru prepararea / preconcentrarea probei prin intermediul computerului.
230
231
selectorii
chirali
ce
exprim
aceeai
enantioselectivitate
selectorului chiral. Acest lucru poate fi limitat de ctre solubilitatea unui selector
chiral, vscozitatea mare a electrolitului de fond sau curentul crescut n cazul
selectorilor chirali ncrcai (ionic). Totui, suporturile de migrare sunt destul de
cuprinztoare pentru optimizarea separrii. Astfel, puterea de separare a CE este n
mod cert mai mare iar instrumentele disponibile pentru ajustarea unei separri chirale
sunt mult mai numeroase dect n cazul tehnicilor cromatografice.
Reproductibilitatea timpilor de migrare i a separrii n ntregime au fost
motive de incertitudine n CE timp ndelungat. Totui, aa cum indic cele mai
recente progrese, acesta nu mai este un aspect critic. Pentru eliminarea interveniei
peretelui capilar asupra motilitii substanei analizate, au aprut cteva tehnici
eficiente, fie prin ajustarea motilitii EOF, fie prin supresia acesteia. n plus,
selectorii chirali utilizai n CE devin din ce n ce mai bine i mai uniform
caracterizai.
Ambele
tendine
descrise
faciliteaz
evoluia
ctre
buna
235
7.6. Perspective
Analiza celor mai recente progrese n domeniul enantioseparrii indic o
continu cretere a importanei acordate dezvoltrii de noi medicamente i a eficienei
n utilizarea celor n uz. Tehnicile miniaturizate de analiz cum ar fi CE, LC capilar
i CEC care funcioneaz cel puin la fel de bine ca i HPLC, vor deveni mai
importante. Tehnicile miniaturizate sunt mai flexibile, mai ieftine i mai puin
poluante.
Pentru
aplicaii
domeniul
produciei
medicamentelor
chirale
238
CAPITOLUL 8
CROMATOGRAFIA DE AFINITATE: APLICAII N
BIOFARMACEUTIC
8.1. Introducere
Conform
definiiei
IUPAC,
termenul
cromatografie
de
afinitate
240
Anticorpi
Substraturi,
coenzime
Lectine
inhibitori,
Acizi nucleici
Proteina A, proteina G
Colorani triazinici
Chelatori metalici
Borai
unde [S] este concentraia substanei dizolvate n faza mobil, [L] i [SL] reprezint
concentraiile de suprafa ale ligandului, respectiv complexului ligandsubstan
dizolvat. kA i kD sunt constantele de asociere i disociere ale reaciilor, iar KA este
constanta de asociere a complexului. Meninerea echilibrului soluiei este definit
prin relaia:
cantitatea de ligand din coloan. Considernd o constant de asociere (KA) de 108 109 M-1 i o concentraie a ligandului (mL/Vm) de 10-5 M, k' devine 1000 10.000, iar
tipul de eluie a substanei analizate legate va tinde ctre cteva zile.
Singura modalitate de a realiza eluia ntr-un interval de timp rezonabil este
prin modificarea variabilelor astfel nct constanta de asociere s fie micorat
considerabil n condiii experimentale. Acest lucru se poate obine prin schimbarea
soluiei tampon de eluie fie intr-o singur etap, fie gradual. Din motivele cele mai
practice, constanta de asociere KA ar trebui s fie egal sau mai mare dect 105 -106
M-1, ceea ce corespunde unei constante de disociere KD de 1-10 M, pentru a asigura
buna adsorbie a substanei de analizat.
Totui, chiar i o valoare KA n intervalul 103 -106 M-1 poate avea ca rezultat o
ntrziere convenabil a proteinei de interes dac densitatea ligandului este suficient
de mare. Pe de alt parte, avnd interaciuni ce depesc 1010 -1011 M-1, vor fi
necesare condiii severe de eluie a proteinei legate, ceea ce va determina denaturarea
proteinei. Constante de disociere n intervalul 10-3 - 10-5 M (ce se transpun n KA= 103
- 105 M-1) sunt n general adecvate pentru eluia n condiii blnde, fr denaturare a
proteinelor.
8.3. Ligandul
Alegerea ligandului de afinitate este cea mai important pentru matricea de
afinitate, afectnd specificitatea de legare, procesul de imobilizare i costul matricei.
Un bun ligand ndeplinete urmtoarele criterii [Carlsson i colab. 1998] :
ligandul trebuie s formeze complexe reversibile cu proteina pentru a fi izolat
sau separat cu o specificitate adecvat pentru aplicaia urmrit;
stabilitatea complexului ar trebui s fie destul de crescut nct s asigure o
ntrziere cromatografic suficient a proteinei;
complexul ar trebui s fie uor de disociat printr-o schimbare a soluiei tampon,
fr ca aceasta s afecteze stabilitatea proteinei ce trebuie izolat sau a
ligandului;
243
cofactori sau
substraturi.
Tab. 8.2 Exemple de liganzi cu specificitate de grup
Ligand
Benzamidina
Arginina
Lizina
245
Liganzi macromoleculari
Heparina
Calmodulina
Lectine
Proteina A
Proteina G
cuplarea ligandului ;i
Substan imobilizat
Amino
Hidroxil
Tiol
Iodoacetil
Bromoacetil
Maleimid
Piridil disulfat
Activare epoxi sau boxiran
Divinilsulfon
2-fluoro-1-metilpiridin toluen-4-sulfonat (FMP)
Acid 5-tio-2-nitrobenzoic (TNB) tiol
Aldehid
Metoda hidrazidei
Introducerea gruprilor amino- prin reacii de reducere
Carboxil
Sinteza diazo
Condensarea Mannich
252
hidrofob, eluia poate fi obinut prin utilizarea aa numiilor ageni chaotropi care
denatureaz structura proteinelor,
detergenii. Totui acestea sunt condiii drastice care pot cu mare probabilitate s
denatureze proteinele. Adesea pe toat durata procesului de purificare atunci cnd
sunt manipulate proteine membranare sau n cursul purificrii anticorpilor, sunt
folosite concentraii sczute de detergeni pentru a se inhiba adsorbia sau agregarea
de tip hidrofob nespecific. Se pot aplica i combinaii de condiii selective i
neselective.
Reutilizarea adsorbanilor de afinitate depinde de natura probei ca i de
stabilitatea ligandului i a matricei, inndu-se cont de condiiile de eluie i curare.
De regul este necesar reechilibrarea atent a coloanei nainte de folosire. n plus,
suporturile pe baz de carbohidrai i liganzii proteici sunt predispuse la degradare
microbian i poate avea loc i contaminarea coloanei cu resturi celulare degradate,
lipide i proteine. Acestea trebuie ndeprtate complet. n plus poate fi necesar
decontaminarea pentru ndeprtarea bacteriilor, virusurilor i piogenilor, dar astfel de
condiii severe ar putea s nu fie aplicabile liganzilor proteici, de exemplu. Este
recomandat depozitarea coloanelor la temperaturi mici.
Civa dintre liganzi sunt prezentai n tabelele 8.1 i 8.2, iar n literatur au
fost descrii muli alii. Acetia includ molecule mici precum aminoacizi, peptide,
carbohidrai, cofactori, substraturi i inhibitori nucleotidici, precum i molecule mari
cum ar fi proteine, polizaharide i acizi nucleici.
Unele forme ce utilizeaz un anumit tip de interaciune sunt recunoscute ca
metod de sine stttoare, ca de exemplu cromatografia de afinitate a lectinei, care se
bazeaz pe interaciunea dintre lectine i carbohidrai i cromatografia de afinitate
avidin-biotin ce utilizeaz legarea de nalt specificitate a biotinei de avidin.
Tabelul 8.4 Tipuri de cromatografie de afinitate i tehnici asociate
Cromatografia de bioafinitate
Cromatografia de imunoafinitate
Cromatografia de afinitate pentru lectin
Cromatografia de afinitate avidin biotin
Cromatografia de afinitate ligand colorant
Cromatografia de afinitate prin ioni metalici imobilizai
Cromatografia prin interaciuni hidrofobe
Cromatografia tiofilic
Cromatografia prin inducie de ncrcare hidrofob
Cromatografia prin afinitate de covalen
Cromatografia de afinitate joas
Cromatografia prin afinitate de receptor
Cromatografia prin afinitate respingere
Cromatografia prin afinitate de perfuzie
Cromatografia prin afinitate de centrifugare
Cromatografia prin amprentare molecular (molecular imprinting)
Cromatografia prin afinitate de membran
Partiia de afinitate
Precipitarea de afinitate
Cromatografia prin afinitate de nalt performan
Electroforeza de afinitate
Electroforeza de afinitate capilar
257
F3G-A (fig. 8.2) a fost primul ligand de afinitate utilizat, iar de atunci s-au folosit
muli compui derivai ai coloranilor. Coloranii sunt imobilizai pe suport prin
intermediul ionilor de clor reactivi pe jumtate, triazina heterociclic. n multe studii
cinetice s-a demonstrat c trazinilcoloranii interacioneaz cu situsurile de legare a
liganzilor nucleozidici NAD+, NADH, NADP+, NADPH, ATP sau GTP. Pn n
momentul de fa prin cromatografia de afinitate ligandcolorant s-au izolat molecule
precum enzime (kinaze, dehidrogenaze, endonucleaze, hidroxilaze, fosfodiesteraze i
multe altele), factori ai coagulrii, interferoni i albumin seric.
Dei coloranii textili pot interaciona cu o remarcabil specificitate cu proteine,
n unele cazuri interaciunile acestora cu un numr mare de proteine aparent
nenrudite compromit inevitabil specificitatea lor de legare ceea ce le confer
dezavantaje majore. Preocuparea n ceea ce privete puritatea, toxicitatea i scprile
n produsul final a coloranilor comerciali le-a limitat utilizarea n domeniul
biofarmaceutic. Tehnicile raionale de proiectare molecular incluznd cristalografia
cu Raze X, modelarea molecular i chimia combinatorie au dus la obinerea de
colorani liganzi biomimetici cu nalt specificitate pentru o protein dat,
pstrnd i majoritatea avantajelor coloranilor comerciali.
acid
carboximetilat
aspartic
sau
N,N,N'-tris(carboximetil)
fa de oxigen. Ionii metalici slabi cum sunt Cu+, Hg2+ sau Ag+ au afinitate fa de
sulf, n timp ce ionii intermediari Cu2+, Ni2+, Zn2+ i Co2+, formeaz legturi
coordinative cu azotul, oxigenul i sulful.
n ciuda faptului c multe resturi de aminoacizi cu perechi libere de electroni
pot participa la formarea legturilor, n practica IMAC retenia proteic se bazeaz n
principal pe disponibilitatea resturilor histidil de la suprafaa proteinelor. Ionii
metalici intermediari utilizai de obicei pot fi ordonai dup creterea specificitii:
Cu2+ < Ni2+ < Zn2+ Co2+. Astfel, Cu2+ va reine mai multe proteine iar numrul va
scdea n cazul Ni2+, Zn2+ i Co2+ datorit afinitii mai sczute pentru situsurile de
legare. Dintre proteinele care au fost purificate prin IMAC cu ajutorul resturilor
expuse ale histidinei sunt proteinele serice umane, interferonul, lactoferina i
activatorul tisular al plasminogenului. Afinitatea pentru resturile histidinice a dus la
sinteza moleculelor de afinitate terminate n histidin pentru proteine i peptide
recombinate. Aceste terminaii conin multiple histidine legate la captul C sau N
terminal. Dup ce au fost evaluate cteva terminaii formate din 1 pn la 8 peptide
repetitive ce conin histidin, astzi de departe cele mai folosite terminaii histidinice
sunt formate din 6 resturi consecutive de histidin, care sunt comercial cunoscute sub
diverse denumiri. Terminaiile histidinice par a fi compatibile cu toate sistemele de
expresie folosite astzi astfel nct proteinele cu terminaii histidinice pot fi produse
cu succes n celule procariote i eucariote, intracelular sau ca proteine secretate.
Ca tehnic mai degrab nespecific de purificare a proteinelor, IMAC este n
prezent una dintre cele mai utilizate metode pentru izolarea proteinelor recombinate .
S-a estimat c peste 50% din proteinele recombinate exprimate la celulele gazd
procariote sunt purificate prin IMAC. De obicei, prelungirile polihistidinice nu
compromit funcionalitatea biologic a unei proteine i nu au imunogenitate
important. Totui, mai ales n cazul proteinelor implicate n terapie, clivarea
terminaiei ar putea fi necesar, nefiind ntotdeauna uor de realizat. n general
clivarea enzimatic este aplicabil n purificarea amestecului rezultat din proteina de
fuziune clivat, enzim, proteina neclivat i alii produi de clivare. n plus, trebuie
luat n considerare toxicitatea ionilor metalici ce scap din coloana IMAC. Mai mult,
260
ionii metalici de multe ori catalizeaz reacii de oxidare ce pot duce la degradarea
oxidativ a proteinelor. Cei mai predispui la reacii de oxidare sunt n special
aminoacizii cisteina i metionina ce conin sulf.
8.6.5. Cromatografia prin interaciuni hidrofobe (HIC)
HIC se bazeaz pe asocierea gruprilor hidrofobe pe suprafaa proteinelor cu
liganzi mobilizai prin legturi de tip hidrofob slabe pe suporturi cromatografice. HIC
este efectuat n soluii apoase, fapt ce o difereniaz de tehnica de cromatografie cu
faz invers, unde sunt folosii solveni organici pentru eluia proteinelor. n plus
densitatea ligandului n cromatografia cu faz invers este mai mare, astfel c faza
staionar poate fi privit ca o faz continu, n timp ce n HIC liganzii
interacioneaz individual cu moleculele int. Liganzi folosii uzual sunt resturi butil,
octil sau fenil adesea legai prin intermediul unui eter glicidil. Sunt folosii ca liganzi
i oligoetilenglicol i hidroxipropil.
Retenia substanei dizolvate este controlat de tipul i concentraia srii
utilizate i a aditivilor organici care schimb polaritatea solventului. Adugarea de
etilen glicol n soluia tampon modific structura de ansamblu a apei n sensul unei
structuri ce se aseamn unei faze organice, scznd astfel interaciunea dintre
protein i liganzi. Influena srurilor asupra legrii poate fi corelat cu poziia srii
n seria Hoffmeister, clasificnd anionii i cationii n liotropici sau chaotropici.
Srurile liotropice cum sunt sulfatul de amoniu sau fosfatul de potasiu vor scdea
solubilitatea apei n proteine crescnd astfel retenia lor n HIC; srurile chaotropice
vor determina desorbia proteinelor. n practic desorbia proteinelor va fi realizat
prin scderea concentraiei saline. Alegerea corect a srii este un factor important ce
determin specificitatea separrilor. Dup ncrcarea probei n coloan folosind o
soluie tampon cu o concentraie a srii suficient de mare pentru a determina legarea
proteinei int dar suficient de sczut pentru a evita precipitarea proteinei,
componentele nelegate din prob sunt splate i eliminate din coloan. Ulterior
concentraia de sare este sczut n trepte sau continuu sub forma unui gradient
pentru a se realiza eluia selectiv a proteinei de interes. Ali factori care trebuiesc
261
(5)
reacie prin intermediul cromatografiei prin covalen se pot izola proteine ce conin
nativ grupri tiol sau proteine la care gruprile tiol pot fi introduse de exemplu prin
reacii de reducere ale punilor disulfidice existente.
8.6.7. Cromatografia de afinitate membranar
Termenul de cromatografie de afinitate membranar se refer la formatul
suportului. n timp ce la cromatografia de afinitate normal matricea de afinitate
este susinut de coloane n timpul procesului cromatografic, n metoda prezentat
sunt utilizate membrane. Prin utilizarea membranelor pot fi depite limitrile
cromatografiei lichide n coloan cu strat compact date de procesele de compactare ce
necesit timp, suplimentarea cu lichid la presiune mare n coloan i restriciile de
transfer ale maselor. n straturile poroase, transferul maselor este limitat prin
difuziunea lent a substanelor analizate n pori (la final) a materialului. Membranele
sunt constituite din canale poroase consecutive ce permit difuziunea filmului la
suprafaa membranei n interiorul canalelor ca singura rezisten opus transportului.
Difuziunea filmului este de obicei de cteva ori mai rapid dect difuziunea prin pori,
ceea ce permite ca limitarea proceselor de adsorbie s fie permutate la interaciunile
ligand substan dizolvat. Aceste procese sunt identice cu cele din cromatografia
pe coloan i n general foarte rapide. Structura macroporoas i faptul c
membranele suprapuse n teancuri sunt subiri n comparaie cu straturile compacte
din cromatografie determin curgeri la presiuni mici ceea ce permite un flux crescut
i prin urmare timpi de separaie mai mici. Capacitatea de legare necesar este atins
prin folosirea unor suprafee interne ale membranelor suficient de mari. Avantajul
unor fluxuri mari se poate transforma n dezavantajul unui timp prea scurt de contact
al soluiei. Un singur strat de membran poate avea teoretic o capacitate mare, dar
capacitatea poate fi mult mai mic datorit timpului de interaciune limitat al probei.
n cazul interaciunilor de afinitate puternice, procesul de eluie al moleculei int
limiteaz i mai mult acest procedeu prin faptul c timpul de contact poate s nu fie
suficient pentru o eluie rapid a materialului legat, rezultnd diluii crescute ale
probelor recuperate. Abordri menite s depeasc aceste inconveniente includ
264
este folosit ca
268
Dimensiune
Fuziune la captul
C- sau N- terminal
glutation-S-transferaza
26 kDa
-galactozidaza
116 kDa
C, N
14 31 kDa
28 kDa
40 kDa
111 aninoacizi
8 kDa
Strep-tag
9 aminoacizi
C, N
8 aminoacizi
poli(Arg)
5 - 15 kDa
poli(Asp)
5 16 kDa
4 9 kDa
C, N
Enzime
Epitopi antigenici
FLAGTM tag
Aminoacizi ncrcai
270
protein,
inclusiv
aspecte
stereochimice,
pentru
determinarea
rezultat este separat de substana de analizat liber prin electroforez capilar. Au fost
descrise dou tipuri distincte. n analiza direct sau noncompetitiv, proba pentru
studiul de afinitate marcat de regul cu un fluorofor este adugat probei pentru
legarea de molecula int. Detecia complexului reprezint o msur direct a probei
n soluia prob. n analiza competitiv, o int marcat fluorescent i o cantitate
limitat de anticorp sunt adugate probei permind intei marcate i intei din prob
s competiioneze pentru anticorp. Moleculele marcate libere sau n complexe sunt
separate i detectate, cantitile relative de compui marcai liberi sau legai
depinznd de concentraia substanei de analizat din prob. Imunoanalizele prin
electroforez capilar s-au dovedit a fi metode versatile pentru o varietate de
substane de analizat i matrice prob [Heegaard, Kennedy, 2002]. S-au fcut
determinri pe medicamente, hormoni, peptide, proteine, toxine, i chiar virusuri i
bacterii. Substanele de analizat pot fi msurate direct n ser sau urin dar i n probe
de celule sau tisulare. Interesant, prima imunoanaliz pentru scrapia, prototipul
encefalopatiei spongiforme, s-a bazat i pe electroforeza capilar. n plus,
imunoanalizele pot fi transferate i pe chip-uri permind timpi de analiz extrem de
redui. Un exemplu este dezvoltarea unei imunoanalize electroforetice capilare bazate
pe chip pentru determinarea teofilinei n ser, unde electroforeza este complet n 35
secunde.
