Sunteți pe pagina 1din 160

ACADEMIA DE TIINE A MOLDOVEI

INSTITUTUL DE MICROBIOLOGIE I BIOTEHNOLOGIE

Cu titlu de manuscris
C.Z.U 573.6.086.83 : 663.1

VALUA ANA

BIOTEHNOLOGIA CULTIVRII SURSEI


DE ANTIOXIDANI CIANOBACTERIEA NOSTOC LINCKIA

167.01 - BIOTEHNOLOGIE, BIONANOTEHNOLOGIE

Tez de doctor n tiine biologice


Conductor tiinific:

Cepoi Liliana, doctor n tiine


biologice, confereniar cercettor

Autor:

Valua Ana

CHIINU, 2015

Ana Valua, 2015

CUPRINS
ADNOTRI .........

LISTA ABREVIERILOR ... 8


INTRODUCERE .....
1.

ANTIOXIDANI DIN CIANOBACTERII TEHNOLOGII DE OBINERE I


PERSPECTIVE DE UTILIZARE............................................................................... 17
1.1. Tehnologii de cultivare a cianobacteriilor............................................................... 18
1.1.1. Izolarea i selecia culturilor de productori. 19
1.1.2. Optimizarea mediilor de cultur i parametrilor de cultivare
19
1.1.3. Sistemele i principiile biologice de cultivare industrial a microalgelor 24
1.2. Cianobacteriile surse de antioxidani... 31
1.2.1. Antioxidanii macromoleculari ai cianobacteriilor..

33

1.2.2. Antioxidanii cu masa molecular joas ai cianobacteriilor

36

1.3. Tehnologii de obinere a antioxidanilor din cianobacterii.

39

1.4. Utilizarea antioxidanilor din cianobacterii 43


1.5. Concluzii la capitolul 1 ..........
2.

45

ACTIVITATEA ANTIOXIDANT I COMPONENA BIOCHIMIC A


BIOMASEI DE NOSTOC LINCKIA PE DURATA CICLULUI VITAL... 47
2.1. Materiale i metode de cercetare 49
2.2. Modificarea cantitii i calitii biomasei de Nostoc linckia pe durata ciclului
vital n condiii de producere i de laborator ............................................................ 54
2.3. Modificarea activitii antioxidante a extractelor din biomasa de Nostoc linckia
pe durata ciclului vital.. 60
2.4. Concluzii la capitolul 2... 68

3.

4.

EXTRAGEREA I PSTRAREA COMPONENTELOR CU EFECT


ANTIOXIDANT DIN BIOMASA DE NOSTOC LINCKIA.
3.1. Materiale i metode de studiu.
3.2. Selectarea solventului optimal pentru obinerea complexelor antioxidante din
biomasa de Nostoc linckia
3.3 Stabilirea condiiilor de conservare a proprietilor antioxidante ale extractelor
hidro-etanolice obinute n baza biomasei de Nostoc linckia
3.3. Concluzii la capitolul 3...
ELABORAREA TEHNOLOGIILOR COMPLEXE NONPOLUANTE DE
CULTIVARE A NOSTOC LINCKIA I DE OBINERE A PREPARATELOR
ANTIOXIDANTE
4.1. Modificarea activitii antioxidante la Nostoc linckia sub influena compuilor
coordinativi ai fierului (III) cu bazele Schiff i cu aminoacizi.

69
70
71
70
90

91
92

4.1.1. Influena compuilor coordinativi ai Fe(III) cu aminoacizi asupra


parametrilor biotehnologici la Nostoc linckia..
4.1.2. Influena compuilor coordinativi ai Fe(III) cu bazele Schiff asupra
parametrilor biotehnologici la Nostoc linckia..
4.1.3. Utilizarea compusilor noi cu schelet hibrid terpenic i azaheterociclic
pentru sporirea activitii antioxidante la Nostoc linckia ...
4.2. Utilizarea reziduului de biomas de Nostoc linckia dup extragerea
antioxidanilor pentru sinteza nanoparticulelor de argint.
4.3. Utilizarea biomasei reziduale de Nostoc linckia n calitate de biosorbent...
4.3.1. Utilizarea biomasei reziduale de nostoc n calitate de biosorbent pentru
purificarea apelor reziduale contaminate cu crom i nichel.
4.3.2. Bioacumularea microcomponentelor metalice din soluii polimetalice
4.4. Tehnologia complex de cultivare a cianobacteriei Nostoc linckia, de obinere a
preparatelor antioxidante i de utilizare a reziduului de biomas..
4.5. Concluzii la capitolul 4...
CONCLUZII GENERALE I RECOMANDRI
BIBLIOGRAFIE......
ANEXE.
Anexa 1. Brevete de invenie MD 4253, MD 4326, MD 4327.
Anexa 2. Act de implementare a tehnologiei de obinere a preparatului antioxidant
NostocAntiOx........................................................
Anexa 3. Diplome la Saloane de Invenii i Expoziii Internaionale........................
DECLARAIA PRIVIND ASUMAREA RSPUNDERII .
CV-ul AUTORULUI

93
98
103
105
110
113
116
121
128
130
132
148
149
152
154
158
159

ADNOTARE
Valua Ana Biotehnologia cultivrii sursei de antioxidani cianobacteria Nostoc
linckia. Tez de doctor n tiine biologice, Chiinu, 2015.
Teza conine introducere, patru capitole, concluzii i recomandri, bibliografie cu 292
titluri, 3 anexe, 131 pag text de baz, 49 figuri, 10 tabele. Rezultatele sunt publicate n 24 lucrri.
Cuvintele cheie: Tehnologie de cultivare, cianobacterii, Nostoc linckia, extracte hidrice i
etanolice, preparate antioxidante, biosorbent, bionanosintez.
Domeniul de studiu: 167.01 - Biotehnologie, bionanotehnologie .
Scopul lucrrii: elaborarea tehnologiei complexe nonpoluante de cultivare a
cianobacteriei Nostoc linckia, de obinere a preparatelor cu efect antioxidant i de valorificare a
reziduului de biomas.
Obiectivele lucrrii: Monitorizarea modificrilor biochimice i a activitii antioxidante a
biomasei i extractelor din ea pe durata dezvoltrii culturii statice de Nostoc linckia; Evidenierea
indicatorilor biotehnologici cu tangen la ciclul vital, utili pentru obinerea preparatelor
antioxidante din biomasa de N. linckia; Stabilirea parametrilor biotehnologici optimi de
extragere i pstrare pe termen lung a componentelor cu efect antioxidant din biomasa de nostoc;
Elucidarea particularitilor modificrii coninutului componentelor antioxidante n biomasa
cianobacteriei N. linckia n condiii de stres oxidativ indus prin aciunea compuilor Fe(III);
Studiul posibilitii valorificrii reziduului de biomas de N. linckia dup extragerea
componentelor antioxidante; Elaborarea tehnologiei complexe de cultivare a N. linckia, de
obinere a preparatelor cu efect antioxidant i de utilizare a reziduului de biomas n calitate de
matrice pentru bionanosintez i n calitate de biosorbent n purificarea mediului.
Noutatea i originalitatea tiinific. Pentru prima dat este pus problema elaborrii unei
tehnologii complexe de cultivare a cianobacteriei Nostoc linckia ca surs pentru obinerea
preparatelor cu efect antioxidant. Pentru prima dat a fost demonstrat eficiena biomasei
reziduale de nostoc n calitate de matrice pentru sinteza nanoparticulelor de argint. Pentru prima
dat a fost elaborat o tehnologie de cultivare a Nostoc linckia, care include etapa de valorificare
a reziduului de biomas dup extragerea antioxidanilor n calitate de biosorbent eficient pentru
metalele grele.
Problema tiinific important soluionat n lucrare const n identificarea
elementelor-cheie a procesului biotehnologic de cultivare a cianobacteriei Nostoc linckia cu
scopul producerii preparatelor cu efect antioxidant i valorificrii reziduului de biomas.
Semnificaia teoretic. Au fost acumulate i expuse rezultate noi despre importana
monitorizrii modificrilor biochimice i a statutului antioxidant ale biomasei de Nostoc linckia
pe durata ciclului culturii statice. A fost evideniat pragul nalt de sensibilitate a culturii de
Nostoc linckia fa de compuii chimici cu metale n ceea ce privete modificarea statutului
antioxidant al biomasei. A fost demonstrat eficiena biomasei de nostoc n calitate de matrice
pentru bionanosintez i n calitate de biosorbent n sistemele multimetalice poluate.
Valoarea aplicativ a lucrrii. n cadrul acestei lucrri au fost elaborate prile
componente ale unei tehnologii complexe de cultivare a Nostoc linckia i utilizare eficient a
biomasei obinute, care pot fi aplicate att ntr-un ansamblu, ct i n calitate de uniti
autonome: procedee de obinere a biomasei de nostoc cu activitate antioxidant nalt; procedee
de extragere eficient a componentelor cu efect antioxidant din biomasa de nostoc; procedee de
obinere a biomasei de nostoc cu nanoparticule de Ag; procedee de utilizare a reziduului de
biomas de nostoc dup obinerea preparatelor antioxidante n calitate de biosorbent eficient.
Implementarea rezultatelor tiinifice. Tehnologia de obinere a preparatului antioxidant
NostocAntiOx a fost implementat la SRL Ficotehfarm (Act Nr.03/11 din 20.11.2014).


- Nostoc linckia". , , 2015 .
, , ,
292 , 3 , 131
, 49 , 10 . 24 .
: , , Nostoc linckia,
, , , .
: 167.01 , .
:
Nostoc linckia, ,
.
:

Nostoc linckia; ,
,
Nostoc linckia;
,
Fe(III);
;
Nostoc linckia ,

.
.
Nostoc linckia
.

. ,

.
, , ,

Nostoc linckia
.
.

.
Nostoc linckia , .
.
.
;
;
;
.
.
NostocAntiOX "Ficotehfarm " ( 01-10
20.10.2013).
6

ANNOTATION
Valuta Ana Biotechnology for cultivation of the source of antioxidants cyanobacterium
Nostoc linckia" PhD thesis in biological sciences, Chisinau, 2015
The thesis consists of an introduction, four chapters, conclusions and recommendations,
bibliography list with 292 references. It comprises 131 pages of the main text, 49 figures, 10
tables and 3 annexes. The results were published in 24 scientific papers.
Keywords: Technology of cultivation, cyanobacteria, Nostoc linckia, aqueous and
ethanolic extracts, antioxidant preparation, biosorbent, and bionanosynthesis.
Field of study: 167.01 Biotechnology, Bionanotechnology.
Aim: To develop cultivation technologies of cyanobacteria Nostoc linckia, obtaining the
antioxidant preparations and valorization of the biomass residue.
Objectives: Monitoring the biochemical changes and antioxidant activity of biomass and extracts
during static culture of Nostoc linckia development; Highlighting the biotechnology indicators with
tangency to vital cycle, useful for antioxidant preparations obtaining from biomass of Nostoc linckia;
Determining the optimal biotechnological parameters for extraction and long term storage of antioxidant
components from Nostoc biomass; Elucidation of the peculiarities for modification of antioxidant
content in the biomass of cyanobacteria Nostoc linckia under oxidative stress induced by Fe(III)
compounds; Study the possibility of recovery of biomass residue after extraction of Nostoc linckia
antioxidant components; Development of complex technology of Nostoc linckia cultivation, antioxidant
preparations obtaining; use of biomass residue as an effective biosorbent in the environmental
purification technologies and for silver nanoparticles biosynthesis.
Scientific novelty of research. For the first time the problem of developing the cultivation
technology of cyanobacteria Nostoc linckia as a source for obtaining the antioxidant complex
preparations was stated.
Important scientific problem, solved in this research work, is to identify the key-elements
of the biotechnology process of Nostoc linckia cultivation in order to use biomass for production of
antioxidant preparations.
Theoretical signification. There were collected and exposed new results about the importance
of monitoring the changes in biochemical and antioxidant status of Nostoc linckia biomass during static
culture cycle. It was revealed high sensitivity threshold of the culture of Nostoc linckia to chemical
compounds with metals in terms of modifying the antioxidant status of biomass. It was demonstrated
effectiveness of Nostoc biomass as biosorbent in polluted multimetallic systems and as matrix for

bionanosynthesis.
Practical value. In this paper were making the parts of complex technology of Nostoc linckia
cultivation and efficient use of biomass, which can be applied as a whole and as autonomous units:
procedures for Nostoc biomass with high antioxidant activity; efficient extraction procedures of
antioxidant components from Nostoc biomass; procedures for obtaining the biomass with silver
nanoparticles; procedures for the use of biomass residue after obtaining the antioxidant preparations as
effective biosorbent.
Implementation of scientific results. Technology of obtaining the antioxidant preparation AON
was implemented at LTD "Ficotehfarm" (Implementation Act Nr. 03/11 from 20.11.2014).

