Sunteți pe pagina 1din 5

4.

METODE DE CULTIVARE A BACTERIILOR


Cunoasterea necesitatilor nutritive ale bacteriilor este foarte importanta n bacteriologia
medicala, deoarece sta la baza prepararii mediilor de cultura destinate izolarii diverselor specii
bacteriene din produsele biologice sau patologice.
La nceputurile dezvoltarii bacteriologiei, prepararea mediilor a fost artizanala, numerosi
bacteriologi intrnd n istoria microbiologiei prin mediile pe care le-au preparat si care le poarta si
astazi numele. Astfel, amintim, de exemplu, mediul Loeffler pentru cultivarea bacilului difteric,
mediul Lwenstein-Jensen pentru bacilul lui Koch, mediul selectiv Wilson-Blair pentru salmonele
si multe altele.
Prin cercetarea necesitatilor nutritive ale diferitelor specii s-au realizat medii adecvate
pentru aproape toate bacteriile de interes medical, speciile necultivabile fiind foarte putine, ca, de
pilda, Mycobacterium leprae si unele spirochete printre care Treponema pallidum.
Cultivarea bacteriilor n scop diagnostic pune n esenta doua probleme:
alegerea unui mediu de cultura optim, care sa permita izolarea tuturor bacteriilor care
ar putea fi prezente n produsul de examinat si
obtinerea bacteriilor n culturi pure, pentru a putea fi identificate.

4.1. Conditii generale pentru cultivarea bacteriilor


Un mediu de cultura uzual trebuie sa contina apa, substante organice, minerale,
oligoelemente si factori de crestere. Pentru satisfacea acestor necesitati se ultilizeaza diferite
substraturi biologice nutritive complexe care au n compozitia lor aceste ingredinente. Astfel:
- peptonele, care se obtin prin hidroliza enzimatica sau acida a proteinelor de origine
animala (de exemplu faina de oase). Ele nu au o compozitie chimica foarte bine definita, iar prin
continutul n peptide si aminoacizi constituie o sursa universala de azot, pentru toate bacteriile
cultivabile, fiind folosite practic n prepararea tuturor mediilor de cultura,
- extractul de carne, ce se obtine prin deshidratarea decoctului de carne de vita. Acesta
contine cantitati importante de creatina, xantina, hipoxantina, acid uric, acid adenilic, glicocol,
uree, glutamina ca sursa de azot precum si glicogen, hexozofosfati, acid lactic etc. ca sursa de
carbon,
- extractul de drojdie, care se obtine prin cultivarea controlata a drojdiilor si care contine
numeroase vitamine, mai ales cele din grupul B,
n afara de ingredientele mai sus mentionate mai amintim:
- clorura de sodiu, care se adauga la mediile uzuale ntr-o concentratie de 0,9%. Pentru
cultivarea bacteriilor halofile concentratie poate creste pna la 10%,
- mono sau polizaharidele, unii alcooli (glicerina, manitol) pot nmbogati mediile,
deoarece constituie surse de carbon usor accesibile multor bacterii,
Cultivarea bacteriilor pe medii lichide. Mediile lichide se folosesc cel mai adesea pentru
nmultirea unor microbi care se gasesc n numar mic ntr-un anumit produs. Cel mai simplu
mediu folosit n laboratorul de bacteriologie este bulionul care se prepara din decoct de carne de
vaca, peptona si clorura de sodiu. Cultivarea unui produs pe medii lichide are dezavantajul ca
nu permite nsa obtinerea unei culturi pure.
Caracterele culturale ale microbilor pe medii lichide difera. Astfel, bacteriile apartinnd familiei
Enterobacteriaceae tulbura uniform mediul, altele, ca de pilda bacteriile strict aerobe (Pseudomonas, Nocardia)
formeaza pelicule la suprafata mediului. Altele formeaza agregate care se dezvolta sub forma de grunji ce se

