Sunteți pe pagina 1din 21

Biologie molecular Replicarea ADN

Reparaia ADN L.Rotaru S.Capcelea

REPLICAREA I REPARAREA ADN


Replicarea este procesul fundamental pentru toate organismele vii i reprezint esena
ereditii. Conform modelului complementaritii a lui Watson i Crick, fiecare caten ADN
conine o secven de dezoxiribonucleotide, care activate se aranjeaz complementar(A-T, G-C),
n direcia 53, fiind polimerizate de ADN polimeraze. Fiecare caten ADN servete drept
tipar pentru formarea unei noi catene. Acordarea Premiului Nobel (1959) luiA. Korn'sOchoa i
berg pentru descrierea mecanismului replicrii ADN, explic astzi obinerea celor mai puternice
antibiotice i antivirale care blocheaz replicarea genomului bacterian/viral.
1. Principiile replicrii:
-

Secvena ADN nou sintetizat este complementar cu


catena matri sintez matricial;

Matria este citit n direcia 3 '5' iar sinteza se


realizeaz n direcia 5 '3': monomerii sunt adugai la
captul 3al catenei nou sintetizate de enzima ADNpolimeraza - astfel replicarea se realizeaz antiparalel;

Procesul se realizeaz bidirecional ambele catene


matrie se citesc concomitent i pe baza lor se
sintetizeaz n direcii opuse catene noi;

Sinteza este semiconservativ molecula bicatenar nou


sintetizat conine o caten veche (matria) i o caten
nou-sintetizat (catena fiic);

Sinteza catenelor noi se sintetizeaz semidiscontinuu


(catena lider continuu, iar catena ntrziat
discontinuu, sub forma unor fragmente mai scurte
Okazaki);

Replicarea se realizeaz rapid ( circa 100 nucleotide/sec) i cu mare fidelitate reparativ.

Biologie molecular Replicarea ADN

Reparaia ADN L.Rotaru S.Capcelea

2. Elemente implicate n replicarea ADN


A. Repliconul fragment de ADN ce conineori- originea replicrii;
B. Monomeri i surse de energie :
a. Dezoxiribonucleotide activate : dATP, dGTP, dCTP i dTTP uniti de
polimerizare pentru noile catene de ADN;
b. Ribonucleotide activate: ATP, GTP, CTP i UTP uniti de polimerizare ARN
pentru primer (amorsa);
C. Proteine sintetaze
a. ADN-polimeraze ,, i ;
b. Primaza
c. ADN-ligaza
D. Proteine ce pregatesc matriele
a. Helicaze
b. Topoizomeraze
c. SSB-proteine
E. Proteine ce asigur reparaia replicativ;
a. ADN-polimeraze , , i ;
F. Proteine reglatori ai replicrii.
2.1. Unitatea de replicare a ADNului - REPLICONUL
Replicarea ADN ncepe n situsuri specifice ale genomului numite origini ale replicrii
(ori), la care se fixeaz proteinele de iniiere ale replicrii numit complexul pre-replicativ
(pre-RC);
Secvena ori are urmtoarea structur :
ORE secvena ADN-ului la care se unesc proteinele situs-specifice i proteinele replicrii;
DUE - situsul care uor se despiralizeaz, este sensibil la nucleaze i nesensibil la mutaii;
A/T situsul ce regleaz activitatea helicazei;
AUX-2 i AUX-1 situsuri ce se unesc cu factorii de iniiere ai replicrii cu specificitate nalt.

La nivelul ntregului genom au fost identificate aproximativ 30-50000 de ori, iar repliconii au o
lungime de 2000kb.
Figura1. Particularitile secvenei de replicare
autonom la eucariote.
Originea replicrii ADNului nuclear conine secvene
consens recunoscute de factori reglatori ai ciclului
celular:
ACS (autonomously consensus sequence)
flancate de regiuni libere de histone, secvene
bogate n A/T - DUE( unwinding elements),
recunoscute de ORC (origin recognition
complex).
In perioada G1
ORC interacioneaz cu un complex MCM2-7
formnd pre-RC (complex prereplicativ cu
helicase inactive) ce reine replicarea pn n
perioada S;
n perioada S
complexul pre-RC interacioneaz cu CDK
(Cyclin-Dependent Kinases) ce activeaz
enzimele aparatului de replicare formnd
pre-IC (complex de iniiere a replicrii).

