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INMOVILIZACIN DE CLULAS

INTRODUCCIN

En la actualidad los pases desarrollados experimentan grandes avances en el campo

cientfico y particularmente en el campo de la biotecnologa. En el Per existen pocos
trabajos al respecto .No obstante, el inters de muchos investigadores en el estudio de
inmovilizacin celular como tcnica de aplicacin de la biotecnologa ha permitido
desarrollar nuevos mtodos que han vuelto rentables a muchos procesos y productos
industriales por su simpleza y rendimiento
.Dentro de la industria alimentaria, la inmovilizacin de microorganismos en soportes
natural eso sintticos proporciona estabilidad a las funciones celulares. Esta tcnica
permite alcanzar altas concentraciones celulares en volmenes reducidos, as como la
reutilizacin como biocatalizador y la implantacin de sistemas de continuos de
produccin
La inmovilizacin de un biocatalizador consiste en la localizacin de una clula o
enzima en una regin definida de espacio, manteniendo al mismo tiempo una actividad
cataltica deseada. Adems, en el caso concreto de las clulas, esto involucra a su
viabilidad.

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INVOMILIZACION DE CELULAS (BIOCATALIZADORES)

Uno de los principales principios de cualquier sistema con biocatalizadores

inmovilizados data en el transporte de substratos y productos producidos por
mecanismos

difusionales.

El

uso

de

biocatalizadores

para

llevar

cabo

biotransformaciones es un rea de la biotecnologa en continua expansin.

El uso de biocatalizadores para llevar a cabo biotransfomaciones es un rea de la
Biotecnologa en continua expansin. Un aspecto clave del proceso es el uso del
catalizador (clula o enzima) en un sistema continuo que permite extender el uso del
mismo en el tiempo dando como resultado una disminucin de los costos del proceso
y otras ventajas como una mayor pureza del producto, mayor productividad etc.
Tambin se puede pensar en la reutilizacin del biocatalizador en procesos batch.
Para lograr este objetivo los biocatalizadores se inmovilizan. La definicin de la
EuropeanFederation of Biotechnology(1983) aclara el concepto. "Los biocatalizadores
inmovilizados son enzimas, clulas u organelos (o combinacin de ellos) confinados o
localizados en cierta regin definida del espacio, con retencin de su actividad
cataltica y, si es necesario, de su viabilidad, y que pueden ser usados de modo
repetido y continuo.
Es necesario analizar tres de los conceptos incluidos en la definicin:

Confinados o localizados": para cumplir con esta condicin es necesario

formar una fase slida dispersa, macroscpica, de alta densidad y
catalticamente activa, dentro de, o en contact con, un medio reactivo lquido
libre de biocatalizador. Se dice que el biocatalizador est compartimentalizado.
Las caractersticas de la fase slida son tales que el transporte de reactivos
hacia y desde el biocatalizador est gobernado por difsin exclusivamente.
Por la resistencia al transporte difusional se establecen en la partcula
gradientes de concentracin o de pH, con lo que el ambiente que rodea a la
partcula de biocatalizador inmovilizado difiere grandemente del seno de la fase

lquida.
retencin de la actividad cataltica (y viabilidad)": los tratamientos a los que
son sometidas tanto las clulas como las enzimas libres que sern
inmovilizadas afectan en cierto grado la actividad. Si bien es deseable, no es
necesario que se retenga el 100% de la actividad del biocatalizador libre, pero,
para mantener la rentabilidad del proceso, debe alcanzarse un valor que no

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debe ser menor al 25%. En el caso de clulas puede ser necesario mantener la
viabilidad. La inmovilizacin, entonces, debe tratar de ser realizada en

condiciones tales quela prdida de actividad sea reducida.

uso repetido y continuo": surge inmediatamente que la gran ventaja del uso de
biocatalizadores inmovilizados se relaciona con la fcil separacin del
catalizador del medio de reaccin sin prdida de actividad, y por consecuencia
directa, con su reutilizacin. Las clulas o enzimas inmovilizadas pueden ser
separadas fcilmente. Es necesario saber cmo afecta el mtodo de
inmovilizacin la estabilidad del biocatalizador, y por ende la extensin de su
uso repetido.