LISTA ABREVIERILOR

ABTS

2,2 azinobis 3-etilbenzotiazolina-6- acidului sulfonic

APX

ascorbat peroxidaza

BAU

biomas absolut uscat

CNM-CB

Colecia Naional de Microorganisme Nepatogene Cianobacterii

CRFC

capacitatea de reducere a reagentului Folin-Ciocalteu

CRFM

capacitatea de reducere a reagentului fosfo-molibdenic

CT

catalaza

DAM

dialdehida malonic

DPPH

1,1 difenil-2-picril hidrazil

EAM

extragere asistat de microunde

EAU

extragere asistat de ultrasunet

EFP

extragere n fluide presurizate

EFS

extragere n fluide supercritice

FBR

fotobioreactor

GPX

glutation peroxidaza

LDL

Low-density lipoprotein (lipide cu densitatea joas)

POx

peroxidazele

SOD

superoxiddismutaza

SRO

specii reactive ale oxigenului

TEAC

echivalentul trolox al activitii antiradicalice

INTRODUCERE
Actualitatea i importana cercetrilor. n ultima perioad interesul n ceea ce privete
alternativa natural n schimbul a tot ceea ce este obinut prin sintez chimic este tot mai mare.
Substanele naturale cu proprieti antioxidante i antiradicalice capt o aplicare tot mai larg n
industria alimentar, cosmetic, i, n special, n cea farmaceutic n calitate de remedii eficiente
n contracararea aciunii nefaste a radicalilor liberi i n stoparea proceselor prooxidante, care
genereaz diferite stri patologice [143, 167, 188, 218]. Remarcm c utilizarea antioxidanilor
sintetici este tot mai limitat datorit activitii lor suspectate ca i promotori de carcinogenez,
precum i de o respingere cert de ctre consumatori a aditivilor alimentari sintetici. Astfel,
administrarea de antioxidani naturali are o importan major i perspective benefice pronunate
n meninerea statutului redox normal al organismului. Cianobacteriile, printre care i speciile
genului Nostoc, de rnd cu faptul c sunt cunoscute ca biofertilizatori, posed un potenial imens
n calitate de surse pentru producerea de antioxidani care nsumeaz enzime antioxidante,
pigmeni, polizaharide funcionale, vitamine, compui fenolici, etc. [58, 76, 94; 118, 142; 179].
Valoarea cianobacteriilor ca surs de antioxidani naturali este n continuare consolidat prin
uurina relativ de purificare a compuilor int. Totodat, activitatea antioxidant pronunat a
cianobacteriilor este datorat i distribuiei lor cosmopolite, de unde evolutiv au fost nzestrate cu
mult mai multe mecanisme de meninere a viabilitii dect orice alte organisme biologice.
Intensitatea sintezei componentelor cu aciune antioxidant i antiradicalice se modific esenial
pe parcursul ciclului de dezvoltare a culturilor, dar i sub aciunea unor factori externi. Raportul
cantitativ al acestor principii biologic active determin caracterul aciunii antioxidante a
biomasei i respectiv a extractelor sau a preparatelor complexe obinute n baza acestei biomase.
Tehnologiile de cultivare a cianobacteriilor i n particular a tulpinilor de Nostoc linckia n
scopul de a obine diferii antioxidani urmeaz a fi axate att pe respectarea necesitilor
fiziologice ale culturii pe durata fluxului tehnologic, ct i pe utilizarea raional a posibilitilor
de modificare a statutului antioxidant al biomasei.
Necesitatea n antioxidani naturali este argumentat att din punct de vedere tiinific, ct
i din punct de vedere al cerinei pieii acestor produse. Produsele naturale, inclusiv cele cu efect
antioxidant, sunt mai atractive datorit acceptrii de ctre marea majoritate a populaiei instruite
a modului sntos de via, unul dintre componentele cruia este utilizarea produselor de origine
natural n schimbul celor obinute prin diferite tipuri de sintez [64]. Motivele expuse au dat un
impuls simitor cercetrilor orientate spre identificarea noilor surse de antioxidani naturali,
precum i a procedeelor de obinere a preparatelor eficiente, standardizate i sigure pentru
utilizarea de ctre om. Printre obiectele ce prezint interes n acest sens sunt cianobacteriile.
9

Biomasa acestora conine numeroase componente care asigur protecia celulelor de aciunea
duntoare a speciilor reactive de oxigen, acionnd ca antioxidani preventivi, care blocheaz
procesele de formare a radicalilor liberi; prevenind perooxidarea lipidelor i formarea radicalilor
lipidici; stingnd reaciile de autooxidare i oxigenul singlet; acionnd ca factori de chelare a
metalelor cu valena variabil, inhibnd aciunea enzimelor prooxidante [33, 123, 189]. La
moment este stabilit, c biomasa cianobacteriilor din genul Nostoc, inclusiv specia Nostoc
linckia, conine un ir de substane cu efect antioxidant i antiradicalic, aa ca pigmenii
ficobilinici i cei carotenoizi, enzime antioxidante, polizaharide, inclusiv cele sulfatate .a. [98,
99, 119, 171]. Sumnd aici i faptul, c printre reprezentanii cianofitelor Nostoc linckia este
lipsit de efecte toxice asupra organismelor vii, fiind utilizat n hran peste 2000 mii ani,
considerm oportune cercetrile orientate spre elaborarea tehnologiilor de cultivare a acestei
culturi biotehnologice n calitate de surs de produse bioactive.
Scopul lucrrii const n elaborarea tehnologiei complexe nonpoluante de cultivare a
cianobacteriei Nostoc linckia, de obinere a preparatelor cu efect antioxidant i de valorificare a
reziduului de biomas.
Obiectivele lucrrii:

Monitorizarea modificrilor biochimice i a activitii antioxidante a biomasei i extractelor


din ea pe durata dezvoltrii culturii statice de Nostoc linckia;

Evidenierea indicatorilor biotehnologici cu tangen la ciclul vital, utili pentru obinerea


preparatelor antioxidante din biomasa de Nostoc linckia;

Stabilirea parametrilor biotehnologici optimi de extragere i pstrare pe termen lung a


componentelor cu efect antioxidant din biomasa de nostoc;

Elucidarea particularitilor modificrii coninutului de componente antioxidante n biomasa


cianobacteriei Nostoc linckia n condiii de stres oxidativ indus prin aciunea compuilor
Fe(III);

Studiul posibilitii valorificrii reziduului de biomas de Nostoc linckia dup extragerea


componentelor cu efect antioxidant;

Elaborarea tehnologiei complexe de cultivare a Nostoc linckia, de obinere a preparatelor cu


efect antioxidant i de utilizare a reziduului de biomas n calitate de biosorbent eficient n
tehnologiile de purificare a mediului i n calitate de matrice pentru biosinteza
nanoparticulelor de argint.
Noutatea tiinific. Pentru prima dat este pus problema elaborrii unei tehnologii de

cultivare a cianobacteriei Nostoc linckia ca surs pentru obinerea preparatelor complexe cu


10

efect antioxidant. Pentru prima dat a fost elaborat o tehnologie de cultivare a Nostoc linckia,
care include etapa de valorificare a reziduului de biomas dup extragerea antioxidanilor n
calitate de biosorbent eficient pentru metalele grele i n calitate de matrice pentru biosinteza
nanoparticulelor de argint.
Problema tiinific important soluionat const n identificarea elementelor-cheie a
procesului biotehnologic de cultivare a cianobacteriei Nostoc linckia cu scopul producerii
preparatelor cu efect antioxidant i valorificrii reziduului de biomas.
Semnificaia teoretic. Au fost acumulate i expuse rezultate noi despre importana
monitorizrii modificrilor biochimice i al statutului antioxidant ale biomasei de Nostoc linckia
pe durata ciclului culturii statice. A fost evideniat pragul nalt de sensibilitate a culturii de
Nostoc linckia fa de compuii chimici cu metale n ceea ce privete modificarea statutului
antioxidant al biomasei. A fost demonstrat eficiena biomasei de nostoc n calitate de biosorbent
n sistemele multimetalice poluate i matrice pentru biosinteza nanoparticulelor de argint.
Valoarea aplicativ a lucrrii. n cadrul acestei lucrri au fost elaborate prile
componente ale unei tehnologii complexe de cultivare a Nostoc linckia i utilizare eficient a
biomasei obinute care pot fi aplicate att ntr-un ansamblu, ct i n calitate de uniti autonome:
procedee de obinere a biomasei de nostoc cu activitate antioxidant nalt; procedee de
extragere eficient a componentelor cu efect antioxidant din biomasa de nostoc; procedee de
obinere a biomasei de nostoc cu nanoparticule de Ag; procedee de utilizare a reziduului de
biomas de nostoc dup obinerea preparatelor antioxidante n calitate de biosorbent eficient i n
calitate de matrice pentru biosinteza nanoparticulelor de argint.
Aprobarea rezultatelor tiinifice. Materialele expuse n teza de doctorat au fost
comunicate la: Conferina a V-a internaional Actual Problems in Modern Phycology,
Chiinu, 2014; cea de-a VI-a conferin internaional a tinerilor cercettori Biodiversity.
Ecology. Adaptation. Evolution, Odessa; Ucraina, 2013; Conferina tiinific internaional
interdisciplinar

Biologically active substances and materials: Fundamental and Applied

Problems, Novii Svet, Ucraina, 2013; Conferina tiinifico-practic internaional a tinerilor


cercettori Pontus Euxinus; Sevastopol, Ucraina, 2013;

Cea de-a doua conferin

internaional n Nanotehnologie i Inginerie biomedical, Chiinu, Moldova, 2014; Conferina


internaional dedicat celei de-a 55-a aniversare de la fondarea Institutului de Chimie al AM;
Chiinu, Moldova, 2014; cel de-al III-lea simpozion naional cu participare internaional
Biotehnologii avansate realizri i perspective, Chiinu, Moldova, 2013.
Publicaiile la tema tezei. Rezultatele sunt reflectate n 24 publicaii tiinifice: 9 articole
n reviste recenzate (2 n reviste cu factor de impact; 2 - n monoautorat), 12 rezumate ale
11

comunicrilor tiinifice, 3 brevete de invenie.


Volumul i structura tezei. Teza const din 4 capitole; are un volum de baz de 131
pagini, conine 10 tabele i 49 figuri. Lista surselor bibliografice citate include 292 titluri.
Cuvintele cheie: Tehnologie de cultivare, cianobacterii, Nostoc linckia, extracte hidrice i
etanolice, preparate antioxidante, biosorbent, bionanosintez.
Sumarul compartimentelor tezei. Teza const din 4 capitole, primul dintre care prezint
analiza situaiei din domeniu, iar urmtoarele trei reflect contribuiile metodice i rezultatele
propriilor cercetri.
Capitolul 1 Antioxidani din cianobacterii tehnologii de obinere i perspective de
utilizare. Capitolul cuprinde analiz ampl a tehnologiilor contemporane de cultivare a
cianobacteriilor. Sunt comparate sistemele deschise i nchise n care are loc creterea diferitor
tulpini valoroase de cianobacterii, evideniate avantajele i dezavantajele cultivatoarelor
contemporane. Sunt analizai factorii de baz care influeneaz rezultatul procesului
biotehnologic de obinere a biomasei cianobacteriene. Se atrage, de asemenea, atenie la
cheltuielile energetice i de resurse, necesare pentru realizarea procesului tehnologic. Este
prezentat o ampl caracteristic a substanelor cu efect antioxidant, care au fost depistate n
biomasa cianobacteriilor de ctre diferii cercettori. Se pune accent pe faptul, c biomasa
cianobacteriilor include componente, care acoper toat gama de mecanisme ale proteciei
antioxidante (de prevenire a formrii radicalilor liberi; de stingere a radicalilor cu ajutorul
componentelor enzimatice i non-enzimatice i de reparare a deteriorrilor, aprute ca rezultat al
interaciunii radicalilor liberi cu macromoleculele biologice).

Datorit acestei diversiti

ciabobacteriile pot fi considerate surse universale pentru elaborarea preparatelor complexe de


antioxidani, care ar asigura protecia pe toate liniile de aciune a radicalilor n sistemele vii. n
acest compartiment mai este analizat i aspectul posibilitii modificrii cantitative i calitative a
complexului de antioxidani (ori a fiecrui component n parte) prin aplicarea diferitor factori
fizici i chimici. Sunt aduse exemple de rspuns prompt al cianobacteriilor la stresul oxidativ
prin modificri n coninutul antioxidanilor cu masa molecular mic.
Capitolul include o caracteristic comparativ a tehnologiilor contemporane, care sunt
utilizate n prezent pentru extragerea componentelor cu efect antioxidant din biomasa
cianobacterian. Este demonstrat c actualmente exist cerere pronunat din partea diferitor
companii n ceea ce ine de tehnologiile simple, ieftine i eficiente de obinere a preparatelor
antioxidante. Dup o analiz a domeniilor de utilizare a antioxidanilor, se ajunge la concluzia,
c Nostoc linckia, care i-a avut ntrebuinare doar n calitate de biofertilizator, ori ca produs
alimentar n zone geografice foarte mici poate deveni un obiect ficobiotehnologic de valoare
12

pentru obinerea produselor antioxidante, att datorit componenei biomasei, ct i cerinelor


minime n procesul de cultivare industrial. n final este formulat problema de cercetare i
direciile de rezolvare a acesteia, sunt definite scopul i obiectivele prezentei lucrri.
Capitolul 2 Activitatea antioxidant i componena biochimic a biomasei de
Nostoc linckia pe durata ciclului vital
Capitolul este dedicat cercetrilor orientate spre elucidarea aspectelor specifice de
dezvoltare a culturii statice de nostoc. Este fcut o paralel ntre parametrii monitorizai la
creterea Nostoc linckia n condiii de laborator i n condiii de producere. Au fost stabilite
modificrile n coninutul de proteine totale, ficobiliproteine, lipide, polizaharide, fenoli pe
durata ciclului vital. Au fost monitorizate modificrile activitii antiradicalice n extractele
hidrice i hidro-etanolice obinute din biomasa de nostoc la diferite etape ale ciclului vital. n
scopul aprecierii nivelului de siguran a biomasei de nostoc, a fost monitorizat nivelul de
acumulare n biomas a produselor peroxidrii lipidelor (dialdehida malonic). A fost stabilit, c
att n condiii de laborator, ct i n condiii de producere ciclul vital al culturii statice de Nostoc
linckia relev un model de cretere caracteristic, iar durata optim din punct de vedere
biotehnologi este de 12 zile n condiii de producere, i 10 zile n condiii de laborator.

condiii de laborator, datorit transferului de cultur n condiii similare cu cele pentru obinerea
inocului, faza de laten este practic imperceptibil, iar n condiii de producere are aspect clasic
cu lipsa complet a creterii culturii. Pe durata ciclului vital modificrile cantitative ale
principalelor componente ale biomasei de nostoc

au limite destul de restrnse, ceea ce

caracterizeaz cultura de Nostoc linckia ca una cu grad ridicat al homeostaziei. Aceasta uureaz
semnificativ manipularea culturii n condiii industriale i simplific procedurile din cadrul
tehnologiilor aplicate. Rezultatele testelor DPPH, ABTS i CRFM demonstreaz, c cultura de
nostoc n condiii de laborator manifest un comportament mai variat n ceea ce ine de
acumularea componentelor antioxidante hidro- i etanol solubile. Astfel, prin fluctuaii valorice
se manifest perioada de laten, nceputul i mijlocul fazei de cretere exponenial, perioada
de declin. n condiii de producere este evident o singur variaie a capacitii de reducere a
radicalilor liberi la nceputul ciclului vital. Cei mai stabili parametri pentru cultura de nostoc n
condiii de laborator se obin la ziua a 10-11-a de cultivare, ce corespunde fazei staionare.
Aceast perioad se caracterizeaz prin cel mai nalt nivel al biomasei i cea mai stabil
activitate antiradicalic i antioxidant.