8.7.2.3. Biosenzori de afinitate
Realizrile tehnicilor de imobilizare i inovaiile din domeniul bioelectronicii
au dus la elaborarea unor noi dispozitive de detecie bazate pe interaciunea specific
dintre receptori, enzime i anticorpi cu moleculele lor int specifice, crendu-se
dispozitive de detecie noi pentru domenii diverse cum ar fi controlul diagnosticului,
tratamentului, controlul mediului i al deeurilor i analiza dinamic a interaciunilor
substanelor biologice. Dei nu se bazeaz pe principii de separare cromatografice sau
electroforetice, pentru funcionarea lor aceti senzori implic interaciuni de afinitate.
n plus biosenzorii sunt utilizai din ce n ce mai mult n multe domenii ale
descoperirii de medicamente, incluznd identificarea intei, ligand fishing, selecia
276
Fig. 8.4 Curba de legare tipic a unui biosenzor optic. Concentraia substanei de analizat
rezult din nivelul de rspuns la echilibrul curbei, n timp ce dinamica de legare poate fi calculat
din rata de asociere respectiv rata de disociere observate. De obicei, este necesar refacerea
ligandului prin eluia n trepte, multe interaciuni avnd durat de supravieuire considerabil. Ciclul
de legare este repetat folosind diferite concentraii ale substanei de analizat, pentru obinerea unor
date compatibile unui algoritm de legare.
278
280
CAPITOLUL 9
IDENTIFICAREA MEDICAMENTELOR PE BAZA
REZONANEI MAGNETICE NUCLEARE
9.1. Introducere
Obinerea medicamentelor se confrunt cu noi provocri, odat cu numrul
mare de proteine produse n era post-genomic. Determinarea structurii, care este
acum mbuntit i mult mai rapid datorit cristalografiei cu raze X i a
spectroscopiei prin rezonan magnetic nuclear (RMN), ofer bazele pentru noile
posibiliti de producie a medicamentelor pe baza structurii. Astfel, screening-ul
proteinelor pentru bncile de molecule mici, a devenit o problem important. In timp
ce metodele de screening de mare capacitate (HTS) permit sute sau mii de scanri
ntr-un timp scurt, necesitatea tehnologiilor de screening inteligent care pot detecta
componente omise de filtrul HTS, este n continu cretere.
Screening-ul inteligent, care poate identifica aspecte ale funciilor proteinelor,
devine din ce n ce mai important, pe msur ce noi inte sunt obinute din baza de
date genomic. Dei analizele cu raze X pot determina structurile proteinelor fr
limitri datorit dimensiunii, mult mai rapid dect spectroscopia RMN, cea din urm
are avantajul unei analize mai detaliate a interaciunilor liganzilor. In ciuda
complexitii unor parametrii RMN, exist parametri sensibili i uor accesibili care
sunt supui modificrilor n spectrul corespunztor proteinelor, n urma legrii
ligandului. Muli dintre aceti parametri au putut fi utilizai pentru a
dezvolta
283
Figura 9.2. Reprezentare schematic a SAR prin RMN. Screening-ul iniial detecteaz
compui cu afinitate sczut pentru cele dou situsuri de legare. Dup ce afinitatea moleculelor
modulatoare a fost optimizat, cele dou fragmente sunt conectate ntr-un mod care menine legarea
la ambele situsuri.
285
Figura 9.3 Diagramele Ribbon ale p85 N-SH2 a PI3 kinazei, codificate cu diferite
culori ce indic transformrile chimice pentru diferii liganzi. (A) Ac-pY-NH2, (B) pYM-NH2
i (C) EEEpYMPME. (A) Modificrile chimice pentru complexul Ac-pY-NH2-SH2. Reziduurile
sunt colorate cu albastru atunci cnd sufer o transformare chimic a ambilor nuclei (eq. 2) de cel
puin 0,45 p.p.m. n figurile (B) i (C), transformrile chimice care nu au fost alterate comparativ cu
(A) sunt marcate cu albastru, cele marcate cu rou reprezint noi modificri chimice neobservate
pentru AcpY-NH2, iar verdele este utilizat pentru reziduurile care au prezentat modificri chimice n
(A), dar nu i n (B) sau (C).
modului n care SAR prin RMN poate fi utilizat n cazul disponibilitii unor
parteneri de legare naturali.
287
Fig 9.4 Reprezentare schematic a proiectrii ligandului utiliznd SAR prin RMN,
pornind de la liganzii naturali ai unei proteine. Forma moleculei legate este alterat gradat la
ambele situsuri de legtur, iar conexiunea este ndeprtat pentru a studia legarea independent la
ambele situsuri. Un ligand cu afinitate nalt poate fi obinut prin delimitarea celor dou fragmente
cu un linker alternativ.
magnetic. pH-ul soluiilor stoc de liganzi trebuie ajustat pentru a evita modificrile
chimice induse de pH.
De asemenea, trebuie evitat o concentraie mare de sruri n soluia de liganzi.
Este recomandat prepararea soluiilor stoc n dimetilsulfoxid (DMSO) pentru a
obine concentraii de aproximativ 100 mM. Aceasta permite adugarea de volume
mici (3-5 ml) la soluia tamponat de proteine. Pentru compuii care nu sunt solubili
n ap, DMSO poate fi adgat i la soluia proteic. Majoritatea proteinelor sunt nc
active n cazul prezenei DMSO ntr-un volum de 20-30% n soluia tampon.
9.2.2. Evaluarea cantitativ
9.2.2.1 Afiniti de legare
Spectrele HSQC (heteronuclear single quantum spectroscopy) obinute pentru
concentraii diferite ale ligandului poart informaii semnificative referitoare la
afinitatea de legare local. Nivelul transformrii chimice observat n spectrul HSQC
pentru o protein titrat cu un ligand depinde de afinitatea i de rata de reacie a
ligandului. n figura 9.3, se observ modificarea poziiei peak-ului (vrfului), care
este tipic pentru schimbrile rapide ntre forma liber i legat a proteinei.
Rata de schimb relevant este rata disocierii (koff) complexului protein-ligand.
Pentru reaciile simple de legare de tipul P + L PL, constanta de disociere este kD =
koff/kon. n consecin, afinitatea sczut este corelat cu rate mari. Deplasrile
vrfurilor la concentraii crescnde ale ligandului sunt observate numai n cazul
interaciunilor cu afinitate sczut (kD > 10-6 mM).
Pentru liganzii cu afinitate crescut, n cazul crora rata de disociere a
complexului este sczut, spectrele HSQC vor prezenta caracteristici de schimbri
lente. n acest caz rezonanele la nivelul proteinei libere i noi rezonane apar
succesiv cu transformrile chimice ale complexului proteic. Acest comportament este
o consecin a ratei de disociere sczute a complexelor cu afinitate nalt. n
asemenea titrri, semnalele complexului proteic trebuie adesea reatribuite, n timp ce
semnalele spectrelor cu schimburi rapide pot fi atribuite prin modificri ulterioare ale
transformrilor chimice datorate adugrii subsecvente de ligand n cantiti mici.
289
1) KD = ([P]0 [PL])([L]0 [PL])/[PL], unde [P]0 i [L]0 sunt concentraiile proteinei libere i
ligandului, iar [PL] este concentraia complexului protein-ligand. [PL] poate fi estimat din transformrile
chimice, care pot fi evaluate din perturbrile chimice ([PL] =(liber obs)/total, unde liber i obs sunt
transformri chimice ale proteinei i complexului la o concentraie dat a ligandului [PL], iar total este
perturbarea total a transformrilor chimice.
290
291
transform datele originale (intensitile i poziiile semnalului ntr-un spectru) ntrun set de scoruri pentru fiecare prob, msurate n funcie de axele componentelor
principale. Scorurile componenteler principale nlocuiesc variantele originale i sunt
corelate cu componentele principale succesive contoriznd descreterea variaiei i
ortogonal, far nicio corelaie ntre scorurile diferitelor axe. Ca o consecin a acestor
proprieti, un numr mic de componente principale pot nlocui variabilele originale
fr o pierdere important de informaii.
Diagramele de mprtiere (scatter plot) ale scorurilor primelor componente
principale utilizate ofer un mijloc excelent de a vizualiza i uneori de a arta
adunarea la un loc a probelor similare, separarea tipurilor diferite de probe sau
prezena seleciei probelor cu valori diferite. Diagramele pot fi utilizate pentru a
explora care dintre compui este mai implicat n separarea probelor n grupuri: cei
mai importani compui tind s corespund celor mai mari valori absolute. De obicei
primele patru componente principale sunt importante. Figura 9.5 prezint o diagram
de mprtiere tipic obinut pentru 92 de spectre ale SAR prin RMN pentru factorul
declanator al Mycoplasma genitalium [23]. Spectrele se mpart n trei clase.
Figura 9.5 Diagrama primului component principal n comparaie cu cel de-al doilea
pentru spectrele 92 HSQC nregistrate pentru factorul declanator al M. genitalium. Cele
patru grupuri nregistrate prin PCA sunt marcate cu verde, albastru, negru i rou.
293
294
Lrgirea este mai pronunat pentru proteine mari sau pentru proteine legate la matrix.
Liganzii legai pot fi identificai prin experimente cu filtru T2. De obicei, trebuie
comparate spectrele cu i fr proteine.
Lrgirea semnalelor liganzilor indus de legarea la o protein a fost utilizat
frecvent n trecut. Sykes i colab. (1994) au studiat interaciunea domeniului
extracelular de 85-kDa al receptorului factorului de cretere epidermal (EGFR-ED)
cu factorul de cretere transformant (TGF-).
Linia protonilor metil a prezentat o dependen regional ce indica regiunea
TGF- implicat n reacie. Acest studiu arat c aceast tehnic ofer informaii
importante pentru o descriere detaliat a interaciunilor protein-ligand.
Potenialul de editare a relaxrii pentru screening a fost demonstrat de Fesik i
colab. (1997) prin utilizarea FKBP i un amestec de nou compui din care a fost
identificat un ligand cu o constant de disociere de 200 M. Aceast metod nu este
practic pentru screening-ul eficient al liganzilor deoarece trebuie utilizate diferenele
ntre spectre cu i fr ligand pentru a obine rezultate relevante. T2 i T1 au fost
utilizate pentru a filtra componentele spectrale ce rezult din durate de relaxare
sczute . Stockmann, Dalvit, (2002) au descris o gam variat de metode de relaxare,
incluznd relaxarea longitudinal, relaxarea transvers n prezena spinilor marcai i
relaxarea cu cuantuum dublu.
9.3.2 Metode de difuzie
Tehnicile de difuzie se bazeaz pe faptul c difuziunea translaional depinde
de mrimea proteinei. Conform ecuaiei Stokes-Einstein D = kT/6r, unde k este
constanta Boltzmann, T este temperatura, este vscozitatea i r este raza moleculei,
coeficientul de difuzie depinde invers proporional de mrimea moleculei. Acest
principiu a fost utilizat pentru a analiza amestecuri de compui n cadrul chimiei
combinatorii. Shapiro i colab. (1996) au combinat tehnicile de editare cu spectrele
TOCSY pentru a obine spectre 2-D cu suprapunere mic a vrfurilor i informaii
valoroase asupra structurii liganzilor (DECODES, spectroscopia de difuziune
codificat).
296
Coeficienii de difuzie sunt msurai prin RMN prin aplicarea pentru timp scurt
a unui gradient de cmp magnetic liniar. Acest gradient aplic cmpuri magnetice
diferite la diferite poziii ale probei i astfel apare defazarea spaial a semnalului care
poate fi inversat prin aplicarea aceluiai gradient codificat spaial dup echo-spin.
Refazarea nu este aplicabil pentru moleculele care s-au micat de la aplicarea
primului gradient. n consecin, moleculele mari cu coeficieni de difuzie mici vor fi
afectate ntr-un grad mai mic de filtrul de difuzie dect moleculele mici. Coeficientul
de difuzie poate fi determinat prin msurarea intensitilor semnalelor n funcie de
timpul de difuzie i tria gradientului.
n cazul schimbrilor rapide, ligandul liber poate exprima proprieti de difuzie
ale complexului. n principiu, au fost utilizate dou tipuri de experimente de difuzie,
PFG-SE (pulsed field gradient spin-echo) i PFG-STE (pulsed field gradient
stimulated-echo). Pierderea magnetizrii datorat relaxrii transverse este redus n
ultimul caz. PFG-SE are dezavantajul c este observat numai o jumtate din semnal.
O secven cu gradiente bipolare i o ntrziere a curentului turbionar sunt frecvent
utilizate pentru a minimaliza artefactele turbionare.
Pentru moleculele mici legate la molecule mai mari, coeficientul de difuzie este
redus n comparaie cu moleculele cu mrimi similare, dar care nu se leag.
Coeficienii de difuzie observai vor fi calculai n funcie de rata de schimb. Shapiro
i colab. (1997) au utilizat expresia afinitate RMN pentru aceast abordare
deoarece amintete de separarea cromatografic pe baza afinitii. Shapiro a utilizat
afinitatea RMN pentru quinin cu un amestec de nou compui din care a putut fi
selectat unul prin analiza spectrelor 1-D i experimente 2-D DECODES.
De asemenea, Shapiro (1998) a aplicat afinitatea RMN pentru a studia legarea
tetrapeptidelor la glicopeptidul vancomicina i pentru a studia legarea moleculelor
mici la ADN. n aceste cazuri raportate ligandul i proteina au fost prezente n
cantiti echimolare la concentraii de 0,5-1 mM. S- a demonstrat c difuzia RMN
poate fi utilizat pentru cartografierea epitopului de legare; aceasta se bazeaz pe
faptul c magnetizarea longitudinal n experimentele STE este supus relaxrii
ncruciate ntre protein i ligand.
297
este
298
299
300
gruparea fenil este fora motric pentru interaciunea cu proteina. Figura 9.8 (C) este
controlul negativ, care nu prezint nicio protein n amestec. Spectrul a fost
nregistrat la aceeai parametrii ca i spectrul STD din figura 9.8 (A).
Dezavantajul STD-RMN este timpul de nregistrare dublat i faptul c liganzii
care se leag strns sunt nregistrai ca nelegai, determinnd rezultate fals negative
ale screening-ului. Necesitatea unui exces de ligand limiteaz STD-RMN la compuii
solubili (peste 10 mM). Pentru a evita eliminarea
artefactelor, spectrometrul i
Fig. 9.7 Reprezentare schematic a secvenei pulsului utilizat pentru STD-RMN. Sunt
evideniate dou spectre, unul cu i cellalat fr saturaia rezonanelor proteice.
Fig. 9.8 (A) Spectrul STD-RMN al unui compus fenolic legat la dehidrogenaza de 72kDa. (B) Spectrul de referin al aceluiai compus. (C) Spectrul STD-RMN de control fr
nicio protein prezent n soluie.
303
L-ascorbic
i glucoza. n spectrul
pomprii NOE au fost observate numai semnalele acidului salicilic [Chen, Shapiro,
1998]. Acest ligand nu a fost detectat ntr-un experiment pur de difuzie fr transferul
NOE.
Spectrul ligandului dintr-un experiment revers-NOE este selectat prin
intermediul filtrului de relaxare transvers care elimin semnalele proteinei i
inverseaz semnalele ligandului. Acest filtru exploateaz timpul de relaxare mult mai
rapid al proteinei - T2, comparativ cu timpul mult mai lent al ligandului. Pe parcursul
timpului de amestec, magnetizarea ligandului este parial transferat la protein via
cross-relaxarea intermolecular. Este retras/sczut un experiment de referin n care
nu se realizeaz niciun transfer al magnetizrii. n spectrul diferenial sunt observate
numai acele semnale ale compuilor care interacioneaz cu proteina. Acest
experiment a fost utilizat pentru albumina seric uman i glucoza i un amestec de
acizi grai neramificai ca presupui liganzi. n spectrul diferenial au fost observai
numai acizii grai. Ratele intensitii ntre diferii liganzi au fost utilizate pentru a
ordona afinitile diferiilor compui [Chen, Shapiro, 2000]. Din cele dou
experimente, revers pomparea NOE este cel mai sensibil.
Pomparea NOE i RNP sunt considerate experimente foarte sensibile pentru
screening-ul RMN primar. Cartografierea epitopilor este limitat de difuzia spin.
304
ePHOGSY
au
potenial
pentru
screening-ul
RMN.
9.4. Concluzii
n ultimii ani, metodele RMN au ptruns n domeniul sistemelor de analiz de
mare capacitate (HTS) al compuilor ca liganzi ai proteinelor. Aceast dezvoltare este
uimitoare, lund n considerare sensibilitatea relativ sczut a experimentelor RMN
de baz, comparativ cu metodele ce prezint o sensibilitate ridicat precum
spectroscopia cu fluorescen. Dezvoltarea recent a hardware-ului a jucat n mod
sigur
dezvoltrii RMN este nc rapid, cu cmpuri magnetice care cresc continuu i noi
tehnologii care mresc sensibilitatea i stabilitatea spectrometrelor RMN curente.
Tehnologia crioprobelor a sporit sensibilitatea i a transformat experimentele RMN n
experimente care utilizeaz concentraii foarte mici ale probelor.
Experimentul SAR prin RMN tipic este acum accesibil pentru concentraii ale
proteinelor de 50 M. Cu toate acestea, experimentele care nregistreaz spectrele
proteinelor sunt limitate n mod curent la proteine relativ mici, cu greuti moleculare
de pn la 40 kDa. Proteinele cu greuti moleculare de 100 kDa vor putea fi
cunoscute prin metode de marcare mai sofisticate. Actual, sunt disponibile
308
309
CAPITOLUL 10
MARCAREA PROTEINELOR CU IZOTOPII C13 I N15
PENTRU ANALIZA STRUCTURII I DINAMICII
MACROMOLECULELOR BIOLOGICE
10.1. Introducere
Spectroscopia de rezonan magnetic nuclear (RMN) a cunoscut o dezvoltare
rapid de-a lungul ultimului deceniu avnd o larg aplicabilitate
un imens
Prin
urmare
studiul
structurii
macroproteinelor
necesit
marcri
310
311
Origine
E.coli.
Reprimare
Lacl
Para
Ptet
1- 10
E.coli
E.coli., Tn10
Bacteriofagi T7 sau
T7 ARN polimeraza
Bacteriofag
AraR
TetR
reprimare/inactivare
PL
Represor cl
Inducere
izopropiltiogalactozid
(IPTG)
L-arabinoza
Tetraciclina
Necesit intervenia T7
ARN polimeraza, IPTG
Indus de cldur,
modificri de
temperatur de 42C
pentru supraproducia de
Purificare
cromatografie cu afinitate
pentru ioni de metal imobili
(IMAC)
cromatografie de afinitate
cromatografie de afinitate
+
+
cromatografia de afinitate
cromatografie de afinitate
frecvent marker peptidic utilizat n scopul unei purificri facile este markerul
poly(His)6 adugat la captul N- sau C-terminal al proteinei. Asemenea micromarkeri
de obicei nu influeneaz structura sau activitatea proteic i ndeprtarea lor postpurificare, poate chiar s nu fie necesar. Proteinele ce conin markerul poly(His)6 pot
fi purificate cu uurin dintr-un extract celular brut, prin formarea unui complex
chelator cu ionii metalici ca Ni2+ sau Cu2+ imobilizai pe o coloan cromatografic.