Biologie molecular Replicarea ADN

Reparaia ADN L.Rotaru S.Capcelea

3. Etapele replicrii
Sinteza ADNului ncepe prin despiralizarea/denaturarea catenelor de ADN i formare a
ochiului de replicare. Fiecare caten reprezint o matri pentru catena nou format.
Despiralizarea este necesar pentru expunerea bazelor celor dou catene n aa mod ca noile baze
s le poat recunoate i s formeze perechea complementar. Sinteza decurge bidirecional: de
la fiecare punct de origine se formeaz dou furci replicative n direcii opuse fa de origine.

Figura 2. Etapele replicrii ADN cromozomial

Replicarea necesit un complex proteic numit ORC care recunoate punctul de origine a
acesteia i o iniiaz. Proteina/proteinele de recunoatere se leag de ori i iniiaz despiralizarea
local a ADN n situsul DUE.
Complexul multifermentativ, numit replizoma, se mic de-a lungul ADN-ului i
efectueaz sinteza pe ambele catene ale ochiului replicativ. Replicarea ar putea fi vzut ca
creterea continu a noi catene de ADN n dublul helix. Este necesar de accentuat c:
Citirea matriei se efectueaz doar n direcia 3 5;
Sinteza catenei noi se efectueaz doar n direcia 53.

Biologie molecular Replicarea ADN

Reparaia ADN L.Rotaru S.Capcelea

Figura 3. Etapele replicrii i responsabilii majori de fiecare etap

3.1. Iniierea replicrii ADN include urmatoarele evenimente:


(1.) Recunoaterea regiuni iori de ctre ORC;
(2.) Formarea complexului pre-replicativ (MCM cu dou helicase inactive);
(3.) Activarea helicazelor i ataarea a cite o helicaz pe o monocaten de ADN;
(4.) Formarea replizomei= complex proteic compus din urmatoarele proteine:
o Primaza (ADN pol )
o ADN pol
o Helicaza
o Topoizomeraze
o Proteine SSB
Sub aciunea helicazelor i topoizomerazelor dublul helix este despiralizat i denaturat,
iar catenele sunt separate temporar formand furca de replicare. Dup legarea helicazei,
proteinele SSB (single-stranded DNA binding) stabilizeaz ADN-ul monocatenar din furca de
replicare, ceea ce impiedic remperecherea bazelor complementare i refacerea spontan a
dublului helix. Din fiecare origine de replicare pleac dou furci de replicare care se ndeprteaz
de locul de origine, desfcnd dublul helix de ADN pe msur ce nainteaz. Deci, replicarea
ADN-ului este bidirecional.

Figur 4 Iniierea replicrii - formarea ochiului replicativ.

Biologie molecular Replicarea ADN

Reparaia ADN L.Rotaru S.Capcelea

Figura 5. Sinteza ARN-primer.

Iniierea replicrii - sinteza ARN-primer;


o un complex de proteine Primozomul format din helicaz i primaz se deplaseaz
simultan cu furca de replicare i este responsabil pentru sinteza unei secvene de
ARN primer (amors)necesar iniierii replicrii noilor catene ADN.
(6) Inceperea sintezei catenelor noi de ADN, elongnd primerii
o Adugarea dNTP complementar matriei ADN de ctre ADN polimeraza cu
urmtoarele proprieti:
Citirea matrielor are loc doar n direcia 3' 5';
sinteza se produce doar n direcia 5' 3' prin adugarea nucleotidului la
gruparea 3'-OH a pentozei nucleotidului precedent;

(5)

Figura 6. Elongaia replicrii.

3.2. Elongaia include:


mrirea ochiului replicativ i sinteza concomitent i bidirecionat a catenelor noi de ADN:
o de la ORI spre helicaz se sintetizeaz catena nou de ADN continuu de la un singur
primer;
o de la helicaz spre ORI, pe msura mririi ochiului replicativ se sintetizeaz catena
nou discontinuu, din fragmente Okazaki care pornete fiecare de la un primer; se
sintetizeazmai lent i este numit catena ntrziat.

Biologie molecular Replicarea ADN

Reparaia ADN L.Rotaru S.Capcelea

Figura 7. Sinteza bidirecionat a catenelor noi de ADN.

o Catena lider este sintetizat de ADN-polimeraza , iar fragmetele Okazaki ale


catenei ntrziate sunt sintetizate de ADN-polimeraza .

Figura 8. Furca replicativ i replisoma.