n condiii de producere, perioada de recoltare a

biomasei n aceleai scopuri poate fi extins. Nivelul sczut al DAM n biomasa de Nostoc

13

linckia la etapele recomandate pentru cultivarea biomasei confirm sigurana acestei biomase,
precum i a produselor, care ulterior pot fi obinute din ea.
Capitolul 3 Extragerea i pstrarea componentelor cu efect antioxidant din biomasa
de Nostoc linckia
Capitolul este dedicat cercetrilor care au avut drept scop de a scoate n eviden principalii
factori ce intervin n procesul de extragere a componentelor bioactive cu activitate antioxidant
din biomasa de nostoc i asigurarea unor parametri optimali ai procesului de obinere a unui
produs calitativ, activ i sigur pentru consumul uman i animal.
Cercetrile orientate spre elaborarea unor tehnologii de obinere a preparatelor antioxidante
n baza biomasei cianobacteriei Nostoc linckia au permis determinarea componentelor care stau
la baza cercetrilor efectuate. Au fost determinate condiiile de obinere a extractelor
antioxidante din biomasa nativ de Nostoc linckia. A fost determinat solventul optimal,
concentraiile lui i durata procesului de extragere. Prin compararea rezultatelor obinute la
extragerea principiilor antioxidante cu etanol i metanol de diferite concentraii a fost
demonstrat posibilitatea aplicrii etanolului la toate etapele de obinere a preparatelor cu efect
antioxidant i antiradicalic.
Extractele hidrice, hidro-etanolice i etanolice din biomasa de nostoc se caracterizeaz prin
activitate antioxidant determinat de diferite componente. Degradarea n timp a extractelor din
biomasa de nostoc poate fi ncetinit prin suplimentarea unor cantiti extrem de mici de
antioxidani sintetici. Au fost aplicai antioxidanii: tocoferol, soluie etanolic; acid ascorbic,
soluie hidric i trolox, soluie etanolic. A fost specificat antioxidantul propus spre
suplimentare n dependen de tipul extractului obinut.
A fost demonstrat capacitatea complexului antioxidant, obinut din biomasa nativ de
nostoc de a proteja uleiurile vegetale de oxidare agresiv, indus de condiiile de pstrare.
Implicarea componentelor antioxidante din biomasa de nostoc n procesul de protecie oxidativ
este susinut de testele antioxidante nespecifice care au demonstrat creterea activitii
antioxidante a uleiurilor vegetale suplimentate cu complex antioxidant din nostoc.
Extractele hidrice, etanolice i hidro-etanolice din biomasa de nostoc posed un nivel
diferit de activitate antioxidant i de stabilitate, care pot fi modificate prin aplicarea dozelor
minimale de stabilizatori.
Capitolul 4 Elaborarea tehnologiilor complexe nonpoluante de cultivare a Nostoc
linckia i de obinere a preparatelor antioxidante
n acest capitol sunt descrise rezultatele studiului posibilitii modificrii statutului
antioxidant al biomasei de nostoc prin aciunea diferitor compui chimici (compui coordinativi
14

cu diferii liganzi). Spre deosebire de alte culturi ficologice aa ca Dunaliella salina i


Porphyridium cruentum, care au rspuns prompt la aceste aciuni, Nostoc linckia s-a dovedit a fi
destul de inert. Astfel, cu toate c pentru anumii compui au fost stabilite efecte de sporire a
anumitor componente ale biomasei, activitatea antioxidant a extractelor complexe rmnea n
limitele normei, iar n unele cazuri a fost nregistrat o cretere semnificativ a procesului de
acumulare a produselor peroxidrii lipidice. Din toat gama de compui testai doar patru au
dus la cretere vizibil a activitii antioxidante a biomasei de nostoc. Acetia sunt N-(8,13biciclohomofarnesenoilamino) carbazolul,

1-(8,13-biciclohomofarnesenoil)-3-amino-1,2,4-

triazolul, compusul [Fe(H2L1)(H2O)2](NO3)31.5H2O (unde L1 - hidrazida acidului izonicotinic)


i compusul [Fe(H2L2)(H2O)2](NO3)35H2O (unde L2 - hidrazida acidului inicotinic). Primii doi
compui asigur creterea activitii antioxidante a extractului etanolic de 70% alcool etilic cu
concentraia de 1 mg/ml substana activ, obinut n baza biomasei de nostoc de 2,11-2,73 ori
fa de varianta martor, iar compuii fierului cu bazele Shiff sporesc activitatea antiradicalic a
extractelor hidrice din biomasa de nostoc pn la 95% inhibiie ABTS+. Odat cu creterea
activitii antioxidante a extractului etanolic crete i valoarea biomasei de nostoc n calitate de
productor de substane antioxidante.
Proprietile compuilor 1-(8,13-Biciclohomofarnesenoil)-3-amino-1,2,4-triazolul i N(8,13-biciclohomofarnesenoil-amino)carbazolului

prezint interes pentru biotehnologie n

calitate de stimulatori al activitii antioxidante al biomasei cianobacteriei Nostoc linckia. Aceste


rezultate au stat la baza elaborrii i obinerii a dou brevete de invenie n colaborare cu colegii
chimiti care au realizat sinteza compuilor (Brevet MD 4326, Brevet MD 4327) [1,2].
n legtur cu creterea interesului tiinific i practic fa de biosinteza diferitor
nanoparticule, n lucrare sunt aduse argumente n susinerea afirmaiei, c biomasa rezidual de
Nostoc linckia este o matrice eficient pentru biosinteza nanoparticulelor de argint. Sinteza
nanoparticulelor a fost monitorizat timp de 72 ore. n cazul nanoparticulelor de argint
importana acestui studiu revine din destinaia acestora. Nanoparticulele de sintez biologic sunt
precutate n calitate de preparate anticancerigene, iar n acest caz asocierea cu o nalt activitate
antioxidant ar oferi remedii eficiente care au mari perspective de valorificare n viitor.
Rezultatele demonstreaz, c la 24 ore de la declanarea bionanosintezei biomasa de nostoc
poate fi considerat surs att de nanoparticule, ct i de antioxidani.
A fost studiat posibilitatea de utilizare a biomasei reziduale dup extragerea
componentelor antioxidante n calitate de biosorbent eficient pentru metalele grele. A fost
demonstrat, c reziduul de biomas poate acumula cantiti considerabile de Ni, Cr, Fe, Zn .a. A
15

fost studiat posibilitatea de utilizare a biomasei de nostoc pentru acumularea cromului i


nichelului din apele reziduale ale industriei galvanice. Dup un contact de 30 min ntre apele
reziduale cu coninut nalt de crom i biomasa de nostoc are loc acumularea a 84% din ionii
acestui metal. Paralel cu aceasta biomasa mai acumuleaz i ionii de fier i zinc, iar concentraia
acestora n biomas dup 30 min crete de 6 i 8 ori respectiv. De asemenea are loc o acumulare
activ a cobaltului, cuprului care sunt prezeni n apele reziduale respective. n cazul apelor
reziduale cu coninut nalt de nichel biomasa de nostoc timp de 30 min de contact acumuleaz
pn la 50% din ionii prezeni.
Biomasa de nostoc rmas dup extragerea componentelor antioxidante a fost testat i n
sisteme multicomponente ce simuleaz componena metalic a apelor reziduale de la
solubilizarea alcalin a uraniului din minereu. A fost demonstrat, c biomasa de nostoc asigur
recuperarea eficient a fierului, zincului, cromului i cuprului. Cromul din aceast sistem se
acumuleaz n proporie de 69 %, zincul de 72%, fierul de 61%. Cel mai nalt nivel de
retenie a fost nregistrat pentru Cu(II). Pentru acest element nostocul asigur acumularea a 86%
din cantitatea prezent n soluia de cercetat. Astfel, biomasa de Nostoc linckia dup extragerea
componentelor antioxidante se transform n produs deosebit de preios cu proprieti de
biosorbent de performan.
A fost elaborat schema realizrii tehnologiei complexe de cultivare a cianobacteriei
Nostoc linckia i de obinere a preparatelor antioxidante, care include nu numai procedeele de
cultivare a cianobacteriei n condiii controlate i cele de obinere a preparatelor antioxidante
eficiente n anihilarea radicalilor liberi, ci i procedeele de utilizare a reziduului de biomas,
rmas dup extragerea componentelor antioxidante n bionanosintez ori n procesul de
purificare a apelor reziduale ce conin metale.

16

1.

ANTIOXIDANI DIN CIANOBACTERII TEHNOLOGII DE OBINERE I


PERSPECTIVE DE UTILIZARE
Creterea spectaculoas a interesului fa de antioxidani n ultimul timp este determinat

n mare msur de faptul, c multe stri patologice, maladii complicate, procese de mbtrnire a
organismelor sunt asociate cu stresul oxidativ. Generarea speciilor reactive ale oxigenului
(SRO), speciilor reactive ale azotului (SRN) i ale clorului este o consecin inevitabil a vieii
n mediul cu coninut de oxigen. Celulele produc SRO n procesele metabolice normale, acestea
avnd funcii fiziologice importante de protecie antimicrobian i antifungic, de transducie de
semnal. SRO sunt derivate ale oxigenului caracterizate prin reactivitate chimic nalt i abilitate
de a aciona n calitate de oxidani. La aceast categorie se refer radicalii liberi - specii ce
conin electroni necuplai cu reactivitate nalt, aa ca superoxidul O2- i hidroxilul OH i
molecule aa ca peroxidul de hidrogen H2O2 i peroxinitritul ONOO care nu sunt radicali, dar
pot fi de asemenea ageni oxidani n sistemele biologice. n condiii fiziologice normale exist
un echilibru ntre generarea SRO

i activitatea sistemelor

antioxidante care diminueaz

cantitatea speciilor reactive [23, 31, 97, 191, 289, 291]. Producerea excesiv de SRO ori
diminuarea activitii sistemei antioxidante duce la starea de stres oxidativ. Stresul oxidativ duce
la deteriorarea

lipidelor,

ADN-ului i proteinelor, ceea ce se asociaz cu diferite stri

patologice, inclusiv maladia Alzheimer, artrita reumatoid, astma, diabetul, i n special


maladiile cardiovasculare [105, 176].
Atunci cnd sistemul antioxidant propriu nu face fa cantitii de radicali liberi, este
necesar de a suplini aportul de substane cu efect antiradicalic din exterior, fiind prezente dou
alternative posibile utilizarea antioxidanilor sintetici sau a celor naturali. Consumatorul n cele
mai multe cazuri pledeaz pentru produsele naturale din aceast cauz, cercetrile orientate spre
evidenierea noilor surse i a noilor tehnologii de obinere a produselor cu efect antioxidant
rmn a fi deosebit de actuale. Astfel de cercetri, n cazul c au drept scop obinerea unui
produs finit, trebuie s includ mai multe componente: elaborarea i optimizarea tehnologiilor
destinate obinerii materiei prime a biomasei - din care vor fi obinute preparatele; elaborarea
metodelor de apreciere a calitii biomasei, adic a coninutului de compui de interes i a
nivelului de inofensivitate i siguran durabil pentru consumator; elaborarea procedeelor
eficiente de extragere i procesare ulterioar a componentelor active din biomas; elaborarea
procedeelor de pstrare n timp a proprietilor antioxidante a preparatelor elaborate i
evidenierea domeniilor de utilizare a produselor finite.

17

1.1. Tehnologii de cultivare a cianobacteriilor


Cianobacteriile reprezint una dintre cele mai vechi i cele mai de succes forme de via pe
Pmnt. Lunga istorie evolutiv i modul de via fotoautotrof le-a permis s colonizeze diverse
habitate, fiind n prezent cel mai important grup de organisme din punct de vedere numeric [177,
219 ]. Biomasa global a cianobacteriilor se estimeaz la mii de milioane tone, ns exploatarea
acestor surse de ctre om este insuficient, chiar daca potenialul lor biotehnologic este nalt
apreciat la nivel global.
Cea mai mare parte din biomasa microalgal utilizat n scopuri biotehnologice este
produs industrial, fie prin cultivare extensiv cu asigurarea unei iluminri si a unui schimb
suficient de gaze (cultivare autotrof), fie prin cultivare alternativ cu utilizarea substraturilor
organice n calitate de surs de carbon i energie (cultivare mixotrof sau heterotrof). Chiar
dac de la apariia sa n anii 1940 ficologia aplicat a marcat realizri importante n cultivarea i
valorificarea microalgelor ca obiecte biotehnologice, nivelul produciei globale a biomasei algale
este nc jos (9.000 -10.000 t substan uscat pe an), iar preul biomasei este nalt, variind de la
10 la 300 EUR kg-1 [67]. Varietatea i valoarea produselor obinute din biomasa algal, precum
i utilizarea larg a microalgelor n procesul de prelucrare a apelor reziduale, fertilizare a solului,
obinerea de biocombustibil etc. dicteaz necesitatea perfecionrii continue a tehnologiilor de
cultivare [56, 66, 93, 101, 224, 228, 265].
Elaborarea i industrializarea tehnologiilor de cultivare n mas a microalgelor, inclusiv a
cianobacteriilor, presupune parcurgerea mai multor etape n cercetri la nivel de laborator, pilot
i industrial, conform schemei ce urmeaz.
n continuare vom analiza cele mai importante etape ale acestui proces prin prisma
cercetrilor realizate pn n prezent din momentul cnd cultivarea n mas a microalgelor a
devenit o realitate.

Etapa de laborator
* Izolarea i selecia culturilor;
* ntreinerea culturilor
productoare;
* Pregtirea culturii de inocul;
* Optimizarea mediului de
cultur;

Etapa de staie pilot


* Verificarea tehnologiei
elaborate n laborator i
optimizarea ei pe instalaii
de capacitate medie;
* Elaborarea procesului
tehnologic pilot;

Etapa industrial
* Elaborarea i construirea
sistemelor de cultivare n
mas (fotobioreactoarelor);
* Analiza factorilor, ce
determin productivitatea
fotobioreactoarelor;
* Optimizarea metodelor de
separare a biomasei i a
componentelor ei.

* Optimizarea condiiilor de
cultivare.