Prilor imidazolice ale restului adiacent de histidin sunt eseniale pentru formarea
ansamblului chelator iar proteinele de legare pot fi ulterior splate din coloan cu un
gradient competitiv de imidazol. Obinerea de proteine, utiliznd markerul poly(His)6
a devenit o tehnic de rutin pentru evidenierea expresiei genelor heterologe
recombinate, indiferent de gazd.
Doar aproximativ 25% din supraproducia de proteine este iniial pretabil sau
suficient de stabil pentru a fi supus analizei structurale [Christendat i colab., 2000]
i majoritatea experimentelor trebuiesc adaptate i optimizate cu scopul obinerii unor
recolte de proteine corect conformate. Ca parametrii generali ai optimizrii sunt
frecvent utilizate selecia unor gazde i vectori de expresie viabili, variabilitatea
condiiilor de cretere i stabilirea concentraiilor de inducere, construcia de proteine
de fuziune i coexprimarea proteinelor helper. O problem frecvent ntlnit n ceea
ce privete expresia heterolog la E.coli o reprezint formarea de corpi de incluziune
- mari agregate de proteine inactive. Marcarea proteinelor drept corpi insolubili de
incluziune ar putea reprezenta o strategie de mpiedicare a activitii bactericide a
proteinelor supraexprimate [Majerle i colab., 2000]. Au fost descrise mai multe
protocoale de solubilizare a corpilor de incluziune dup purificare i de refacere a
structurii proteinelor denaturate pn la obinerea structurii lor corecte 3-D. Cu toate
acestea, strategia de reconformare trebuie optimizat pentru fiecare protein n parte
i poate reprezenta o procedur laborioas cu reuite i eecuri, dei uneori
rezultatele nu sunt satisfctoare. Prin urmare, intenia este aceea de a maximiza
obinerea de proteine n forme complet solubile.
316
asamblarea
proteinelor
supraexprimate
depinde
de
factori
de
Modificri
expresie a regiunilor trx- i gor-, cu obinerea
unui mediu citoplasmatic cu aciune
oxidant
coexpresia disulfid izomerazelor ca DsbA,
DsbC sau PDI
expresia periplasmatic folosind peptide
semnal
coexpresia factorilor de monitorizare ca
GroELS i/sau DnaKJ/GrpE
coexprimarea tARNs corespunztoare
proteine int necesare analizei RMN. Pe lng acestea, datorit capacitii secretorii
a proteinelor recombinate de P. Pastoris, purificarea se poate realiza rapid ntr-un
singur pas [De Lamotte i colab., 2001]. Multe proteine de origine eucariot trebuie
s treac prin modificri specifice posttranslaionale asemenea glicozilarii sau
lipidrii, formrii de legturi disulfidice sau procesrii posttranslaionale. Aceste
modificri sunt adesea eseniale pentru stabilitatea activitii enzimatice a proteinelor,
sau pentru adoptarea conformaiei lor native. Eecul formrii legturilor disulfidice
corecte poate ntrzia sau chiar bloca procesele de asamblare proteic determinnd
formarea de corpi de incluziune sau chiar degradare proteic. Producerea de proteine
modificate nu poate fi abordat ntr-o manier satisfctoare prin utilizarea unor
gazde procariote ca E.coli. Exprimarea la nivelul celulelor de drojdie poate fi prin
urmare soluia la cutrile noastre a unor gazde cu potenial de cretere rapid i
posibilitatea de producere a proteinelor modificate i glicozilate [Cereghino, Cregg,
2000]. Cu toate acestea, trebuie luat n considerare faptul c modelul de modificare
proteic obinut dup exprimare la nivelul drojdiei de bere poate s fie diferit de cel
prezent la nivelul proteinelor native , spre exemplu, celulele de drojdie sunt capabile
doar de ataarea glicanilor bogai n manoz, care reprezint polizaharida central a
glicoproteinei.
Abordarea tehnicilor de marcare ar trebui s ia n considerare faptul c
producia de proteine heterologe din P. Pastoris este corelat cu o densitate celular
mare. Creteri de aproare 100 straturi de protein n cultur au fost obinute prin
fermentaia celulelor n bioreactoare spre deosebire de aa numitele culturi proteice
agitate sau submerse [Van den Burg i colab., 2001]. Inducerea produciei de proteine
heterologe ar trebui declanat dup atingerea unei densiti celulare mari. Au fost
nregistrate chiar producii de peste 100 mg protein per litru de cultur. n culturile
proteice agitate, produciile raportate de proteine heterologe uniform marcate au
variat de la 2 mg/l n cazul proteinei de control a complementului virusului Vaccinia
pn la cantiti de 27 mg/l pentru proteina anticoagulant a cpuei. Prin urmare,
producia medie de proteine de drojdie obinut prin tehnica culturilor agitate atinge
doar limita inferioar a cantitii de proteine produse prin cultivarea extractelor de
319
iar durata sa total este de aproximativ cinci ori mai mare dect cea a lui E.coli,
datorit timpului de dublare mai lent. Cu toate acestea n condiiile n care pot fi
utilizai precursori de marcare mai ieftini , costurile totale se pot reduce cu
aproximativ 10%. Poducia de proteine heterologe la Anabaena poate constitui o
opiune pentru generarea de proteine cu o rat de producie sczut care necesit
cantiti mai mari de mediu de cultur. Pe lng toate acestea trebuie luat n
considerare c natura deprotonat a rezervelor de carbon final se poate dovedi
avantajoas i economic pentru generarea unor probe de proteine deuterate necesare
analizei structurale a macroproteinelor sau studiilor dinamice (Dingermann i colab.,
2004).
Dei producerea de proteine heterologe reprezint abordarea cea mai comun,
microproduii peptidici au fost de asemenea marcai n mediul lor nativ. O condiie
esenial este aceea ca organismul s se poat adapta la creterea pe medii specifice
mbogite cu precursori corespunztori. Exemple de abordri ncununate de succes
sunt reprezentate de marcarea ciclosporinei A la Tolypocladium inflatum,
alamethicina din Trichoderma viride, belenaminei la Streptomyces nashvillensis i
cianoficinei n sporii Synechocystis.
10.2.5. Strategii de producere a proteinelor marcate selectiv cu izotopi C13
i
N15
Spectrul RMN al proteinelor uniform marcate a devenit din ce n ce mai
respectiv,
coninnd
izotopul
de
marcare
dorit.
Rezonana
de
asamblare.
ntr-un
studiu
anterior,
marcarea
selectiv
cu
324
Dezavantaje
Productivitate sczut adesea
Sisteme complexe comparate cu
sinteza de proteine in vivo
Tehnic costisitoare comparativ cu
modalitatea de exprimare in vivo
Numrul mic de sisteme comerciale i
kituri
Standardizarea
dificil
datorat
multitudinii componentelor de reacie
Costuri ridicate
Sisteme eucariote
Germeni de gru
Reticulocite
de
iepure
Extract
de Reticulocite lizate
germeni de gru de iepure
Utilizat direct
Tratate cu RN-aze
pentru expresia
dependente de
copiilor endogene Ca2+
i exogene
Prepararea extractului
S100
Fraciunea de supernatant centrifugat la
10000g privat de toi
acizii
nucleici,
spre
exemplu prin tratament
DEAE cu celuloz
Conine: ARN poliConine: ribozomi,
meraze, ARS-aze i tARNs, ARS-aze,
factori de translaie
factori de
translaie
Ribozomi, tARNs
20-27C pn la
adugai la 24- 38C
32Ca
a
(optim la 37C)
[Tulin i colab.,
1995]b
Conine: ribozomi,
tARNs, ARS-aze,
factori de
translaie
30- 38Ca
[Craig i colab.,
1992]b
Temperetura de reacie
Referine
Elemente de adugat:
ADN (plasmid cu promotor potrivit pentru SP6, T7 ARN-polimeraza)+ polimeraza
(bacteriofagul SP6 sau T7 ARN polimeraza) sau mARN
Aminoacizi.
Componente energetice: ATP sau GTP.
Sistem NTP de regenerare al energiei: PEP+PK sau CP+CrP sau AcP.
Formil tetrahidrofolat sau omonimele sale metenil tetrahidrofolat sau acid folinic.
Compus-SH: mercaptoetanol sau ditiotreitol (DTT).
Mg2+ i K+ n concentraii optime.
Necesare uneori:
Ca2+ i NH4+ n concentraii optime.
cAMP.
Poliamine, spre exemplu spermidina
b
331
Fig. 10.2 Ilustrarea reactoarelor acelulare pentru sistemele acelulare de flux continuu
(A i B) i schimb continuu (C i D). Ilustrarea schematic a unui reactor CFCF cu flux continuu
unde elementele de substrat sunt pompate iar produii sunt eliminai prin filtrarea forat a soluiei
nutritive printr-o pomp. (B) Reactorul CFCF cu flux Y, care conine dou membrane de
ultrafiltrare cu pori de dimensiuni diferite, care separ produii proteici de reziduurile cu greutate
molecular mic. (C) Reactorul CFCF ilustrat cu explicitarea soluiei nutritive (gri deschis) i
componentele mixturii de reacie (gri nchis). Compartimentele sunt separate printr-o membran de
dializ semipermeabil, care permite schimburile de difuziune ale substratului i ale produilor cu
greutate molecular mic precum i retenia componentelor mixturii de reacie. (D) Reactorul
coloan pentru fluxul de schimb alctuit din mini-vezicule grupate n coloan, coninnd mixtura de
reacie, nconjurate de soluia nutritiv, modificate de fluxul din coloan. Produii cu greutate
molecular mic i substratele sunt modificate de difuziunea prin membrana mini-veziculelor.
Modificat dup Shirokov i colab. [Shirokov i colab., 2002].
336
cuantifiact prin ELISA, a depit cantitativ producia obinut prin reacia analog
discontinu de 10 pn la 12 ori. Apoi s-a reuit sinteza proteinelor CAT i Ras n
cantiti de pn la 6mg/ml pe o perioad de 18 ore folosind varianta lor de sistem
bacterian CECF, iar Madin i colab. ( 2000) au atins producii de 1-4 mg/ml pentru
mai multe proteine active funcional precum DHFR, proteina verde fluorescent
(GFP), luciferaza sau ARN replicaza a virusului mozaicul tutunului (TMV). Figura
10.3 descrie sinteza acelular a GFP printr-o metod CECF care utilizeaz un
MicroDialyzer.
Avantajul sistemului CECF este reprezentat de acumularea produilor
sintetizai n mixtura de reacie. Sinteza de proteine i polipeptide fuzionate cu GFP
ofer o modalitate direct i nalt demonstrativ de a vizualiza acumularea de produs
prin intermediul fluorescenei jumtii GFP a complexului. Sinteza unei proteine
HIV, aa numitul antigen Nef, fuzionat cu GFP [Chekulayeva i colab., 2001] i a
unei polipeptide antibacteriane Cecropina P1 fuzionat cu GFP [Martemyanov i
colab., 2001], au fost raportate ntr-un sistem bacterian de transcripie/translaie
CECF T7.
Fig. 10.3 Sinteza acelular a GFT ntr-un sistem bacterian CECF folosind un
MicroDialyzer de 100 l. Punctele kinetice arat media a trei reacii iar barele de eroare indic
deviaia mediei. Reacia a fost realizat la 30C folosind o mixtur nutritiv de 17 straturi
comparativ cu volumul mixturii de reacie i sub urmtoarele condiii de reacie: 0,05% NaN3, 2%
fosfoenolglicol, 196 M acid folinic, 2mM 1.4-ditiotreitol, 1,2 mM ATP, 0.8 mM din urmtoarele:
CTP, GTP i UTP, 20mM acetil fosfat, 1mM din fiecare aminoacid cu excepia argininei, acidului
aspartic, cisteinei , acidului glutamic, metioninei i triptofanului din care au fost utilizai 2mM,
100mM HEPES-KOH (pH 8.0), 2,8mM EDTA, 1X inhibitor complet de proteaz (Roche), 280mM
K+, 13mM Mg2+, 40l/ml piruvat kinaza, 500g/ml tARN (E.coli), 3U/l T7-ARN polimeraza, 0.3
U/l RNasin, 35% extract S30 (E.coli) i 15g/ml plasmid.
338
Fig. 10.4 Comparaie ntre spectrul 2-D HSQC H1-N15 al generrilor in vitro i in vivo
ale domeniului C-terminal purificat al factorului bacterian reglator transcripional RcsB
(cRcsB) folosind un spectometru Bruker DRX-800 MHz RMN cu o crioprob. (A) Marcarea
acelular cu izotop N15 a cRcsB sintetizat ntr-un sistem CECF optimizat, utiliznd un
DispoDialyzer. Toi aminoacizii cu excepia asparaginei (N) i glutaminei (Q) au fost marcai cu
N15. Cum era de ateptat, resturile de N i Q (cercuri) sunt absente n spectrul 2-D HSQC H1-N15.(B)
cRcsB exprimat in vivo uniform marcat izotopic cu N15. Acest spectru este n bun dependen cu
cRcsB marcat izotopic generat acelular, iar resturile de N i Q pot fi uor identificate. (dup
Dingermann i colab., 2004).
341
343
CAPITOLUL 11
UTILIZAREA FRAGMENTELOR DE ANTICORPI CA
MEDIATORI AI CRISTALIZRII PROTEINELOR
MEMBRANARE N VEDEREA DESCOPERII DE NOI
MEDICAMENTE
11.1. Introducere
O dat cu decodarea genomului uman i dup ce au devenit disponibile din ce
n ce mai multe genomuri ale organismelor patogene, cum ar fi Helicobacter pylori,
Mycobacterium tuberculosis i Plasmodium falciparum, au crescut speranele legate
de
345
Totui, atunci cnd pot fi obinute cristale 3-D de bun calitate, determinarea
rapid a structurii la rezoluie mare prin cristalografie cu raze X este mult mai
eficient. Caracterul amfifil al suprafeei proteinelor membranare permite formarea
cristalelor 3-D n dou moduri (vezi fig. 11.1).
Fig. 11.1. Tipurile elementare de cristale 3-D ale proteinelor membranare. Cristalele tip
I sunt constituite din straturi ordonate de cristale 2-D care sunt prezente n bistrat. Suprafeele
hidrofobe ale proteinelor membranare sunt acoperite de un miceliu n conformaie solubilizat prin
detergent. Aceste complexe detergent-protein membranar formeaz aa-numitele cristale 3-D tip
II. Contactele de legtur stabile din cristale se formeaz ntre suprafeele hidrofile ale proteinei.
ntr-o form modificat a tipului II (tip IIb), fragmente de anticorp legate strns i specific adaug
un domeniu hidrofil complexului. Aceste expansiuni ale suprafeei confer noi situsuri pentru
contacte de legtur i spaiu pentru miceliile detergent.
din miceliul detergent. n acest caz condiiile de cristalizare sunt foarte similare
acelora pentru proteinele solubile. Este posibil i formarea cristalelor mixte tip I i II,
dei cele mai multe cristale ale proteinelor membranare aparin tipului II.
Evident, miceliile de detergent necesit spaiu n matricea cristalelor. Dei
forele de atracie dintre micelii permit stabilizarea structurii cristaline, acestea nu pot
contribui la constituirea contactelor de legtur rigide din cadrul structurii cristaline.
Astfel, sunt dificil de cristalizat n mod special proteine cu domenii hidrofile mici,
cum ar fi multe proteine transportoare sau proteine canal care sunt alctuite n
principal din poriuni transmembranare helicoidale i bucle foarte scurte expuse
mediului solvent. O metod menit s creasc probabilitatea de a obine cristale de tip
II bine ordonate este creterea suprafeei polare a proteinei membranare prin ataarea
de domenii polare cu fragmente de anticorpi cu legare specific. Aceast metod
dezvoltat de Michel i colab.,(2001) a fost pentru prima dat aplicat cu succes
pentru cristalizarea i determinarea structurii Citocrom C oxidazei (COX) din
Paracoccus denitrificans legat cu un Fv (fragment variabil) de anticorp.
Pe lng cerinele specifice pe care trebuie s le ndeplineasc un detergent
pentru cristalizarea 3D a proteinelor membranare, a doua problem n cadrul analizei
structurale este procurarea unor cantiti suficiente de proteine. Cristalizare 3D
presupune consumul a cel puin 10 mg de protein pur per etap de examinare.
Aproape toate structurile proteinelor de membran care au fost determinate aparin
proteinelor ce se gsesc n cantiti mari n mediul lor natural, cum ar fi proteinele
lanului respirator sau de membrane fotosintetice. Totui, majoritatea proteinelor
membranare cum ar fi receptorii i proteinele transportoare sunt prezente intracelular
n concentraii mici. Prin folosirea sistemelor de producie bazate pe recombinare,
inseria proteinei ntr-o membran limiteaz eficiena produciei, cu excepia
cazurilor n care decidem producerea prin intermediul formrii corpului de incluzie i
repliere. Ultima metod a fost aplicat cu mult succes pentru proteine membranare
barrel foarte stabile, din membranele bacteriene externe. S-au realizat progrese
nsemnate n aplicarea sistemelor de supraexpresie pentru proteine membranare cu
origine bacterian, ca de exemplu pentru determinarea structurii canalului ionic
347
o rezoluie de 2,8, compus din toate cele patru subuniti ale COX i cele dou
polipeptide ale fragmentului Fv. Fragmentele Fv sunt implicate n toate contactele de
legtur din cristal. Totui, lipsa interaciunilor directe protein protein pe axa-c
determin anizotropie n difracie i dificulti de reproducere a cristalelor. S-au
obinut cristale mai bine ordonate printr-o sintez a COX ce conine numai cele dou
subuniti catalitice eseniale I i II. Cristalele produc difracia razelor X la o rezoluie
mai mic de 2,5. Noul mod de asamblare al cristalului implic interaciunea direct
dintre suprafeele citoplasmatic i periplasmatic cu moleculele COX adiacente.
Toate celelalte contacte sunt mediate exclusiv prin intermediul fragmentului Fv. n
toate aceste structuri, complexul COX-Fragment Fv a fost purificat prin
cromatografie indirect de imunoafinitate (a se vedea mai jos). Complexul este
format prin combinarea membranelor solubilizate cu periplasm ce conine fragment
Fv i apoi este purificat ntr-o singur etap prin cromatografie de afinitate cu
streptavidin, folosindu-se secvena terminal strep (strep-tag) fuzionat la fragmentul
Fv.
A doua protein membranar cristalizat prin aceast tehnic este complexul
citocrom bc1 (QCR) din drojdie, o component fundamental a lanului respirator
mitocondrial. Ca i n cazul COX bacteriene, complexul a fost cristalizat cu un
fragment Fv recombinat. Acesta din urm se leag la domeniul extrinsec al
subunitii catalitice Rip1p, aa numita protein Rieske.
Anticorpul monoclonal parental 18E11 a fost obinut prin tehnici standard de
hibridom prin imunizarea oarecelui cu QCR din drojdie solubilizat cu detergent i
purificat . Anticorpul nu recunoate proteina n Western Immunoblot dup separarea
complexului prin electroforez n gel poliacril amid-duodecil sulfat sodic (SDSPAGE), dar se leag de un epitop discontinuu nativ. Dei acest complex format din
mai multe subuniti (230kDa per monomer) are un domeniu hidrofil mare ce
ptrunde n spaiul matriceal (aproximativ 86kDa) i o poriune hidrofil destul de
mare prezent n spaiul intermembranar (aproximativ 46kDa), cristale de QCR din
drojdie adecvate pentru analiza n raze-X au fost obinute doar n complex cu
fragment Fv. Structura complexului a fost determinat la rezoluie de 2,3.