3.3. Terminarea-replicarea se oprete atunci cnd se ntlnesc furcile replicative a doi


repliconi vecini. ntr-o faz mai avansat a replicrii primerii sunt ndeprtai de ribonucleaza
H1, att din structura catenei lider, ct i din cea ntrziat, dup care golurile sunt umplute de
ADN polimeraza , iar aceste fragmente sunt apoi unite ntre ele de ctre o ADN-ligaz prin
legturi fosfo-diesterice.

Figura 9. Terminarea replicrii.

Biologie molecular Replicarea ADN

Reparaia ADN L.Rotaru S.Capcelea

Caracteristica principalelor proteine ce asigur replicarea ADNului

ADN-polimeraza catenei lider


sintetizeaz o caten nou de ADN
complementar matriei: citete
nucleotidele catenei iniiale n direcia
3'5' i polimerizeaz dNTPuri n
direcia 5'3'; ncepe de la primer,
alunec de-a lungul matriei dup
helicaz.

Helicaza- denatureaz dublul


helix, scindnd puni de H, ce
permite naintareaADNpolimerazei catenei lider i sinteza
unui nou fragment Okazaki pe
catena ntrziat.
Topoizomeraza despiralizeaz
molecula de ADN, relaxnd dublul
helix ce permite naintarea
helicazei i alungirea furcii
replicative, ochiului replicativ

ADN-polimeraza catenei ntrziate


sintetizeaz mai multe fragmente
Okazaki pentru o caten nou de ADN
complementar matriei: citete
nucleotidele catenei iniiale n direcia
3'5' i polimerizeaz dNTPuri n
direcia 5'3'; ncepe de la primer,
alunec de-a lungul matriei de la
helicaz intetiznd un Okazaki, apoi alt
Okazaki..

Primaza/ ADN polimeraza


sintetizeaz primerii (secvene de
nucleotide ARN) pentru a ajuta
ADN polimeraza s nceap sinteza
catenelor noi de ADN (! ADN
polimeraza nu poate ncepe sinteza
pe loc gol)
Proteinele SSB (singlestrandbindingproteins) stabilizeaz
matriele, menin separate cele dou
catene iniiale i previn formarea
palindroamelor, facilitnd alunecarea
ADN polimerazelor pe matrie.

Biologie molecular Replicarea ADN

Reparaia ADN L.Rotaru S.Capcelea

ADN- helicazele, sunt enzime care hidrolizeaz ATP, producnd ruperea legturilor de hidrogen dintre cele dou
catene parentale ADN;
ADN-topoizomerazele relaxeaz dublul helix, scade numtul de spire/ kpb:

ADN- topoizomeraza I- induc rupturi monocatenare ADN;

ADN topoizomeraza II induc rupturi bicatenare ADN;


Proteinele SSB faciliteaz activitatea ADN-polimerazelor:

Figura 10. Rolul proteinelor SSB


ADN polimerazele - asigur polimerizarea nucleotidelor, sintetiznd o caten nou de ADN numai, n direcia
53. ADN polimeraza nu ncepe sinteza unei catene noi de ADN, ci numai o extinde, adugnd fiecare nou
nucleotid la gruparea 3OH a nucleotidului deja ncorporat. Unele ADN
polimeraze au capacitatea de relectur, verific erorile, nltur ultimul
nucleotid ncorporat greit asigur reparaia replicativ.
Exist 5 tipuri de ADN- polimeraze:
ADN polimeraza sinteza catenei ntrziate i sinteza ARN primer;
ADN polimeraza repararea ADN;
ADN polimeraza sinteza i repararea ADNmitocondrial;
ADN polimeraza - sinteza catenei lider i repararea ADN;
ADN polimeraza - sinteza catenei ntrziate i repararea ADN;
PCNA (Proliferatingcell nuclear activity) complex proteic cu rol de
stimulare a activitaii nucleare, alunecnd pe matria ADN permite
ncorporarea nentrerupt a nucleotidelor n catena nou sintetizat.
Primaza - enzima responsabil de sinteza unei mici molecule de ARN cu
rol de primer a replicrii. Primerul este un fragment oligonucleotidic
ARN de 510 nucleotide, ce ofer ADN polimerazei un capt 3OH liber.
Ribonucleaza H1 (RNaza H1) - enzima ce intervine n degradarea
primerului ARN la finalizarea replicrii.
ADN ligaza - este enzima implicat n refacerea legaturilor fosfo
diesterice i sudarea capetelor ADN din catena nou sintetizat n timpul
terminrii replicrii.