depun pe peretele eprubetei sau la fundul mediului (Streptococcus). Unele bacterii secreta n mediu pigmenti
difuzibili ca de exemplu bacilul piocianic (Ps.aeruginosa).
Cultivarea bacteriilor pe medii solide. Introducerea mediilor de cultura solide a nsemnat
un progres urias n tehnicile de diagnostic, deoarece permite dezvoltarea distincta a microbilor,
sub forma de colonii izolate. O colonie bacteriana este o micropopulatie ce rezulta din nmultirea
unui singur microb pe un mediu, vizibila n general cu ochiul liber.
Cel mai simplu mediu solid este geloza simpla, ce se obtine prin adaugarea la bulion a unei
substanta gelificabile, care de regula este geloza, un polizaharid obtinut din alga marina agaragar. La aceast mediu simplu se pot adauga diferite ingrediente (snge de oaie, ser, ascita,
extract de drojdie etc.) pentru a putea cultiva bacteriile pretentioase.
Caracterele culturale sunt foarte importante n identificarea microbilor. Ele se apreciaza fie
cu ochiul liber, fie cu ajutorul unei lupe. Elementele ce se descriu, n general, sunt dimensiunea,
forma, pigmentul, consistenta, aderenta la mediu, activitatea hemolitica si unele modificari pe
care microorganismele le produc n mediul respectiv.
Coloniile cu aspect neted, cu marginile regulate si care se suspenda omogen n ser
fiziologic se numesc colonii de tip S (smooth), pe cnd coloniile aceleiasi specii, cu suprafata
rugoasa, relief si margini neregulate si care aglutineaza sponatan n ser fiziologic - colonii de tip
R (rough). n general, cu unele exceptii, coloniile S apartin tupinilor virulente, pe cnd cele R sunt
nevirulente.
Cultivarea microbilor pe medii solide permite, de asemenea, numaratoarea de germeni ntrun anumit produs. Acest aspect este deosebit de important deoarece n multe infectii criteriul de
implicare etiologic este numarul bacteriilor n produsul de examinat (infectii urinare).
Medii speciale. Exista situatii n care izolarea unui microb necesita medii deosebite care sa
favorizeze selectarea lui din produse intens contaminate.
Mediile de mbogatire sunt medii lichide care permit nmultirea preferentiala a unui microb
dintr-un amestec. Astfel sunt mediile cu continut mare de clorura de sodiu (1-10%) n care se pot
dezvolta numai bacterii halofile ca, de exemplu, stafilococul (mediul Chapmann lichid) si
enterococul. Unele medii de mbogatire au ca factor electiv anumite substante, ca, de exemplu,
selenitul acid de sodiu, care permite dezvoltarea salmonelelor din materiile fecale. Alte medii se
bazeaza pe propietatea unor germeni de a se dezvolta la un pH mai acid sau mai alcalin dect
majoritatea speciilor bacteriene de interes medical. Astfel, vibrionul holeric se dezvolta la un pH
alcalin (9) iar brucelele la la un pH acid (6).
Medii selective. Daca un mediu de mbogatire se solidifica, rezulta un mediu selectiv care
are avantajul obtinerii microbilor sub forma de colonii izolate. Datorita acestor medii, izolarea si
identificarea bacteriilor este astazi mult simplificata. Mediile selective, care se bazeaza pe
particularitatile metabolice ale unor specii microbiene sau mai ales pe rezistenta naturala a
acestora la antibiotice, sunt utilizate n mod curent n laboratoarele de bacteriologie, deoarece
permit, practic, izolarea dintr-un amestec de microbi, a oricarui microb n cultura pura.
Mediile de diagnostic sunt medii de cultura care evidentiaza anumite proprietati fiziologice
si caractere biochimice ale tulpinilor bacteriene pe baza carora acestea pot fi identificate. Astfel,
de exemplu, numeroase specii bacteriene se recunosc pe baza zaharurilor pe care le
fermenteaza. Mediile de diagnostic cu zaharuri contin zaharul de cercetat si un indicator de pH.
n cazul n care bacteria nsamntata n acest mediu va fermenta zaharul, culoarea mediului se
va schimba dupa cteva ore datorita scaderii pH-ului.