349
Fig. 11.2 Fragmentele de anticorp sunt eseniale pentru cristalizarea citocromului bc1
din drojdie, contactele de legtur ale cristalului (sgeile albe) din co-complexul Fv18E11
complex citocrom bc1 din drojdie fiind mediate de fragmentul Fv (ncercuit). Fragmentul se leag
de domeniul extrinsec al subunitii Rip1p i ofer spaii ample pentru miceliile detergent n care
este mpachetat poriunea transmembranar a complexului (linii punctate), prezentat schematic n
detaliu.
350
buclele expuse. Totui, deseori aceste peptide sunt flexibile, iar legarea unei molecule
de anticorp va introduce foarte probabil un domeniu mobil ce va fi nefavorabil
cristalizrii. Specificitatea pentru un epitop discontinuu poate fi uor verificat prin
Western imunoblot dup separarea proteinei denaturate prin SDS-PAGE, n care
anticorpul nu ar trebui s se lege de polipeptidul linear.
11.2.2.1. Imunizarea
Una din primele etape importante pentru obinerea cu succes a unor anumite
clone de hibridom este imunizarea animalelor cu antigen i obinerea unui titru
suficient de anticorp. Proteinele membranare solubilizate prin detergent i purificate
au fost utilizate cu succes ca i antigene pentru obinerea liganzilor de nalt afinitate
pentru membranare native, ca de exemplu pentru obinerea anticorpului monoclonal
18E11 specific QCR din drojdie sau diveri anticorpi monoclonali specifici pentru
proteina schimbtoare de ioni Na+/H+ (sistem antiport) NhaA.
n general, protocoalele de imunizare pe termen lung sunt folositoare pentru
obinerea multor liganzi de nalt afinitate. ntr-un protocol standard aplicat pentru
obinerea anticorpilor ndreptai mpotriva QCR din drojdie i NhaA, oareci BALB/c
femele n vrst de 10 sptmni au fost imunizai prin injecii intraperitoneale cu
protein nalt purificat, solubilizat n detergent [100g protein n 50% (v/v)
adjuvant (ABM2; Pan Biotech, Aidenbach, Germany) ntr-un volum total de 250l].
Imunizarea iniial a fost urmat de 4 injecii cu suspensie proteic la interval de 4
sptmni[50g protein n 50% (v/v) adjuvant (ABM1; Pan Biotech) ntr-un volum
total de 250l]. Pentru administrarea final, ultima injecie a fost repetat trei zile
consecutiv iar n ziua urmtoare oareci au fost sacrificai pentru recoltarea splinei. Sa recoltat plasm sanguin de la oareci naintea imunizrii i la 10 zile dup fiecare
injecie. Dup a treia imunizare, s-au obinut semnale clar pozitive pn la o diluie a
serului de 105 ntr-un test standard ELISA, folosind NhaA purificat drept antigen.
Evident, un asemenea regim de imunizare la mamifere mici pentru proteine
membranare nalt omologe (derivate umane, de murine, de obolan, de maimue) este
mai puin probabil s aib ca rezultat producerea anticorpilor datorit mecanismelor
352
detergentului
duodecil--D-maltopiranozid,
proteina
este
pliat
i primer. Pentru a amplifica genele VH i VL, sunt folosii primeri degenerai care se
potrivesc captului terminal 5' al cadrului 1 i captului 3' al cadrului 4,
corespunztor capetelor N-terminale ale lanului greu i uor ale moleculei de
anticorp, respectiv capetelor C-terminale ale domeniilor variabile. Secvena
regiunilor cadru este foarte bine conservat, fiind elaborat un set de perechi de
primeri pentru amplificarea specific a genelor ce codific lanul V, subclasele 1, 2,
3 i 5 ale lanului Vk, subclasele 4 i 6 ale lanului Vk, i VH. Aceti primeri conin
situsuri de restricie unice, care permit inseria produsului PCR n plasmida pASK68
care este utilizat pentru producerea fragmentului Fv n periplasma E. coli (a se vedea
mai jos).
358
362
363
364
ancoreaz
subunitatea
Rip1p
de
la
periferia
poriunii
11.3. Concluzii
n ultimii ani, cercetarea n domeniul structurii proteinelor membranare a
evoluat rapid, deschiznd calea descoperirilor raionale a medicamentelor. Totui,
numrul structurilor proteice membranare la rezoluie aproape atomic este nc mic
n comparaie cu cel al proteinelor solubile. Fragmentele de anticorpi sunt utilizate
pentru creterea suprafeelor hidrofile a proteinelor membranare mbuntind astfel
ansele cristalizrii 3-D. Prin aceast metod s-au obinut deja structuri de nalt
rezoluie pentru 3 proteine membranare diferite. Toate fragmentele de anticorp
utilizate pentru co-cristalizarea cu succes a proteinelor membranare pn n
momentul de fa au fost derivate din anticorpi monoclonali obinui prin tehnologia
clasic a hibridomului. Acetia recunosc epitopii nativi, non-lineari a antigenelor
respective i se leag cu nalt afinitate. Pentru a conferi acestei strategii statutul de
metod cu caracter general n domeniul cristalizrii proteinelor membranare, tehnicile
de recombinare a anticorpilor trebuie optimizate pentru a permite accesul rapid la
liganzii de nalt afinitate. Cristalizarea mediat prin fragmente de anticorpi poate fi
folositoare n mod deosebit pentru proteine membranare constituite n principal din
helixuri transmembranare cu bucle expuse la solvent foarte scurte, precum i pentru
consolidarea proteinelor flexibile ntr-o conformaie fix.
367
CAPITOLUL 12
FARMACOGENETICA: EFECTUL VARIANTELOR
GENETICE N DISPONIBILITATEA I RSPUNSUL
MEDICAMENTELOR
12.1. Consideraii generale
Este bine cunoscut faptul c n practica clinic exist o variaie interindividual
remarcabil n ceea ce privete rspunsul biologic al pacienilor la administrarea unui
medicament. Aceast variabilitate poate fi rezultatul a numeroi factori, cum ar fi
patogeneza i severitatea bolii tratate, bolile asociate, vrsta pacientului, funcionarea
rinichilor i a ficatului, starea de nutriie i interaciunile dintre medicamente. n
ciuda relevanei acestor factori, variaiile comune ale genelor ce codific enzime de
metabolizare a medicamentelor (DMEs), transportatorii de medicamente i receptorii
medicamentelor int - aa-numitele polimorfisme - contribuie n mod semnificativ la
heterogenitatea rspunsului la medicamente observat n cadrul populaiei [Renegar ,
2001].
Investigarea sistematic a influenei polimorfismului genetic n variabilitatea
interindividual
rspunsului
biologic
la
medicamente
este
denumit
evaluarea mecanismelor
sczut
datorit
predispoziiei
lor
genetice,
nainte
de
nceperea
terapiei
medicamentoase.
Prima observaie n ceea ce privete diferenele motenite n rspunsul la un
produs chimic, a constituit-o incapacitatea de a simi gustul feniltioureei evideniat
nc din 1932 [Snyder, 1932]. Farmacogenetica i are nceputurile n anii 1950,
atunci cnd variaiile determinate genetic au fost considerate a fi cauza efectelor
adverse ale medicamentelor. De exemplu, hemoliza dup tratamentul antimalaric a
fost corelat cu lipsa activitii glucozo-6-fosfat dehidrogenazei eritrocitare. n mod
similar, o deficien n activitatea enzimei de acetilare N-acetiltransferaza 2 (NAT2) a
fost considerat cauza neuropatiei periferice dup izoniazid.
Elucidarea bazelor geneticii moleculare a diferenelor motenite n rspunsul la
medicamente a nceput la nceputul anilor 1980, cu clonarea i caracterizarea unei
gene umane polimorfice ce codific CYP2D6 (debrisoquin hidroxilaza DME
citocrom P450 monooxigenaza II D6) [Gonzalez i colab., 1988]).
De atunci, au fost stabilite pentru un numr tot mai mare de gene umane relaii
ntre variantele alelice, modificrile funcionale la nivel de protein i rezultatul clinic
(rspunsul la medicamente) .
a structurii/activitii
(genotipul)
schimbrile
interindividuale
msurabile/observabile
de
obicei,
cohortele
celor
dou
fenotipuri
sunt
mprite
frecven de distribuie mai mult sau mai puin unimodal, n care diferitele fenotipuri
nu mai sunt clar separate unele fa de altele. n general rspunsul la medicamente
este poligenic, din cauza complexitii cascadelor fiziologice implicate, care, eventual,
sunt controlate de jocul combinat al unei varieti de gene codificatoare de enzime.
371
este acela de a crea hri de biomarkeri la nivel genomic, care ar putea fi corelate cu
anumite fenotipuri pe baza studiilor de asociere nonfamiliale.
n scopul realizrii de cartografieri ale polimorfismelor cu densitate nalt,
SNPs par a fi polimorfismele de alegere. n comparaie cu alte tipuri de variante
genetice, cum ar fi variaii ale numrului de repetiii n tandem (VNTRs), SNPs ofer
o serie de avantaje. SNPs sunt cele mai frecvente forme de polimorfism ale
genomului uman, care se produc, n medie, la fiecare 1000-2000 de perechi de baze,
ce prezint prin urmare o densitate de polimorfisme maxim. Ele sunt binare, ceea ce
le face, bine adaptate pentru a fi automatizate i pentru analize de mare capacitate. n
cele din urm, SNPs par s aib rate de mutaii reduse, i, astfel, sunt relativ stabile n
timp.
O varietate de tehnologii pot fi utilizate pentru identificarea i caracterizarea
polimorfismelor [Shi, 2001]. Acestea includ:
polimorfismul conformaional monocatenar (SSCP);
electroforeze n gel sensibile conformaional;
detecia clivrii nepotrivirii/ mperecherii greite enzimatice sau chimice;
electroforeza n gradient de gel denaturant ;
analiza heteroduplexurilor prin denaturarea cromatografic n faz
lichid de nalt performan (HPLC) ;
secvenierea ADN de mare capacitate;
spectrometrie de mas (MS);
scanarea i resecvenierea pe membrane de nucleotide (scaning array).
Crearea hrilor SNP ale ntregului genom a devenit acum fezabil odat cu
progresele uriae fcute n analiza de mare capacitate a genelor.
n 2001, Grupul de Realizare a Hrilor SNP a publicat o hart de variaie a
secvenelor genomului uman coninnd 1,42 milioane SNPs [International SNP Map
Working Group., 2001]. Depozitul de date SNP ale consoriului conine n prezent
aproape 1,8 milioane SNPs (disponibil prin intermediul websitul-ui TSC Centrul
Coordonator de Date la http://snp.cshl.org [Thorisson GA, 2003]).
372
373
nemodificat
versus
metaboliii
374
lui
plasm sau
urin.
376
CYP2D6
379
Amiodarona
Indoramina
Perfenazina (PM: eliminare sczut - acumularea de
compui iniiali, de origine ce au ca rezultat toxicitate)
Zuclopentixol (PM: eliminare sczut - acumularea de compui iniiali
ce au ca rezultat toxicitate)
Itioridazina
Carvedilol (variaii n blocada 1/2)
Antiaritmice (proaritmic i alte efecte toxice)
CYP2E1
N-nitrozodimetilamina
Acetaminofen
Etanol (posibil efect asupra consumului de alcool)
CYP3A4/A5/A7
Macrolide
Ciclosporina
Tacrolimus
Blocante ale canalelor de calciu
Midazolam
Terfenadina
Lidocaina
Dapsona
Quinidina
Triazolam
Etoposid
Teniposid
Lovastatin
Alfentanil
Tamoxifen
Steroizi
ALDH2
Ciclofosfamida
Etanol (metabolizatori leni: nroirea feei, metabolizatori rapizi:
protecie fa de ciroz hepatic)
ALDH3
Etanol (creterea consumul de alcool i dependen)
DPD
Fluorouracil (posibil toxicitate sporit, 5-fluorouracil neurotoxicitate,
mielotoxicitate)
NQO1
Ubiquinona
Menadiona (urolitiaz asociat menadionei)
Mitomicina c
Pseudocolinesteraza Succinilcolina (hidroliz lent a esterilor: apnee prelungit)
plasmatic
COMT
Levodopa (metilatori sraci: rspuns crescut)
Metildopa(metilatori sraci: rspuns crescut)
Estrogeni (abuz de substane)
Acid ascorbic
GSTM1
Aminocrom
Dopacrom
Adenocrom
Noradrenocrom
GSTP1
Acid 13-cis-retinoic
Acid etacrinic
Acroleina
Epirubicina
HMT
Histamina
380
NAT1
NAT2
STs
TPMT
UGT1A1
UGT2Bs
Acid p-aminosalicilic
Acid p-aminobenzoic
Sulfametoxazol
Izoniazida [EM (autozomal dominant): hepatit, PM: (autozomal
recesiv): neurotoxicitate isoniazidic, lupus eritematos, neuropatie
periferic, inhibarea oxidazei hepatice, creterea toxicitii fenitoinei
atunci cnd este coadministrat]
Hidralazina (PM: lupus eritematos indus de hidralazin)
Procainamida (PM: dezvoltarea lupusului eritematos mai devreme i mai
frecvent)
Fenelzina (PM: grea, somnolen)
Sulfasalazina (PM: reacii severe, mai probabil, atunci cnd sunt folosite
doze mari)
Dapsona (PM: efecte hematologice)
Sulfonamide (hipersensibilitate la sulfonamide)
Cafeina
Amonafida (acetilatori rapizi: eficacitate sczut, toxicitate crescut,
mielotoxicitate, cancer colorectal)
Steroizi
Acetaminofen
Estrogeni
Dopamina
Epinefrina
Naringenina
6-mercaptopurinA (PM: toxicitate tiopurinic i eficacitate, risc de
cancere secundare, mielotoxicitate, toxicitate hematopoietic, reducere a
mduvei osoase)
6-tioguanina (PM: toxicitate tiopurinic i eficacitate, risc de cancere
secundare, mielotoxicitate, toxicitate hematopoietic)
Azatioprina (PM: toxicitate tiopurinic i eficacitate, risc de cancere
secundare, mielotoxicitate, toxicitate hematopoietic)
Irinotecan (diaree, mielosupresie)
Bilirubina
Flavopiridol
Opioizi
Androgeni
Morfin
Naproxen
Ibuprofen
383
catalizeaz
hidroxilarea
propafenonei.
Produsul,
5-
conjugai
Glutation
Conjugai glucuronid
Conjugai sulfat
Antivirale nucleozide
386
intei
unui
medicament
influeneaz
direct
efectele
387
Creterea FEV1 a fost de 6,5 ori mai mare la pacienii care au fost homozigoi pentru
16Arg/16Arg comparativ cu pacienii cu genotip Gly/Gly. Totui aceast relaie nu a
putut fi confirmat constant de ctre alte studii [Tan i colab., 1997].
Aplicnd abordri de gene candidate, un alt grup de cercettori a determinat
rspunsul la tratamentul bronhodilator cu albuterol la indivizii cu cele mai frecvente 5
haplotipuri de receptori 2-adrenergici. Ei au artat c rspunsurile variaz de mai
mult de 2 ori i sunt asociate n mod semnificativ cu perechile de haplotipuri, dar nu
sunt legate de SNPs individuale.
12.9.3. Polimorfismul intei unui medicament poligenic: rspunsul la
tratamentul cu Clozapin
Clozapina, un antipsihotic atipic, interacioneaz cu o varietate de receptori
pentru medicamente, de exemplu, receptorii adrenergici, receptorul dopaminergic D3
i receptorul pentru neurotransmitorul serotonin.
Dei, se consider c variaia alelic a receptorului pentru neurotransmitorul
serotonin 2A (5-HT2A) este un factor n determinarea rspunsului la clozapin,
aceasta nu poate explica dect parial variaiile interindividuale [Arranz i colab.,
1998].
Un studiu implicnd multiple gene candidat a fost realizat n scopul de a gsi
asocieri, cu valori de predicie mbuntite. Au fost studiai nousprezece
polimorfisme dintr-un set de nou subtipuri de receptori int pentru clozapin plus
un transportor de neurotransmitor .
Cea mai puternic asociaie a fost gsit pentru o combinaie de patru
polimorfisme ale 5-HT2A, un polimorfism 5-HT2C, un polimorfism al promotorului
transportorului de serotonin (5-HTTLPR) i receptorului pentru histamin,
conducnd la 76% predictibilitate pentru rspunsul la clozapin i o sensibilitate de
95% pentru un rspuns satisfctor [Arranz i colab., 2000].
Alte exemple de polimorfism ale receptorilor pentru medicamente sunt redate
n tabelul 12.3.
389
Inozitol-p1p
Apolipoproteina E4
Receptorul ryanodinic
Receptorul FC trombocitar
(FCR II)
Proteina Gs
Glicoproteina IIIa
subunitate a receptorului
glicoproteinei IIb/IIIa
Receptorul de estrogen
Proteina G 3
-Adducina
Angiotensinogen
Gena protrombinei
Factorul V
Metilguanin metiltransferaza
12.10. Concluzii
Cercetrile farmacogenetice au demonstrat c polimorfismul genetic este un
factor important n disponibilitatea i rspunsul medicamentelor la om. n special n
domeniul metabolismului medicamentelor, cunotinele actuale ne permit s explicm
diferenele farmacokinetice interindividuale prin polimorfismul genetic. Cu toate
acestea, elucidarea relaiei dintre rspunsul individual la medicamente i genotip este
mult mai dificil din cauza naturii sale poligenice i, prin urmare, aceasta nu poate fi
realizat prin abordri de mecanisme farmacogenetice.
Strategiile care sunt capabile s abordeze polimorfismul poligenic sunt la nivel
de cutri genomice pentru polimorfismele asociate cu efectele medicamentelor,
utiliznd hri SNP anonime de nalt densitate i strategii de gene candidate, care
preiau avantajul cunotinelor existente despre farmacodinamica i disponibilitatea
medicamentelor.
n prezent, abordrile candidate par a fi mai promitoare, pentru c se
concentreaz pe un numr uor de manageriat de gene i polimorfisme care par a fi
391
392
CAPITOLUL 13
FARMACOGENOMICA BIODISPONIBILITII I
ELIMINRII MEDICAMENTELOR
13.1. Introducere
Efectele interindividuale ale medicamentelor fac obiectul unei substaniale
variabiliti. La baza acestei afirmaii stau numeroase motive de ordin fiziopatologic,
datorate interaciunilor din mediu intern dar i raiuni de ordin genetic. nc din 1953
s-a observat la pacienii care primeau un medicament tuberculostatic, i anume
izoniazida, c dozarea n urin a produsului acesteia acetilat era diferit de la un
pacient la altul. Conceptul de farmacogenetic a fost elaborat prima oar n 1958 de
ctre geneticianul german Vogel, care a observat c variabilitatea individual a
farmacocineticii se supune ntr-o oarecare msur ereditii familiare. De atunci, s-au
obinut succese remarcabile n domeniul farmacogenomicii. n special identificarea
polimorfismului genelor sistemului citocromului P450 (CYP) a contribuit
considerabil la explicarea variabilitii individuale a farmacocineticii pentru anumite
medicamente. Mai mult, de curnd au fost elucidate variaiile ereditare ale genelor
transportorilor membranari ai medicamentelor. Alturi de aceti factori care pot
influena
farmacocinetica
s-au
fcut
eforturi
pentru
clarificarea
rolului
P450, alelele
Frecvena
alelelor
(%)
1-3
1
5
14
1
0
13
8-13
7-9
13
0
CYP2D6 --blocante:
alprenolol, carvedilol,
metoprolol, propanolol
antiaritmice:propafenona,
encainida, flecainida,
mexiletin, sparteina
-neuroleptice:
haloperidol, perhexilina,
perfenazina, risperidon,
tioridazina
-antidepresive:
amitriptilina,
clomipramina,
desipramina, fluoxetina,
fluvoxamina, imipramina,
maprotilina, nortriptilina,
paroxetina,codeina,
dextrometorfan, tramadol,
amfetamina, fenacetina
metoxiamfetamina,
Debrisoquine, ondasetron,
2XN(duplicaie
genic)
*
2(R296C;S486T)
12-21
enzim inactiv
4-6
fr enzim
fr enzim
1
1-2
activitate sczut
activitate sczut
expresie sczut
<1
activitate sczut
enzim inactiv
enzim inactiv
<1
<1
fr enzim
94
4(G1846A mutaie
a situsului de clivare)
*
5(deleie genic)
*
6[T1707cu
decalarea cadrului
de citire
(frameshift)]
*
10(P34S)
*
17(T107I;R296C)
*
41(G-1584C)
*
-anestezice:
2(R76H)
enfluran, halotan,
izofluran,
metoxifluran, *3(V381I)
*
sevofluran,
4(V179I)
-variate:
paracetamol,
clorzoxazona, etanol
CYP3A5 se suprapun larg cu *3 (mutaia
substratele CYP3A4
intronului 3
A6986G la nivelul
situsului de
clivare)
CYP2E1
10-20
Enzimele CYPs sunt cele mai importante iar familia CYP3A contribuie la
aproximativ 50% din totalul activitii CYP la nivelul ficatului adult uman i
metabolizeaz aproximativ 60% din toate medicamentele uzuale. Principalul subiect
al polimorfismului ereditar l constituie genele CYP2C9, 2C19 i 2D6 care contribuie
la metabolizarea a circa 30% din medicamente (tabelul 13.1).