Figura 11. Polimerizarea nucleotidelor i


proprietatea ADN polimerazei de
autocorecie a greelilor de mperechere
a nucleotidelor n timpul replicrii.

Biologie molecular Replicarea ADN

Reparaia ADN L.Rotaru S.Capcelea

4. Modele de replicare
4.1 Replicarea ADN-nuclear
este un proces foarte complex deoarece genomul nuclear este enorm, asociat cu
proteine, cu diferite nivele de compactizare;
se desfoar n condiii stricte numai n faza S a ciclului celular,
este multirepliconic ncepe n mai multe puncte de origine (ori), ce corespund unui
replicon- numit unitatea de replicare independent ADN;

Figura 12. Replicarea ADNului cromozomial asincron i multireplicon.

este asincron regiunile de eucromatin se replic precoce la nceputul fazei S, n timp


ce heterocromatin se replic tardiv la sfritul fazei S;
este multiproteic implic un numr mare de proteine i enzime numit replizom sau
aparat de replicare;
O particularitate a replicrii ADN
eucariotic este c captul 5 al catenei noi
este mai scurt, deoarece nu exist
posibilitatea completrii golului dup
nlturarea primerului ultimului fragment
Okazaki. Astfel apare riscul ca n
succesiunea generaiilor de molecule s se
scurteze cromozomii, ceea ce ar putea
cauza pierderea informaiei genetice de la
captul lor. Pentru prevenirea pierderilor
de secvene terminale de ADN captul
cromozomului este prevzut cu o structur
special (telomerul) cu un mechanism
propriu de sintez.

Figur 13 Particulatitile terminrii replicrii ADNului crs

Regiunile telomerice ale cromozomilor se replic dup un mecanism special, cu


participarea enzimei telomeraza, format dintr-o protein cu funcie de reverstranscripie
ce conine ARN n calitate de matri.

Biologie molecular Replicarea ADN


4.2. Replicarea

Reparaia ADN L.Rotaru S.Capcelea

telomerelor

Particularitile telomerelor:
Telomerii sunt secvene repetitive de ADN (TTAGGG)n localizate la terminaiile
cromozomilor la majoritatea organismelor eucariote, care asigur protecia i
stabilitatea cromozomilor.
Replicarea ADN la nivelul capetelor cromozomilor este incomplet: la captul 5
al catenei noi sintetizate exist o mic regiune nereplicat;
Telomeraza- enzima ce asigur replicarea ADN telomeric i repar telomerele.
Telomeraza este format din:
Revers-transcriptaza
telomerazic
TERT(complex proteic);
O molecul de ARN telomerazic TERC cu
lungimea de 451 n., ce include o scurt regiune
complementar cu repetiia telomeric: la om 5 CAAUCCCAAUC 3;
disckerina(DKS1) proteina ce asigur
foldingul i stabilitatea Revers-transcriptazei.

este activ n celulele germinale i la embrion, se


inactiveaz postnatal (excepie celulele stem) ;
extinde capul 3 al catenei ADN parentale ;
nu necesit primer separat,folosete capul 3-OH al catenei parentale;
pe post de caten matrif olosete ARN-ul propriu ;
se desprinde de pe catena ADN, se deplaseaz spre capul 3 i se reaeaz repetnd
elongarea 3'.
Replicarea telomerelor:
(1.) Telomeraza se aeaz cu ARN-ul propriu
n regiunea de complementaritate a monocatenei
ADN de la capul 3-OH;
(2.) Telomeraza extinde aceast monocaten
ADN, folosind drept primer captul 3-OH al
acesteia, iar drept matri propriul ARN;
(3.) Telomeraza repet de multe ori acest
ciclu,
alungind
la
captul
3multerepetiii[TTAGGG ];
(4.) Telomeraza se desprinde complet;
(5.) Captul 5 este extins, pe modelul unei
catene ntrziate, de ctre o ADN polimezaz
obinuit.
n final, la eucariote cromozomii au capul 3
extins, prelungit monocatenar.
Figur 14 Replicarea telomerilor

10

Biologie molecular Replicarea ADN

Reparaia ADN L.Rotaru S.Capcelea

4.3. Replicarea ADNmit


Se realizeaz pe parcursul interfazei, nu este limitat n faza S;
Deoarece ADN mitocondrial are structur inelar, fiecare caten conine un cte
un situs de iniiere (ori);
Enzima polimerazic ADN polimeraza, care sintetizeaz n direcia 5' 3'
prin adugarea nucleotidului la gruparea 3'-OH a pentozei i citirea are loc doar
n direcia 3' 5'; ADN polimeraza este ajutat de helicaze, topoizomeraze,
primaz, SSB proteine, ARNaza H1, ADN-ligaza.
Replicarea este asincron dup modelul D:
ncepe de pe catena grea (H);
Cnd furca de replicare ajunge la punctual ori al catenei uoare (L) ncepe
replicarea acesteia n sens opus.

