Facultad de Ciencias Aplicadas

Departamento de Ciencias de la Vida

Ingeniera en Biotecnologa

Laboratorio de Enzimologa
INTEGRANTES:
Cynthia Andrade
Anah Boada
Carlos Ortiz
FECHA
: 2015-05-13

ASIGNATURA: Enzimologa

1 TITULO DE LA PRCTICA: Actividad en detergentes de lavadora en polvo comerciales

2 OBJETIVOS
1 Objetivo General
Determinar la actividad amilasa siguiendo la reaccin de hidrlisis del almidn
2 Objetivos Especficos
Comprobar la presencia de la amilasa a partir del mtodo de DNS-Maltosa.
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INTRODUCCION

Segn (Cristancho y Monroy, 2014) Las enzimas optimizan la eficiencia de detergentes, permitiendo el
limpiar a bajas temperaturas y perodos ms cortos, reduciendo el consumo de energa y las emisiones
de CO2. Uno de los mtodos ms acordes y con mejor resultados en la determinacin de los azucares
con carcter reductor, es el mtodo (DNS), para el anlisis de diferentes materiales y con alta
sensibilidad y productividad debido a que es un mtodo espectrofotomtrico; el procedimiento se basa
en una reaccin redox que ocurre entre el DNS y los azcares reductores presentes en la muestra. El
presente informe desarrollara el procedimiento respectivo para la determinacin de azucares reductores
a partir de una solucin patrn de maltosa de concentracin 4mM, que permitir realizar y ajustar una
curva de calibracin, y una solucin desconocida; por el mtodo del cido 3,5 dinitro saliclico (DNS).
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MARCO TEORICO

Las enzimas son biodegradables y reemplazan a los compuestos qumicos que se vienen liberando al
ambiente desde hace muchos aos, son usadas en los detergentes de lavado de ropa actan sobre los
materiales que forman parte de las manchas, desintegrndola y/o desprendindola de la tela durante el
lavado. (Cristancho y Monroy, 2014)
Las amilasas degradan molculas grandes como el almidn en otras ms pequeas, de forma que puedan
ser absorbidas en el intestino. Las molculas de almidn, son demasiado grandes para ser absorbidas,
son degradadas por enzimas a molculas ms pequeas como la maltosa, y a glucosa, la cual s puede
ser absorbida a travs de las clulas del intestino. (Guzmn, Garca y Larios, 2013)
Amilasa: para la degradacin de los residuos de almidn de alimentos como papa, chocolate, etc. No
son componentes esenciales de los detergentes ya que tienen una accin limitada sobre los carbohidratos

y stos son solubles en agua (por lo tanto son de fcil remocin por los lavados corrientes). Se emplean
las amilasas de Bacillus licheniformis. (Guzmn, Garca y Larios, 2013)
Maltosa: La maltosa, o maltobiosa o azcar de malta, es un disacrido formado por dos glucosas unidas
por un enlace glucosdico, presenta el OH hemiacetlico siendo un azcar reductor. Se puede obtener
mediante la hidrlisis del almidn y glucgeno. (Cristancho y Monroy, 2014)
Reactivo DNS: Reactivo (DNS) que tiene capacidad de oxidar a los azcares reductores dando
resultados colorimtricos que se pueden medir con una longitud de onda de 540nm en el
espectrofotmetro. (Cristancho y Monroy, 2014)
Fundamento DNS-Maltosa
Los azucares reductores poseen un grupo carbonilo libre formando un grupo hemiacetal que le confiere
la caracterstica de poder reaccionar con otros compuestos. El mtodo de Miller o DNS (cido
dinitrosaliclico como reactivo tiene la capacidad de oxidar los azucares reductores mostrando un
comportamiento diferencial hacia mono y disacridos, dando resultados colorimtricos que se puede
medir con una longitud de onda de 575 nm. (Cristancho y Monroy, 2014)
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MATERIALES
Muestras: Almidn, detergentes comerciales de lavado de ropa