Mai mult, exist polimorfisme cunoscute la nivelul genelor CYP1A1, 1A2,
1B1, 1A6, 2B6, 2C8, 2E1, 3A4, 3A5, 3A7, 5A1 i 8A1 ns importana lor
funcional rmne controversat.
395
13.2.1.1. CYP2C9
La nceputul anului 1999 a fost publicat un studiu n care se arta c pacienii
care au primit doze sczute de derivat cumarinic-varfarina pentru profilaxia
accidentelor trombotice au prezentat episoade semnificativ mai crescute de
hemoragie dect un grup de control care a primit nite doze superioare. Aceast
descoperire aparent paradoxal a fost determinat de faptul c, un numr mare de
metabolizatori leni (PMs) ai CYP2C9 au fost decelai la grupul care a primit un
regim cu dozaj sczut. Clerance-ul S-enantiomerului efector al varfarinei a fost
decelat ca semnificativ sczut la aceti pacieni determinnd concentraii plasmatice
intermediar crescute i nu concentraii sczute aa cum era de ateptat la pacienii
care au primit doze reduse. Consecutiv, sinteza de factori de coagulare dependeni de
vitamina K a fost puternic inhibat n raport cu valorile Ratei Normalizate
Internaionale (INR) prezentnd i o crescut tendin la episoade hemoragice.
CYP2C9 aparine grupului de gene de pe cromozomul 10, care cuprinde
CYP2C8, 2C9, 2C18 i 2C19. Deficiena de CYP2C9 este determinat ntr-o mare
proporie, de dou mutaii punctiforme care conduc la schimbul de aminoacizi:
Arg144Cys (CYP2C9*2) i Ile359Leu (CYP2C9*3). Frecvena alelelor la
populaia germanic este cuprins ntre 11 i 7%. Homozigoi reprezentativi pentru
fenotipul PMs au o prevalen de 3,2%. n mod interesant, la asiatici o schimbare
alternativ de aminoacizi: Ile359Thr a fost decelat, i denumit CYP2C9*4. Mai
mult, un polimorfism al exonului 7 (2C9*5; Asp360Glu) [Dickmann i colab.,
2001] i un codon stop prematur, datorat unui polimorfism de deleie 818delA care
nu a demonstrat activitate (2C9*6), au fost evideniate la populaia afro-american.
Pn azi, 12 alele diferite au fost recunoscute de Comitetul de Nomenclatur al
Alelelor Citocromului Uman P450 (CYP). Pe lng varfarin (prezentat ns ntr-o
concentraie mult mai redus- fenprocumonul) multe antiflogistice nestreroidiene
cum sunt diclofenacul, ibuprofenul i meloxicamul, antidiabetice orale ca tolbutamida
glimenclamida, antagoniti ai receptorilor angiotensinei ca irbesartan i losartan ca
i alte medicamente dintre care amintim fenitoina sunt metabolizate de CYP2C9
[Kirchheiner i colab., 2003]. Exist probe din ce n ce mai certe despre clerance-ul
396
individ la individ (pentru detalii vezi Bertilsson i colab., 2002). Ulterior s-a
demonstrat c metabolismul debrisochinei, medicament antihipertensiv, i al
sparteinei, un antiaritmic, este polimorfic iar metabolizarea este realizat de ctre
aceeai enzim CYP2D6. n special antidepresivele i neurolepticele, care prezint un
numr considerabil de efecte adverse, sunt de asemenea metabolizate de ctre
hidroxilaza sparteinei/debrisochinei. Prin urmare, a devenit clar ntr-un timp scurt c
aceast trstur genetic poate avea consecine clinice severe. CYP2D6 este azi
cunoscut a fi una dintre cele mai importante gene polimorfice implicate n
metabolismul medicamentelor. Aproximativ 7-10% din populaia european a PMs
prezint CYP2D6 i un metabolism redus pentru numeroase medicamente asemenea
antiaritmicelor, antidepresivelor, neurolepticelor i de asemenea pentru unele
blocante i opiacee. n cadrul acestui subgrup, apariia efectelor secundare clinic
relevante ale medicamentelor sunt mai probabile comparativ cu persoanele care
prezint metabolizatorii buni/inteni (EMs). Lipsa ocazional a unor efecte secundare
este explicat n unele cazuri pe seama fenomenului de duplicaie genic i apare la
circa 1-3% din persoanele din Europa Central.
CYP2D6 aparine unei agregri genice a pseudogenei, puternic omolog
inactiv, CYP2D7, care conine un singur cadru de citire ce perturb inseria la
nivelul primului su exon i pseudogena real CYP2D8. Gena CYP2D6 este legat de
cromozomul 22q13.1 i conine 9 exoni cu un cadru de citire deschis, de 1383 bp,
care codific 461 de aminoacizi. Polimorfismele sunt bine i extensiv caracterizate de
ctre Sachse i colab.,(1997). Astzi, peste 73 de haplotipuri diferite de CYP2D6 sunt
nregistrate de ctre Comitetul de Nomenclatur al Alelelor Citocromul Uman P450
(CYP) (http://www.iim.ki.se/cypalleles). Alelele pot fi clasificate pe baza nivelului de
activitate la care codific enzimele CYP2D6 n grupuri funcionale, nonfuncionale i
cu funcionalitate redus. Unul dintre defectele genetice primare de la nivelul
locusului CYP2D este CYP2D6*4, care apare cu o frecven de 20,7% la caucazieni.
O translocaie a G1846A genereaz o modificare a situsului de clivare la limita dintre
intronul 3 i exonul 4, determinnd n continuare apariia unor noi proteine
nefuncionale. ntreaga regiune de codificare sufer o deleie la 4-6% dintre
398
caucazieni i alte grupuri etnice. Prin urmare, alela *5 este considerat a avea o
origine strveche. Alte variante relevante sunt reprezentate de deleii ale 2549A la
nivelul alelei *3 (2,0%) i ale 1707T la nivelul alelei *6 (0,9%), genernd modificri
de cadru de citire. Contrastnd cu aceste polimorfisme fatale, o deleie tripl a
perechii de baz la nivelul alelei *9 (1,8%) nu altereaz neaprat activitatea enzimei,
iar un schimb al prolinei cu serina la nivelul codonului 34 este asociat cu o activitate
enzimatic mai sczut i n mod particular cu o scdere a stabilitii CYP2D6.10
[Nakamura i colab., 2002]. Aceast variant apare la 1-2% dintre caucazieni, ns
reprezint cauza major a activitii sczute a CYP2D6 la orientali. La rasa neagrafrican, alela *17 reprezint una dintre motivele majore ale activitii sczute a
CYP2D6.
Activitate extrem de crescut a CYP2D6 a fost identificat la circa 1-2% dintre
caucazieni ca urmare a duplicaiei genice a alelelor *1 (*1X2) i *2 (*2X2). n
Europa de Nord prevalena scade sub 2%, ns n anumite regiuni din Spania au fost
nregistrate i frecvene de peste 7%. n rile Arabe, precum i n nord-estul Etiopiei,
au fost raportate prevalene ale metabolizatorilor ultrarapizi (UMs) de pn la 29%.
n cteva cazuri au existat familii cu peste 13 copii genice identificate. n contrast, n
China, duplicaiile genei CYP2D6 sunt extrem de rare, dar media ratei de
metabolizare a debrisochinei/4-hidroxidebrisochina este mai crescut dect la
caucazieni. Acest fapt se datoreaz prevalenei crescute a variantelor alelice CYP2D6
*10 puin
heterogenitate extins.
Fenotipul metabolizatorilor intermediari (IMs) poate fi i rezultatul ratelor de
expresie sczute ale CYP2D6, spre exemplu exist dovezi considerabile c
homozigoii cu polimorfism C/G 1584, prin contrapoziionarea codonului strat,
prezint o expresie proteic de doar 50%, comparativ cu purttorii variantei 1584G
[Zanger i colab., 2001]. Aceast variant CYP2D6*2 linkat, denumit CYP2D6*41
poate mbunti activitatea aa numiilor IMs.
Pn acum au fost raportate multe alele, ns unele extrem de rare au fost
evideniate doar la populaii specifice [Ingelman-Sundberg i colab., 2001]. Dei rata
399
asemenea
simpomelor
extrapiramidale
[Scordo
colab.,2002;
enzimelor
cu
polimorfism
ridicat
asupra
terapiei
bolilor
cardiovasculare este controversat i pentru certificare sunt necesare mai multe date,
spre exemplu propafenona prezint o inhibiie ridicat a receptorilor , la purttorii
PMs, i s-a sugerat c determin efecte adverse puternice la un pacient PM pentru
CYP2D6. ns, flecainida este parial metabolizat de CYP2D6, dar aparent
comportarea electrofiziologic a inimii nu a fost influenat determinant de ctre
genotip. blocantele, asemenea metoprololului, i ntr-o anumit msur carvedilolul,
400
vinca i etoposidul. Gena care codific P-gp a fost definit prin urmare gena
rezistenei medicamentoase multiple (MDR1) (ABCB1).
Cu toate acestea, este bine stabilit c P-gp este responsabil de transportul
apical al altor medicamente lipofilice variate cum sunt digoxina i blocantul
celiprolol, i talinolol, inhibitoare ale sintezei colesterolului ca lovastatina,
atorvastatina i simvastatina, inhitoarele proteazei HIV, indinavir i saquinavir,
opioide i de asemenea ciclosporina A cu efect imunosupresor. Din moment ce P-gp
mediaz transportul acestor compui importani prin membranele intestinale sau ale
celulelor endoteliale de la nivelul capilarelor cerebrale, proteina poate de asemenea
servi drept barier funcional mpotriva ptrunderii medicamentelor sau poate
contribui la excreie (fiind exprimat la nivelul canaliculelor hepatocitelor sau la
nivelul celulelor tubulare din rinichi). Mai mult, exprimarea la nivelul celulelor
endoteliale ale barierei sanguine cerebrale protejeaz mpotriva penetrrii
medicamentoase la nivelul sistemului nervos central. Prin urmare oarecii knockout
P-gp prezint dispoziii semnificativ nalte ale substraturilor P-gp.
La oameni, expresia P-gp prezint o mare variabilitate interindividual i face
subiectul unor
interaciuni
medicament-medicament,
spre
exemplu
agentul
407
13.4. Concluzii
Adaptarea timpurie a schemelor terapeutice la trsturile genetice ar putea avea
drept rezultat evitarea efectelor secundare i mbuntirea rezultatelor clinice ale
farmacoterapiei. Genotiparea n loc de fenotipare pentru medicamentele de testat este
de preferat a se realiza n timpul unei farmacoterapii n desfurare, din moment ce
unele medicamente pot inhiba, de exemplu, activitatea CYP2D6. Cel puin
majoritatea alelelor deficitare proprii diferitelor grupuri etnice, ar trebui caracterizate
i folosite n aprecierea fenotipului sau genotipului. Beneficiul adaptrii dozelor
conform genotipului este cel mai bine descris de studiile realizate pe medicaia
antipsihotic; cu toate acestea, exist nc o mare nevoie de studii prospective care s
genereze dovezi certe. Dozele iniiale recomandate, dependente de trsturile
farmacogenetice, au fost publicate pentru toate medicamentele antidepresive de
Kirchheiner i colab.,( 2001). Acesta a reprezentat un pas major n ncercarea de a
mbunti terapia medicamentoas individual, ns este nevoie de studii clinice mult
mai standardizate, care s testeze eficacitatea i efectele secundare genotipic adaptate
i nonadaptate ale diferitelor scheme terapeutice.
408
CAPITOLUL 14
TOXICOGENOMICA: INTEGRAREA NOILOR METODE
PROPRII BIOLOGIEI MOLECULARE N TOXICOLOGIE
14.1. Dezvoltarea toxicologiei
Efectele toxice produse aupra unui organism i induse de substanele din mediu
au fost studiate ani la rnd. Iniial toxicologii au luat n considerare n studiile lor,
morfologia i fiziologia organismului, incluznd determinarea dozelor de substane,
potenial letale, greutatea corpului i a organelor i inclusiv patologia brut.
Dezvoltarea tehnicilor histopatologice a permis examinarea microscopic a
esuturilor i determinarea efectelor toxice la nivel celular. n anii 1980, tehnicile
moleculare au devenit accesibile constituind modaliti de identificare precoce i cu o
nalt sensibilitate a punctelor moleculare afectate i a evideniat deosebirile existente
ntre diferitele tipuri de toxicitate. Aceste tehnici au avut drept rezultat scurtarea
timpului dintre administrarea medicamentului i detectarea efectelor sale, adic a
timpului de expunere. Acum sunt frecvent cercetate modificrile legate de nivelul
anumitor proteine sau metabolii tisulari, din snge sau urin, n strns corelaie cu
tipuri specifice de toxicitate.
Majoritatea parametrilor chimici convenionali, specifici analizelor clinice, au
fost stabilii empiric. Ei sunt rezultatul proceselor celulare aberante, n mai mare
msur dect componentelor mecanismului toxic. Spre exemplu pasajul enzimelor la
nivelul membranelor lezate este un proces secundar unei faze trzii a apoptozei
celulare. Determinarea punctelor lezate avnd la baz o singur molecul pot s-i
gseasc aplicabilitate dac exist noiuni prestabilite asupra modului de aciune al
agentului aflat n studiu. Prin urmare aceste experimente primare pot contribui la
confirmarea ipotezei. Cercettorii i propun s descopere markeri
409
specifici ai
integreaz
genomica
funcional
cu
metode
toxicologice
n acest capitol, mai nti, vom trece n revist diferitele tehnologii genomice
funcionale i apoi vom discuta despre aplicabilitatea lor n studiile toxicologice.
Toxicogenomica are potenialul de a mbunti aprecierea efectelor compoziiei
genomice asupra rezultatelor toxicologice, oferind o mai bun nelegere a
mecanismelor toxicitii; ea va facilita evaluarea toxicitii compuilor necunoscui,
va ajuta la producerea unor markeri indui de mecanismul toxicologic, va mbunti
corespondena toxicologic ntre specii i extrapolrile in vitro-in vivo, i nu n cele
din urm va facilita dezvoltarea unor subdiscipline toxicologice care se vor ocupa de
mixturile chimice.
14.2.1. Genomica
O multitudine de oportuniti au fost oferite biologiei i stiinelor care se ocup
cu studiul vieii de ctre dezvoltarea proiectelor de secvenionare genomic, precum
i eforturilor ntreprinse n scopul determinrii secvenelor genoamelor altor specii
cum ar fi obolanul sau maimua. Acizii nucleici sunt depozitarii informaiei genetice,
care reprezint informaia de baz necesar produciei proteinelor celulare.
nelegerea acestei informaii genetice de baz reprezint un pas important
pentru elucidarea mecanismelor moleculare care au loc la nivelul acestor proteine.
411
14.2.3. Proteomica
Nu toate mecanismele celulare pot fi msurate n ceea ce privete nivelul de
ARNm. Modificarea rapid a redistribuirii subcelulare a proteinelor deja prezente la
nivelul celulei, ar putea fi necesar, n special n ceea ce privete mecanismele
protectoare de rspuns celular . Tehnologiile de analiz proteic ar putea permite o
vizualizare mai bun a proceselor care nu implic biosinteze active, sau cel puin, vor
putea fi complementare analizei de expresie genic. Termenul de proteom este
utilizat pentru a nota ntreaga populaia complet de proteine exprimate ntr-o celul.
Pe lng transcriptomic, tehnologiile proprii proteomicii pot fi aplicate pentru
msurarea simultan a miilor de proteine dintr-o celul. Din moment ce proteinele
acioneaz cu precdere n reaciile celulare mai degrab dect n transcripia genic,
proteomica se va dovedi a fi mai important dect determinrile transcriptomice.
Determinarea proteomului este mai complex dect transcriptomica, unde populaia
total de ARNm poate fi izolat deodat i, relativ uor, miile de elemente de
transcripie care difer doar n secvena nucleotidic, sunt sortate n procesul
hibridizrii microfragmentelor ADNc. n contrast, separarea tuturor proteinelor
414
415
microregiunilor
proteice
ntr-o
manier
comparabil
cu
cea
417
418
sistematice care deriv din variate surse tehnologice ar trebui corectate. Dup
procesarea brut a datelor, sunt obinute fiiere secundare care ar trebui salvate alturi
de cele care descriu metodele de analiz a datelor.
O nou provocare pentru cercetarea biomedical o constiutie transformarea
bazelor mari de date, cu cantiti mari de zgomot i fr o nsemntate biologic
evident n descoperiri relevante, care s includ selecia unor subseturi dintre miile
de gene, proteine sau metabolii care s aib caracteristici biologice relevante. Acele
subseturi vor putea fi supuse unor cercetri ulterioare elaborate. Tehnici matematice
sunt aplicate pentru a aglomera datele n grupuri interpretabile sau modele structurate.
419
421
nivelul de metabolii ofer informaii asupra reaciilor biochimice care au avut deja
loc. Cea mai relevant confirmare biologic a modificrilor o reprezint relaionarea
lor cu efectele fiziologice. Doar la acest nivel modificrile au relevan i prezint
consecine asupra organismului. Modificrile expresiei genice i proteice sau ale
coninutului n metabolii pot fi desemnate drept efecte adverse dup corelarea cu
efectele fiziologice cunoscute ca nsoind strile toxice.
Tabelul 14.1 Referine privind genele i tehnologiile genomice
Swissprot
http://us.expasy.org/
http://www.ebi.ac.uk/
http://ep.ebi.ac.uk/EP/EPCLUST
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
GeneCards
http://bioinfo.wiezmann.ac.il/cards/
http://www.genome.ad.jp/kegg/
http://www.biocarta.com/genes/index.asp
425
426
14.4.