Figura 15. Modelul D de replicare a ADNului mitocondrial

11

Biologie molecular Replicarea ADN

Reparaia ADN L.Rotaru S.Capcelea

Particularitile replicrii ADNului bacterian :

Deimecanismul de replicareprocariotic nu se difereniazmult de celeucariot, acestatotui are


niteparticulariti:
Cromozomulbacterianeste un replicon unic, adic are o singursecven de origine a replicrii.
Moleculelecirculare ale procariotelor (nucleoidul, plasmidele) se replica prinmecanismulreplicrii de
tip . Din situsuloripornesc concomitant doufurci replicative, ceeace duce la formareaunor structure
asemntoare cu literagreceasc (teta); cele 2 furci de replicare se ntlnesc la
nivelulsecveneiterspredeosebirecromozomul de tip eucariotcareare o structurlinear, iarcapetelelui
(denumite telomere) se replica diferit de restulcromozomului.

Celemaiimportanteproteine ale aparatului de replicarebacteriansunt:


- Primaza: la bacteriiestedenumitproteinaDnaG;
- Proteinele de iniiere: DnaA, DnaB, DnaCiDnaT
o IniiereareplicriipresupunedetaareasecveneioriC de membranaplasmatic, dupce,
nprealabil, a fostatins o anumitmascelular (denumitmas de iniiere)
inurmaacumulriiuneicantitisubstaniale de fosfolipideacidepefaaintern a
membraneiplasmatice;
- ProteinaDnaB - funcie de helicaz;
- Topoizomeraza la procarioteestedenumit giraza;
- ADN polimerazele I, II i III;
- Proteine SSB.

12

Biologie molecular Replicarea ADN

Reparaia ADN L.Rotaru S.Capcelea

5. Rolul biologic al replicrii


Replicarea ADN-ului reprezint procesul molecular de sintez a doua molecule de ADN
identice prin copierea unei molecule de ADN iniiale. Astfel, fiecare molecul ADN nou format
reprezint o copie a moleculei de ADN parentale, care va conduce la dublarea cantitii de ADN
i transmiterea informaiei ereditare n succesiunea generaiilor de celule i organisme. ADN
nuclear se replic numai n faza S a ciclului celular, iar ADN mitocondrial pe tot parcursul
interfazei. Acest proces se desfoar, de regul, cu mare exactitate i reprezint una din funciile
eseniale ele materialului genetic.

Figur 16 Perioadele ciclului celular i evoluia cromozomilor

Perioada G1 Celula rezultat din mitoz motenete de la celula mam Cromosomi monocromatidieni, decondensai (cromatin);
Perioada S Celula primete semnale mitogene, se activeaz complexele de iniiere a replicrii
i se desfsoar REPLICAREA:
Multireplicon din mai muli ORI concomitent;
Asincron segmentele de eucromatin se replic mai precoce, cele de heterocromatin
spre sfritul perioadei S;
Cromozomii devin bicromatidieni cele dou cromatide surori conin cte o molecul
de ADN identice, ce rmn unite prin centromer pn n Anafaz.
Perioada G2 Celula cu cromozmi bicromatidieni, decondensai se pregtete pentru mitoz:
13

Biologie molecular Replicarea ADN

Reparaia ADN L.Rotaru S.Capcelea

Verificarea dublrii exacte a ADNului cromozomial;