Las clulas libres en suspensin presentan un rpido decaimiento en su actividad

cataltica; sin embargo, las clulas inmovilizadas presentan una estabilidad mayor, y
por lo tanto la inmovilizacin es un requisito necesario para poder reutilizar las clulas.
El tiempo de vida media, en condiciones operacionales, vara normalmente entre 20 y
50 das.

Un caso particular, ampliamente usado, es aquel en el que se desea efectuar una

reaccin de una sola etapa donde la viabilidad celular no interesa. Mas aun esta se
destruye deliberadamente mediante tratamientos fiscos o qumicos los que tambin
estabilizan la estructura celular. En este caso las clulas no viables actan como
soporte de la actividad cataltica de inters.

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METODOS DE INMOVILIZACION:
Para obtener biocatalizadores inmovilizados que retengan actividad y sean estables es
necesario aplicar un mtodo de inmovilizacin adecuado, que depender del tipo de
actividad cataltica de inters. Existen diversos mtodos para inmovilizar clulas, los
cuales pueden dividirse en:

entrecruzamiento fisico (floculacion).

entrecruzamiento covalente.
adsorcion sobre matrices insolubles
enlace covalente con matrices insolubles.
entrampamiento fisico en materiales porosos.
encapsulamiento.

Segn la ruta seguida para su preparacin los sistemas pueden clasificarse en cuatro:
1. INMOVILIZACIN SIN CARRIER:
es el caso de clulas unidas con otras clulas, tanto por adsorcin o por
uniones covalentes. La floculacin de clulas, durante su fermentacin o por
procesos secundarios mediante variacin en parmetros fisicoqumicos(pH,
fuerza inica) es un proceso de unin por adsorcin. Este proceso puede
ayudarse por el agregado de pequeas cantidades de agentes de floculacin
(polimeros). Es tambin comn eluso de agentes qumicos bifuncionales, tal
como el glutaraldhedo para unir clulas mediante entrecruzamiento qumico.
El caso tpico es la floculacin de algunas cepas de Zymomonasmobilis,
empleadas en la produccin de etanol. El mtodo de inmovilizacin es sencillo,
pues espontneamente se producen flocs cuando se crecen clulas en un
medio adecuado sin agitacin. Los flocs asformados se utilizan como inculo
de medios de cultivo frescos, y pueden ser usados en la produccin de etanol a
partir de glucosa en reactores especialmente diseados. Las clulas
inmovilizadas son retenidas dentro del reactor.
Este mtodo permite alcanzar altas concentraciones celulares, y se lleva a
cabo en condiciones de reaccin suaves, que no perjudican la estabilidad del
biocatalizador. Presenta algunas desventajas: se alcanza una baja resistencia
mecnica frente a la agitacin y a la compresin, hay limitaciones difusionales
al transporte de nutrientes, y est limitado a pocas clases de microorganismos.
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2. INMOVILIZACION DEL BIOCATALIZADOR EN CARRIERS PREFORMADOS:
Es la estrategia tpica en la inmovilizacin de enzimas, especialmente por
medio de enlaces covalentes. La matriz puede generarse sin las limitaciones
en condiciones fsicas y qumicas (temperatura, pH, etc.) impuestas por el
biocatalizador, por lo que pueden mejorarse y optimizarse las caractersticas de
estabilidad mecnica, la estructura porosa del material, la resistencia, etc. En el
caso de clulas, el problema estriba en cmo favorecer la adhesin de las
clulas (relativamente grandes) a las superficies de la matriz, manteniendo la
estabilidad y la resistencia al lavado. La matriz debe presentar poros de mayor
dimetro que la clula para permitir la penetracin a las superficies internas. Se
emplean carriers porosos, que son embebidos por inmersin en suspensiones
celulares. En el caso de enzimas es necesario activar el soporte, mediante la
generacin de grupos reactivos capaces de reaccionar con los grupos amino o
carboxilo libres presentes en la enzima.
3. INMOVILIZACION DURANTE LA PREPARACION DEL CARRIER:
Es la estrategia ms comn en la inmovilizacin de clulas enteras Si bien hay
dos mtodos, entrampamiento y encapsulamiento, este ltimo es de limitada
importancia.
Debido al tamao de las clulas enteras, es relativamente sencillo preparar
redes de porosidadtal que garanticen la completa retencin de las clulas, y
que los procesos de transporte desustratos y productos sean suficientemente
rpidos para obtener alta eficiencia en la actividad cataltica. La dificultad se
encuentra en la bsqueda de condiciones de preparacin de carriers que
cumplan con los requerimientos exigidos para que se retenga la actividad del
biocatalizador y/o la viabilidad celular. Es el mtodo de inmovilizacin ms
usado, debido asu flexibilidad y simplicidad, y a las poco agresivas condiciones
de reaccin (en el caso depolmeros naturales).
4. INMOVILIZACION