Materiales de Proteccin Personal

Mandil
Guantes
Vestimenta apropiada
Reactivos
Varios detergentes de lavado de ropa en polvo (asegurarse que en su composicin aparezcan
enzimas, y a sr posible que sean glicosidasas)
Reactivo DNS, dinitrosaliclico (1 g. de cido 3,5-dinitrosaliclico en 20 mL de NaOH 2 N, y 50
mL de agua. Aadir 30 g. de tartrato sdico-potsico 4 H2O y llevar a 100 mL. Proteger de la
luz y del dixido de carbono)
Disolucin de maltosa 4 mM en agua.
Disolucin de almidn en agua: (10 g/ L)
Materiales e Insumos

Balanza
Espectrofotmetro
Agitador magntico
Bao Mara
Tubos de ensayo y gradilla
Pipetas y propipetas de 1 y 5 mL

METODOLOGA

Mientras se realizaba la reaccin enzimtica y se formaban las muestras, se realiz la recta de calibrado
del mtodo DNS utilizando la disolucin patrn de maltosa. Para ello rotulamos 5 tubos de ensayo, y
adicionar lo siguiente.

Tubo N 1
Tubo N 2
Tubo N 3
Disolucin de maltosa (ml)
0,0
0,3
0,6
Agua destilada (ml)
1,0
0,7
0,4
Reactivo DNS (ml)
1,0
1,0
1,0
Volumen Total (ml)
2,0
2,0
2,0
Tabla No.1 Datos para la preparacin de soluciones

Tubo N 4
1,0
0,0
1,0
2,0

Una vez mezclados los tubos se incubaron en un bao a 90 o C durante 15 minutos Finalmente estos
tubos se midieron tambin en el espectrofotmetro a 540nm.
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RESULTADOS

Para la construccin de la curva de calibracin es necesario conocer las concentraciones de la maltosa

en cada solucin despus de haber realizado la dilucin con el agua destilada. Esta concentracin se
puede determinar con la ecuacin:
V 1 C 1=V 2 C2
Esta es la ecuacin No. 1, despejando de esta ecuacin la C2, la que se desea obtener y se obtiene:
C2 =

V 1C1
V2

De esta ecuacin se conoce la C1 que es la concentracin de la solucin patrn de maltosa 4mM en

agua, y el y el volumen final (V2) que es 2 mL que es el volumen total de todas las soluciones. A partir
de esta ecuacin se determinar las concentraciones de la siguiente manera
Para la solucin No. 1 se obtiene
0,0 ml4 mM
C2 =
=0 mM
2 ml
Para la solucin No. 2 se obtiene
0,3 ml4 mM
C2 =
=0,6 mM
2 ml
Para la solucin No. 3 se obtiene
0,6 ml4 mM
C2 =
=1,2mM
2 ml
Para la solucin No. 4 se obtiene
1,0 ml4 mM
C2 =
=2,0 mM
2 ml
Este proceso se repite hasta obtener las concentraciones de maltosa de las 4 soluciones a estudiar, los
cuales estn registrados en Tabla No2

Tubos

Concentracin
(mM)
Tubo N 1
0 mM
Tubo N 2
0,6 mM
Tubo N 3
1,2 mM
Tubo N 4
2,0 mM
Tabla No.2: Concentracin de maltosa de las 4 soluciones
Despus de preparar las soluciones, se midi la absorbancia con el espectrofotmetro y se obtiene la
tabla No.3, que muestra las absorbancias medidas con el espectrofotmetro, tomando como 0 el blanco
de reactivos que se lo coloc antes de todas las soluciones para encerar la mquina.
DNS MALTOSA
TIEMPOS
ABSORBANCIAS
T1
0.020
T2
0.060
T3
0.080
T4
0.186
Tabla No.3 Datos de absorbancia tomados con el espectrofotmetro
A partir de estos datos tomados durante la prctica se construy la curva de calibracin, que relaciona
las concentraciones de las diferentes soluciones y la absorbancia medida en cada una de ellas. La Tabla
No.4 nos relaciona estos datos.
No. Solucin
Concentracin (mM) Absorbancia (nm)
Tubo No 1
0
0,020
Tubo No 2
0,6
0,060
Tubo No 3
1,2
0,080
Tubo No 4
2,0
0,186
Tabla No.4: Datos para la construccin de la curva de calibracin
Con la (Tabla No.4) se obtiene la (Grfica No. 1) que es la curva de calibracin obtenida de acuerdo
con los datos tomados durante la prctica.
CURVA DE CALIBRACIN ABSORBANCIA VS CONCENTRACION (DNS-MALTOSA)