Verificarea i repararea erorilor din moleculele nou sintetizate de ADN;
Acumularea factorilor necesari desfurrii mitozei.
Mitoza diviziunea ecvaional a celulei somatice:
Profaza condensarea cromatinei i transformarea ei n cromozomi, maximal
condensai i bicromatidieni; disocierea anvelopei nucleare; interaciunea cromozomilor
cu fusul mitotic;
Metafaza alinierea cromozomilor bicromatidieni la ecuatorul celulei;
Anafaza clivarea centromerului, separarea cromatidelor surori spre poli opui ai
celulei;
Telofaza cromozomii monocromatidieni ajung la polii celulei, decondenseaz (se
transform n cromatin); se reface anvelopa nuclear pentru doi nuclei genetic identici.
Citochineza separarea citoplasmei cu formarea a dou celule fiice.
Astfel replicarea :
A. Asigur sinteza matricial a moleculelor de ADN cu dublarea exact a IG;
B. Dublarea exact a IG determin transmiterea IG:
i. Altor celule prin mitoz sau
ii. Altor generaii prin mitoz i fecundaie;
C. Transmiterea IG din generaie n generaie asigur autoreproducerea celulelor /
organismelor i st la baza ereditii caracterelor de familie, de populaie, de specie.

14

Biologie molecular Replicarea ADN

Reparaia ADN L.Rotaru S.Capcelea

6. Reparaia ADN
Leziunile ADN-ului celular sunt frecvente i se produc n orice perioad a interfazei, n
timpul replicrii normale sau independent de ea. Defectele din ADN sunt supuse procesului de
reparare care scade probabilitatea de apariie a mutaiilor, iar acurateea replicarii este critic
pentru transmiterea informaiei genetice. n corpul uman secvena i structura ADN-ului sunt
deteriorate cu o rat de 10 000 1 000 000 leziuni moleculare / zi / celul 0,000165% din
genomul unei celule umane este afectat zilnic.
Repararea este proprietatea unic a moleculelor de ADN de a-i restabili structura
primar, iniial.
Repararea ADN este reprezentat de un complex enzimatic capabil:
S identifice greelile din ADN proteine de recunoatere;
S nlture fragmentul de ADN cu eroare - endonucleaze;
S sintetizeze un nou fragment ADN-polimeraza;
S integreze fragmentul n macromolecula de ADN bicatenar - ADN-ligaza.
Principiile de realizare a repararii ADN:
Matricial - una din catenele ADN este matri n timpul reparrii celeilalte catene de
ADN;
Complementar catenei matri.
Mecanismele posibile de producere a erorilor n moleculele de ADN
erori de replicare a ADN, prin mperecheri greite (mismatch) a nucleotidelor n
catena nou sintetizat.
leziuni provocate n ADN de factori mutageni exogeni sau endogeni (fizici sau chimici
sau biologici)
- dezaminare,
- depurinare,
- demetilare.
Leziunile la nivelul ADNului pot apare:
la nivelul structurii primare a moleculei de ADN prin
modificarea chimic a bazelor azotate (dezaminarea, oxidarea, etc.);
nmerecherea incorect a bazelor azotate;
depurinizarea nucleotidelor.
la nivelul structurii secundare a moleculei de ADN
afecteaz mpachetarea ADN-ului cu histone;
ruperea catenelor de ADN (cu rearanjarea incorect a fragmentelor, deleii,
inserii).
6.1 FACTORI CE INDUC LEZIUNI LA NIVELUL ADNului:
Factori endogeni:
replicarea eronat a ADN-ului;
transpozonii (inserii n regiunile codificatoare sau reglatoare ale genelor);
speciile reactive de oxigen generate prin procesele oxidative normale
respiraie, generare ATP.
Factori exogeni:
Ageni chimici reactivi (modificarea bazelor azotate, mperechere greit);
Analogi de baze (mperechere greit);
Ageni de intercalare (mperechere greit);
radiaia UV (200 400 nm) emise de soare sau din surse antropice (apariia
dimerilor pirimidinici);
15

Biologie molecular Replicarea ADN

Reparaia ADN L.Rotaru S.Capcelea

radiaiile X sau Gamma ( ruperea catenelor de ADN)


temperatura ridicat (depurinizarea pierderea bazelor purinice);
toxine de origine vegetal, animal sau fungice aflatoxinele (depurinizare,
afecteaz eficiena reparaiei, produc specii reactive de oxigen ce duc la
mperecheri eronate de baze azotate);
Virui (inserii n regiunile codificatoare sau reglatoare ale genelor);
Metalele As (arsenium), Cd (cadmiu), Cr (crom), Ni (nikel) pot induce
apariia radicalilor liberi ce modific bazele azotate, pot afecta desfurarea
reparaiei).