POR

CRECIMIENTO

DE

CELULAS

PREVIAMENTEINMOVILIZADAS:
En realidad es un caso particular del criterio anterior. Esta estrategia es
utilizada para aumentar la concentracin de clulas dentro del carrier, por lo
que,evidentemente, slo sirve para inmovilizacin de clulas. Permite
inmovilizar clulas que contienen sistemas multi enzimticos, ya sea en estado
estacionario o en condiciones de crecimiento. La desventaja es, al igual que en
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caso de clulas libres, la existencia de reacciones laterales no deseadas.
Generalmente se realiza por entrampamiento en redesinicas. Es posible
restaurar la actividad cataltica, e inclusive aumentarla. Es un mtodo til para
obtener clulas difciles de inmovilizar como tales, como por ejemplo micelio
celular.
La tcnica en este caso consiste en la inmovilizacin de esporos en matrices
insolubles, los cuales originarn micelio una vez inmovilizados en la matriz.
TIPOS DE CARRIERS.
Lo Carriers son las sustancias implementadas para el soporte de biocatalizadores,
desde el punto de vista qumico; pueden ser divididas en orgnicas e inorgnicas,
teniendo por consiguiente un origen sinttico y/o natural.
Desde el punto de vista qumico, las sustancias usadas para soportar a los
biocatalizadores pueden ser divididas en inorgnicas u orgnicas, y el origen de las
mismas puede ser natural u obtenidas por sntesis.
INORGANICOS:

Naturales: arena, silicatos, arcillas.

Sintticos: vidrios de porosidad controlada, cermicas.

ORGANICOS:

Naturales: virutas de madera, antracita, colgeno, celulosa, alginatos,

carragenatos, albmina.
Sintticos: PVC, polipropileno, poliacrilamida, resinas de intercambio inico,
epxidos, poliuretanos.

La seleccin del material se realiza siguiendo algunos criterios heursticos:

Materiales de alta disponibilidad y bajo costo

Materiales que permitan un proceso de inmovilizacin simple y efectivo

respecto de la retencin de la actividad.

Materiales con alta capacidad y eficiencia
Materiales que permitan un diseo de reactores sencillo.

Los dos primeros criterios apuntan al uso de materiales naturales y que permitan
tcnicas de inmovilizacin por adsorcin. Los dos ltimos criterios dirigen la eleccin
hacia carriers orgnicos complejos. Obviamente la eleccin final deber tener en