Aplicaiile
toxicogenomicii
studiul
mecanismului
a fost
fost
14.5. Concluzii
Toxicogenomica definit ca o aplicaie i un element de integrare al
transcriptomicii, proteomicii i metabolomicii n toxicologie, va servi multor scopuri
n ceea ce privete recunoaterea i tratarea toxicologiei la nivel molecular. Mai nti
este important ca descoperirile experimentelor funcionale genomice s fie puse n
legtur cu cunotinele deja existente i determinrile toxicologice convenionale.
Rezultate ale laboratoarelor de specialitate arat c un progres uria n domeniul
toxicologiei se va realiza odat cu dezvoltarea tehnologiilor funcionale genomice.
Mecanismele de aciune ale toxicitii vor putea fi elucidate n detaliu, la momente
iniiale ale evoluiei lor i la doze sczute, comparativ cu parametrii convenionali ai
toxicitii. Se ateapt mbuntiri n domeniul toxicologiei din aplicarea
toxicogenomicii, ce presupun descoperirea unor noi markeri, extrapolri crescute i
evaluarea toxicitii combinatorii. n special, n ceea ce privete testarea siguranei
medicamentelor, unde importana unei complete monitorizri a posibilelor efecte
adverse induse de ctre un compus asupra ntregului organism este deosebit de
important, se observ c abordarea genomic funcional se dovedete a fi din ce n
ce mai util.
430
CAPITOLUL 15
IMPORTANA POLIMORFISMULUI GENETIC I A
INTERACIUNILOR MEDICAMENTOASE N
TRATAMENTUL DURERII
15.1. Introducere
Variabilitatea interindividual farmacocinetic i farmacodinamic pentru
numeroase analgezice poate fi abordat din punct de vedere farmacogenetic, prin
studierea bazelor ereditii diferenelor rspunsului la un tratament medicamentos.
Anumite enzime ce acionez pentru metabolizarea medicamentelor, transportul
medicamentelor sau pentru medicamentele int sunt ntr-adevr supuse unui
polimorfism genetic care este definit prin diferenele existente n expresia genic ce
au o frecven mai mare de 1% n populaie.
Polimorfismul enzimatic (mai ales citocromii P450(CYP)) i transportorii
membranari [cum ar fi glicoproteina P(P-gp)] sunt deosebit de importani n domeniul
analgezic. Populaia difer n patrimoniul su genetic i n rspunsul su la
medicamente. Consecinele clinice posibile ale administrrii dozelor standard de
substane metabolizate de ctre enzimele supuse unui polimorfism genic vor merge
de la toxicitatea medicamentoas la absena eficacitii dup analgezic i
polimorfismul
considerat.
Polimorfismul
enzimatic
este
important
cnd
Hidrocodon
Ibuprofen
Imipramina
Indometacin
Maprotilina
Meloxicam
Metadona
Mianserina
Naproxen
Nortriptilin
Oxicodon
Paracetamol
Paroxetin
Piroxicam
Sertralin
Tenoxicam
Tramadol
Trimipramin
Valdecoxib
Cale metabolic major
Cale metabolic minor
Fig.15.1 Cile metabolice ale analgezicelor substraturi ale citocromilor P450 (CYP)
Substraturile sunt clasificate n ordine alfabetic dup denumirea lor internaional (list non
exhaustiv). Diferiii citocromi P450 implicai n metabolismul analgezicelor listate sunt indicate
sus. Ptratele negre indic o cale metabolic important, ptratele gri: o cale metabolic mai puin
important.
pozologia optim pentru fiecare pacient. De aceea noi vom prezenta n continuare
diferitele tehnici i perspective pentru viitor.
434
CYP
2C9
3A4
Aminoglutamida
Amprenavir
Carbamazepina
Ciclofosfamida
Dexametazona
Efavirenz
Etanol
Felbamat
Ifosfamid
Meprobamat
Millepertuis
Nevirapina
Oxacarbazepina
Fenobarbital
Fenilbutazona
Fenitoina
Primidona
Rifabutin
Rifampicina
Ritonavir
Topiramat
Inhibitor puternic
Inhibitor moderat
435
CYP
CYP
2C9
Acid valproic
Izoniazida
Amiodarona
Itraconazol
Amprenavir
Ketoconazol
Bupropion
Levomepromazina
Celecoxib
Losartan
Silibinina
Metadona
Clorochina
Metronidazol
Clorpromazina
Miconazol
Cimetidina
Moclobemid
Ciprofloxacin
Nateglinid
Citalopram
Nefazodon
Claritromicina
Nelfinavir
Clomipramina
Nifedipin
Clopidogrel
Nitrendipin
Delavirdin
Paroxetin
Desogestrel
Fenilbutazona
Dihidralazina
Fenitoin
Diltiazem
Prometazin
Difenhidramina
Propafenona
Efavirenz
Timidina
Eritromicina
Risperidon
Etilynestradiol
Ritonavir
Flecainida
Roxitromicina
Fluconazol
Saquinavir
Fluoxetin
Sertralin
Fluvastatina
Simvastatina
Fluvoxamin
Terbinafin
Gemfibrozil
Tioridazin
Gestoden
Tacrolimus
Grapefruit
Valdecoxib
Halofantrin
Venlafaxin
436
2D6
3A4
Haloperidol
Verapamil
Imatinib
Voriconazol
Indinavir
Zafirlukast
Irbesartan
Inhibitor puternic
Inhibitor moderat
Figura 15.3 Principalii inhibitori ai citocromilor P450(CZP)2C9, 2D6 i 3A4. Inhibitorii
sunt clasificai n ordine alfabetic dup denumirea internaional. Puterea de inhibiie este indicat
printr-un ptrat negru (inhibitor puternic) sau gri (inhibitor moderat). Impactul interaciunii va
depinde de importana relativ a cii de eliminare inhibat n raport cu clearence-ul total i
concentraiile plasmatice ale inhibitorului. Administrarea concomitent a unui substrat i a unui
inhibitor pentru acelai citocrom ncetinete eliminarea substratului. Dac tratamentul inductor este
oprit, activitatea citocromului revine progresiv la normal (> 2 sptmni).
441
Activitate opioida
cerebrala
Codeina
CYP3A4
CYP2D6
Morfina-6glucuronid
Morfina
Norcodeina
Morfina-3glucuronid
Codeina-6-glucuronid
442
Metadona este un opioid puternic care este uneori utilizat ca analgezic. Exist
diferene inter-individuale importante n concentraiile metadonei care se explic
parial prin activitatea CYP2D6. Concentraiile sanguine ale metadonei n stare de
echilibru au fost studiate la 256 de pacieni toxicomani i au fost mai crescute la PM
i mai sczute la UM. Mai mult de 70% dintre PM aveau un tratament de substituie
eficace (fa de 40% la UM). La fel, 50% dintre UM i numai 28% dintre PM au
primit doze de metadon superioare la 100mg pe zi (Eap i colab.,2001).
15.2.5 CYP2D6 i blocanii N-metil-D-aspartat(NMDA)
Dextrometorfanul (DEM) este un derivat morfinic i nonarcotic (analog
dextrogirului codeinei) lipsit de activitate opioid care acioneaz in vivo ca
antagonist necompetitiv al receptorului NDMA. De asemenea DEM pare s posede o
activitate neuromodulatoare. El este metabolizat n dextrorfan (DOR) de ctre
CYP2D6 i este utilizat ca substrat test pentru a fenotipa aceasta cale metabolic.
DEM este rapid transformat n DOR la EM. Datele experimentale arat c DEM
exercit un efect antinociceptiv i neuromodulator mai evident la CYP2D6 al PM,
spre deosebire de efectele de durat mai scurt observate la EM. Deci, CYP2D6 ar
putea juca un rol important n efectul neuromodulator al DEM i ar explica
contradiciile asupra impactului su clinic n studiile randomizate controlate perioperator n prevenia durerilor.
15.2.6. CYP2D6 i dependena de opiacee
Se pare ca PM ar putea fi protejai mpotriva dependenei la opiacee pentru
anumite molecule. Astfel, niciun PM nu a fost regsit prin genotipaj i fenotipaj n
grupele de pacieni dependeni de
pacienii care n-au fost niciodat dependeni de aceste substane (4%) sau dependeni
de numeroase alte substane (alcool, cocain, amfetamine; 6,5%). Aceast
submparire a metabolizatorilor leni la pacienii dependeni de opiacee sugereaz c
acetia au o protecie farmacogenetic mpotriva dependenei orale la opiacee (odd
ratio > 7). Inhibiia CYP2D6, care blocheaz producia de morfin, ar putea astfel s
443
parte, aceste efecte au fost corelate cu nivelurile plasmatice crescute ceea ce necesit
reducerea dozei (Spina i colab.,1997). S-a sugerat c exist o relaie ntre fenotipul
PM i cardiotoxicitate (palpitaii, dispnee, aritmie) la pacienii PM tratai cu
venlafaxina. Printre pacienii ce prezint efectele indezirabile la tratamentul cu
substraturi antidepresoare pentru CYP2D6 sunt de dou ori mai muli PM. Trebuie s
menionam c exist o variaie a dozelor eficiente n tratamentul depresiei care ar fi
de 25 la 300mg pentru clomipramin fie la PM, fie la UM. Chinezii (majoritatea
indivizi UM) metabolizeaz antidepresorii (desipramin, nortriptilin, clomipramin)
mai lent i vor primi n general doze mai sczute de antidepresori. Astfel, primele
recomandri de doze n funcie de genotip/fenotip al CYP2D6 privind 14
antidepresori au fost fcute de Kirchheiner i colab.,(2001). Pentru antidepresorii
triciclici PM este recomandat o reducere a dozelor de la 50 la 80% ,iar pentru ISRS
de 30%. Pentru UM dozele recomandate cresc la 260% pentru desipramin, 300%
pentru mianserin, i 300% pentru nortriptilin (Samer i colab.,2005). Astfel,
genotipajul ar putea s permit individualizarea pozologiilor.
15.2.8. Polimorfismul CYP3A
Familia CYP3A are rol n biotransformarea n proporie de 45-60% a
medicamentelor dintre care menionm opioidele naturale (codeina) sau sintetice
(tramadol, buprenorfin, metadon, fentanyl i dextrometorfan) (Desmeules i colab.,
2004). n anumite populaii exist diferene interindividuale n expresia CYP3A.
Subfamilia CYP3A cuprinde patru gene: CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7 i CYP3A43
situate pe cromozomul 7.
n subfamilia CYP3A, enzima cea mai abundent i mai important la nivelul
reaciilor oxidative este CYP3A4. Ea a fost izolat pe baza activitii sale oxidante
asupra nifedipin i variabilitii metabolismului nifedipinului (de peste 10 ori), ceea
ce sugereaz existena unui polimorfism genetic. Dei sunt descrise variantele alelice
ale CYP3A, niciuna nu determin o modificare semnificativ a activitii enzimatice.
CYP3A5 este exprimat la 20-30% dintre caucazieni, ceea ce reprezint cel puin
50% din coninutul total al CYP3A hepatice la persoanele care l exprim, participnd
445
administrate
concomitent
pot,
datorit
interaciunii
metadonei.
Inhibitorii CYP3A4 ca macrolidele i anumii antidepresori ca paroxetin,sau
neuroleptice ca olanzapin (fig. 15.3) vor determina pe de alt parte o reducere a
clairence-ul metadonei i vor crete riscul de supradozaj. Shinderman i colab.,(2003)
au observat o corelaie ntre concentraiile plasmatice ale metadonei i starea de
echlibru i activitate a CYP3A4. Alte studii in vitro arat c antiproteazele (ritonavir,
indinavir, saquinavir) sunt inhibitori in vitro ai metabolismului metadonei i
buprenorfinei. La fel, CYP3A4 este izoforma cea mai responsabil de dezalchilarea
fenantyl, alfentanil i sulfentanil. Astfel rifampicina un inductor al CYP3A4 crete de
trei ori clereance-ul alfentanil, spre deosebire de macrolide care-l scade de patru la
cinci ori.
Midazolamul este un benzodiazepin hidrosolubil cu o scurt durat de aciune,
care este (ca majoritatea benzodiazepinelor) substrat al CYP3A4. Interaciunile
farmacocinetice cu substanele inhibtoare ale CYP3A4 (fig.15.2) pot s conduc la o
cretere a efectelor sale indezirabile, din cauza creterii concentraiilor sale
plasmatice. Astfel, la un pacient de 61 de ani a fost descris o com prelungit dup
ce a primit midazolam (doz total cumulat 300 mg) pentru o sedare n timpul
cardioversiunii electrice, amiodaron n cadrul episoadelor de tachiaritmii
supraventriculare, ca i pentru o antibioterapie prin eritromicin pentru o
pneumopatie acut. Coma (ase zile) a fost
447
448
stare de echilibru sunt mai ridicate la voluntarii sntoi purttori ai alelei T (Jolme i
colab., 2002).
Substraturile P-gp au n comun proprieti fizice cum ar fi, un ciclu aromatic, o
hidrofobicitate, o greutate molecular cuprins ntre 200 i 1800Da sau un grup azotat
cationic. Pe de alt ,trebuie menionat c majoritatea substraturilor i inhibitorilor Pgp sunt de asemenea substraturi i inhibitori ai CYP3A4. Genele lor sunt dispuse n
apropiere pe acelai cromozom (7q22.1 i 7q21.1) i la nivel intestinal ar putea exista
o corelaie ntre polimorfismul C3435T al MDR1 i nivelul expresiei CYP3A4.
Opioidele au n comun o structur aromatic cu trei inele i un inel piperidin
substituit, i sunt din aceast cauz candidai buni pentru a fi substraturi ale P-gp.
Studiile in vitro au demonstrat c loperamidul, morfina, metadona, meperidin,
hidromorfon, naloxon, naltrexon, pentozacin sunt transportai de ctre P-gp. Exist
rezultate contradictorii pentru fentanyl. Sulfentanyl-sulfentanil i alfentanyl-alfentanil
nu sunt substraturi pentru P-gp. Dimpotriv, aceste ultime trei substane sunt
inhibitori in vitro ai P-gp (la concentraii puin comparabile cu cele administrate n
clinic). Anumite endorfine i enkefaline sunt de asemenea substraturi ale P-gp
(Oude i Zadina, 2001).
Studiile experimentale in vivo la animale au artat pe de alt parte un rol
posibil al P-gp asupra modulrii medicamentelor anti-nociceptive. Astfel la oarecii
deficieni n P-gp a fost evideniat o cretere a efectului anti-nociceptiv al
enkefalinei sintetice (DPDE) n comparaie cu oarecii normali datorit unei
ameliorri a biodisponibilitii cerebrale. n aceeai manier la obolanul care a
primit un inhibitor puternic al P-gp i o doz unic iv de morfin, efectele antinonciceptive sunt prelungite n raport cu obolanii netratai. Aceste schimbri nu sunt
dect imperfect corelate cu schimbrile farmacocinetice plasmatice ale morfinei.
Activitatea in vivo la animal a altor opioide cum ar fi meperidin, metadon i fentanyl
ar putea s fie influenat de expresia P-gp. La om, loperamidul, un opiaceu utilizat
pentru efectul su antidiareic, acioneaz asupra receptorilor pentru opiaceele
intestinale reducnd motilitatea intestinal i este la doze standard, lipsit de efecte
centrale. Dimpotriv, un pretratament cu chinidin (600mg administrat cu o or
449
ofer avantajul de a fi realizat odat pentru toat viaa. Tehnica aceasta este
costisitoare i sensibilitatea sa variaz n funcie de citocromul analizat. Astfel
datorit genotipului specific i/sau mutaiilor nc necunoscute, CYP2D6 ai UM nu
sunt toi detectai (Zanger i colab.,2004). Progresul tiinific n domeniu este rapid i
noi variante alelice sunt puse acum n eviden.
Metodele de detecie rapid prin microarray ADN sunt frecvent utilizate.
Microarray-urile sunt suporturile solide de civa centimetrii ptrai pe care pot s fie
fixate de manier organizat mii de secvene de ADN diferite. Aceste fragmente
servesc drept sonde genetice pentru a msura nivelul expresiei genetice. Sondele
genetice captureaz de manier foarte specific fragmentele de ADN complementare
coninute ntr-un eantion biologic ce trebuie testat. Acest fenomen (hibridizare)
poate fi evideniat prin tehnicile optice sub lumin fluorescent sau prin detecia
radioactivitii. Cuantificarea semnalelor obinute i identificarea fragmentelor de
gene recunoscute sunt posibile datorit unui sistem de achiziie de imagini, apoi
pentru analiza datelor se face apel la programe informatice special concepute.
Rezultatele obinute vor fi n continuare validate statistic i interpretate n context
biologic. Acum sunt utilizate dou metode macro i microarray cu depozitarea
direct a moleculelor de ADN pe suportul lor i cu fragmente de oligonucleotide
sintetizate in situ ca sonde oligonucleotidice pe o suprafa solid. Ele vor permite
detecia mai rapid i la scar mai mare a diferitelor variante alelice.
15.4.2. Indicaii n practica clinic i perspective
La ora actual, genotipajul i fenotipajul citocromilor se justifc retrospectiv la
pacienii care nu rspund la un tratament adecvat, adic insuficient (eec terapeutic)
sau dimpotriv la cei care au parte de un tratament excesiv (toxicitate
medicamentoas). Astfel se poate face distincia ntre o problem de complian i un
metabolism foarte rapid, cnd medicamentul este ineficace sau cnd concentraiile
sunt infraterapeutice ca n cazul antidepresorilor. Pe de alt parte , aceste tehnici
permit distincia ntre o suspiciune de dependen medicamentoas i un deficit
metabolic n cazul unui consum important de opiaceu slab, cum ar fi codeina
452
considerat ineficace pentru pacientul PM. Cuplajul celor dou tehnici permite pe de
alt parte detecia interaciunilor medicamentoase pertinente cnd fenotipul
pacientului este cunoscut n prealabil sau dac un genotipaj este realizat n paralel.
Totui, la ora actual, testele farmacogentice sunt limitate la spitalele
universitare i centrele specializate. Recomandrile de doze n funcie de genotip
trebuie s fie considerate ntr-adevr ca un concept preliminar care trebuie s fie
verificat. Eficacitatea i utilitatea clinic a acestor teste diagnostice rmne s fie
validat prin studii prospective randomizate controlate, ca i prin analizele
farmacoeconomice (numrul de teste necesar pentru a evita un caz de toxicitate i
costurile asociate).
15.5. Concluzii
Terapia antalgic este un prototip important de individualizare a prescripiei
medicamentoase. Cea mai mare parte a analgezicelor este metabolizat de ctre CYP,
ei nii fiind supui unui polimorfism genetic. Aceste polimorfisme pot s explice
ineficacitatea sau dimpotriv toxicitatea medicamentului. n perspectiv, detecia prin
fenotipaj i genotipaj a acestor polimorfisme ar putea s ne ofere metode rapide i
fiabile pentru a optimiza strategiile terapeutice anticipnd efectele indezirabile
(ineficacitate terapeutic), identificnd medicamentul potrivit , prezicnd pozologia
cea mai eficace i cea mai sigur pentru fiecare pacient. Pe de alt parte ne permite s
distingem o problem legat de un metabolism ultrarapid, de un abuz medicamentos
a unui deficit metabolic. Analiza cost/beneficiu a acestor metode trebuie s fie totui
confirmat de ctre studii prospective adecvate.