5. INFLUENTA FACTORILOR FIZICI ASUPRA

BACTERIILOR

5.1. Temperatura
Temperarura optima de dezvoltare a bacteriilor este cea a habitatului lor natural. n functie
de aceasta temperatura, bacteriile se mpart n psihrofile, care se nmultesc optim la 20C dar si
sub aceasta temperatura, mezofile, cu temperatura optima cuprinsa ntre 20-40C si termofile,
care se nmultesc optim la peste 45C. Bacteriile mezofile sunt cele patogene deoarece se
nmultesc la temperatura organismului, fiind denumite si bacterii homeoterme.
Limitele de temperatura n care aceste bacterii pot sa creasca sunt nsa mai mari si variaza
de la specie la specie. Astfel, gonococul si meningococul nu suporta variatii mai mari de 1-2C
fata de temperatura optima, spre deosebire de enterobacterii, care cresc n limite foarte largi.
Microorganismele sunt sensibile la temperaturile ridicate, aplicatia practica a acestui aspect
fiind sterilizarea.
Temperaturile moderat scazute, ca, de pilda, cea de +4oC din frigidere, nu distrug bacteriile,
dar opresc n general nmultirea lor prelungindu-le viabilitatea. Din acest motiv, majoritatea
produselor biologice sau patologice destinate examenului bacteriologic se pastreaza n aceste
conditii. Totusi, exista tulpini microbiene care se nmultesc si la temperatura frigiderului ca, de
exemplu, tulpinile criogene de Pseudomonas aeruginosa, ce se nmultesc la 0oC si tulpini din
familia Enterobacteriaceae (E.coli) care se n nmultesc la +5oC. Acest aspect trebuie luat n
calcul de catre medicul bacteriolog, mai ales acolo unde implicatia etiologica a unui germene
ntr-o infectie se bazeaza pe criteriul numeric.
Congelarea. Daca o suspensie bacteriana este supusa nghetului la temperaturi nu prea
mici fata de 0oC, cristalizarea apei determina formarea unor spatii ce contin solutii concentrate
de saruri care nu cristalizeaza dect la temperaturi mult mai joase (-20C pentru NaCl de
exemplu), cnd solutiile devin saturate ssi pot cristaliza. Aceste concentratii ridicate de saruri
minerale, la care se adauga cristalele de apa, vor leza structurile bacteriene. Prin nghetare nu
vor fi omorte toate celulele unei suspensii, dar nghetul ssi dezghetul repetat scade foarte mult
numarul de bacterii viabile.
Conservarea prin congelare. Temperatura congelatoarelor casnice (-20C) nu este destul de
scazuta pentru a permite conservarea bacteriilor. Temperatura optima este cea realizata de CO2
(-78C) sau de azotul lichid (-180C). Conservarea bacteriilor, a virusurilor prin congelare este
favorizata de adaosul de glicerol sau dimethilsulfoxid. Acesti agenti chimici induc o solidificare
amorfa, vitroasa care nlocuieste solidificarea prin cristalizare.
Prin liofilizare (desicare brusca la -78oC), care este o metoda de conservare a microbilor, se
extrage practic ntreaga apa libera din celulele bacteriene, ceea ce are ca urmare cresterea
stabilitatii biopolimerilor si ncetarea metabolismului. Bacteriile liofilizate se pastreaza ani de zile.

5.2. pH-ul
Bacteriile se pot dezvolta n limite largi de pH, cele patogene pentru om dezvoltndu-se
optim la un pH de 7,2-7,4. Exista si exceptii ca, de pilda, bacteriile din genul Brucella care cresc
la un pH de 6,0 si vibrionul holeric la pH de 9,0. Lactobacilii, prezenti n flora vaginala normala se
dezvolta chiar si la un pH de 3,9.

Unele bacterii modifica prin procesele metabolice pH-ul mediului. Aceasta modificare poate
opri nmultirea lor sau chiar distruge cultura. Din acest motiv, multe medii au n compozi tia lor
solutii tampon care mentin pH-ul n limite convenabile.
Modificarea de catre o bacterie a pH-lui unui mediu poate avea valoare deosebita n
identificarea unui microb si poate fi sesizata prin adaugarea n mediu a unui indicator de pH.
Foarte multe bacterii se identifica biochimic prin proprietatea lor de a fermenta diferite zaharuri.
Aceasta capacitate se evidentiazaa tocmai prin nsamntarea unei bacterii pe mai multe medii
ce contin fiecare alt zahar si un indicator de pH. n cazul fermentarii, acidifierea va determina
schimbarea culorii mediului.

5.3 Ultrasunetele
Ultrasunetele cu o frecventa peste 20.000 de cicli/s sunt bactericide. Bacteriile si virusurile
sunt distruse de ultrasunete ntr-un interval de o ora. Ultrasonarea microorganismelor se
foloseste mai putin pentru sterilizare, ct pentru a obtine diferite componente bacteriene sau
virale, cum sunt: enzime, pereti celulari, acizi nucleici bacterieni n scopul cercetarii acestora.

5.4. Presiunea hidrostaticaa


Bacteriile obisnuite sunt rezistente la presiunea atmosferica. Formele vegetative sufera
alterari la 300 de atm si sunt omorte la 600 de atmosfere, presiune ntlnita n oceane la o
adncime de 6000m. Cultivarea bacteriilor la presiuni mari induce cresterea lor filamentoasa
scazndu-le capacitatea de diviziune. Totusi unele bacteria gram-pozitive pot rezista pana la
3000 de atmosfere cu conditia ca variatiile de presiune sa fie lente si da permita adaptarea
bacteriilor. Variatiile bruste de presiune duc la spargerea peretelui bacterian