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cuenta el biocatalizadr a utilizar, el proceso en el cual va a participar y,
fundamentalmente, el producto que se desea obtener.
De todos los mtodos mencionados se har especial nfasis en aquellos que
involucran la formacin de redes polimricas a partir de prepolmeros de cadena larga,
tales como alginatosy kappa-carragenatos (K-carragenatos). La variedad de sistemas
de este tipo es tan grande que pueden subdividirse segn los mecanismos de
formacin de las redes polimricas:
1. Precipitacin: formacin de red sin reaccin qumica, por separacin de fases.
2. Gelificacin: formacin de redes sin reaccin qumica, por transicin de fase
debida a cambios de pH, temperatura, etc.
3. Gelificacin ionotrpica: formacin de redes con reaccin qumica (intercambio
de iones) debido al entrecruzamiento de cadenas polinicas con contraiones
multivalentes.
4. Entrecruzamiento covalente: formacin de redes con reaccin qumica debida
al entrecruzamiento de polmeros multifuncionales entre s o con reactivos
bifuncionales de bajo peso molecular.
VENTAJAS

El empleo de biocatalizadores inmovilizados representa un gran nmero de

ventajas:
Permite la utilizacin continua del biocatalizador, dado que ste queda
fcilmente retenido en el interior del reactor utilizado, mientras se mantiene en

flujo continuo de entrada y salida de lquido.

Favorece la re-utilizacin del biocatalizador en el caso de reacciones en

discontinuo.
Con la inmovilizacin se puede aumentar sensiblemente la concentracin de
biocatalizador, con respecto a un proceso en el que el mismo se encuentre en

suspensin.
En cuanto a sistemas operando en continuo, stos permiten un aumento en las
productividades de los correspondientes biorreactores, dado que permiten
operara a mayor concentracin de catalizador, (mayor conversin de substrato)

y con caudales ms altos.

En el caso de enzimas inmovilizadas es frecuente observar un aumento de su

estabilidad y su resistencia a la desnaturalizacin y proteolisis.

Permite reducir los efectos de contaminacin accidentales del proceso en las
clulas; dado que la poblacin de clulas contaminantes se encuentran en

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suspensin y en concentracin mucho menor que la poblacin de clulas
inmovilizadas, sta puede ser eliminada mucho ms fcilmente del reactor.

DESVENTAJAS

Por otra parte, la utilizacin de estos biocatalizadores inmovilizados presenta

ciertos inconvenientes o desventajas:

Es necesario tener en cuenta que la actividad de una clula o una enzima
puede quedar directamente afectada por las condiciones a que se lleva a cabo

el proceso de inmovilizacin, perdiendo parte de su actividad o su viabilidad.

La velocidad de difusin de substratos y productos dentro del sistema de
biocatalizadores inmovilizados puede limitar su actividad cataltica y su eficacia,
cuando dicha velocidad sea ms lenta que la velocidad de la transformacin

que se est llevando a cabo.

La inmovilizacin de catalizadores involucra la incorporacin de una nueva
etapa al proceso, y por tanto un aumento de su complejidad, el cual tiene que
verse compensado por aumentos de productividad claros, mejoras en la
separacin entre el producto y el biocatalizador y en tiempos de operacin ms
largos.

En el trabajo prctico se estudiar la inmovilizacin de clulas de levadura con

actividad invertasa en geles de alginato de Ca+2, con el fin de emplearlas en la
hidrlisis de sacarosa.
Por lo tanto, se describirn brevemente los mecanismos de entrampamiento por
gelificacin y por gelificacinionotrpica.
GELIFICACION:
La gelificacin por transicin de fase suele ser promovida por cambios en temperatura
o en pH. Los agentes gelificantes usados tradicionalmente son gelatina y agar, los
cuales promueven una fcil gelificacin pero presentan la desventaja de originar geles
blandos y mecnicamente inestables. Una mejora significativa constituye la
introduccin deK-carragenato, heteroopolisacrico con ~-D-galactosa sulfato y 3,6anhidro a-D-galactosa,soluble en agua a temperaturas entre 40 y 60 C y que gelifica a
temperatura ambiente. Este material permite la formacin de bolillas, bloques y
membranas que pueden ser usados como soporte de biocatalizadores.
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Hay dos reas donde se aplica el K-carragenato:

Conversiones catalizadas por sistemas monoenzimticos, donde pueden

usarse clulas muertas. La matriz es post-tratada con glutaraldehido o

hexametilendiamina, reactivos que estabilizan la actividad cataltica.