18

1.1.1. Izolarea i selecia culturilor de productori


Principiile de baz ale culturii microbiene sunt, n linii generale, aplicabile i n cazul
cianobacteriilor. Totui, aceste obiecte de studiu posed o capacitate unic, ce le deosebete de
alte microorganisme i anume fotosinteza. De aceea iluminarea este o condiie obligatorie pentru
izolarea, cultivarea i meninerea culturilor fotoautotrofe i mixotrofe.
Izolarea microalgelor ncepe prin selectarea surselor (probele de sol sau ap sunt colectate
din diverse habitate), urmat de mbogirea culturii pe medii i n condiii specifice obiectului
dat, izolarea propriu-zis prin transferarea celulelor pe medii sterile i producerea culturii
axenice prin tehnicile cunoscute n practica biotehnologic.
Screening-ul tulpinilor izolate n vederea identificrii moleculelor bioactive se efectueaz
prin metode directe (determinarea produsului-int specific) sau indirecte (determinarea
activitii biologice a produsului dorit). Aici trebuie s menionm progresele importante n
elaborarea metodelor i aparatajului de nalt performan ce permit o detectare rapid, selectiv
i exact a produselor metabolice microalgale. Astzi pentru identificarea produselor algale de
importan biotehnologic (pigmeni, acizi grai, lipide, polizaharide etc.) se utilizeaz pe larg
cromatografia lichid de nalt performan (HPLC), gaz cromatografia (GC), spectrometria de
mas (MS) i spectrometria de rezonan magnetic nuclear (NMR) [88, 243]. La fel, i testele
biologice indirecte cunosc o dezvoltare i perfecionare continu, fiind aplicate n cazul
determinrii activitii antibiotice i antitumorale a metaboliilor algali [212].
Mii de culturi algale au fost izolate din habitatele lor naturale, dar numai cteva din ele au
ajuns s fie cultivate pe scar larg n scopuri industriale. Procesul de identificare a tulpinilor de
interes biotehnologic este unul de lung durat, fiind dependent de mai muli parametri. Unul din
parametrii puin studiai, dar foarte importani pentru cultivarea mai ales n sistemele deschise,
este specificitatea ecologic a tulpinilor izolate de cianobacterii. Mai multe studii efectuate
asupra diferitor tulpini de Athrospira (Spirulina) izolate din diverse medii, au demonstrat un
rspuns variabil la aciunea factorilor mediului. Aceast variabilitate ar trebui s stea la baza
selectrii culturilor de interes biotehnologic: de exemplu, tulpini foto-, termo- sau osmotolerante.
Utilizarea de ctre productorii industriali a culturii de inocul mixte este o cale de a compensa
lipsa unor tulpini productoare adaptate la anumii factori ai mediului [30, 120].
1.1.2. Optimizarea mediilor de cultur i parametrilor de cultivare
Alegerea mediului de cultur reprezint o etap cheie n cultivarea microalgelor ce a fost
ntotdeauna printre preocuprile majore ale specialitilor, deoarece poate influena aspectele
economice ale procesului de producie.
19

n linii generale, exigenele nutritive ale microalgelor sunt legate de modul de nutriie
predominant fotoautotrof. A.Vonshak a sistematizat factorii nutritivi de importan major
pentru elaborarea reetelor mediilor de nutriie, dup cum urmeaz [249]: coninutul total de
sruri minerale, care este determinat de habitatul de provenien a tulpinii; - compoziia celular
n ce privete componentele ionice majore: K+, Mg2+, Na+, Ca2+, SO4-, Cl-; sursele de azot
(nitrat, amoniu, uree); sursa de carbon (CO2 sau HCO3); pH-ul; microelementele i agenii de
chelare (de exemplu EDTA); vitaminele.
De obicei formulele mediilor de cultur sunt calculate n aa fel, nct aportul nutrienilor
s fie n exces ca sa nu devin un factor limitativ. ns e important de a ine cont de scopul
cultivrii tulpinii respective: meninerea culturii n colecie, cultivarea ei pentru obinerea unei
cantiti optime de biomas, sau cultivarea ei n condiii de stres pentru biosinteza produselor
valoroase vor necesita diferite formule ale mediilor nutritive. n scopuri aplicative nutrienii pot
fi intenionat administrai n concentraii limitative. De exemplu, la cultivarea Dunaliella salina
excesul de azot i salinitatea joas contribuie la obinerea unei cantiti optime de biomas, pe
cnd salinitatea nalt i coninutul redus de azot contribuie la sporirea carotenogenezei.
Conform rezultatelor multiplelor cercetri, pentru creterea i dezvoltarea organismelor
fotoautotrofe sunt necesare aproximativ 30 elemente nutritive. Majoritatea din aceste
macroelemente (n g/l) i microelemente (n mg/l) se regsesc n mediile nutritive cunoscute n
practica ficobiotehnologic: mediile BG-1, Allen modificat, Bold, Gromov - utilizate pentru
cultivarea algelor verzi i cianobacteriilor; mediile Sorokin i Krauss elaborate special pentru
Chlorella; mediul Zaroukk - pentru Spirulina; mediul Ben-Amotz i Avron elaborat pentru
Dunaliella [91]. Cei mai importani nutrieni pentru creterea autotrof sunt carbonul, azotul i
fosforul.
Carbonul. Aprovizionarea cu CO2 i HCO3- este cea mai important condiie pentru
asigurarea unei rate nalte a produciei autotrofe. Spre deosebire de plantele de cultur, bioxidul
de carbon din atmosfer nu poate satisface necesitile sistemelor de biosintez de randament
nalt ale algelor autotrofe. De exemplu, difuzia CO2 n sistemele deschise de cultivare pot susine
o productivitate de maximum 10 g/m2/zi . Sistemul CO 2- H2CO3 - HCO3- - CO3

2-

este cel mai

bun mod de control i meninere a nivelului pHului optimal pentru speciile cultivate de
microalge [68, 81, 91, 235]. Pentru cultivarea mixotrof a unor specii de microalge se folosesc i
alte surse de carbon, cum ar fi glucidele, acizii organici sau alcoolul. De exemplu, acidul acetic
este utilizat pentru controlul pH-ului la cultivarea culturilor mixotrofe de Chlorella i
Chlamydomonas reinhardtii, iar pentru majorarea productivitii microalgei Porphiridium
cruentum se folosesc cu succes alcoolii [12, p.297-320].
20

Azotul este un alt nutrient important ce contribuie la producerea de biomas. Coninutul su


n biomasa algal variaz de la 1% la 10% (n dependen de specie, nivelul de aprovizionare si
disponibilitatea sa n mediu), constituind elementul de baz al tuturor proteinelor structurale i
funcionale din celula algal. Mai muli compui sunt utilizai de ctre alge n calitate de surs de
azot, dar cel mai des n mediile nutritive acest element este adugat sub forma de nitrat (NO3),
amoniu (NH4) sau uree. Unele cianobacterii au o particularitate specific de a fixa azotul
atmosferic, adic a reduce N2 n NH4, proces catalizat de ctre enzima nitrogenaza [213]. n
general, n condiiile suplinirii suficiente cu azot, microalgele au o capacitate redus de
producere a compuilor de stocare a azotului. O excepie de la aceast regul sunt cianoficina i
ficocianina, compui de stocare a azotului din celulele numeroaselor tulpini de cianobacterii [12,
p.173-227]. De aceea primul rspuns al acestor organisme la epuizarea sursei de azot este
reducerea cantitii de ficobilisomi. Un alt rspuns tipic la insuficiena de azot este acumularea
componentelor organice, cum ar fi polizaharidele i lipidele. De fapt, pan la atingerea pragului
limit a coninutului de azot din celul, procesul de fotosintez continu (fie chiar i la o rat
sczut). n acest caz fluxul de carbon este redirecionat de la calea de sintez a proteinei spre
cile de sintez fie a lipidelor, fie a polizaharidelor. Numeroase studii confirm acest fapt pentru
diferite grupe taxonomice. O alt reacie vizibil a celulelor algale la insuficiena de azot este
decolorarea celulelor (reducerea cantitativ a clorofilelor i sporirea cantitii de carotenoizi).
Aceast reacie caracteristic multor specii de alge este utilizat n scopul stimulrii sintezei
bunoar a -carotenului la Dunaliella salina sau astaxantinei la Haematococcus pluvialis.
Cercetrile efectuate de Zhekisheva .a. [262]

arat interdependena, n cazul epuizrii

rezervelor de azot, a proceselor de sintez a astaxantinei i a acidului oleic la Haematococcus


pluvialis, fapt ce contribuie la meninerea coninutului nalt al esterilor astaxantinei n celul.
Deci, suplinirea adecvat a acestui important nutrient este un factor ce nu trebuie neglijat n
procesul optimizrii mediilor de cultur pentru biotehnologia algal.
Fosforul este un element esenial pentru creterea microalgelor, avnd un rol important n
astfel de procese metabolice cum ar fi transferul de energie, sinteza acizilor nucleici etc. Sursa
preferat de fosfor pentru microalge este ortofosfatul (PO42-), incorporat n componentele
organice prin intermediul diferitor tipuri de fosforilare, iar asimilarea sa este dependent de
energie. Dei coninutul su n biomas nu depete 1%, fosforul este deseori factorul limitativ
principal n biotehnologia algal, datorit proprietii sale de a se lega uor cu ali ioni formnd
precipitat i devenind neasimilabil. O capacitate important a algelor este cea de a depozita
excesul de fosfor sub form de granule polifosfatice n timpul aa zisei asimilri de lux. Aceste
rezerve pot fi utilizate ulterior n cazul deficienei de fosfai.
21

La fel ca i azotul, fosforul influeneaz compoziia biomasei, mai ales coninutul de lipide
i carbohidrai. Insuficiena de fosfor de asemenea duce la acumularea -carotenului i
astaxantinei, ns ntr-o msur mai mic dect n cazul azotului. Spre deosebire de azot,
insuficiena fosforului duce la degradarea neesenial a ficobilisomilor, fapt care poate fi explicat
prin multiplicarea mai rapid a celulelor ce conin noi ficobilisomi. i n sfrit menionm
importana raportului N:P n mediile nutritive, care nu numai c determin potenialul productiv,
dar i influeneaz meninerea dominanei speciei cultivate [91].
Alte elemente, ageni de chelare. Majoritatea microelementelor (Fe, Cu, Mn, Zn, Mo, Co)
din formulele mediilor nutritive sunt indispensabile pentru funcionarea enzimelor i sinteza
compuilor de importan biotehnologic. Printre elementele prezente obligatoriu n mediile de
cultur, un rol important i revine ferului datorit proprietilor sale redox i implicrii n astfel
de procese metabolice fundamentale, cum ar fi fotosinteza, respiraia, azotfixarea i sinteza
ADN. Pe de o parte, insuficiena Fe duce la degradarea c-ficocianinei i clorofilei a n celul, iar
pe de alt parte, excesul de Fe (II) n culturile algale poate provoca un stres oxidativ cu multiple
schimbri fiziologice [144, 168]. Cercetrile efectuate n acest domeniu atest o influen de
stimulare nalt a compuilor coordinativi ai ferului asupra sintezei ficobilinelor la Nostoc linckia
(de 3-3,5 ori) i ficocianinelor, carotenoizilor, activitii SOD la Spirulina platensis [12, 173227]. Sinteza acetat-indus a astaxantinei la

Haematococcus pluvialis este semnificativ

mbuntit n prezena Fe (II), iar influena stimulatoare a compuilor coordinativi ai Fe (III) cu


aminoacizi a stat la baza elaborrii unor tehnologii de sintez dirijat a acestui compus preios
[9].
Ca i n cazul fosforului, asimilarea microelementelor este limitat de capacitatea lor de a
se lega cu ali constitueni nutritivi, sedimentndu-se. Adugarea n mediul nutritiv a agenilor de
chelare, EDTA de exemplu, atenueaz aceasta problem.
Condiiile de cultivare. De rnd cu parametrii chimici (factorii nutritivi), parametrii fizici
(condiiile de cultivare) au un rol important n modelarea metabolismului, deci i a compoziiei
biochimice a celulelor algale. Sensibilitatea celulelor algale la influena factorilor mediului
(iluminare, temperatur, turbulen, salinitate) este pe larg folosit n biotehnologie pentru
obinerea componenei celulare prognozate.
Iluminarea.