453
BIBLIOGRAFIE
454
455
haloperidol pharmacokinetics and on the outcome of haloperidol treatment. Clin Pharmacol Ther
72, 43852
BROOKES AJ. 1999. The essence of SNPs. Gene 234, 17786.
BRSEN K, GRAM LF. 1993. The pharmacogenetics of the selective serotonin reuptake
inhibitors. Clin Invest 71, 10029.
BRUNET A, ROUX D, LENORMAND P, DOWD S, KEYSE S, POUYSSEGUR J. 1999.
Nuclear translocation of p42/p44 mitogen-activated protein kinase is required for growth factorinduced gene expression and cell cycle entry. EMBO J 18, 66474.
BULERA SJ et al., 2001, RNA expression in the early characterization of hepatotoxicants in
Wistar rats by high-density DNA microarrays, Hepatology 33, 12391258.
BURMESTER J, PLCKTHUN A. 2001. Construction of scFv fragments from hybridoma or
spleen cells by PCR assembly, in: KONTERMANN R, DBEL S, eds, Antibody Engineering 19
40, Springer, Berlin.
BURNASHEV N, ROZOV A. 2000. Genomic control of receptor function. Cell Mol Life Sci
57, 1499507.
BYRNE B, IWATA S. 2002. Membrane protein complexes, Curr Opin Struct Biol 12, 23943.
CAMILLERI-BROET S, VANDERWERFF H, CALDWELL E, HOCKENBERY D. 1998.
Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosis.
Exp Cell Res 239, 27792.
CARLSSON J, JANSON J-C, SPERRMAN M, in: JANSON J-C, RYDEN L, eds, 1998.
Protein Purification: Principles, High- Resolution Methods and Applications, 2nd edn, 375442,
Wiley, New York
CASCORBI I, GERLOFF T, JOHNE A, MEISEL C, HOFFMEYER S, SCHWAB M,
SCHAEFFELER E, EICHELBAUM M, BRINKMANN U, ROOTS I. 2001. Frequency of single
nucleotide polymorphisms in the P-glycoprotein drug transporter MDR1 gene in white subjects.
Clin Pharmacol Ther 69, 16974.
CELIS JE, KRUHOFFER M, GROMOVA I, FREDERIKSEN C, OSTERGRAAD M,
THYKJAER T, GROMOV P, VU J, PLSDOTTIR H, MAGNUSSON N, ORTNTOFT TF. 2000.
Gene expression profiling: monitoring transcription and translation products using DNA
microarrays and proteomics. FEBS Lett 480, 216.
CEREGHINO JL, CREGG JM. 2000. Heterologous protein expression in the methylotrophic
yeast Pichia Pastoris. FEMS Microbiol Rev 24, 4566.
CHADEE DN, HENDZEL MJ, TYLIPSKI CP, ALLIS CD, BAZETT-JONES DP, WRIGHT
JA, DAVIE JR. 1999. Increased Ser-10 phosphorylation of histone H3 in mitogen-stimulated and
oncogenetransformed mouse fibroblasts. J Biol Chem 274, 2491420.
CHALFIE M, TU Y, EUSKIRCHEN G, WARD WW, PRASHER DC. 1994. Green
fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263, 8025.
CHANKVETADZE B. 2004, Recent trends in enantioseparation of chiral drugs in:
DINGERMANN TH, STEINHILBER D, FOLKERS G. eds. Molecular Biology in Medicinal
Chemistry. 181 -211, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
CHEBIB M, JOHNSTON GA. 2000.GABA-activated ligand gated ion channels: medicinal
chemistry and molecular biology. J Med Chem 43, 142747.
CHEKULAYEVA MN, KURNASOV OV, SHIROKOV VA, SPIRIN AS. 2001. Continuousexchange cell-free protein synthesizing system: synthesis of HIV-1 antigen Nef. Biochem Biophys
Res Commun 280, 9147.
CHEN A, SHAPIRO MJ. 1998. NOE pumping: a novel NMR technique for identification of
compounds with binding affinity to macromolecules, J Am Chem Soc 120, 102589.
CHEN A, SHAPIRO MJ. 2000. NOE Pumping. 2. A high-throughput method to determine
compounds with binding affinity to macromolecules by NMR, J Am Chem Soc 122, 4145.
CHOI KH, CHEN CJ, KRIEGLER M,RONINSON IB. 1988. An altered pattern of crossresistance in multidrug-resistant human cells results from spontaneous mutations in the mdr1
(Pglycoprotein) gene. Cell 53, 51929.
456
DICKMANN LJ, RETTIE AE, KNELLER MB, KIM RB, WOOD AJ, STEIN CM, et al.
2001. Identification and functional characterization of a new CYP2C9 variant (CYP2C9*5)
expressed among African Americans. Mol Pharmacol 60, 3827.
DIERCKS T, COLES M, KESSLER H. 2001. Applications of NMR in drug discovery, Curr
Opin Chem Biol 5, 28591.
DING GJ, FISCHER PA, BOLTZ RC, SCHMIDT JA, COLAIANNE JJ, GOUGH A, RUBIN
RA, MILLER DK. 1998. Characterization and quantitation of NF-kappaB nuclear translocation
induced by interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha. Development and use of a high capacity
fluorescence cytometric system. J Biol Chem 273, 28897905.
DINGER MC, BECK-SICKINGER AG. 2002. The first reporter gene assay on living cells:
green fluorescent protein as reporter gene for the investigation of Gi-protein coupled receptors. Mol
Biotechnol 21, 918.
DINGERMANN TH, STEINHILBER D, FOLKERS G. 2004. Molecular Biology in
Medicinal Chemistry. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim 133-134
DINGERMANN TH, STEINHILBER D, FOLKERS G. 2004. Molecular Biology in
Medicinal Chemistry. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim 136-137
DINGERMANN TH, STEINHILBER D, FOLKERS G. 2004. Molecular Biology in
Medicinal Chemistry. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim 142.
DRYSDALE CM, MCGRAW DW, STACK CB, STEPHENS JC, JUDSON RS,
NANDABALAN K, ARNOLD K, RUANO G, LIGGETT SB. 2000. Complex promoter and coding
region beta2-adrenergic receptor haplotypes alter receptor expression and predict in vivo
responsiveness. Proc Natl Acad Sci USA 97, 104838.
DUROCHER Y, PERRET S, THIBAUDEAU E, GAUMOND MH, KAMEN A, STOCCO R,
ABRAMOVITZ M. 2000. A reporter gene assay for high-throughput screening of G-proteincoupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells.
EAP CB, BROLY F, MINO A, 2001. Cytochrome P4502D6 genotype and methadone steadystae concentrations. J Clin Psychopharmacol, 21:229-234.
EAVES CJ. 1995. Assay of hematopoietic progenitor cells. In Beutler E, MA Lichtman, BS
Collier, TJ Kipps (eds), Williams Hematology, 5th edn. New York: McGraw-Hill, 226.
EDWARDS BS, KUCKUCK FW, PROSSNITZ ER, RANSOM JT, SKLAR LA. 2001. HTPS
flow cytometry: a novel platform for automated high throughput drug discovery and
characterization. J Biomol Screen 6, 8390.
EDWARDS SW, TAN CM, LIMBIRD LE. 2000. Localization of G-proteincoupled receptors
in health and disease. Trends Pharmacol Sci 21, 3048.
ENGBERG J, JENSEN LB, YENIDUNYA AF, BRANDT K, RIISE E. 2001. Phage-display
libraries of murine antibody Fab fragments, in: KONTERMANN R, DBEL S, eds, Antibody
Engineering, 6592, Springer, Berlin.
ENGELS JE, PARSCH J. 2004, Nucleic acid drugs in: DINGERMANN TH, STEINHILBER
D, FOLKERS G. eds. Molecular Biology in Medicinal Chemistry. 153 - 179, WILEY-VCH Verlag
GmbH & Co. KGaA, Weinheim
EPSTEIN CB, BUTOW RA. 2000. Microarray technology enhanced versatility, persistent
challenge. Curr Opin Biotechnol 11, 3641.
EUSTICE DC, FELDMAN PA, COLBERG-POLEY AM, BUCKERY RM, NEUBAUER RH.
1991. A sensitive method for the detection of beta-galactosidase in transfected mammalian cells.
Biotechniques 11, 73940, 7423.
EVANS TC, MARTIN D, KOLLY R, PANNE D, SUN L, GHOSH I, CHEN L, BENNER J,
LIU XQ, XU MQ. 2000. Protein trans-splicing and cyclization by a naturally split intein from the
dnaE gene of Synechocystis species PCC6803. J Biol Chem 275, 90914.
EVANS WE, JOHNSON JA. 2001. Pharmacogenomics: the inherited basis for interindividual
differences indrug response. Annu Rev Genomics Hum Genet 2, 939.
EVANS WE, MCLEOD HL. 2003. Pharmacogenomics drug disposition, drug targets and
side effects. N Engl J Med 348, 53849.
458
459
GROTEN JP et al.., 2000, An analysis of the possibility for health implications ofjoint actions
and interactions between food additives, Regul Toxicol Pharmacol 31, 7791.
GU H, ZOU YR, RAJEWSKY K. Independent control of immunoglobulin switch
recombination at individual switch regions evidenced through CreloxP- mediated gene targeting.
1993. Cell 73, 115564.
GNTHER U, LIU Y, SANFORD D, BACHOVCHIN W, SCHAFFHAUSEN B. 1996.
NMR analysis of interactions of a PI-3 kinase SH2 domain with phosphotyrosine peptides reveals
interdependence of major binding sites, Biochemistry 35, 1557081.
GNTHER U, SCHAFFHAUSEN B. 2002. NMRKIN: simulating line shapes from twodimensional spectra of proteins upon ligand binding, J Biomol NMR 22, 2019.
HAJDUK P, BOYD S, NETTESHEIM D, NIENABER V, SEVERIN J, SMITH R,
DAVIDSON D, ROCKWAY T, FESIK S. 2000. Identification of novel inhibitors of urokinase via
NMR-based screening, J Med Chem 43, 38626.
HAJDUK P, GERFIN T, BOEHLEN J, HABERLI M, MAREK D, FESIK S. 1999. Highthroughput nuclear magnetic resonance-based screening, J Med Chem 42, 23157.
HAJDUK P, OLEJNICZAK E, FESIK S. 1997. One-dimensional relaxation- and diffusionedited NMR methods for screening compounds that bind to macromolecules, J Am Chem Soc 119,
1225761.
HAJDUK PJ, AUGERI DJ, MACK J, MENDOZA R, YANG J, BETZ SF, FESIK SW. 2000.
NMR-based screening of proteins containing 13C-labeled methyl groups, J Am Chem Soc 122,
7898904.
HANAHAN D, WEINBERG RA. 2000. The hallmarks of cancer. Cell 100, 5770.
HEASMAN J. Morpholino oligos: making sense of antisense? 2002. Dev Biol 243, 209214.
HEFTI JP, KUMAR A. 1999. Sensitive detection method of dielectric dispersions in aqueous
based, surface bound macromolecular structures using microwave spectroscopy. Appl Phys Lett 75,
18024.
HEIJNE WH et al., 2003, Toxicogenomics of bromobenzene hepatotoxicity: a combined
transcriptomics and proteomics approach, Biochem Pharmacol 651, 85775.
HITZL M, DRESCHER S, VAN DER KH, SCHAFFELER E, FISCHER J, SCHWAB M, et
al. 2001, The C3435T mutation in the human MDR1 gene is associated with altered efflux of the Pglycoprotein substrate rhodamine 123 from CD56+ natural killer cells. Pharmacogenetics 11, 293
8.
HOFFMEYER S, BURK O, VON RICHTER O, ARNOLD HP, BROCKMOLLER J, JOHNE
A, CASCORBI I, GERLOFF T,ROOTS I, EICHELBAUM M, BRINKMANN U. 2000. Functional
polymorphisms of the human multidrug resistance gene: multiple sequence variations and
correlation of one allele with Pglycoprotein expression and activity in vivo. Proc Natl Acad Sci
USA 97, 34738.
HOFFMEYER S, BURK O, VON RICHTER O, et al ., 2000. Functional polymorphisms of
the human multidrug-resistence gene: multiple sequence variations and correlation of one allele
withP-glycoprotein expression and activity in vivo. Proc Natl Acad Sci USA, 97:3473-3478.
HOLMES E et al., 2001, Metabonomic characterization of genetic variations in toxicological
and metabolic responses using probabilistic neural networks, Chem Res Toxicol 14, 18291
HONDA A, ADAMS SR, SAWYER CL, LEV-RAM V, TSIEN RY, DOSTMANN WR.
2001. Spatiotemporal dynamics of guanosine 3,5-cyclic monophosphate revealed by a genetically
encoded, fluorescent indicator. Proc Natl Acad Sci USA 98, 243742.
HUNTE C, KANNT A. 2003. Antibody fragment mediated crystallization of membrane
proteins, in: HUNTE C, VON JAGOW G, SCHGGER H, eds, Membrane Protein Purification
and Crystallization 20518, Elsevier Science, Amsterdam.
HUNTE C, MICHEL H. 2002. Crystallisation of membrane proteins mediated by antibody
fragments, Curr Opin Struct Biol 12, 5038.
460
461
KIMURA S, UMENO M, SKODA RC, MEYER UA, GONZALEZ FJ. 1989. The human
debrisoquine 4-hydroxylase (CYP2D) locus: sequence and identification of the polymorphic
CYP2D6 gene, a related gene and a pseudogene. Am J Hum Genet 45, 889904.
KIRCHHEINER J, BROSEN K, DAHL ML, GRAM LF, KASPER S, ROOTS I, et al., 2001.
CYP2D6 and CYP2C19 genotype based dose recommendations for antidepressants: a first step
towards subpopulation-specific dosages. Acta Psychiatr Scand 104, 17392.
KIRCHHEINER J, MEINEKE I, STEINBACH N, MEISEL C, ROOTS I, BROCKMOLLER
J., 2003. Pharmacokinetics of diclofenac and inhibition of cyclooxygenases 1 and 2: no relationship
to the CYP2C9 genetic polymorphism in humans. Br J Clin Pharmacol, 55, 5161.
KIRCHHEINER J, STORMER E, MEISEL C, et al., 2003. Influence of CYP2C9 genetic
polymorphisms on pharmacokinetics of celecoxib and its metabolites. Pharmacogenetics, 13: 473480.
KOEN YM et al., 2000, Identification of three protein targets for reactive metabolites of
bromobenzene in rat liver cytosol, Chem Res Toxicol 13, 132635.
KOTARSKY K, OWMAN C, OLDE B. 2001. A chimeric reporter gene allowing for clone
selection and high-throughput screening of reporter cell lines expressing G-protein-coupled
receptors. Anal Biochem 288, 20915.
KRUGLYAK L. 1999. Prospects for whole-genome linkage disequilibrium mapping of
common disease genes. Nat Genet 22, 13944.
KUEHL P, ZHANG J, LIN Y, et al., 2001.Sequence diversity in CYP3A promoters and
characterization of the genetic basis of polymorphic CYP3A5 expression. Nat Genet, 27: 383-391.
KUHLBRANDT W. 2003. Two-dimensional crystallization of membrane proteins: a practical
guide, in: HUNTE C, VON JAGOW G, SCHGGER H, eds, Membrane Protein Purification and
Crystallization, 25384, Elsevier Science, Amsterdam.
KUIVENHOVEN JA, JUKEMA JW, ZWINDERMAN AH, DE KNIJFF P, MCPHERSON R,
BRUSHCKE AV, LIE KI, KASTELEIN JJ. 1998. The role of a common variant of the cholesteryl
ester transfer protein gene in the progression of coronary atherosclerosis. The Regression Growth
Evaluation Statin Study Group. N Engl J Med 338, 8693.
KWIATKOWSKI RW, LYAMICHEV V, DE ARRUDA M, NERI B. 1999. Clinical, genetic,
and pharmacogenetic applications of the Invader assay. Mol Diagn 4, 35364.
LANDER ES, et al. 2001. Initial sequencing and analysis of the human genome, Nature 409,
860921.
LANGE C, HUNTE C. 2002. Crystal structure of the yeast cytochrome bc1 complex with its
bound substrate cytochrome c, Proc Natl Acad Sci USA 99, 28005.
LEE JT, KROEMER HK, SILBERSTEIN DJ, FUNCK-BRENTANO C, LINEBERRY MD,
WOOD AJ, RODEN DM, WOOSLEY RL. 1990. The role of genetically determined polymorphic
drug metabolism in the beta blockade produced by propafenone. N Engl J Med 322, 17648.
LEFKOWITZ RJ. 2000. The superfamily of heptahelical receptors. Nat Cell Biol 2, E1336.
LEOF EB. 2000. Growth factor receptor signaling: location location location. Trends Cell
Biol 10, 3438.
LESLIE AG, MOODY PC, SHAW WV. 1988. Structure of chloramphenicol acetyltransferase
at 1.75-A resolution. Proc Natl Acad Sci USA 85, 41337.
LEVO A, KOSKI A, OJANPERA I, 2003. Post-morten SNP analysis of CYP2D6 gene
reveals correlation between genotype and opioid drug (tramadol) metabolite ratios in blood.
Forensic Sci Int, 135:9-15.
LIESE A, SEELBACH K, BUCHHOLZ A, HABERLAND J, in: LIESE A, SEELBACH K,
WANDREY C. 2000. Eds Industrial Biotransformations, 95392, Wiley-VCH, Weinheim.
LIN M, SHAPIRO M. 1996. Mixture analysis in combinatorial chemistry, application of
diffusion-resolved NMR spectroscopy, J Org Chem 61, 76179.
LIN M, SHAPIRO MJ, WAREING JR. 1997. Diffusion-edited NMR-affinity NMR for direct
observation of molecular interactions, J Am Chem Soc 119, 524950.
462
LLEDO P. 1993. Variations in drug metabolism due to genetic polymorphism. Drug Invest 5,
1934.
LOCKHART DJ, WINZELER EA. 2000. Genomics, gene expression and DNA arrays.
Nature 405, 82736.
LORENZ WW, CORMIER MJ, OKANE DJ, HUA D, ESCHER AA, SZALAY AA. 1996.
Expression of the Renilla reniformis luciferase gene in mammalian cells. J Biolumin Chemilumin 11,
317.
LOVLIE R, DALY AK, MATRE GE, MOLVEN A, STEHEN VM. 2001. Polymorphisms in
CYP2D6 duplicationnegative individuals with the ultrarapid metabolizer phenotype: a role for the
CYP2D6*35 allele in ultrarapid metabolism? Pharmacogenetics 11, 45 55.
MADIN K, SAWASAKI T, OGASAWARA T, ENDO Y. 2000. A highly efficient and robust
cell-free protein synthesis system prepared from wheat embryos: plants apparently contain a suicide
system directed at ribosomes. Proc Natl Acad Sci USA 97, 55964..
MAHAJAN NP, LINDER K, BERRY G, GORDON GW, HEIM R, HERMAN B. 1998. Bcl
2 and Bax interactions in mitochondria probed with green fluorescent protein and fluorescence
resonance energy transfer. Nat Biotechnol 16, 54752.
MAITLAND-VAN DER ZEE A, KLUNGEI OH, STRICKER BHC, VERSCHUREN WMM,
KASTELEIN JJP, LEUFKENS HGM, DE BOER A. 2002. Genetic polymorphisms: importance for
response to HMG-CoA reductase inhibitors. Atherosclerosis 163, 21322.