Inmovilizacin de clulas vivas, donde hay crecimiento de clulas en la matriz.

GELIFICACION IONOTROPICA:
El sistema ms comn es el entrecruzamiento de alginatos con iones Ca+2. Los
alginatos son polmeros de cido manurnico y gulurnico, solubles en agua a
temperatura ambiente como alginatos de Na+ y que gelifican en presencia de ciertos
iones polivalentes. En general una solucin de alginato de Na+ se deja gotear en una
solucin de CaCl2 obtenindose en tiempos cortos, bolillas esfricas de tamao
controlado y homogneo. Es un mtodo que presenta gran flexibilidad, pues alginatos
de distinto peso molecular y distinta composicin qumica (distintas proporciones de
cidos gulurnico y manurnico) rinden geles de muy buenas caractersticas qumicas
y fsicas. El requerimiento de Ca+2 depende de la composicin qumica del gel. La
concentracin de CaCl2 en la mezcla de gelificacin puede variar entre 0,05 y 2 %. El
rango de temperaturas de operacin va desde 0 hasta 80 C. Las bolillas que se
obtienen presentan dimetros entre 0,1 y 5 mm.y pueden presentar una alta carga
celular por entrampamiento directo (hasta 30 g de clulas hmedas por ml de
catalizador). Este sistema puede someterse a un secado parcial, con lo que el tamao
disminuye y aumenta la estabilidad mecnica sin variacin en la porosidad. La
desventaja que presenta es la inestabilidad frente a ciertos agentes capaces de
secuestrar iones Ca+2 (p. ej.: fosfatos).
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Los puntos destacables de este mtodo son:

Reversibilidad de la gelificacin: obliga a tornar precauciones en cuanto a la

composicin del medio a utilizar, principalmente pH y presencia de agentes que
puedan secuestrar a los contraiones por precipitacin o por formacin de

complejos.
Buena estabilidad mecnica respecto al empaquetado en columna y a la
agitacin.
e Formacin de bolillas regulares, y con tamao controlado.
e Formacin de redes macroporosas, que se conserva an despus del secado

parcial.
Alta capacidad de carga sin prdida de estabilidad mecnica, pero con prdida

de eficiencia debido a resistencias difusionales.

Rendimientos de actividad cataltica de entre 80 y 100% en condiciones de
reaccin controladas.
e Mtodo suave, que permite que las clulas mantengan viabilidad y
estabilidad.

Problemas con la inmovilizacin de clulas

Si bien, el uso de clulas inmovilizadas en matrices solidas ha permitido la
implementacin de procesos de fermentacin en sistemas de flujo continuo.
Existen numerosos problemas que se presentan a nivel industrial, los cuales
se describen a continuacin.
Los sistemas floculados presentan un difcil manejo debido a que la floculacion
depende de factores como el pH, la concentracin de Ca2+, temperatura y la
agitacion Ademas, cadacepa de levadura presenta un comportamiento
diferente.Otro caso, es el uso de membranas microporosas como filtros para
retener las levaduras en el reactor, lo cual resulta muy costoso cuando se
emplean reactores continuos.
El mayor problema que presenta esta tcnica es el bloqueo que
eventualmente sufren los poros de la membrana debido a particulas o a las
mismas levaduras .Por otro lado, la inmovilizacin de clulas por adsorcin
sobre la superficie de materiales es fcil deconseguir, pero al ser la adsorcin
un fenmeno fundamentalmente electrostatico, durante los procesos en
continuo, especialmente por efecto de la agitacin, las clulas se liberan del

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soporte. Adems, por este mtodo es difcil inmovilizar grandes cantidades de
biomasa (Verbelen et al., 2006).