Influena

iluminrii

asupra

componentelor

biochimice

ale

algelor

fotosintetizante este pe larg controlat de procesul de fotoadaptare, cnd celulele algale sufer
schimbri biochimice, fiziologice, biofizice i structurale pentru a intensific procesul de
fotosintez i cretere [170]. O tendin comun a rspunsului celular la diminuarea intensitii
luminii este de a mri cantitatea pigmenilor fotosintetici: clorofila a, clorofila b, clorofila c,
22

ficobiliproteinele, carotenoizii primari. Intensificarea iluminrii induce diminuarea cantitativ a


pigmenilor implicai n procesul de fotosintez i sporirea cantitii carotenoizilor secundari cu
rol fotoprotector (-carotenul, zeaxantina, astaxantina). Intensitatea nalt a luminii duce la
mrirea cantitii de polizaharide n celulele algale. Pentru cultura Porphyridium aerugineum a
fost nregistrat o triplare a coninutului de polizaharide la triplarea iluminrii. La cultivarea n
bazine deschise a spirulinei, sinteza carbohidrailor este mult mai nalt n zile cu soare.
Numeroase studii atest o dependen invers proporional a coninutului de lipide, n special a
acizilor grai polinesaturai, de intensitatea luminii [42].
Temperatura. Influena temperaturii asupra reaciilor biochimice determin rolul ei
important n dirijarea compoziiei biochimice a microalgelor. Este bine studiat aciunea
temperaturii asupra coninutului cantitativ i calitativ al lipidelor membranare. Temperaturile mai
joase dect cele optime sporesc gradul de nesaturare a lipidelor din sistemele membranare, ceea
ce duce la o stabilitate i fluiditate mai mare a membranelor celulare i prin urmare, asigur
protecia aparatului fotosintetic contra fotoinhibrii la temperaturi joase. De asemenea s-a
constatat, ca temperaturile mai joase dect cele optime pot duce la un nivel sporit de sintez a
enzimelor n calitate de mecanism adaptiv de meninere a fotosintezei i respiraiei [163].
Temperaturile joase induc acumularea poliolilor i aminoacizilor n calitate de solutani
compatibili, ceea ce poate spori tolerana microalgelor la rcire [62]. Temperaturile nalte au un
efect stimulator asupra sintezei carotenoizilor: mrirea temperaturii de la 20o C la 30o C duce la
dublarea cantitii totale de carotenoizi sau triplarea cantitii de astaxantin la Haematococcus i
Chlorococcum sp. [141].
Salinitatea. Importana acestui factor pentru biotehnologie este determinat de perspectiva
utilizrii apelor srate pentru cultivarea industrial a microalgelor. Fiind prezente n biotopurile
cu variaii semnificative ale salinitii, microalgele i cianobacteriile pot servi drept model pentru
studiul rspunsului organismelor fotosintetizante la stresul osmotic. Diferite aspecte ale adaptrii
cianobacteriilor la salinitate nalt au fost studiate i trecute n revist [44, 122, 175, 177]. Ca
rspuns la stresul salin micoalgele sunt capabile s acumuleze molecule mici n calitate de
substane osmoreglatoare (glicerol, manitol, galactitol, sorbitol , sucroz, trehaloz). De
exemplu, capacitatea fenomenal a microalgei Dunaliella salina de a se adapta la modificarea
brusc a condiiilor osmotice se datoreaz capacitii de a-i schimba concentraia intracelular
de glicerol, care poate atinge pn la 50% din biomasa uscat [27].
Turbulena. Acest factor este foarte important mai ales pentru cultivarea n mas a
microalgelor. n condiiile cnd aportul de nutrieni este constant i condiiile de cultivare nu
limiteaz creterea culturii, agitarea cu scopul crerii turbulenei devine factorul decisiv al
23

productivitii nalte. Acest proces este important nu numai pentru asigurarea schimbului de
nutrieni i metabolii dintre cultur i mediu, dar i pentru mrirea frecvenei ciclului fazelor de
lumin i ntuneric, ducnd prin urmare la sporirea eficienei fotosintezei [90].
Efectul sinergic al combinrii factorilor chimici i fizici asupra compoziiei celulare.
Asimilarea nutrienilor depinde de toi factorii fizici ce influeneaz creterea algal. Pe parcursul
fazei luminoase a fotosintezei asimilarea nutrienilor va fi constant n condiiile unei iluminri
satisfctoare. i mai important este sinergia dintre intensitatea luminoas i

temperatur

asupra asimilrii nutrienilor. Unele cercetri atest influena razelor ultraviolete asupra
asimilrii azotului de ctre fitoplancton: excluderea razelor ultraviolete duce la sporirea
asimilrii azotului, care n cazul ureei a nregistrat o cretere de la 17% la 130% [65]. A fost
demonstrat efectul combinat al mai multor factori fizici asupra coninutului de pigmeni la
Dunaliella. La modificarea salinitii mediului de cultivare de la 1-30% NaCl pentru cele 9
tulpini n studiu s-a observat c raportul dintre carotenoizi i clorofil rmne neschimbat egal cu
1. n acelai timp, combinarea salinitii nalte cu temperatur nalt i iluminare intens duce la
sporirea cantitii de -caroten [48]. O influen cumulativ stimulatoare a stresului salin i a
compuilor coordinativi ai Fe(III) s-a observat i n cazul acumulrii biomasei i coninutului de
lipide la Dunaliella salina [8]. Un alt exemplu elocvent al influenei sinergice a factorilor
combinai a fost demonstrat de ctre Steinbrenner i Linden [230], care au studiat sinteza stresindus a astaxantinei la Haematococcus pluvialis i au observat c producerea astaxantinei a
atins nivel maxim la aplicarea simultan a 3 factori: iluminare intens, salinitate nalt i
prezena ferului.

Combinarea a doi factori (iluminare excesiv i prezena compuilor

coordinativi ai ferului sau zincului) au stat la baza elaborrii unor tehnologii de producere a
biomasei de hematococ cu un coninut sporit de astaxantin [9]. n cazul culturii de Nostoc sp. a
fost stabilit legtura dintre tolerana la salinitate mrit i coninutul de exopolizaharide
extracelulare, stresul salin provocnd sporirea cantitativ a exopolizaharidelor capsulare pn la
65% din biomasa uscat [257].
1.1.3. Sistemele i principiile biologice de cultivare industrial a microalgelor
n elaborarea sistemelor de cultivare n mas a cianobacteriilor, de rnd cu totalitatea
microalgelor de interes tehnologic, chiar de la nceput au fost aplicate doua abordri principale:
1) cultivarea n rezervoare deschise: lacuri naturale i artificiale, cascade, bazine circulare
sau bazine de tip pist cu recirculare;

24

2) cultivarea n fotobioreactoare nchise cu iluminare natural sau artificial: tuburi


transparente, panouri orizontale sau verticale aranjate n form de bucle serpentine, bobine
flexibile sau trepte, n interiorul crora suspensia microalgal este n continu circulaie [195].
Sistemele de cultivare de tip deschis sunt utilizate pe larg n biotehnologia algal. Tabelul 1
prezint o clasificare a sistemelor ce se refer la aceast categorie:

Tabelul 1.1. Clasificarea sistemelor deschise de cultivare


Tipul
Lacuri
naturale

Bazine
naturale

Sisteme
nclinate
(cascade)

Destinaia, parametrii de
Referine
producere
bibliografice
Lacurile alcaline din Chad
Recoltarea
biomasei
de [18]
Arthrospira
Craterele vulcanice din
[169]
Myanmar
Recoltarea biomasei de Arthrospira
producia medie: 30 tone/an
Exemple

Caracol n Mexic (compania Cultivarea Arthrospira maxima


Sosa Texcoco)
pentru
producerea biomasei, 40 ha, 300
Lagunele
din
Australia tone/an
exploatate de:
Western Biothechnology Ltd Cultivarea
Dunaliella
pentru
Henkel Co
producerea
de -caroten
250 ha, 7 tone -caroten/an
460 ha, 10 tone -caroten/an
Roupite (Bulgaria)
Cultivarea biomasei de Arthrospira
i Scenedesmus, 2600 m2, 18
g/m2/zi
Australia
Cultivarea biomasei de Chlorella
2600 m2, 18 g/m2/zi
Japonia, Taiwan, Indonezia
Cultivarea biomasei de Chlorella

Bazine
circulare
Bazine de Cyanotech, Hawai
tip
pist
cu
recirculare Entreprise Farms, California

Cultivarea
biomasei
Arthrospira, 75.000 m2
150.000 m2

[25]

[27]

[70]

[27]
[138]

de [137]

[137]

Nature Beta Technologies, Cultivarea biomasei de Dunaliella [239]


Israel
salina
Lacurile i bazinele naturale unde sunt asigurate condiiile necesare (de ex. pH-ul sau
salinitatea) pentru dezvoltarea culturilor monospecifice. Unele din aceste lacuri (lacurile alcaline
din Chad sau craterele vulcanice din Myanmar) reprezint sisteme naturale de o productivitate
25

nalt, utilizate pentru obinerea de ctre populaia autohton a biomasei de Arthrospira n


scopuri alimentare. Altele, au fost adaptate de ctre productorii industriali la cultivarea
extensiv a microalgelor (de ex. Arthrospira maxima sau Dunaliella salina), cu utilizarea unui
control minimal al parametrilor de cultivare. Aceste sisteme de cultivare sunt cost eficiente n
cazul cnd condiiile de cultivare sunt favorabile cea mai mare perioada a anului.
Sistemele nclinate au fost nc puin exploatate, chiar dac ncercrile de a utiliza
conceptul suprafeelor nclinate pentru cultivarea arthrospirei i clorelei la scar industrial au
dat rezultate bune. Folosirea gravitii suspensiei culturale ce alunec de sus n jos pe suprafeele
nclinate duce la crearea unei turbulene nalte i a unui strat subire a culturii - parametri
importani pentru asigurarea unei productiviti nalte a sistemelor. Neajunsul principal al acestui
tip de cultivare este sedimentarea culturii n locurile cu o turbulen mic, evaporarea excesiv i
cheltuielile de energie pentru pomparea continu a culturii de jos n sus [239].
Bazinele circulare nu sunt favorizate n cultivarea industrial, din cauza c necesit o
construcie costisitoare bine determinat i cheltuieli de energie pentru amestecarea culturii.
Totui ele sunt pe larg utilizate n Japonia, Taiwan i Indonezia pentru producerea biomasei de
Chlorella [138].
Bazinele de tip pist cu recirculare au fost tradiional sistemele preferate pentru
producerea industrial a biomasei algale, fiind i astzi cele mai utilizate n cultivarea la scar
larg a culturilor de Arhrospira i Dunaliella, dar i altor microalge [136, 161, 162, 198, 208] .
Utilizarea exclusiv a acestor sisteme pentru cultivarea n mas a microalgelor se datoreaz
simplicitii i costurilor mici pentru realizarea i manipularea lor (figura 1.1).

Fig. 1.1. Schema unui bioreactor de tip pist cu recirculare [7].


Cu toate acestea, ele permit un control limitat al parametrilor de cultivare i nu asigur
condiiile necesare pentru a evita contaminarea culturii. Printre dezavantajele menionate de mai
muli autori [53, 93] este i imposibilitatea de a opera cu un strat al culturii mai subire dect 15
cm, deci i o iluminare ineficient a culturii n profunzime, precum i pierderi prin evaporare
26

considerabile. Dei a fost raportat o productivitate maximal a acestor sisteme egal cu 40


g/m2/dl, totui cel mai des aceste bazine pot atinge 20-25 g/m2/dl pentru perioade scurte, iar
productivitatea de lung durat a bazinelor industriale rareori depete 12-13 g/m2/dl. Costul
biomasei produse n sistemele industriale variaz ntre 9 i 17 per kg [138]. Dei sistemele de
cultivare de tip deschis domin n biotehnologia algal (att dup producia anual, ct i dup
rspndire), tot mai multe sunt la ora actual cercetrile ndreptate spre dezvoltarea sistemelor
de tip nchis.
Sistemele de cultivare de tip nchis - fotobioreactoarele (FBR) pot fi clasificate dup mai
multe criterii. Dup modul de operare FBR pot fi cu una sau dou faze de cultivare; dup
construcie pot fi: 1) plate, tubulare sau cilindrice; 2) orizontale, nclinate, verticale sau n
spiral; 3) cu colector sau n form de serpentin. La fel, fotobioreactoarele pot fi din sticl sau
plastic, flexibile sau rigide [239]. Principalele avantaje ale fotobioreactoarelor de tip nchis sunt:
1) pierderi minime de CO2, 2) cheltuieli minime de ap, 3) risc de contaminare redus, 4) reglarea
optimal a temperaturii, 5) hidrodinamica controlabil, 6) condiii de cultivare reproductibile, 7)
flexibilitate considerabil fa de influenele mediului, 8) economia spaiului ocupat [89].
Fotobioreactoarele de tip nchis au fost cu succes testate pentru obinerea biomasei de
Porphyridium, Phaeodactylum, Nannochloropsis, Chlorella, Haematococcus, Tetraselmis .a.
[19, 20, 78, 244]. Fotobioreactoarele tubulare sunt cele care satisfac cerinele tehnologice pentru
obinerea preparatelor farmaceutice de rnd cu preparatele alimentare i aditive. Recentele
succese n domeniul elaborrii i construciei fotobioreactoarelor in de realizarea unor sisteme
ce ar mbina avantajele productive ale fotobioreactoarelor tubulare cu cheltuielile minime ale
sistemelor deschise de cultivare [19]. Un pas important n aceast direcie l constituie
reactoarele n strat subire sau panourile plate flexibile. [239]. Mai muli autori au propus
strategii de cultivare a microalgelor n etape, cu utilizarea combinat a diferitor tipuri de sisteme
de cultivare. innd cont de specificul fiecrei tulpini i de scopul cultivrii lor, au fost testate
mai multe combinri: bazine deschise i fotobioreactor; fotobioreactor tubular i panou plat;
panouri plate de grosime variabil sau reactoare tubulare de diametru variabil; fotobioreactor i
fermentator pentru cultivare heterotrof. De exemplu, conceptul cultivrii combinate a
microalgelor n reactoare tubulare dimineaa i circularea culturii prin bazine deschise dup
amiaza a fost propus pentru a evita supranclzirea culturii. Un al exemplu este sistemul pentru
cultura Haematococcus pluvialis: la prima etap cultivarea se efectua n panouri plate pentru a
atinge o rat de cretere maximal, la etapa a doua suspensia cultural era trecut n reactor
tubular pentru a spori carotenogeneza.
n Tabelul 1.2 sunt prezentate cteva exemple de utilizare industrial a fotobioreactoarelor.
27

Tabelul 1.2. Utilizarea practic a fotobioreactoarelor de tip nchis


Tipul

Exemple de utilizare

Centrul
de
Studiu
a
Microorganismelor Autotrofe,
Florena, Italia
Departamentul
de
Biotehologie al Universitii
din Singapore
Departamentul
de
Biotehologie Agricol al
Universitii din Florena
Inc
(Hawai,
FBR tubular n form Aquasearch
de serpentin, volum USA)
20.000 l.
Uzina
Salata
GmbH,
FBR tubular,
Rutschenhausen, Germania
volum total 85.000 l.
FBR tubular orizontal
n form de serpentin, volum 145 l.
FBR
tubular
cu
colector de tip ,
volum 300 l.
FBR
tubular
cu
colector volum 1.200 l.

