Metoda HPLC i LC-MS/MS de determinare a benzoatului de sodiu n alimente i

buturi

Introducere
Aditivi alimentari, avnd proprieti antimicrobiene, antioxidante sunt utilizati drept
conservani n diverse alimente pentru a preveni dezintegrarea lor. Benzoatul de
sodiu i de sorbat de potasiu sunt utilizate pe scar larg pentru a pstra alimente
prelucrate, cum ar fi suc de fructe, sifon, sos de soia, ketchup etc inhiband
creterea de mucegai, evitarea alterarii i pstrarea prospeimii produselor.
Dei acesti conservani sunt utilizati legal n alimente, acestia pot fi duntoari dac
absorbia de ctre organism este mai mare dect limitele autorizate, provocand
reacii alergice, urticarie i astm. Astfel, au fost puse n vigoare cteva regulamente
privind limitarea utilizrii lor . n ceea ce privete utilizarea de benzoat i sorbat n
alimente procesate, FDA a permis lor limit maxim ca 0,1% i 0.1-0.2%, precum i
nivelele maxime de benzoat i sorbat ca 200 mg/L la 2 000 mg/L pentru diferite
alimente prelucrate.
Pentru a putea verifica concentratiile existente in aceste produse alimentare, de-a
lungul anilor,s-au folosit mai multe metode, printre care si cromatografia lichide de
inalta presiune HPLC, si LC-MS/MS. Ketchup-ul este unul dintre alimente cu o
concentratie crescuta de conservati . Astfel, metoda dezvoltata n acest studiu a
fost aplicata la probele de ketchup i am raport aici un nou i rapid LC-UV metoda
pentru determinarea benzoatul de sodiu i sorbat de potasiu n ketchup.

Au fost folosite in paralel doua metode:

1.1Aparatura folosita
a.HPLC UV cromatografie lichida de inalta presiune in domeniul UV
Analizele au fost efectuate, folosind un system HPLC Agilent 1100 echipat cu o
pompa cuaternara, un auto-sampler cu termostat, un detector lungime de und
variabil, o coloana si un termostat de prob i o statie software Chem.
Au fost efectuate separrile cromatografice, folosind ACE-121-1504 C18 HPLC
coloana (15 cm x 3,9 mm I.D., 5 ml). Faza mobil a constat intr-o solutie tampon
de acetat de amoniu: acetonitril (72:28, v/v). Tampon acetat a fost pregtit cu
0.30 g acetat de amoniu n HPLC cu 900 mL ap i acid acetic galcial pentru a
ajusta pH-ul la 4.20. Soluia tampon de acetat de amoniu a fost filtrata printr-un
filtru de 0,45 lm Millipore Millex-HV. Faza mobil a fost degazata timp de 10 min
n baia ultrasonic nainte de utilizare.
Lungimile de und selectate pentru determinarea Benzoatul de sodiu i sorbat
de potasiu au fost de 225 i respectiv 255 nm. Detectare UV a fost efectuat la
dou lungimi de und simultan la un debit de 1 mL/min. Volumul de injectare a