MAJERLE A, KIDRIC J, JERALA R. 2000. Production of stable isotope enriched.
antimicrobial peptides in Escherichia coli: an application to the production of a 15N-enriched
fragment of lactoferrin. J Biomol NMR 18, 14551.
MALAKOFF D. The Rise of the Mouse, Biomedicines Model Mammal. 2000. Science 288,
24853.
MANNING AM. 1996. Transcription factors: a new frontier for drug discovery. Drug Discov
Today 1, 15160.
MAREZ D, LEGRAND M, SABBAGH N, GUIDICE JM, SPIRE C, LAFITTE JJ, MEYER
UA, BROLY F. 1997. Polymorphism of the cytochrome P450 CYP2D6 gene in a European
population: characterization of 48 mutations and 53 alleles, their frequencies and evolution.
Pharmacogenetics 7, 193202.
MARINISSEN MJ, GUTKIND JS. 2001. G-protein-coupled receptors and signaling networks:
emerging paradigms. Trends Pharmacol Sci 22, 36876.
MARLEY J, LU M, BRACKEN C. 2001. A method for efficient isotopic labeling of
recombinant proteins. J Biomol NMR 20, 71-5
MARTEMYANOV KA, SHIROKOV VA, KURNASOV OV, GUDKOV AT, SPIRIN AS.
2001. Cell-free production of biologically active polypeptides: application to the synthesis of
antibacterial polypeptide cecropin. Protein Expr Purif 21, 45661.
MAYER M, MEYER B. 2001. Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR
to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor, J Am Chem Soc 123,
610817.
METZGER D, CHAMBON P. Site- and time-specific gene targeting in the mouse. 2001.
Methods 24, 7180.
MAYER TU, KAPOOR TM, HAGGARTY SJ, KING RW, SCHREIBER SL, MITCHISON
TJ. 1999. Small molecule inhibitor of mitotic spindle bipolarity identified in a phenotype-based
screen. Science 286, 9714.
MEYER B, WEIMAR T, PETERS T. 1997. Screening mixtures for biological activity by
NMR, Eur J Biochem 246, 7059.
MEYER UA. 2000. Pharmacogenetics and adverse drug reactions. Lancet 356, 166771.
MICHEL H. 2001. Crystallization of membrane proteins, in: ROSSMANN MG, ARNOLD E,
eds, International Tables of Crystallography F: Macromolecular Crystallography, 949, Kluwer,
Dordrecht.
463
MICHIENZI A, CAGNON L, BAHNER I, ROSSI JJ, 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97,
895560.
MILLIGAN G, REES S. 1999. Chimaeric G alpha proteins: their potential use in drug
discovery. Trends Pharmacol Sci 20, 11824.
MITCHELL P. 2001. Turning the spotlight on cellular imaging. Nat Biotechnol 19, 10137.
MOORE JT, DAVIS ST, DEV IK. 1997. The development of beta-lactamase as a highly
versatile genetic reporter for eukaryotic cells. Anal Biochem 247, 2039.
MORIYA Y, NAKAMURA T, HORINOUCHI M, SAKAEDA T, TAMURA T, AOYAMA
N, et al. 2002., Effects of polymorphisms of MDR1, MRP1, and MRP2 genes on their mRNA
expression levels in duodenal enterocytes of healthy Japanese subjects. Biol Pharm Bull 25, 1356
9.
NAGY A, ROSSANT J, NAGY R, ABRAMOW-NEWERLY W, RODER JC. Derivation of
completely cell culture derived mice from early-passage embryonic stem cells. 1993. Proc Natl
Acad Sci USA 90, 84248.
NAKAMURA K, ARIYOSHI N, YOKOI T, OHGIYA S, CHIDA M, NAGASHIMA K, et al.
2002. CYP2D6.10 present in human liver microsomes shows low catalytic activity and thermal
stability. Biochem Biophys Res Commun 293, 96973.
NICHOLSON JK, CONNELLY J, LINDON C, HOLMES E. 2002. Metabonomics: a
platform for studying drug toxicity and gene function. Nat Rev Drug Discov 1, 15361.
NICHOLSON JK, LINDON JC, HOLMES E. 1999. Metabonomics: understanding the
metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical
analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica 29, 11819.
NOWOTNY P, KWON JM, GOATE AM. 2001. SNP analysis to dissect human traits. Curr
Opin Neurobiol 11, 63741.
ORMO M, CUBITT AB, KALLIO K, GROSS LA, TSIEN RY, REMINGTON SJ. 1996.
Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science 273, 13925.
OUDE ELFERNIC R P,ZADINA J, 2001. MDR1 P-glycoprotein transports endogenous
peptides. Peptides, 22:2015-2020.
PADAN E, HUNTE C, REILANDER H. 2003. Production and purification of recombinant
membrane proteins, in: HUNTE C, VON JAGOW G, SCHGGER H, eds, Membrane Protein
Purification and Crystallization, 5583, Elsevier Science, Amsterdam.
PAIGEN K. 1989. Mammalian betaglucuronidase: genetics molecular biology and cell
biology. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 37, 155205.
PALCZEWSKI K, KUMASAKA T, HORI T, BEHNKE CA, MOTOSHIMA H, FOX BA,
LE TRONG I, TELLER DC, OKADA T, STENKAMP RE, YAMAMOTO M, MIYANO M. 2000.
Crystal structure of rhodopsin: a G protein-coupled receptor. Science 289, 73945.
PARSONS SJ, RHODES SA, CONNOR HE, REES S, BROWN J, GILES H. 2000.Use of a
dual firefly and Renilla luciferase reporter gene assay to simultaneously determine drug selectivity
at human corticotrophin releasing hormone 1 and 2 receptors. Anal Biochem 281, 18792.
PELLETIER JN, CAMPBELL-VALOIS FX, MICHNICK SW. 1998. Oligomerization
domain-directed reassembly of active dihydrofolate reductase from rationally designed fragments.
Proc Natl Acad Sci USA 95, 121416.
PEREZ OD, NOLAN GP. 2002. Simultaneous measurement of multiple active kinase states
using polychromatic flow cytometry. Nat Biotechnol 20, 15562.
POLLOK BA, HEIM R. 1999. Using GFP in FRET-based applications. Trends Cell Biol 9,
5760.
RAAMSDONK LM, TEUSINK B, BROADHURST D, ZHANG N, HAYES A, WALSH MC,
BERDEN JA, BRINDLE KM, KELL DB, ROWLAND JJ, WESTERHOFF HV, VAN DAM K,
OLIVER SG. 2000. A functional genomics strategy that uses metabolome data to reveal the
phenotype of silent mutations. Nat Biotechnol 19, 4550.
RAM PT, IYENGAR R. 2001. G protein coupled receptor signaling through the Src and Stat3
pathway: role in proliferation and transformation. Oncogene 20, 16016.
464
RAO NN, LIESE A. 2004, Stereoselective synthesis with the help of recombinant enzymes in:
DINGERMANN TH, STEINHILBER D, FOLKERS G. eds. Molecular Biology in Medicinal
Chemistry. 125 -153, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
RAU T, HEIDE R, BERGMANN K, WUTTKE H, WERNER U, FEIFEL N, et al. 2002.
Effect of the CYP2D6 genotype on metoprolol metabolism persists during long-term treatment.
Pharmacogenetics 12, 46572.
REICH DE, CARGILL M, BOLK S, IRELAND J, SABETI PC, RICHTER DJ, LAVERY T,
KOUYOUMJIAN R, FARHADIAN SF, WARD R, LANDER ES. 2001. Linkage disequilibrium in
the human genome. Nature 411, 199204.
REMINGTON SJ. 2002. Negotiating the speed bumps to fluorescence. Nat Biotechnol 20,
289.
REMY I, MICHNICK SW. 1999. Clonal selection and in vivo quantitation of protein
interactions with proteinfragment complementation assays. Proc Natl Acad Sci USA 96, 53949.
RENEGAR G, RIESER P, MANASCO P. 2001. Pharmacogenetics: the Rx perspective.
Expert Rev Mol Diagn 1, 25563.
ROBERTS G. 2000. Applications of NMR in drug discovery, Drug Discov Today 5, 23040.
ROBERTSON JD, ORRENIUS S. 2000, Molecular mechanisms of apoptosis induced by
cytotoxic chemicals, Crit Rev Toxicol 30, 60927.
ROGERS JF, NAFZIGER AN, BERTINO JS., 2002. Pharmacogenetics affects dosing,
efficacy and toxicity of cytochrome P450- metabolized drugs. Am J Med, 113: 746-750.
RONG YS, TITEN SW, XIE HB, GOLIC MM, BASTIANI M, BANDYOPADHYAY P,
OLIVERA BM, BRODSKY M, RUBIN GM, GOLIC KG. Targeted mutagenesis by homologous
recombination in D. melanogaster. 2002. Genes Dev 16, 156881.
ROSSANT J, NAGY A. Genome engineering: the new mouse genetics. 1995. Nat Med 1,
5924.
SAENGER W, 1984, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer Verlag, New York.
SAMER CF, PIGUET V, DAYER P, et al., 2005. Polymorphisme genetique et interaction
medicamenteuses: leur importance dans le traitement de douleur. Can J Anesth, 52:806-821.
SARVER JG, KLIS WA, BYERS JP, ERHARDT PW. 2002. Microplate screening of the
differential effects of test agents on Hoechst 33342, rhodamine 123, and rhodamine 6G
accumulation in breast cancer cells that overexpress Pglycoprotein. J Biomol Screen 7, 2934.
SAUTEL M, MILLIGAN G. 2000. Molecular manipulation of G-proteincoupled receptors: a
new avenue into drug discovery. Curr Med Chem 7, 88996.
SCHAAP AP, AKHAVAN H, ROMANO LJ. 1989. Chemiluminescent substrates for alkaline
phosphatase: application to ultrasensitive enzyme-linked immunoassays and DNA probes. Clin
Chem 35, 18634.
SCHAUFELE F. 2001. Shedding light on molecular timing. Nat Biotechnol 19, 212.
SCHERR M, REED M, HUANG C-F, RIGGS AD, ROSSI JJ, 2000, Mol Therapy 2, 2638.
SCHLESSINGER J. 1993. Cellular signaling by receptor tyrosine kinases. Harvey Lect 89,
10523.
SCORDO MG, AKLILLU E, YASAR U, et. al., 2001. Genetic poymorphism of cytochrome
P450 2C9 in a caucasian and a black African population. Br J Cin Pharmacol, 52: 447-450.
SCORDO MG, SPINA E, ROMEO P, DAHL ML, BERTILSSON L, JOHANSSON I, et al.
2000. CYP2D6 genotype and antipsychotic-induced extrapyramidal side-effects in schizophrenic
patients. Eur J Clin Pharmacol 56, 67983.
SCRIBA G. 2004, Affinity chromatography in: DINGERMANN TH, STEINHILBER D,
FOLKERS G. eds. Molecular Biology in Medicinal Chemistry. 211 - 242, WILEY-VCH Verlag
GmbH & Co. KGaA, Weinheim
SHAPIRO M, WAREING J. 1998. NMR methods in combinatorial chemistry, Curr Opin
Chem Biol 2, 3725.
465
SULLIVAN E, TUCKER EM, DALE IL. 1999. Measurement of [Ca2+] using the
Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR). Methods Mol Biol 114, 12533.
SWYNGHEDAUW B. 2001. Cardiovascular pharmacogenetics and pharmacogenomics. J
Clin Basic Cardiol 4, 20510.
SYKES B. 1994. Interaction of transforming growth factor-a with the epidermal growth factor
receptor: binding kinetics and differential mobility within the bound TGF-a, Biochemistry 33,
1528392.
TAMMINGA WJ, WERNER J, OOSTERHUIS B, BRAKENHOFF JPG, GERRITIS MGF,
DE ZEEUW RA, DE LEIJ LF, JONKMAN JH. 2001. An optimized methodology for combined
phenotyping and genotyping on CYP2D6 and CYP2C19. Eur J Clin Pharmacol 57, 1436.
TAN S, HALL IP, DEWAR J, DOW E, LIPWORTH B. 1997. Association between beta 2
adrenoceptor polymorphism and susceptibility to bronchodilator desensitisation in moderately
severe stable asthmatics. Lancet 350, 9959.
THOMAS KR, CAPECCHI MR. Site directed mutagenesis by gene targeting in mouse
embryo-derived stem cells. 1987. Cell 51, 50312.
THOMAS RS, RANK DR, PENN SG, ZASTROW GM, HAYES KR, PANDE K, GLOVER
E, SILANDER T, CRAVEN MW, REDDY JK, JOVANOVICH SB, BRADFIELD CA. 2001.
Identification of toxicologically predictive gene sets using cDNA microarrays. Mol Pharmacol 60,
118994.
THORISSON GA, STEIN LD. 2003. The SNP Consortium website: past, present and future.
Nucleic Acids Res 31, 1247.
TSIEN RY. 1998. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem 67, 509 44.
TSUJI Y et al., 2000, Coordinate transcriptional and translational regulation of ferritin in
response to oxidative stress, Mol Cell Biol, 20, 581827.
TSUNEOKA Y, MATSUO Y, IWAHASHI K, TAKEUCHI H, ICHIKAWA Y. 1993. A
novel cytochrome P-450ID6 mutant gene associated with Parkinsons disease. J Biochem 114, 263
6.
TUCKER CL, FIELDS S. 2001. A yeast sensor of ligand binding. Nat Biotechnol 19, 10426.
TULIN EE, KEN-ICHI T, SHIN-ICHIRO E. 1995. Continuously coupled transcriptiontranslation system for the production of rice cytoplasmic aldolase. Biotechnol Bioeng 45, 5116.
UDVADIA AJ, LINNEY E. Windows intodevelopment: historic, current, and future
perspectives on transgenic zebrafish. 2003. Dev Biol 256, 117.
UINGS IJ, FARROW SN. 2000. Cell receptors and cell signaling. Mol Pathol 53, 2959.
VAN DEN BURG HA, DE WIT PJGM, VERVOORT J. 2001. Efficient 13C/15N double
labeling of the avirulence protein AVR4 in a methanol-utilizing strain (Mut+. of Pichia pastoris. J
Biomol NMR 20, 25161.
VENTER JC, et al. 2001. The sequence of the human genome, Science 291, 130451.
VENTURI M, HUNTE C. 2003. Monoclonal antibodies for the structural analysis of the
Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli, Biochim Biophys Acta Biomembr 1610, 4650.
VENTURI M, SEIFERT C, HUNTE C. 2002. High level production of functional antibody
Fab fragments in an oxidizing bacterial cytoplasm, J Mol Biol 315, 18.
VERSTUYFT C, SCHWAB M, SCHAEFFELER E, KERB R, BRINKMANN U, JAILLON
P, et al., 2003, Digoxin pharmacokinetics and MDR1 genetic polymorphisms. Eur J Clin
Pharmacol 58, 80912.
VOGT A, ADACHI T, DUCRUET AP, CHESEBROUGH J, NEMOTO K, CARR BI, LAZO
JS. 2001. Spatial analysis of key signaling proteins by high-content solid-phase cytometry in Hep3B
cells treated with an inhibitor of Cdc25 dual-specificity phosphatases. J Biol Chem 276, 2054450.
VOGTHERR M, PETERS P. 2000. Application of NMR based binding assays to identify key
hydroxy groups for intermolecular recognition, J Am Chem Soc 122, 60939.
WARREN MK, ROSE WL, BEALL LD, CONE J. 1995. CD34+ cell expansion and
expression of lineage markers during liquid culture of human progenitor cells. Stem Cells 13, 167
74.
467
WEINBERGER SR, DALMASSO EA, FUNG ET. 2002. Current achievements using Protein
Chip Array technology. Curr Opin Chem Biol 6, 8691.
WELSH S, KAY SA. 1997. Reporter gene expression for monitoring gene transfer. Curr Opin
Biotechnol 8, 61722.
WHITE MA. 1996. The yeast twohybrid system: forward and reverse. Proc Natl Acad Sci
USA 93, 100013.
WORMHOUDT LW, COMMANDEUR JN, VERMEULEN NP. 1999. Genetic
polymorphisms of human N-acetyltransferase, cytochrome P450, glutathione-S-transferase, and
epoxide hydrolase enzymes: relevance to xenobiotic metabolism and toxicity. Crit Rev Toxicol 29,
59124.
WUTTKE H, RAU T, HEIDE R, BERGMANN K, BOHM M, WEIL J, et al.2002. Increased
frequency of cytochrome P450 2D6 poor metabolizers among patients with metoprolol-associated
adverse effects. Clin Pharmacol Ther 72, 42937.
XING H, TRAN H, KNAPP TE, NEGULESCU PA, POLLOK BA. 2000. A fluorescent
reporter assay for the detection of ligands acting through Gi protein-coupled receptors. J Recept
Signal Transduct Res 20, 189210.
XING H, TRAN HC, KNAPP TE, NEGULESCU PA, POLLOK BA. 2000. A fluorescent
reporter assay for the detection of ligands acting through Gi protein-coupled receptors. J Recept
Signal Transduct Res 20, 189210.
XU JZ, WANG X, ENSIGN B, LI M, WU L, GUIA A, XU J. 2001. Ion-channel assay
technologies: quo vadis? Drug Discov Today 6, 127887.
ZABIN I. 1982. A model of protein interaction. Mol Cell Biochem 49, 87 96.
ZAIGLER M, TANTCHEVA-POOR I, FUHR U. 2000. Problems and perspectives of
phenotyping for drug-metabolizing enzymes in man. Int J Clin Pharmacol Ther 37, 19.
ZANGER UM, FISCHER J, RAIMUNDO S, STUVEN T, EVERT BO, SCHWAB M, et al.
2001. Comprehensive analysis of the genetic factors determining expression and function of hepatic
CYP2D6. Pharmacogenetics 11, 57385.
ZANGER UM, RAIMONDO S, EICHELBAUM M, 2004. Cytochrome P450 2D6: overview
and update on pharmacology, genetics, biochemistry. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol
369:23-37.
ZHANG H, HASTY P, BRADLEY A. Targeting frequency for deletion vectors in embryonic
stem cells. 1994. Mol Cell Biol 14, 240410.
ZHOU H, TONG Z, MCLEOD J F, 2004. Cocktail approaches and strategies in drug
development: valuable tool or flwedscience? J Clin Pharmacol 44:120-134.
ZHOU P, LUGOVSKOY AA, WAGNER G. 2001. A solubility-enhancement tag (SET) for
NMR studies of poorly behaving proteins. J Biomol NMR 20, 114.
ZHU HJ, BURGESS AW. 2001. Regulation of transforming growth factor-beta signaling.
Mol Cell Biol Res Commun 4, 32130.
ZHU M, FAHL WE. 2000. Development of a green fluorescent protein microplate assay for
the screening of chemopreventive agents. Anal Biochem 287, 2107.
ZLOKARNIK G, NEGULESCU PA, KNAPP TE, MERE L, BURRES N, FENG L,
WHITNEY M, ROEMER K, TSIEN RY. 1998. Quantitation of transcription and clonal selection of
single living cells with beta-lactamase as reporter. Science 279, 848.
ZSCHIESCHANG P, HIEPE F, GROMNICA-IHLE E, ROOTS I, CASCORBI I., 2002. Lack
of association between arylamine N-acetyltransferase 2 (NAT2) polymorphism and systemic lupus
erythematosus. Pharmacogenetics 12, 55963.
ZUHLSDORF MT. 1998. Relevance of pheno- and genotyping in clinical drug development.
J Clin Pharmacol Ther 36, 60712.
468
469