In structura normal a ADNului bazele azotate se afl sub forma tautomeric: keto sau
amino. In unele condiii, care se ntalnesc mai rar acestea pot trece in formele enol i imino, prin
deplasarea unui proton (H+) ce pot forma mperecheri greite: C-A (forma rar), T-G (forma
rar).
Alchilarea bazelor poate induce mperecherea greit a bazelor
Agenii de intercalare (proflavina, acridin-oranj) se intercaleaz ntre perechile de baze
i mimeaz dispunerea acestora. In stare intercalat agenii de intercalare favorizeaz deleiile
sau inseriile.
Razele ultraviolete pot induce formarea dimerilor de T (2 baze de pe aceeai caten
formeaz legturi covalente). Aceste legturi pot fi de tip C5-C6 cu formare de structur de tip
ciclobutil sau pot fi de tip C4-C6.

Figura 17. Formarea dimerilor de Timin sub aciunea UV.

16

Biologie molecular Replicarea ADN

Reparaia ADN L.Rotaru S.Capcelea

Aflatoxina B1 este un carcinogen puternic descoperit prima data la alune infectate cu


ciuperci. Aflatoxina B1 se leag de N7 a guaninei, care cauzeaz ruperea legturii glicozidice
dintre baz i pentoz, astfel rmane un situs apurinic.

Figura 18. Depurinizarea Guaninei i consecinele asupra replicrii ADNului

Modificarea bazelor poate avea loc prin reacii de dezaminarea a altor baze. Dezaminarea C are
ca rezultat formarea U. Uracilul poate forma legturi de H cu A, iar la replicarea ulterioar a
ADN pe catena nou sintetizat in locul G va fi A. In unele cazuri (forma ionizat a U) poate
forma legturi de H si cu G. Dezaminarea 5-metil citozinei (se presupune c 5-metil-C particip
la inactivarea genelor) va avea ca rezultat o T.

Figura 19. Dezaminarea Citozinei.

Erorile datorate replicrii (introduse de ADN polimeraz) sunt rare, 1 la 100 mln
pb.Toate organismele posed mecanisme de reparare a ADN. Mitocondria nu posed mecanisme
de reparare a ADN, acest fapt explic rata mare a erorilor n ADNmt.
17

Biologie molecular Replicarea ADN

Reparaia ADN L.Rotaru S.Capcelea

6.2 TIPURI I MECANISME DE REPARAIE A ADNului:


Reparaia erorilor de mperechere a nucleotidelor din cursul replicrii
(mismatch repair = MMR)
Reparaia bazelor /nucleotidelor modificate dup replicare:
excizie a bazelor
(BER)
excizia nucleotidelor (NER)
Reparaia rupturilor ADN (sistemul HR)

Mecanismele de reparare (MMR, BER, NER) difer prin inta lor dar modul de aciune
este asemntor (implicnd multiple gene i enzime mutator); Enzimele de reparare
sunt codificate de anumite gene (MSH, MLH, PMS) numite i gene mutator
Mutaiile acestor gene predispoziie la cancer.

Figura 20. Mecanisme de reparaie a leziunilor din ADN i factorii proteici specifici fiecrui tip de reparaie
concordant cu tipul defecturlui. Abrevieri: AGT, O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase; ATM, ataxia
telangiectasia mutated; BER, base excision repair; DR, direct repair; GG-NER, global genome NER; HR,
homologous recombination; 06MeG, O6-methylguanine; MMR, mismatch repair; NER, nucleotide excision
repair; NHEJ, non-homologous end joining.

Etapele reparaiei:
recunoaterea defectului din molecula de ADN (biomarcatori specifici erorii);
excizia fragmentului de ADN modificat (endonucleaza)
ndeprtarea i degradarea fragmentului (helicaza, exonucleaza)
refacerea, sinteza secvenei normale (ADN polimeraze) = reparare
legarea secvenei sintetizate n catena reparat ( ADN ligaza)

