Técnicas Histológicas

A técnica histológica visa a preparação dos tecidos destinados ao estudado à

microscopia de luz. O exame ao microscópio é feito geralmente por luz transmitida, o
que significa que a luz deve atravessar o objeto a ser examinado. Assim, é necessária a
obtenção de fragmentos dos tecidos que serão coletados em lâminas muito finas e
transparentes.

Visão Geral do Processamento de Tecidos

Os tecidos a serem processados para estudo ao microscópio devem ser preparados de

modo a preservar sua estrutura original ao máximo possível. Entretanto, isso não é
possível e todos os preparados apresentam artefatos, que são alterações produzidas nas
células pelas técnicas utilizadas. Podemos resumir os passos das técnicas histológicas
com a seguinte seqüência: fixação dos tecidos, desidratação, inclusão, microtomia (corte
em fatias finas), coloração e montagem de lâminas. Essas etapas serão descritas adiante.

OBTENÇÃO DO MATERIAL E FIXAÇÃO

Uma boa preparação histológica se inicia com o uso correto das técnicas de obtenção do
material. Os cuidados devem ser observados já no sacrifício dos animais de laboratório
para o estudo histológico de seus tecidos. Em se tratando de animais de laboratório o
sacrifício pode ser obtido através de técnicas como, traumatismo brusco, intoxicação
(overdose de anestésico) e perfusão/imersão.

Objetivos da fixação

A fixação paralisa o metabolismo celular e preserva as estruturas do tecido para os

tratamentos posteriores. A fixação evita a autólise celular, impede a proliferação de
microorganismos, leva ao endurecimento do tecido para que resista ao tratamentos
posteriores. O fixador deve causar o mínimo de dano ao tecido e produzir o mínimo de
artefatos. A escolha adequada da solução fixadora irá variar de acordo com o material
que irá ser usado para a inclusão. A solução de glutaraldeído 2,5% em tampão fosfato
0,1M, pH 7,4 ou a solução “formalina neutra tamponada” (NBF) são comumente
usadas. Os fixadores preservam a estrutura dos tecidos ao interagirem com os grupos
aminos das proteínas, através de pontes de hidrogênio. O glutaraldeído possui dois
grupos aldeídos um em cada extremidade de sua estrutura molecular que podem
estabelecer pontes de hidrogênio entre as proteínas. As moléculas de formaldeído, no
entanto, possuem apenas um grupamento aldeído, sendo um fixador menos eficiente
para alguns tipos de proteínas.

A técnica da perfusão para lavagem e fixação do tecido.

Usando anestesia profunda, em ratos e camundongos por exemplo, uma técnica que
resulta em boas preparações consiste na perfusão cardíaca. Este método simula o
funcionamento do sistema circulatório, uma vez que injeta os vasos do espécime com
soluções químicas e perfunde os tecidos. O processo consiste inicialmente na retirada da
circulação sanguínea através de lavagem feita com uma solução salina de pH neutro.
Posteriormente, processa-se então a fixação através da injeção de solução fixadora. Em
ambos os casos, as soluções são impulsionadas nos vasos através de tubos que se
conectam à uma bomba peristáltica e à um grande vaso do animal a ser perfundido, com
o arco aórtico por exemplo. Neste ponto, é importante regular a pressão de injeção da
solução, que não pode exceder a pressão do sangue, pois de outro modo, artefatos por
fixação são produzidos. Outro fator importantíssimo para que a técnica da perfusão seja
bem sucedida é a ausência de sangue coagulado nos vasos. Para evitar esse imprevisto, é
conveniente administrar heparina diluída a 1:50 (Liquenine) ao animal 10 minutos antes
da etapa de sacrifício. A filtração criteriosa das soluções também é um cuidado que
evita a obstrução dos pequenos vasos e o consequente iimpedimento do fluxo da
solução através dos tecidos.

A técnica de fixação por imersão

Além da perfusão cardíaca, pode-se também recorrer à fixação por imersão, ainda muito
utilizada. O volume de fixador empregado deve ser 15 a 20 vezes maior que o volume
do fragmento de tecido a ser fixado. O fixador inicia a sua ação da periferia para o
centro do material. As porções periféricas do material são primeiramente fixadas em
relação as suas porções mais internas. A boa penetração de qualquer fixador está
diretamente relacionada ao tamanho e espessura do material. Entretanto, de acordo com
o tipo de tecido, com a fixação de um encéfalo, por exemplo, a fixação por imersão
seria um método condenável, devido à dificuldade de penetração da solução. Para estes
casos sugere-se recorrer ao método da perfusão.

Protocolo Soluções

DESIDRATAÇÃO , INCLUSÃO E MICROTOMIA

Objetivos

Para a observação ao microscópio de luz a espessura da secção do tecido presente em

uma lâmina deve ser delgada o suficiente para que possa ser atravessado por um raio de
luz. Para tal os tecidos devem ser criteriosamente preparados para receber um meio
endurecedor, ou seja meio de inclusão. Desta forma será possível a obtenção de cortes
delgados, obtidos no processo de microtomia.