FBR de tip panou


alveolar plat, volum 10
- 6.000 l.
FBR de tip panou plat
din sticl, volum 500 l.
FBR n plci ultra
subiri

IGV Institute Germania

Richmond A., Israel

Tulpinile cultivate
Referine
i productivitatea
bibliografice
lor
Arthrospira
[238]
platensis
27,8 g/m2/zi
Chlorella
[139]
2
72 g/m /zi
Arthrospira
platensis
28 g/m2/zi
Haematococcus
pluvialis
9-13 g/m2/zi
Arthrospira
35-40 g/m2/zi

[240]

Chlorella
130 g/m2/zi

[196]

Nannochloropsis
10-14,2 g/m2/zi
Uzina APS Red Hawk Power Arthrospira
Plant,
USA,
cultivarea 80-100 g/m2/zi
continu a cianobacteriilor
pentru sechestrarea CO2-

[172]

[89]

[261]
[190]

Este mbucurtor faptul, c fotobioreactoarele moderne manifest o productivitate stabil


nalt, chiar i pentru un volum de zeci de mii de litri.
Dei au fost nregistrate progrese evidente n evoluia sistemelor de cultivare n mas a
microalgelor, nu exist o unanimitate de preri n ceea ce privete viitorul lor: unii specialiti
afirm c bazinele deschise de dimensiuni mari par s aib un viitor mai bun dect sistemele
nchise de cultivare [197], alii leag succesele biotehnologiei algale de perfecionarea continu a
fotobioreactoarelor [19, 93, 239]. De fapt, pentru a da dreptate unor sau altor opinii, este
important de a ine cont de destinaia biomasei algale cultivate: va fi utilizat n calitate de
supliment alimentar sau surs de biocombustibil, n scopul decontaminrii apelor i fertilizrii
solurilor sau ca materie prim pentru obinerea componentelor valoroase. Un factor ce nu trebuie
neglijat n acest demers sunt particularitile specifice de cultivare a fiecrei tulpini n parte,
precum i potenialul su de biosintez.
Principiile biologice de cultivare n mas a microalgelor stau la baza proiectrii
sistemelor de cultivare i sunt n permanen n atenia cercettorilor [53, 206, 207]. Nu exist
28

sisteme universale de cultivare, fiecare din ele fiind adaptat tulpinii i scopului cultivrii ei.
Sistemele de cultivare a microalgelor, mai cu seam cele de tip nchis permit controlul i
manipularea factorilor de cretere a culturii. innd cont de faptul, c scopul cultivrii industriale
a microalgelor este de a valorific capacitatea acestor organisme fotoautotrofe de a converti
radiaia luminoas ntr-o varietate de metabolii, factorul limitativ principal al acestui proces este
iluminarea. Cu scopul realizrii unei iluminri calitative, care s asigure un randament nalt al
fotosintezei i s diminueze fotoinhibarea, sunt calculai i adaptai mai muli parametri ai
sistemelor de cultivare: grosimea stratului suspensiei culturale, profunzimea optic, densitatea
culturii, frecvena ciclului de lumin i ntuneric, reglarea unghiului de iluminare etc.[93, 239].
Dup cum se vede din figura 2, productivitatea nalt a sistemelor nchise n strat ultrasubire se
datoreaz n mare parte unei iluminri mai uniforme.
Sisteme deschise de tip pist
Sisteme nchise tubulare
cu recirculare
Productivitatea: 10-20 g /m2/zi Productivitatea: 35-40 g
/m2/zi

Sisteme nchise n strat ultra


subire (UTL)
Productivitatea: 80-100 g
/m2/zi

Grosimea stratului: 200-350 mm

Grosimea stratului: 30-50


Grosimea stratului: 1-12 mm
mm
Fig. 1.2. Suprafaa productiv a diferitor sisteme de cultivare a microalgelor n dependen de
grosimea stratului suspensiei algale [196].
Un alt parametru important al culturii de microalge este pH-ul i asigurarea cu CO2,

ambele variabile fiind controlate prin injectarea cu CO2 [19]. Acumularea oxigenului este un
factor toxic pentru majoritatea autotrofilor i trebuie s fie luat n considerare la proiectarea
fotobioreactoarelor. FBR cu colector i reactoarele verticale ofer un avantaj important n acest
29

scop [239].

Agitarea culturii este necesar pentru a preveni sedimentarea celulelor i

stratificarea lor termic, pentru distribuirea uniform a nutrienilor, eliminarea oxigenului i


asigurarea unei iluminri uniforme [92]. O productivitate maxim a culturilor poate fi asigurat
numai n cazul meninerii unei temperaturi optime pentru creterea ei. Soluiile tehnice n acest
scop sunt: umbrirea (care duce la scderea iluminrii i deci a productivitii); scufundarea n bi
de apa (eficient, dar costisitor) i rcirea prin pulverizare cu ap (cost eficient n condiiile
climaterice uscate) [239]. Asigurarea cu nutrieni este deseori considerat drept un parametru
uor controlabil n culturile algale. Dar aici este loc pentru discuie, dac lum n considerare
viteza diferit de cretere n anumite condiii, flexibilitatea diferit a culturilor la concentraiile
nutrienilor etc.[92].
Trecerea n revist a tehnologiilor de cultivare a cianobacteriilor indic asupra faptului c
cea mai popular, mai productiv, deci i cea mai bine studiat este cianobacteria Arthrospira
(denumirea comercial Spirulina). Cu o productivitate net superioar fa de alte obiecte
biotehnologice este cel mai solicitat supliment alimentar i o surs preioas de substane
bioactive. Printre cianobacteriile de relevan economic, de rnd cu genul Arthrospira,
specialitii evideniaz i genurile Nostoc i Aphanizomenon datorit coninutului lor biochimic
preios: coninut nalt de proteine pentru Arthrospira i

Aphanizomenon, coninut nalt de

polizaharide la Nostoc (Tabelul 1.3).


Tabelul 1.3. Coninutul de proteine, lipide i carbohidrai la cianobacteriile de relevan
comercial [52, 53, 215]

Proteine
Lipide
Carbohidrai

Arthrospira spp.(%)

Nostoc spp.(%)

Aphanizomenon flos-aquae (%)

58-73

10-23

60-75

6-8

5-6

2-8

15-25

56-57

20-30

Biomasa de Nostoc de mai multe secole este utilizat n calitate de supliment alimentar, cu
preponderen n Asia. Cantitatea medie anual este de aproximativ 100 tone, colectate din
habitatele naturale. innd cont de tendinele biotehnologiei de extragere i utilizare a fraciilor
valoroase ale biomasei (de ex. polizaharide, ficobiliproteine) i de cererea lor crescnd pe pia,
n ultimele decenii au fost ntreprinse tentative de cultivare n mas a acestei cianobacterii [53,
54, 211]. La cultivarea experimental n reactoare tubulare verticale a fost obinut o
productivitate 0,6 g/l/zi de biomas de Nostoc. O productivitate de 16,4 mg/l/or a fost obinut
la cultivarea Nostoc sp. n fotobioreactoare n strat subire. La cultivarea n fotobioreactoare
30

verticale de 20 L cu diferit rat de agitare, cea mai nalt productivitate nregistrat a fost de
0,07 g/l/zi [231]. O alt abordare a cultivrii, implicnd condiii mixotrofe, a demonstrat o
productivitate de pn la 0,23 g/l/zi biomas de Nostoc [258]. Cu toate c unele specii de Nostoc
au fost cultivate cu succes n bioreactoare la etapa pilot, pentru comercializarea pe viitor vor fi
depite unele dificulti tehnice, cum ar fi rata sczut de cretere, pierderile de biomas sau
preul nalt al fotobioreactoarelor.
Un lucru este cert: pentru optimizarea sistemelor de producere microalgal trebuie luate n
considerare att aspectele biologice ct i cele tehnologice.
1.2. Cianobacteriile surse de antioxidani
Cianobacteriile unele dintre cele mai timpurii organisme aprute pe Pmnt sunt practic
omniprezente n toate habitatele terestre i acvatice. Acest lucru se datoreaz capacitii lor de a
supravieui la temperaturi nalte i sczute, la intensitate nalt i joas a luminii, la diferite
concentraii de CO2 proprieti datorit crora cianobacteriile au radiat ntr-o gam larg de
zone geografice i nie ecologice. Fiind astfel cosmopolite n distribuie, cianobacteriile
formeaz o component important a populaiei microbiene n ecosistemele acvatice terestre. Ele
joac un rol central n procesele de succesiune, producia mondial de biomas i n circuitele
naturale ale elementelor. Posednd capacitatea de fixare a azotului, cianobacteriile constituie
adesea microflora dominant a solurilor umede, contribuind n mod semnificativ la fertilitatea
acestora. Semnalizarea oxidativ constituie o funcie crucial asociat cu mecanismele prin care
organismele percep modificrile mediului i realizeaz ajustrile necesare n expresia genelor,
metabolism i procesele fiziologice [71].
Organismele fotosintetice tolereaz nivelul

ridicat de oxigen datorit mecanismelor

endogene, care inhib eficient i elimin produsele toxice, nainte ca acestea s produc daune.
O serie de mecanisme de protecie i de reparare implicate n combaterea pericolului, pe care l
reprezint prezena SRO au fost raportate n mai multe organisme, inclusiv n cianobacterii.
Rspunsul diferitor organisme la stresul oxidativ poart amprenta diferenelor interspecifice, dar
n linii generale, pentru realizarea oricrui mecanism de protecie este necesar prezena
antioxidanilor.
Evoluia mecanismelor performante de fotosintez i orientarea spre un mod de via
caracterizat prin mobilitate redus au dus la aceea, c n mediul normal de via al acestor
organisme este prezent n permanen o stare de stres, inclusiv stres oxidativ. Evoluia
filogenetic a acestui grup de procariote fotosintetizante a asigurat formarea la ele a
numeroaselor mecanisme de protecie antioxidant i de reparare a daunelor provocate de
31

speciile reactive de oxigen (SRO). Aceste mecanisme includ antioxidani enzimatici i nonenzimatici, care ofer celulelor adaptabilitate sporit i capacitatea de a supravieui n condiii de
stres endo- i exogen [21, 39, 46, 141, 221]. Astfel, cianobacteriile posed potenial imens
pentru a servi drept materie prim pentru producerea de antioxidani, pe lng faptul, c deja sunt
pe larg utilizate n calitate de biofertilizatori i ca surse de enzime i pigmeni [84, 115, 124,
146, 164, 181, 209, 237]. Din punct de vedere fundamental, mecanismele de protecie utilizate
de cianobacterii n stresul oxidativ pot fi puse n aplicare pentru elaborarea strategiilor de
descifrare a imensei plasticiti metabolice i genetice a acestor organisme precum i pentru
dezvoltarea tehnologiilor de sporire a capacitii de toleran la stres a organismelor vii [128].
Studiul mecanismelor de protecie antioxidant la cianobacterii a evideniat mai multe ci,
prin care aceste organisme i asigur securitatea n mediul oxic. Astfel, n biomasa
cianobacteriilor sunt prezente substane, care acioneaz ca antioxidani preventivi, care inhib
reaciile de oxidare, i deci, previn procesul de formare a radicalilor liberi. O serie de compui ai
biomasei acioneaz prin blocarea formrii radicalilor lipidici, protejnd catenele acizilor grai
contra rupturilor oxidative. Sunt de asemenea substane capabile de a rupe lanul reaciilor de
autooxidare, ori de a stinge oxigenul singlet care apare ca rezultat al proceselor fotosintetice. O
serie de componente ale biomasei cianobacteriilor

acioneaz ca sinergiste pentru ali

antioxidani celulari, ca ageni de reducere, ca factori de chelare a metalelor, ca inhibitori ai


enzimelor prooxidante [33, 123, 189].
Exist un numr mare de clasificri a antioxidanilor, la baz fiind puse diferite principii de
aciune. n acest compartiment vom clasifica antioxidanii cianobacteriilor n dependen de
masa lor molecular. Astfel, n conformitate cu acest criteriu, exist dou clase de antioxidani
macromoleculari i micromoleculari.
Din categoria antioxidanilor macromoleculari fac parte att antioxidani enzimatici, ct i
nonenzimatici. Antioxidanii enzimatici, la rndul lor formeaz dou categorii: enzime
antioxidante

primare (peroxidazele, n special glutation peroxidaza; catalaza i superoxid

dismutaza) i enzime antioxidante secundare (reductazele i dehidrogenazele). Antioxidanii


macromoleculari non-enzimatici la cianobacterii sunt prezentai prin proteinele de chelare a
metalelor i grupul ficobiliproteinelor.
Din categoria antioxidanilor micromoleculari fac parte grupurile carotenoizilor,
clorofilelor, compuilor fenolici,

aminoacizilor i peptidelor antioxidante (de exemplu

glutationul), precum i acidul ascorbic, vitaminele (A, E, C), cofactori ai enzimelor (Q10),
minerale (zinc i selenium), compuii azotai (de exemplu acidul uric) .a. [33, 60, 192, 221].