Otros mtodos de inmovilizacin de clulas para procesos de

fermentacin

Si bien, existe una problemtica alrededor del uso de clulas inmovilizadas,

hoy en dia se han enfocado esfuerzos en el desarrollo de rutas novedosas que
permitan el desarrollo de sistemas inmovilizados mediante el uso de materiales
porosos diferentes a los polmeros de origen natural que se han usado hasta
ahora. Muchos de estos slidos porosos podran encontrar un lugar importante
en los procesos de produccion de vinos y fermentaciones alcohlicas en

general.
Las zeolitas y los diferentes zeotipos son materiales microporosos muy usados
en diversos procesos cataliticos,prueba de ello es su extensa aplicacin
.Debido a su tamao de poro pequeo, no seria posibleinmovilizar levaduras
dentro de sus cavidades. Sin embargo, el uso de membranas zeoliticas si
podra ser de granutilidad en procesos de fermentacin en los que se requiere

eliminar el etanol del reactor de forma selectiva .

Para tal aplicacion se podrian emplear materiales zeoliticos hidrofobicos
convencionales como lazeolita beta o materiales hibridos organicos-inorganicos
como

los

metilaluminofosfatos-alfa

ymetilaluminofosfatosbeta

.Cabe

mencionar que la produccion de membranas zeoliticas compactas y con

propiedades mecanicas adecuadas no es sencilla y hoy en dia sigue siendo un
reto para muchos grupos de investigacin. Los materiales mesoporosos

templados mediante aglomeraciones micelares , aunque siguen sin presentar

el tamao de poro adecuado para la inmovilizacin de levaduras, si permiten la

inmovilizacin de enzimas
Esto hace que estos slidos tengan un interes especial en la industria vincola
ya que mediante el uso de enzimas podran modificarse la naturaleza de
algunas sustancias responsables de aromas y sabores caractersticos del vino
consiguindose productos con propiedades organolpticas diferentes.

Los materiales mesoporosos mas adecuados para la inmovilizacin de enzimas

serian los solidos del tipo SBA-15 debido a su gran tamao de poro .La
inmovilizacion de las enzimas se conseguiria por difusin de las mismas en los

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poros del solido previamente funcionalizado con moleculas que anclarian la
enzima a la pared del material Solidos como los que se proponen aqui podrian

usarse en procesos en continuo o en sistemas fluidizados.

La inmovilizacion de levaduras requiere de materiales macroporosos con radios
del orden de algunas micras. Estos materiales pueden sintetizarse mediante

dos tecnicas:
La primera hace uso de esferas sintetizadas por polimerizacion en
microemulsion, que posteriormente son usadas como moldes que se recubren
con precursores de oxidos, metales u otros materiales .Por medio del proceso
de calcinacion de las esferas es posible sintetizar materiales macroporosos de
cavidades esfericas regulares conectados por ventanas de menor tamano.
Mediante esta tcnica seria posible sintetizar biosolidos de gran resistencia
mecanica en los que no habria grandes problemas de difusin de reactivos o
productos. El paso mas complejo de sintesis seria la inoculacin de las clulas
en el interior del solido, ya que aunque los poros pueden ser muy grandes, las
levaduras deben difundir por las ventanas que comunican los poros. La
estructura 3D de canales que estos materiales exhiben podria resultar de
interes para la fabricacin de membranas para la retencin de levaduras en

reactores en continuo.
El segundo mtodo que posee gran potencial es el uso de materiales porosos
sintetizados por congelacin unidireccional y posterior liofilizacion .Esta tcnica
de preparacin de solidos macroporosos, al ser reciente, es la menos
explorada en el campo de la catalisis. Este metodo implica la congelacin de
una solucin de partculas que pueden ser polimericas, siliceas, metalicas etc.
a temperatura de nitrgeno liquido de manera unidireccional y a velocidad
controlada. El proceso que parece complejo, es en realidad un metodo sencillo
de fabricacin de materiales macroporosos que, adems, permite la
incorporacin de especies biologicas in-situ en la matriz durante la sintesis del

material debido a que no se requiere calcinacion de ningun molde organico.

Para inmovilizar bacterias dentro de una matriz polimerica Gutierrez et al.
partieron de una suspensin acuosa concentrada de bacterias E. coli
protegidas con alginato de calcio y glucosa. Las cuales incorporaron a la
suspension alcohol polivinilico y la mezcla se transfirio a una jeringa de
insulina.