18

Biologie molecular Replicarea ADN

Reparaia ADN L.Rotaru S.Capcelea

Reparaia erorilor de mperechere a nucleotidelor mismatch repair = MMR


n cursul replicrii se produc frecvent erori de mperechere (mismatch) cu frecvena
de 1:10.000 nucleotide = 10-4 ce determin mutaii. Organismul uman are posibilitatea
coreciei lor. Rata mutaiilor este meninut la un nivel sczut (10-10) prin intervenia unor
mecanisme de recunoatere i reparare a leziunilor (controlul calitii ADN). Aciunea lor
este cuplat cu mecanismele de control a progresiei prin ciclul celular i cu apoptoza G1 Go
reparare G1 sau apoptoz. Dac NU au o eficien absolut n final, se produce o
mutaie nou la fiecare replicare / diviziune celular.
Repararea bazelor nepotrivite nucleotidele
ncorporate greit n timpul replicrii formeaz o bucl,
enzimele reparatorii excizeaz nucleotidul incorect, iar
ADN polimerza il adaug pe cel corect, legtura
fosfodiesteric este refcut de ctre ADN ligaz. Aceste
mperecheri greite se ntalnesc mai des n regiunile cu
secvene repetitive, ADN polimeraza introduce erori mai
des n cazul acestor secvene. Secvenele repetitive sunt
frecvente n genomul uman (mini i microsateliii). ADN
polimerazele recunosc erorile de mperechere (prin variaia
diametrului moleculei de ADN) i le corecteaz iar
numrul erorilor scade de la 10-4 la 10-6.
Mecanismul de proof-reading - eliminarea bazelor
azotate introduse greit de domeniul catalitic al ADNpolimerazei prin intermediul unei activiti 3'-5' exonucleazice a ADN-polimetazei.

Figura 21 Autocorecia erorilor de ctre


ADN polimeraz pe parcursul replicrii

Leziunile la nivelul unei singure catenei de ADN sunt reparate pe baza informatiei de pe catena
complementar prin aciunea unor mecanisme de excizie-reparaie, ce taie secvena cu defect i
resintetizeaz poriunea de ADN dup principiul complementaritaii.

19

Biologie molecular Replicarea ADN

Reparaia ADN L.Rotaru S.Capcelea

Au fost descrise dou tipuri distincte de mecanisme de excizie-reparaie:


A. prin excizia i inseria unei singure baze - base excision repair (BER) se repar
defectele ce afecteaz o singur nucleotid prin urmtoarele etape:
Recunoaterea defectului din molecula de ADN (o baz
modificat, o ruptur monocatenar) de ctre un factor de recunoatere
specific defectului.
nlturarea bazei greite prin aciunea unor glicozilaze i
obinerea unui situs AP;
nlturarea nucleotidei fr baz cu ajutorul unei APendonucleaze;
Completarea golului cu un dNTP complementar catenei intacte
realizat de o ADN polimeraz specific;
Integrarea nucleotidului inserat n catena reparat realizat de o
ADN ligaz.
Figura 22. Reparaia BER

B. prin excizia i inseria uneia sau a mai multor nucleotide - nucleotide excision
repair (NER) repar defectele ce afecteaz una sau mai multe nucleotide prin:
Recunoaterea defectului din molecula de
ADN (dimerului) de ctre un factor de recunoatere
specific defectului.
Clivarea catenei de ADN cu defect de ctre
endonucleaze;
nlturarea fragmentului de 24-32 de
nucleotide ce conine defectul cu ajutorul helicazei;
Completarea golului cu un dNTPuri
complementare catenei intacte de o ADN
polimeraz specific;
Integrarea fragmentului sintetizat n catena
reparat de o ADN ligaz.
Figura 23. Reparaia NER.

20

Biologie molecular Replicarea ADN

Reparaia ADN L.Rotaru S.Capcelea

6.3 ROLUL BIOLOGIC I ROLUL MEDICAL AL REPARAIEI ADNului UMAN


Diferii factori mutageni exogeni sau endogeni, fizici, chimici sau biologici determin
diferite defecte n molecula de ADN. Erorile se pot produce n diferite perioade ale ciclului
celular. Gardienii ciclului celular semnalizeaz defectele, blocheaz evoluia ciclului celular i
activeaz sistemele de reparaie corespunztoare tipului de modificare n molecula de ADN,
pentru evitarea acumulrii i transmiterii acestora altor generaii de celule. n caz c reparaia nu
s-a produs celula este ncurajat s-i activeze mecanismul de apoptoz. Dac celula nu poate
realiza reparaia i evit apoptoza mutaiile se acumuleaz, se transmit altor generaii de celule
perturbnd dezvoltarea sau producnd clone tumorale (cancere).

Figura 24. Abbrevieri: cis-Pt and MMC, cisplatin and mitomycin C, respectively (both DNA-cross-linking agents); (64)PP
and CPD, 64 photoproduct and cyclobutane pyrimidine dimer, respectively (both induced by UV light); BER and NER,
base- and nucleotide-excision repair, respectively; HR, homologous recombination; EJ, end joining.

21