32

1.2.1. Antioxidanii macromoleculari ai cianobacteriilor


Pigmenii ficobilinici (sau ficobiliproteinele) sunt cunoscui n calitate de componente
auxiliare ale structurilor ce asigur derularea normal a fotosintezei la cianobacterii, algele roii
i unele criptomonade. Fiind caracterizai prin culori deosebite de cea a clorofilei, acetia sunt
capabili s capteze lumina n diapazonul de lungimi de und inaccesibile pentru pigmenii
clorofilieni. Astfel, fiind reprezentani preponderent al mediilor acvatice, organismele nzestrate
cu ficobiliproteine au un randament mult mai nalt de utilizare a energiei solare. n acelai timp,
a fost demonstrat, c n condiii de stres oxidativ aceti compui deosebii au capacitatea de a
stinge radicalii liberi formai n exces, astfel protejnd membranele tilacoidale de procesul de
peroxidaze, i deci, asigurnd eficiena fotosintezei i supravieuirii culturii.
Pigmenii ficobilinici se clasific n baza culorii lor n dou grupuri mari: ficoeritrinele
(roii) i ficocianinele (albastre). Maximul de absorbie al ficoeritrinelor se poziioneaz ntre
490 i 570 nm, iar cel al ficocianinelor ntre 610 i 665 nm. Aceste grupuri mari se divizeaz la
rndul lor, reflectnd diferenele ntre proteine n anumite locaii ale maximului de absorbie i
forma specific a spectrului de absorbie. La nceput, aceste grupuri definite prin litere n calitate
de prefixe (de exemplu C-ficocianina, sau abreviat C-PC (C-phycocyanin)) indic taxonul, la
care se refer organismul, din care a fost izolat pigmentul dat. De exemplu R-ficoeritrina (R-PR)
a fost izolat pentru prima data din reprezentanii filumului Rhodophyta. Cercetrile ulterioare
au demonstrat, c tipul specific de pigment nu este obligatoriu restricionat doar n limitele
taxonului respectiv.
Ficobiliproteinele sunt compuse dintr-un anumit numr de subuniti, fiecare din ele avnd
o ax proteic cu care cromoforul tetrapirolic linear formeaz legturi covalente. Orice
ficobiliprotein conine fie ficocianobilina, fie ficoeritrobilina, ori mai poate conine una din trei
biline minore: ficourobilina, criptoviolina sau bilina 696 nm. Fiecare tip de biline are
caracteristici spectrale unicate, care se pot modifica ca rezultat al interaciunii dintre subuniti
sau dintre cromofor i apoprotein.
n majoritatea microalgelor ficobiliproteinele sunt aranjate n structuri subcelulare numite
ficobilisomi. Aceste structuri permit pigmenilor de a se aranja n structuri geometrice ntr-o
manier, care faciliteaz capturarea energiei i transferul ei. Toate ficobiliproteinele absorb
lumina incident direct, iar n continuate particip ntr-un lan transportor de energie n
ficobilisomi: ficoeritrina ficocianina aloficocianila clorofila a [51].
Interesul comercial fa de ficobiline vine de la posibilitatea utilizrii lor n calitate de
marcheri fluoresceni ai anticorpilor n diagnostica precoce a strilor canceroase, dar i n
domenii legate de producerea de colorani naturali pentru industria alimentar i cosmetic.
33

Ca antioxidani eficieni ficobiliproteinele se manifest n procesul de neutralizare a


radicalilor liberi. Astfel, a fost stabilit, c aceti compui elimin radicalii alcoxil, hidroxil i
peroxil. Efectul lor protector este exprimat prin protecia membranelor fiziologic active de
procesul de peroxidare [216]. Oxidarea peroxid a lipidelor se consider una din cauzele
principale a distrugerii membranelor celulare. S-a demonstrat c ficocianina supreseaz
considerabil aceste procese n celulele organismelor vii. De asemenea, s-a constatat efectul
inhibitor al ficocianinei obinut din spirulin asupra reaciilor alergice n organism [202].
Cu toate c producerea de ficobiliproteine n cianobacterii i alte organisme este
reglementat genetic, limitele fiziologice de variere a coninutului lor n biomas sunt destul de
largi. Modificarea coninutului de ficobiliproteine n componena celulelor microalgelor i
cianobacteriilor este unul din mecanismele de rezisten a acestor organisme la aciunea diferitor
factori. Astfel, o modificare esenial a coninutului de ficocianin i aloficocianin la Spirulina
platensis, Porphyridium cruentum, Nostoc linckia este nregistrat att la aciunea diferitor
factor chimici, cum ar fi compuii coordinativi ai metalelor de tranziie, ct i la aciunea
factorilor fizici de mediu, cum sunt temperatura i intensitatea luminii. [5, 6; 12 (p p. 30-53, 173215, 255-270), 14, 35].
Posibilitatea dirijrii procesului de acumulare a ficobiliproteinelor n biomasa
cianobacteriilor prin aplicarea unor procedee simplu de realizat i necostisitoare ofer avantaje
importante pentru utilizarea acestor organisme n calitate de materie prim pentru obinerea
preparatelor cu efecte antioxidante.
Un rol foarte important n protejarea celulelor vii ale cianobacteriilor de aciunea
radicalilor liberi le revine proteinelor care realizeaz chelarea metalelor cu valena variabil.
Aceste metale, n special cuprul i fierul, sunt parte component a reaciilor, n cadrul crora are
loc formarea radicalului hidroxil (reaciile Fento i Haber-Weiss) [187]. Stabilizarea ionilor
metalelor cu valena variabil prin includerea lor n structuri inerte este o msur de profilaxie a
formrii radicalilor liberi agresivi. Din categoria proteinelor pentru chelarea metalelor fac parte
transferinele sau proteinele asemntoare transferinelor, care sunt prezente n abunden n
membranele celulelor cianobacteriene i asigur n mod normal aportul de fier intracelular. n
condiii de exces de fier n mediu i supraacumulare a ionilor de fier trivalent n celule,
transferinele formeaz cu aceti ioni legturi puternice, blocnd astfel aciunea lor negativ
[158].
Enzimele antioxidante primare superoxiddismutaza (SOD), catalaza (CT) i peroxidazele
(POx) sun implicate direct n procesele de nlturare a efectelor nocive ale stresului oxidativ
prin anihilarea aciunii SRO.
34

SOD este prima barier a arsenalului antioxidant mpotriva speciilor de oxigen n curs de
formare. Enzima joac un rol critic n atenuarea efectului toxic al radicalului superoxid. Rolul
protector al SOD la cianobacterii a fost demonstrat pentru astfel de situaii ca strile de
prejudicii fotooxidative, disecare, lipsa ori insuficiena de azot, prezena substanelor toxice, ca
de exemplu coloranii azotici .a. SOD catalizeaz reacia de dismutaie, transformnd radicalii
superoxid n dioxigen i peroxid de hidrogen, care este mai puin activ i este scindat de alte
enzime. Exist trei tipuri distincte de SOD, clasificate pe baza cofactorului metalic prezent:
izozimele cupru / zinc (Cu / Zn-SOD), mangan (MnSOD) i fier (Fe-SOD). Cu/Zn SOD este
caracteristic pentru citoplasm, iar Mn SOD este localizat n mitocondriile formelor eucariote
de alge. n formele procariote, deci tipice pentru cianobacterii, a fost depistat Fe SOD i Mn
SOD. Sinteza activ a SOD i creterea activitii asigur supravieuirea organismului n condiii
de stres oxidativ [83, 132, 133, 148, 210, 241]. Nivelul sporit de SOD ofer un grad nalt de
toleran organismelor aerobe n condiii atipice pentru ele [73, 74, 102]. Coninutul nalt al SOD
n biomas este un marcher biologic al unei stri de stres oxidativ i acest indice poate fi folosit
pentru aprecierea nivelului de influen a unor factori nocivi asupra sistemelor vii.
CT structur hemic tetrameric - este cunoscut ca prima enzim izolat n stare pur,
care realizeaz reacia de transformare a peroxidului de hidrogen n ap i oxigen. n prezent se
cunosc 5 izoforme ale catalazei, care se deosebesc ntre ele prin
Activitatea normal a catalazei asigur funcionarea

structura prii proteice.

sistemului citocromic celular, fiind

implicat i n procesul de fosforilare oxidativ. Concentraia substratului specific a


peroxidului de hidrogen nu este un factor limitativ pentru activitatea CT, acionnd i n
condiii de supraproducere a peroxidului. O molecul de catalaz poate s scindeze pn la
44 000 molecule de peroxid de hidrogen pe secund. n mod normal catalaza este destul de
stabil, pstrndu-i activitatea un timp ndelungat. n condiiile stresului oxidativ n celule se
nregistreaz o cretere semnificativ a aciunii CT [124, 210, 237, 241].
Substratul specific al peroxidazelor n celule l constituie peroxizii organici i peroxidul de
hidrogen. n celulele organismelor ce realizeaz fotosinteza - i deci inclusiv a cianobacteriilor
n calitate de substrat al peroxidazelor sunt polifenolii i aminele aromatice.

Grupul

peroxidazelor este format din ascorbat peroxidaza, NADH - peroxidaza, NADPH - peroxidaza,
glutation - peroxidaza, guaiacol - peroxidaza .a. Funcia acestui grup de enzime const n
reducerea substratului specific menionat

pn la formarea apei. Pe parcursul activitii

peroxidazelor are loc oxidarea aminelor aromatice, anilinei, benzidinei, tirozinei, triptofanului,
indolului, acidului indolil acetic, fenolilor, acizilor aromatici, fierocitocromului C, NADPH . n
calitate de grup prostetic peroxidazele conin fieroporfirina.
35

Cel mai intens studiat din grupul peroxidazelor care realizeaz reducerea peroxidului de
hidrogen este ascorbat peroxidaza (APX), care utilizeaz ascorbatul n calitate de donor de
electroni [115]. APX este o enzim din grupul peroxidazelor hemice, care poate fi absent la
unele cianobacterii. Pe baza prezenei sau absenei ascorbat peroxidazei cianobacteriile pot fi
clasificate n dou grupuri: (i) care reduc peroxidul de hidrogen cu participarea peroxidazei
folosind un fotoreductor ca donor de electroni, i (ii) care reduc peroxidul de hidrogen doar cu
ajutorul

catalazei. Printre reprezentanii primului grup, care conin

APX sunt genurile

Synechocystis, Anacystis, Synechococcus i Nostoc [128].


Activitatea glutation peroxidazei (GPX) este indus enzimatic, de aceea cantitatea ei
depinde de intensitatea stresului oxidativ. GPX este o enzim seleniu - dependent, care asigur
protecie fa de hidroperoxizii organici i ajut la regenerarea formei reduse a vitaminei C. Au
fost identificate 8 izoforme ale GPX. Funcia GPX const n meninerea strii active a mai
multor enzime, care in celul se oxideaz spontan [75].
1.2.2. Antioxidanii cu masa molecular joas ai cianobacteriilor
Antioxidanii cu mas molecular joas constituie un grup foarte variat de substane
capabile s asigure protecia celulelor de aciunea radicalilor liberi, prin blocarea formrii lor,
inhibarea radicalilor formai i repararea distrugerilor cauzate de stresul oxidativ. Acetia se
deosebesc dup proprietile chimice i localizarea n celul.
Cei mai cunoscui, mai intens studiai, dar i cel mai activ aplicai n practic antioxidani
naturali sunt carotenoizii. Exist o gam larg de carotenoizi naturali, actualmente fiind descrii
peste 600 [103, 104]. Carotenoizii constituie un grup omniprezent de pigmeni izoprenoizi. Ei
sunt recunoscui n calitate de stingtori eficieni a oxigenului singlet i captatori ai altor SRO.
Carotenoizii pot aciona, de asemenea, ca stingtori ai proceselor de oxigenare ireversibil.
Mecanismele moleculare care stau la baza acestor reacii nu sunt nc pe deplin nelese, n
special n contextul activitii anti i pro-oxidante a carotenoizilor care, dei nu sunt sintetizai
de oameni i animale, sunt, de asemenea, prezeni n sngele i esuturile lor, contribuind la o
serie de procese biochimice. Potenialul antioxidant al carotenoizilor este de o importan
deosebit pentru sntatea uman. Date provenind din studii epidemiologice i clinice susin
postulatul c suplimentarea adecvat cu carotenoizi naturali reduce semnificativ riscul unor
tulburri mediate de SRO. Sunt demonstrate efectele benefice (de protecie) a aportului alimentar
de carotenoizi n boli larg rspndite, tipice civilizaiei moderne, i anume, n cancer, tulburri
cardiovasculare sau de fotosensibilitate.

36

n cianobacterii carotenoizii formeaz dou categorii de baz: carotenele (molecule nonoxigenate) i xantofilele (molecule oxigenate). Rolul acestor pigmeni const n colectarea
luminii, disiparea excesului de lumin i stabilizarea structurilor celulare prin asigurarea
fotoproteciei membranelor funcionale. Efectul antioxidant al carotenoizilor este determinat de
prezena legturilor duble conjugate i inelelor hexenice nesaturate n structura moleculelor lor.
Carotenoizii cu nou i mai multe legturi duble realizeaz stingerea radicalilor clorofilei prin
acumularea asupra lor a energiei i eliberarea ei n form de cldur la relaxarea termic [113].
Procesul de stingere are loc prin intermediul reaciilor chimice, transferului de energie,
formarea radicalilor proprii, ca radicalii peroxilipidici [84, 154, 200, 234].
Posibilitatea modelrii cantitii carotenoizilor n biomasa cianobacteriilor prin aplicarea
procedeelor tehnologice, activitatea pronunat in vivo pentru muli din ei, efectul prooxidant
minim sau lipsa lui complet acestea sunt argumentele pentru continuarea studiilor orientate
spre elaborarea tehnologiilor de obinere a preparatelor antioxidante pe baza carotenoizilor
naturali [8, 9, 117].
Tocoferolul sau vitamina E este un termen ce ntrunete un grup de compui, n care sunt
incluse opt forme derivate ce exercit activitate -tocoferolic. Acesta este unul din cel mai bine
cunoscui antioxidani, utilizat n practica medical i de cercetare mai multe decenii.
Tocoferolul rupe reaciile radicalice n lan, interacionnd cu radicalul peroxil. Rezultatul
acestei reacii l constituie formarea radicalului tocoferil. Regenerarea acestui radical napoi n
tocoferol are loc cu concursul ubichinonei, glutationului ori acidului ascorbic. Partea negativ a
aplicrii practice a acestui grup de antioxidani const n aceea, c n mediul lipofil n
concentraii mari, aceste substane devin prooxidani, care contribuie la ramificarea lanului
reaciilor de peroxidare lipidic [33]. Tocoferolii sunt depistai practic n toate tipurile de celule
vii, iar cantitatea lor este determinat de condiiile de mediu i de starea fiziologic a celulelor
ori organismului. n cazul cianobacteriilor aceast cantitate este determinat de etapa ciclului de
dezvoltare a culturii [32, 61].
Glutationul (GSH) este

cofactorul glutation peroxidazei, glutation transferazei,

dehidroascorbat reductazei enzime cu aciune antioxidant pronunat. Independent acest


compus de asemenea are proprieti antioxidante fiind o capcan direct pentru radicalul hidroxil
i oxigenul singlet. n componena enzimei glutation peroxidaza particip la neutralizarea
peroxizilor, inclusiv a celor lipidici. Efectul direct al glutationului n calitate de antioxidant mai
este exprimat i prin regenerarea radicalului tocoferil n tocoferol, acionnd astfel n mod
sinergist cu acest component i asigurnd protecie antioxidant eficient n primul rnd
membranelor, n care se localizeaz vitamina E [60]. n situaii experimentale un nivel sporit al
37