Tipos de inclusões e a importância da desidratação

A inclusão pode ser feita utilizando a parafina (mais comumente usada) e as resinas
plásticas, como o glicol metacrilato. Após a fixação com as soluções aquosas de
glutaraldeído ou formalina, os tecidos devem ser desidratados, uma vez que a água
presente nos tecidos não é miscível em substancias apolares como a parafina e as resinas
de inclusão. A desidratação será feita através de imersão numa bateria de soluções
alcoólicas em concentrações graduais e crescentes. A graduação pode ser iniciada, se
necessário, a partir de 50% e terminando finalmente em álcool absoluto. A graduação
nas concentrações é imprescindível para que ocorra a desidratação homogênia dos
tecidos, evitando que ocorram danos na estrutura tecidual.

Algumas particularidades podem ser citadas quanto ao material de inclusão. caso de

parafinas, o tecido deve ser tratado com uma substância de transição. A inclusão em
parafina é precedida pelo uso de substâncias químicas como o xilol, este miscível tanto
em álcool quanto em parafina. Após a remoção do álcool, o tecido passa por uma
infiltração em parafina líquida, esta mantida em estufa a 56°C (ponto de fusão) e
posteriormente o mesmo é transferido para o molde contendo parafina líquida. Em
poucos minutos a parafina endurecerá e obter-se-á portanto, o "bloco" de parafina
contento o fragmento do tecido em seu interior. No caso da inclusão em resina como o
glicol metacrilato, o tecido é infiltrado com uma resina de infiltração por uma noite, e
então incluído no molde contendo a resina ainda líquida, sendo que esta endurece após
algumas horas. Como no caso da parafina, após o endurecimento, obtém-se um bloco de
resina que contém o fragmento de tecido em seu interior. Os blocos serão a partir desta
etapa levados para a microtomia e consequente obtenção das secções, que serão então
coletadas em lâminas de vidro. No caso de inclusão em parafina, após a microtomia, o
tecido é tratado com xilol novamente para remoção da parafina e rehidratado, para que
possa ser submetido à coloração.

Protocolo de inclusao para parafina e metacrilato

COLORAÇÃO

Objetivo da coloração

Os cortes de tecidos apresentam-se incolores após a microtomia. A coloração visa

contrastar as estruturas teciduais. A ação da maioria dos corantes se baseia na interação
entre os radicais ácidos ou básicos dos elementos químicos dos mesmos com os dos
tecidos. No entanto existem outros tipos de corantes, como será descrito adiante.

Corantes Ácidos e Básicos

Eosina e Hematoxilina: A hematoxilina é um corante básico que carrega uma carga

positiva na porção da molécula que irá conferir cor ao tecido. Corantes básicos reagem
com componente aniônicos das células e tecidos, os quais incluem grupos fosfatos,
ácidos nucléicos, grupos sulfatos de glicosaminoglicanas e grupos carboxila das
proteínas. A habilidade de grupos aniônicos reagirem com corantes básicos é chamada
basofilia, estruturas celulares que se coram com corantes básicos são denominadas
basófilas. Estruturas celulares que podem ser coradas com corantes básicos incluem
heterocromatina, nucléolo, RNA ribossômico, matriz extracelular da cartilagem. A
hematoxilina cora geralmente as estruturas em azul. Corantes ácidos reagem com
componentes catiônicos das células e tecidos. Quando usados juntamente com corantes
básicos como a hematoxilina, coram o citoplasma, filamentos citoplasmáticos e fibras
extracelulares. A eosina geralmente cora as estruturas em vermelho ou rosa.

Outros exemplos:corantes ácidos: fucsina ácida, azul de anilina e orange G; básicos:

azul de metileno, verde metil e azul de toluidina.

Outras técnicas de coloração

Hematoxilina e eosina são corantes adequados para evidenciar características
estruturais, mas eles não são capazes de revelar todos componentes celulares. Outras
técnicas de coloração são disponíveis para evidenciar diferentes componentes.

Coloração pela prata – Algumas substâncias intra e extracelulares promovem a redução

do nitrato de prata que formam precipitados negros em estruturas como fibras
reticulares dos linfonodos, por exemplo.

Associação de corantes - É a somatória de corantes diferentes, como o Tricrômico de

Gomori, que usa verde luz, cromotropo 2R e hematoxilina

Após a coloração as lâminas são montadas ou seja, os fragmentos são protegidos pela
cobertura com lamínulas de vidro. Esta é colada na lâmina através de substâncias
selantes como por exemplo o Entellan. Após a secagem, as lâminas podem ser
observadas ao microscópio de luz.