Esta se introdujo en un bao con nitrgeno liquido a velocidad controlada (5.9

mm/min) y posteriormente se liofilizo. Durante el proceso de congelacin

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unidireccional se producen frentes de congelacin perpendiculares a la
direccin de inmersin en los que los cristales de hielo apartan las impurezas,
que en este caso serian las bacterias y el alcohol polivinilico.

Una vez eliminado el hielo por liofilizacion se obtiene una matriz porosa de
alcohol polivinilico en la que quedan retenidaslas bacterias. En este caso las
bacterias se recubrieron con alginato-glucosa para protegerlas durante el
proceso de congelacion criogenica. Mtodos similares de proteccin deben
usarse si se pretende inmovilizar sistemas biologicos sensibles al proceso de
congelacin. Otra ventaja de este metodo es que se obtienen monolitos con la
forma y geometria del recipiente que contiene la suspensin que se congela,
en lugar de los clsicos polvos que dan como resultado los otros mtodos de
inmovilizacin. Tambin es posible modular el tamao de poro al jugar con la
relacin masa suspendida/agua de la suspensin a congelar y con la velocidad
de inmersion. De ahi que estos mtodos novedosos de inmovilizacin de
clulas abran un abanico de posibilidades empleando matrices solidas de
diversa naturaleza, y asi de esta forma lograr disear sistemas de fermentacin
que trabajen en reactores continuos.

Asimismo, existen otros mtodos modernos que no requieren del uso de

dispositivos inmovilizadores complejos. Uno de estos mtodos es el uso de
catalizadores artificiales inertes, como los nanotubos de carbono, que inducen
la floculacin de los micro-organismos. Utilizando nanotubos de carbono,
clulas de Saccharomyces cerevisiae han sido inmovilizadas exitosamente por
el mtodo de floculacion . Aunque esta tcnica aporta buenos resultados con
respecto a la inmovilizacin, la sntesis selectiva de nanotubos de carbono

sigue siendo costosa.

Es comn que la inmovilizacin de levaduras y enzimas con los mtodos
mencionados anteriormente enfrenten problemas tcnicos y cientficos. No
obstante, es importante plasmar una visin sobre las expectativas y
potencialidades que tienen estos materiales en el proceso de fermentacin
alcohlica. Por lo tanto, surge la motivacin para realizar investigacin
profunda y novedosa fundamentada en el hecho de que los recientes avances
en la sntesis de micro y nano materiales porosos aun no se han permeado al
campo de la catlisis con levaduras.

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Por lo cual, se abren nuevos horizontes en el area de investigacin y aplicacin

de estos mtodos de inmovilizacin de clulas.

APLICACIONES DE INMOVILIZACION DE CELULAS:

EN FERMENTACION DE VINO (diversos mtodos de inmovilizar clulas de
levaduras)

1. MATERIALES:

2. PROCEDIMIENTO:

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2.1Reactivacin del cultivo Saccharomyces sp.
Se sembr por estra en tubos de agar Sabouraud la cepa de levadura. Incubar a
temperatura ambiente por 3 a 4 das.

2.2 Proliferacin celular

.A partir de la cepa reactivada se sembr por superficie en 1 placa de agar Sabouraud
con la ayuda de un hisopo estril. Incubar a temperatura ambiente por 3 a 4 das.

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2.3 Cosecha de clulas y obtencin del inculo
a. Se coloc 3 ml de solucin salina fisiolgica (al 0.85%) en la placa sembrada y
5 perlas de vidrio estril, se movi suavemente la placa hasta obtener la
suspensin celular, colocamos la suspensin en un tubo falcon estril.

b) Colocar en agitacin a 200 rpm por 18 horas a temperatura ambiente

(procedimiento no ejecutado
c) realizar el recuento celular utilizando la cmara de Neubauer (109 cl/ml).