fost 10 lL pentru toate probele. Temperatura coloanei a fost meninuta constant

la 21 C n timpul rularii.
b. metoda cromatografiei lichide cuplata cu spectrometria de masa LC-MS/MS.
In cadrul acestei metode analizele au fost efectuate folosind un instrument
Zivak LC-MS/MS (Istanbul, Turcia), dotat cu o pompa cuaternara cu termostat, un
detector de mas, o coloan i un sistem de termostatare impreuna cu softwareul Zivak LC-MS/MS.
Separrile cromatografice au fost efectuate folosind un phenomenex 150 2 mm,
4 l HPLC coloana. Faza mobil a constat dintr-o solutie tampon de acetat de
amoniu amoniu: metanol (50, v/v). 1 L de 5 mM de acetat de amoniu a fost
preparat prin dizolvarea acetatului de amoniu n ap deionizat i ajustarea pHul la 4.2 folosind acid acetic glacial.
Apoi, 50 mL din aceast soluie tampon a fost diluat cu ap deionizat la 1/4
(tampon: ap, 1:4). Soluie tampon de acetat de amoniu a fost filtrata printr-un
filtru de 0,45 lm Millipore Millex-HV. Faza mobil a fost degazata timp de 10 min
n baia ultrasonic nainte de utilizare. Probele au fost injectate cu un debit de
0,35 mL/min. Volumul de injectare a fost 10 lL pentru toate probele.
Temperatura coloanei a fost meninute constanta la 21 C n timpul rularii.
1.2Prepararea solutiilor standard
Benzoatul de sodiu (25 mg) i sorbat de potasiu (25 mg) au fost cntrite i
transferate ntr-un balon cotat de 25 mL. Coninutul balonului a fost iniial
dizolvat ntr-o poriune de ap de apoi adus la volum final. Apoi, pri alicote de
soluie de primara au fost transferate ntr-un balon de 100 mL i diluat cu
ajutorul fazei mobile pentru a pregti soluii standard cu concentraii diferite,
0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 i 100 mg/L.
Soluiile standard au fost pregtite ca 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 i 100
mg/L pentru analiza LC-MS/MS.
1.3Prepararea probelor
Marci diferite de suc de portocale, suc si ketchup-ul au fost achiziionate.
Probele de suc si sifon au fost centrifugate pentru 5 min i o prob de 1 mL de
supernatant a fost diluat la 10 mL cu faz mobil, filtrate printr-un filtru de 0,45 lm
i injectat n coloan.
Ketchup (20 g) a fost cntrit ntr-un borcan de 100 ml folosind un echilibru calibrat.
Apoi, 60 mL din faza mobil adugat n borcan i vortexed n 5 min. Soluia din
borcan a fost turnata n balonul volumetric de 100 mL i borcanul s-a cltit de dou
ori cu 10 mL din faza mobil, dup care a fost umplut balon cotat la marcaj cu faza
mobil.
Coninutul din balon cotat a fost agitat i amestecat ntr-o baie ultrasonic timp de 3
min. Apoi 1 mL de soluie a fost transferata ntr-un balon cotat de 10 mL si diluat
pana la semn cu faza mobil. n cele din urm, soluia de prob a fost filtrata printrun filtru de 0,45 lm i injectat in coloana HPLC sau LC-MS/MS pentru separaia
cromatografic.
3.1. detectarea limitele, limita de cuantificare i liniaritate
3.1.1. Metode HPLC-UV i LC-MS/MS

Limitele de detectii (LODs) s-au determinat din calculul rapoartelor S/N pentru
benzoat de sodiu i de sorbat de potasiu.
Valorile LOD ale benzoatul de sodiu i sorbatului de potasiu s-au dovedit a fi
cuprinse intre 0.023 i 0,001 mg/L pentru metode HPLC i de LC-MS/MS.
Determinarile concentraiilor LOD au fost raportate utiliznd un semnal / zgomot
(S/N) de fundal de 3. Limita de cuantificare (LOQs) au fost estimate ca fiind de 10 ori
S/N pentru concentraiile de mai sus. n tabelul 1 sunt prezentate valorile LOD i
LOQ benzoat i sorbat pentru metode att HPLC i LC-MS/MS. Cromatograma probei
pentru LOD este dat n Fig. 3 n sprijinirea informaiilor.
Curbele de calibrare pentru benzoat i sorbat au fost obinute de complot picurilor
comparativ cu concentraii de analit n mg/L. liniaritatea a fost evaluat folosind
analiza de regresie liniar a unui ase puncte liniar complot constnd din trei
replici fiecare punct i estimarea ptrat coeficienii de corelare, r2 per analitului.

HPLC

LC-MS
Fig 1.