5.5. Presiunea osmotica


Bacteriile se nmultesc optim pe medii izotonice, rezistenta lor la variatiile presiunii
osmotice fiind incomparabil mai mare dect cea a celulelor organismelor superioare. Aceastaa
rezistenta se datoreazaa peretelui celular. Bacteriile din genul Mollicutes, lipsite de actiunea
protectoare a peretelui celular, sunt foarte sensibile la variatii mici ale presiunii osmotice.
ntr-un mediu puternic hiperton, bacteriile vor pierde apa din citoplasma si vor muri. Acest
fenomen se numeste de plasmolizaa.
Daca presiunea osmotica a mediului este foarte scazutaa, apa va patrunde n celula, care
se va umfla devenind turgescenta. Moartea bacteriei se produce prin plasmoptizaa.
Cresterea presiunii osmotice a unui mediu prin adaus de NaCl sau zaharuri sta la baza
conservarii unor alimente.
Exista nsa bacterii osmofile, dintre care cele halofile sunt capabile sa se nmulteasca n
solutii hipersaline (bacteriile din genul Staphylococcus si Enterococcus). Pe baza acestei
proprietati se prepara unele medii de mbogatire si selective asa cum este mediul hiperclorurat
Chapmann pentru stafilococi. Acesta contine 7,5% NaCl spre deosebire de mediile obisnuite care
contin doar 0,5 %. Dintre bacteriile osmofile mentionam si pe cele zaharofile, care sunt capabile
sa se nmulteasca pe medii cu continut mare de glucide (6g%). Acest aspect este important
pentru unele medicamente, ca de pilda, siropurile care, n ciuda continutului ridicat de zaharoza,
se pot altera n urma contaminarii cu aceste bacterii.

5.6. Radiatiile
5.6.1. Razele neionizante

Razele ultraviolete. Puterea bactericida a razelor luminoase devine perceptibila la o lungime


de unda de 330nm, crescnd pe masura scaderii lungimii de unda a luminii UV. Timpul necesar
distrugerii microorganismelor depinde de intensitatea luminii, distanta de sursa de emisie si
mediul n care se gasesc microorganismele. Mecanismul bactericid al razelor UV consta n
inducerea formarii n celula bacteriana a unor dimeri de timina care interfereaza replicarea DNA.
Alterarile altor elemente structurale bacteriene sunt neglijabile.
Fotoreactivarea. Modificarile induse n celulele bacteriene prin razele UV sunt reversibile,
eficienta sterilizarii prin aceste raze nefiind prea performanta. Astfel, daca se expune o cultura
bacteriana care a fost iradiata cu raze UV la lumina vizibila, o parte din dimerii de timina se vor
disocia si bacteriile aparent omorte si reiau activitatea metabolica si nmultirea. Aceasta poate
depasi de sute de ori activitatea initiala a culturii neiradiate.
n scop practic lampile cu vapori de mercur se folosesc pentru a reduce numarul de bacterii
existente n aer n salile de operatie, n laboratoare, n ncaperi n care sunt adapostite animale
de exprientaa etc.
Efectul bactericid al razelor solare se datoreaza continutului n raze UV (300-400nm). n
conditii naturale efectul bactericid al luminii solare este mai mare n tarile sudice unde continutul
n raze UV este mare. Semple si Greig au aratat n India (1909) ca bacilii tifici expusi pe lenjerie
albaa la soare sunt distrusi n doua ore, pe cnd la ntuneric si pastreaza viabiliatea peste 6 zile.
S-a observat nsa ca expunerea la lumina puternica solara poate omor bacteriile chiar
cnd radiatiile UV sunt ecranate, datorita sensibilitatii la lumina a unor substante necesare
metabolismului bacterian cum sunt riboflavina si porfiriniele. Astfel, expunerea la lumina solara a
fiolelor n care se afla BCG1 va avea ca urmare pierderea viabilitatii si deci a eficientei
vaccinului.
Sensibilizarea fotodinamica. Razele luminoase vizibile au o actiune bactericida slaba, care
poate nsa fi crescuta pna la nivelul actiunii razelor UV daca sunt trecute prin coloranti
fluorescenti ca, de pilda, eozina, rosu bengal etc.
5.6.2. Radiatiile ionizante
Mecanismul bactericid al acestor raze consta n formarea n celula a unor radicali cu viatata
scurta ssi protoni. Acesti produsi vor altera bazele azotate si legaturile dintre ele. Efectul
bactericid al razelor ionizante depinde de cantitatea de energie absorbita, temperatura, presiuea
partiala a oxigenului, continutul n substante organice, prezenta unor substante protectoare ca
alcoolii alifatici sau substante bogate n grupari sulfhidrilice, specia microorganismului si
continutul n apa. Sporii sunt n general mai rezistenti dect formele vegetative ale bacteriilor,
exceptie fiind o bacterie nesporulata, Micrococcus radiodurans, care este cel mai rezistent
microorganism la radiatii. El rezista la doze de 200 de ori mai mari dect restul bacteriilor datorita
faptului ca este echipat cu mecanisme deosebit de eficiente de reparare a alterarilor acizilor
nucleici.