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2.4. Inmovilizacin de clulas
.a.) Se tom los 3.4 ml. del inculo y se mezcl con 100 ml. de agar-agar fundido a
42C al 3%,(concentracin celular final 10-8cl/ml).

b) Con ayuda de pipetas estriles se tom agar-agar con levaduras (mantenido en

bao mara 42C) se deja caer gota a gota en forma rpida en aceite vegetal,
contenido en un frasco de vidrio sumergido en un recipiente con hielo en forma
permanente.

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C) Las perlas son lavaron con agua corriente y destilada estril en forma sucesiva para
desprender el aceite de su superficie

2.5. Produccin de alcohol utilizando las clulas inmovilizadas.

a.)Se prepar un mosto de fruta de 2000 ml. A este se le agreg las clulas de
levaduras inmovilizadas en agar

agar y se dej fermentar por espacio de una

semana. Se realizaron las evaluaciones diarias determinando consumo de sustrato

(azcar) utilizando un refractmetro (realizar la curva consumo de sustrato/tiempo).

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b) Posteriormente, una vez terminada la fermentacin, las perlas o clulas

inmovilizadas fueron recuperadas del fermento y colocadas en una solucin de
glucosa al 20% (utilizamos agua pasteurizada a 85C).

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3. RESULTADOS
3.1 Evaluacin de la Determinacin de Azcares Reductores.

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3.2 Anlisis Organolptico del Fermento

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DISCUSIN
La inmovilizacin de levaduras disminuye la mayora de los problemas que plantea la
fermentacin utilizando clulas libres. Este sistema tiene la ventaja de poder manejar
la densidad celular, previa al inicio de la fermentacin. Adems, facilita el sistema de
operacin del proceso de fermentacin continua, evitando el paso de eliminar las
levaduras del fermentador. La inmovilizacin celular desacopla el crecimiento
microbiano de los procesos metablicos de inters industrial.
Es as, que diversos grupos de investigacin han empleado este sistema de levaduras
inmovilizadas especialmente del gnero Saccharomyces para la obtencin de variados
productos de inters industrial como el vino por ejemplo. En el laboratorio tras reactivar
e inmovilizar el cultivo de Saccharomyces y ver su capacidad fermentativa, logramos
determinar que los azcares (glucosa y fructosa) del mosto disminuyeron en un 80%,
los cuales han sido empleados por las clulas y esto debido a que ellas necesitan
fuentes carbonadas para su desarrollo.
Durante el proceso de fermentacin, hubo la conversin de los azcares a etanol, que
es el metabolito esperado en estos bioprocesos, sin embargo no se pudo medir los
grados generados en durante el desarrollo de la prctica. Por otro lado no todas las
levaduras se inmovilizaron, ya que hubieron brotes que se filtraron delegar-agar
(debido derrepente a su concentracin) y se consolidaron como clulas libres. Por
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ltimo, la gran ventaja de este bioproceso es que se pueden reutilizar las levaduras
inmovilizadas en el agar-agar, siempre y cuando se le suministre una fuente
carbonada que les permita estar viables para una prxima fermentacin.

CONCLUSIONES

Existe viabilidad de las levaduras inoculadas en el mosto, ya que hubo una

considerable reduccin de azcares y aumento de acidez.

Adicionalmente se registr la presencia de Etanol, caracterstica descubierta en

el anlisis organolptico.

El Agar-Agar al 3% result ser un eficaz inmovilizador celular.

El tiempo es un factor importante cuando se maneja fermentaciones con

clulas inmovilizadas.

La concentracin celular de cada perla fue adecuada para la cantidad de mosto

empleado.

EL aceite comn utilizado fue un buen formador de perlas de agar-agar, debido

a su propiedad hidrofbica.

La inmovilizacin de clulas, este proceso puede ayudar a mejorar la

produccion de alimentos, farmacos, quimicos y bioproductos de interes
cientifico y economico.

los procesos que utilizan levaduras inmovilizadas en soportes gelificantes,

proporcionan la oportunidad de superar los largos tiempos de fermentacin y
maduracin encontrados en las industrias cerveceras tradicionales

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BIBLIOGRAFIA:

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