CURVA DE CALIBRACIN (DNS-MALTOSA)

0.2
f(x)==0.99
R
0.08x + 0.02

0.15

Absorbancia (nm)

0.1
0.05
0

0.5

1.5

2.5

Concentracin de Maltosa (mM)

Grfica No. 1: Curva de calibracin

Con la curva obtenida se realiza una grfica de tendencia lineal que se ajusta a los datos, el R 2 obtenido
para la ecuacin de la recta es de 0.9914. Teniendo en cuenta que el R 2 es mayor a 0.95 los datos no
tienen mucha dispersin y por lo tanto son aceptables.
T. 30

T. 15

T. 0

Grfica No. 2: Cambio de coloracin a caf oscuro en las muestras colocadas en la incubadora a 80 o C
de DNS-Maltosa
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DISCUSIN

Mtodo DNS-Maltosa
Se comprob en el laboratorio la presencia de azucares reductores como la maltosa aplicando el
mtodo DNS como reactivo oxidando a azucares reductores como la maltosa en el grupo hidroxilo del
carbono 1, al calentar la muestra en la incubadora a 80,5 o C (Cristancho y Monroy, 2014) obteniendo
un color caf oscuro que se midi a una longitud de onda de 540 nm. Se utiliz el mtodo matemtico
utilizando la ecuacin lineal de la curva patrn, realizando una curva de calibracin para azucares
reductores como la maltosa determinando su respectiva absorbancia y as llegando a su concentracin.
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CONCLUSIONES

Mtodo DNS-Maltosa
Se logr comprobar la presencia de la amilasa a partir del mtodo de DNS-Maltosa utilizando el
reactivo (DNS) que permite oxidar a los azcares reductores en este caso la maltosa obteniendo
una coloracin caf oscuro, y se analiz su concentracin midiendo su longitud de onda de
540nm en el espectrofotmetro, indicando que la curva de calibracin presenta resultados
aceptables porque no se encontraban dispersos.
10 ANEXOS
Cuestionario:
1. Qu permite relacionar la grfica de la recta calibrada?
Recta de calibrado Seleccionando la longitud de onda mxima a la que absorbe mi sustancia y
utilizando unas muestras patrn, de concentracin conocida puedo obtener los datos de absorbancia
frente a concentracin, A vs [ ], que debidamente representados dan lugar una recta (Ec. Lambert-Beer)
de calibrado. A travs de una recta de calibrado este mtodo nos sirve como anlisis cuantitativo de una
sustancia determinada. (Riu, y Boqu, 2010)

Para una muestra de concentracin desconocida tan solo hay que medir su absorbancia a la longitud de
onda del mximo y extrapolar en la curva de calibrado el valor de la concentracin. (Riu, y Boqu,
2010).
11 BIBLIOGRAFIA
1. P. Guzmn G. Garca, E. Larios. (2013) Determinacin de azcares reductores mtodo DNS.
Fundacin Universidad de Amrica Campus de los Cerros: Avda Circunvalar No. 20-53. Tel: 57
13376680. Fax. 57 1 3362941.
2. J. Riu, R. Boqu. (2010). Calibracin Lineal- Tcnicas de Laboratorio. Departamento de
Qumica Analtica y Qumica Orgnica Universitat Rovira i Virgili. Pl. Imperial Trraco, 1
43005-Tarragona. 256 (2000) 745-747.
3. L. M. Cristancho, R. A. Monroy. 2014. Manual de mtodos generales para determinacin de
carbohidratos. UPTC