4. Discutii
Spre deosebire de rapoartele anterioare pe metode HPLC, n acest studiu, au fost
folosite coloane de separare mai scurte. O coloan C18 HPLC de 15 cm cu un
diametru de 3.9 mm furnizeaza mai repede separaia cromatografic a benzoatului
de sodiu i sorbatului de potasiu, folosind solventul de faz mai puin mobilA.
Optimizarea de faz mobil (acetat de amoniu 72:28%: acetonitril) i debitul (1
mL/min) permite eluia mai repede de analii cu o rezoluie bun prin cromatografie,
(Rs = 0.28). Cromatogramele reprezentativ pentru amestecul standard i ketchup-ul
eantion afiate o separare de linia de baz foarte bun i simetrice vrfuri cu
metoda actual (Fig. 1).
Dei exist uoare diferene ntre HPLC-UV si metode LC-MS/MS n ceea ce privete
pregtirea probelor, mult mai mici valori LOD i LOQ (folosind etaloanele ngrijite),
se poate ajunge LC-MS/MS compara cu metoda HPLC. Indicat prin valorile LOD,
coninutul de benzoat i sorbat n mult mai puin concentraiilor (aprox. 20 de ori)
pot fi detectate prin metode LC-MS/MS dect c metoda HPLC.
De-a lungul timpului, inca din 2005 cand au inceput primele teste in laboratoarele
din Turcia, pt ketchup au putut fi observate 3.03 pentru benzoat de sodiu i 4.09
pentru sorbat de potasiu.
n 2012, rezultatele s-au majorat de dou ori (25%), comparativ cu anul 2005.
For both analytes, the relationship between peak area and concentration
was found to be linear from 0.1 to 100 mg/L (for HPLC)
and 0.01 to 100 mg/L (for LCMS/MS) with typical correlation
coefficients of r2 = 0.99999.

Participantii la testarea de competen mbuntit capacitatea lor de msurtori

prin participarea la astfel de teste. Modelul de performan de un laborator selectat
ar putea fi gsit n tabelul 3, care sunt rezultatele i z-scorurile de laborator au
participat la teste de competen ntre anii 2005 2013. Anii ntre 2005 i 2007,
scorurile z a laboratoarelor pentru benzoat i de sorbat de teste au fost mai mari i
din gama. Dar, dup 2007, valorile z-scor eliberat din acelai laborator au fost n
limitele. Figura 2 Arat z-scor de un laborator de ani, care indic faptul c testele de
competen au instrumente de control de calitate extern foarte bun pentru
organismul de acreditare i mbuntete calitatea de msurtori n laboratoare
acreditate. Studiul de competen de testare a fost evaluat gratuit la metoda de
dezvoltare i incertitudine calcule. Nu sunt nici calcule de incertitudine a rezultatelor
testelor de competen.

6. concluzii

HPLC i metode LC-MS/MS suplimentare au fost elaborate i validate pentru

determinarea simultane Benzoatul de sodiu i de sorbat de potasiu n alimente i
buturi. n timp ce lor de detectare a fost realizat la 225 (benzoat de sodiu) i 255
(sorbat de potasiu), folosind ACEC18 coloana n metoda HPLC, n LC-MS/MS, a fost
utilizat un detector de mas i timpul de execuie a unui eantion a fost redus puin
3 min. Cum era de ateptat, metoda LC-MS/MS este mai rapida, simpla, sensibil,
precis dect metoda HPLC. n plus, este o metod economic care consuma mult
mai puin solvent. De aceea, este convenabil pentru laboratoare performante
determinarea rutin Benzoatul de sodiu i de sorbat de potasiu n alimente i
buturi. Diferena cea mai important dintre LC-MS/MS i metode HPLC este limita
inferioar de valori LOD i LOQ.
Analiz total de timp, inclusiv pregtirea probelor , este numai 15 min pentru
ketchup si 10 min pentru probele de bauturi.

Limita de detectie se defineste ca fiind concentratia minima masurabia, cu

un nivel de
incredere specificat, a unui element chimic care produce un semnal egal cu de trei
ori abaterea
standard experimentala a zgomotului de fond.
Limita de detectie (LOD) pentru compusii studiati a fost determinata la o intensitate
de
semnal egala cu de 10 ori intensitatea zgomotului. In Tabelul 1 sunt aratate limitele
de
detectie pentru pesticidele studiate.