GSH este nregistrat atunci, cnd organismul este supus aciunii factorilor de stres, iar n celule
survine starea de stres oxidativ. Mrirea cantitii de GSH n aceste condiii este o reacie de
rspuns orientat spre anihilarea aciunii radicalilor liberi i altor SRO [185, 251].
Acidul ascorbic sau vitamina C este un cunoscut antioxidant care in vitro are capacitatea de
a neutraliza majoritatea radicalilor liberi i SRO. In vivo efectul antioxidant al acidului ascorbic
este determinat de sinergismul aciunii lui n tandem cu tocoferolul i glutationul, participnd la
reaciile de transformri reciproce a formelor radical n forme stabile i invers. [60]. Ca i n
cazul tocoferolului, hotarul ntre aciunea antioxidant i cea prooxidant este destul de efemer,
acest echilibru fiind sub un constant pericol de prbuire. n cazul acidului ascorbic factorul
destabilizator este prezena metalelor cu valen variabil n forma lor ionic. n aceste condiii
ascorbatul devine prooxidant genernd formarea metaboliilor toxici, inclusiv a radicalului
hidroxil. Un alt pericol, ce vine de la vitamina C pentru celulele vii provine din capacitatea
acesteia de a se autooxida cu formarea dehidroascorbatului, care afecteaz grav transducia de
semnal i ntreaga activitate vital a celulelor [29, 117].
Coenzima Q (CoQ) sau ubichinona face parte din sistemul succinat-dehidrogenazic.
Activitate antioxidant posed forma redus a coenzimei

numit ubichinol (CoQH2) care

reacioneaz cu radicalul superoxid i radicalii lipidici asigurnd stingerea lor eficient [129]. n
rezultatul acestor reacii se formeaz semichinona un radical liber primar cu funcie biologic
determinat, fiind un element structural i funcional al lanului respirator transportor de
electroni. Acioneaz sinergist cu vitamina E, asigurnd regenerarea radicalului tocoferil n
forma stabil a vitaminei.
Prezena fenolilor - compui n care grupa funcional -OH este legat de un atom de
carbon ce aparine unui nucleu aromatic a fost demonstrat pentru biomasa majoritii speciilor
biotehnologic importante de cianobacterii i microalge [96, 103, 104, 127, 132, 133, 152].
Datorit proprietilor chimice specifice, fenolii sunt n esena lor substane cu efect antioxidant
pronunat. Efectul de anihilare a radicalilor liberi de ctre compuii fenolici are loc n primul
rnd, datorit capacitii lor de a forma radicali fenoxil caracterizai prin grad nalt de stabilitate
deci, acionnd n calitate de sprgtori ai lanului oxidativ. Pe lng aceasta au mai fost
depistate dou mecanisme specifice, prin care compuii fenolici se realizeaz ca antioxidani
eficieni n celul. Primul const n chelarea ionilor metalici, iar cel de-al doilea const n
ptrunderea acestor compui n bistratul lipidic al membranelor i modificarea fluiditii
acestora. Pentru unii fenoli aa ca cvercitina, miricetina, fuzetina este caracteristic i aciunea
sinergist n tandem cu ali antioxidani recunoscui, aa ca glutationul ori enzima glutation S
transferaza. Varietatea mecanismelor proteciei antioxidante prin care se pot implica compuii
38

fenolici n protecia celulelor determin i gradul nalt de corelare ntre cantitatea de fenoli n
biomas i activitatea antioxidant a acesteia [84, 96, 140]. Cantitatea fenolilor n biomasa
microalgelor i cianobacteriilor poate fi modificat prin aciunea diferitor procedee
biotehnologice, cum sunt aciunea factorilor chimici, modificarea intensitii luminii,
modificarea raportului dintre principalii nutrieni, aciunea temperaturilor mai nalte ori mai
joase dect cele optimale .a. [127].
Astfel, cianobacteriile, fiind printre primele organisme fotosintetizante care au contribuit la
formarea atmosferei oxigenice a Pmntului au cea mai lung istorie de formare i perfecionare
a mecanismelor, ce asigur protecia eficient a structurilor celulare de efectele negative ale
stresului oxidativ. Biomasa lor prezint o varietate enorm de componente, ce posed activitate
antioxidant. De regul, efectul protector este asigurat de un complex policomponet n care
fiecare component are rolul su indispensabil. De aici vine i activitatea mai pronunat a
sistemelor antioxidante complexe comparativ cu cea a substanelor pure. n special aceasta se
refer la rezultatele in vivo, fapt pentru care tot mai muli cercettori pledeaz pentru complexe
antioxidante, iar eforturile se concentreaz pe descifrarea mecanismelor de interaciune a
elementelor complexului n asigurarea proteciei antioxidante.
1.3. Tehnologii de obinere a antioxidanilor din cianobacterii
Importana cianobacteriilor pentru natur i om cuprinde dou aspecte diametral opuse.
Dintr-un punct de vedere, aceste organisme care numr peste 2000 specii joac diverse roluri n
ecosistemele acvatice i terestre [193]. Creterea excesiv a cianobacteriilor, aa numita nflorire
a apelor, reprezint o ameninare serioas la adresa ecosistemelor acvatice [82]. Acest fenomen
contribuie la degradarea calitii apei i valoarea de agrement a lacurilor i altor bazine acvatice
[69]. Pe de alt parte, cianobacteriile ce populeaz apele potabile sunt recunoscute n calitate de
productori de metabolii secundari biologic activi cu diferit structur. n ultimul deceniu,
cianobacteriile au fost recunoscute ca o sursa major de produse naturale, cu aplicaii poteniale
terapeutice n tratamentul cancerului, maladiilor metabolice, SIDA .a. [151]. Metaboliii
cianobacteriilor sunt, de asemenea, explorai activ n calitate de compui activi farmacologic,
utili n diagnosticul medical, unde pot fi aplicai n calitate de sonde fluorescente, nutraceutice i
suplimente alimentare i furajere. Este recunoscut, c radicalii liberi sunt implicai n declanarea
unor maladii, cum ar fi ciroza ficatului, ateroscleroza, cancerul, diabetul, etc., iar compuii care
pot anihila radicalii liberi au un mare potenial n ameliorarea acestor procese patologice [26].
Astfel, antioxidanii joac un rol important n protejarea organismul mpotriva deteriorrii
provocate de SRO. Antioxidanii sintetici utilizai frecvent, cum ar fi butilhidroxianizolul i
39

butilhidroxitoluenul ascund poteniale riscuri pentru sntate i se caracterizeaz prin toxicitate


nalt. Prin urmare, acestea trebuie s fie nlocuite cu antioxidani naturali [114].
n compartimentul precedent al acestui reviu au fost trecute n revist doar unele dintre
componentele biomasei cianobacteriene cu activitate antioxidant pronunat. Acestea pot fi att
compui cu masa molecular mare, ct i cu mas molecular joas; pot fi hidrosolubili ori
liposolubili, se pot localiza n citozol, diferite compartimente celulare, inclusiv membrane
funcionale, ori pot difunda n mediul extracelular. Tehnologiile de obinere a antioxidanilor din
biomasa cianobacteriilor sunt determinate, n primul rnd de scopul care st n faa
productorului, de natura substanelor care urmeaz a fi obinute i de tipul preparatului care este
solicitat n aceast tehnologie. n linii generale, aceste tehnologii au la baz principiul de
extragere a componentelor active, ce urmeaz a fi realizat n condiii care s garanteze sigurana
produsului finit.
n acest sens, este necesar de a combina selectivitatea, inofensivitatea i rentabilitatea
procedeelor de extragere a principiilor bioactive cu aciune antioxidant cu cerinele legale
privind utilizarea solvenilor de grad alimentar i proceselor acceptate n acest sens. Tehnicile de
extracie tradiionale precum Soxhlet, extracia solid-lichid, sau extracia lichid-lichid sunt
caracterizate prin utilizarea unui volum mare de solveni i/ ori prin durata mare a acestor
procese. Aceste tehnici adesea se caracterizeaz prin randament i selectivitate mici. In plus,
extragerea cu aplicarea tehnicilor tradiionale de obicei nu este un proces automatizat, i deci,
reproductibilitatea poate fi adesea compromis. Tehnicile contemporane de extragere a
principiilor bioactive cum ar fi extracia n fluide supercritice, extracia cu lichid presurizat,
extracie cu solvent accelerat, extracia cu ap cald presurizat, extracia asistat de ultrasunete,
i extracia asistat de microunde ofer un mod eficient de alternativ de depire a problemelor
tipice pentru tehnicile de extragere tradiionale [111].
Extracia n fluide supercritice (EFS) a fost aplicat n calitate de metod alternativ de
extragere n 1879. Cu toate acestea, nu a fost aplicat pe larg pana n anii 1960. Metoda a
nceput s fie investigat, ca o alternativ a metodelor de extracie convenionale, cum ar fi
extracia solid-lichid ori lichid-lichid, care utilizeaz mari cantiti de substane chimice
periculoase, cum ar fi solveni clorurai [108]. EFS se bazeaz pe utilizarea solvenilor la
temperaturi i presiuni mai mari dect cele ce corespund punctelor critice. Aceast tehnic a fost
folosit anterior pentru a extrage o mare varietate de compui interesani din diferite materiale.
Una dintre cele mai valoroase caracteristici ale EFS este rata extrem de redus (de multe ori la
zero) de utilizare a solvenilor organici toxici. Dioxidul de carbon (CO2) este solventul cel mai
frecvent utilizat pentru a extrage compui bioactivi din surse naturale utiliznd EFS. CO2 are o
40

serie de proprieti avantajoase pentru utilizare n extragerea antioxidanilor: este ieftin,


condiiile sale critice sunt uor de atins (30,9C i 73,8 bari), este un solvent ecologic, care este
n general recunoscut ca fiind sigur pentru utilizare n industria alimentar. Principalul
dezavantaj al CO2 supercritic este polaritatea sczut, o problem care poate fi depit prin
utilizarea modificatorilor polari sau a co-solvenilor pentru a schimba polaritatea fluidului
supercritic i a mri puterea lui de solubilizare. Au fost propui i ali solveni pentru EFS,
printre care propanul, butanul i eterul dimetilic, dar nici unul dintre acetia nu respect toate
principiile chimiei i ingineriei ecologice la fel ca dioxidul de carbon. Avantajele utilizrii CO2
supercritic pentru extragerea antioxidanilor din biomasa cianobacteriilor include posibilitatea
de a regla cu uurin temperatura i presiunea n sistem, ceea ce asigur controlul puterii i
viscozitii extractului; posibilitatea de a obine extracte libere de solveni, deoarece odat ce
procedura de extracie este finalizat, depresurizarea sistemului transform CO2 din lichid n gaz,
ceea ce faciliteaz mult recuperarea extractului. Aceste proprieti determin utilizarea extins a
CO2 supercritic pentru extragerea compuilor bioactivi, inclusiv a antioxidanilor. Din biomasa
cianobacteriilor (Arthrospira, Nostoc) prin aceast metod au fost extrai compui volatili,
lipide, produse saponificabile, compui fenolici, tocoferol i ali compui cu proprieti
antioxidante pronunate [130, 252]. Pornind de la avantajele acestei metode originale, atunci
cnd sunt prezente instalaiile respective, EFS este un procedeu avantajos de obinere a
antioxidanilor din biomasa de cianobacterii cu un grad nalt de siguran a produsului finit.
Extracia n fluid presurizat (EFP) este, de asemenea, cunoscut cu variaiile de extracie
n solvent de nalt presiune, sau extracie accelerat n fluid, extracie n ap fierbinte
presurizat .a. [169]. Aceast tehnic a fost descris pentru prima dat n 1996. In EFP este
aplicat presiunea nalt pentru a permite utilizarea de lichide la temperaturi mai mari dect
punctul lor de fierbere n condiii normale. Dintre acestea, extracia accelerat n lichid, care
poate fi considerat o nou versiune a aparatului Soxhlet, dar care funcioneaz la presiuni i
temperaturi ridicate, extracia cu ap de temperatur nalt sunt

tehnici promitoare de

extragere a substanelor bioactive din diferite materii prime. Utilizarea combinat a presiunii i
temperaturii ridicate asigur viteza nalt a procesului i utilizarea cantitilor minime de
solveni. De exemplu un proces, care prin aceast metod se realizeaz timp de 20 min folosind
10-50 ml solvent poate fi comparat cu o procedur de extracie tradiional n care sunt necesare
10-48 ore i pn la 300 ml solvent. Creterea temperaturii de extracie poate promova
solubilitatea mai mare a compuilor de interes, n primul rnd prin transferul mai eficient de
mas. In plus, temperaturile ridicate scad viscozitatea i tensiunea superficial a solvenilor,
facilitnd accesul la zonele de interes ale matricelor, mrind astfel rata de extracie. Pe de alt
41

parte, EFP este larg recunoscut ca o tehnic de extracie ecologic, n principal din cauza
consumului redus de solveni organici, care ndeplinete perfect elementele de baz ale msurilor
de prevenire a polurii i principiile chimiei i ingineriei ecologice. Variaii de extracie au fost
aplicate cu succes n extragerea diferitor grupuri de carotenoizi din biomasa cianobacteriilor,
precum i n extragerea complexelor fenolice din acest tip de biomas. Aplicarea n calitate de
fluid presurizat a amestecurilor ap-etanol i ap-metanol asigur obinerea extractelor cu o
activitate antioxidant deosebit de nalt [146, 174].
Extracia n ap fierbinte sub presiune, de asemenea, cunoscut sub numele de extracie n
ap subcritic, extracie n ap de polaritate sczut sub presiune, sau extracie n ap
supranclzit este un caz particular al metodei EFP. Apa are multe avantaje n ceea ce privete
universatilitatea i impactul asupra mediului i poate fi utilizat n procese de extracie i izolare
a ingredientelor funcionale din diferite materii prime, inclusiv plante i deeuri alimentare.
Tehnica se bazeaz n utilizarea apei la temperaturi peste punctul de fierbere atmosferic, n timp
ce pstrarea n stare lichid are loc prin aplicarea presiunii nalte. n aceste condiii, proprietile
fizice i chimice ale apei se modific dramatic, de exemplu, constanta dielectric a apei scade
de la aproximativ 80 la temperatura camerei (25C) la aproximativ 33 la 200, adic, aproape de
cea a unui solvent organic polar cum ar fi metanolul. Mai mult dect att, viscozitatea i
tensiunea superficial scad odat cu creterea temperaturii, n timp ce difuzia crete, ceea ce
mpreun duce la mbuntirea procesului de extracie n termeni de eficien i vitez. n plus,
solubilitatea este, de asemenea, modificat de temperatur, favoriznd astfel solubilizarea unor
altfel de compui prin modificarea selectivitii acestora. Apa este, de asemenea, un solvent
ecologic pur, care poate fi utilizat, perfect cu respectarea normelor de chimie i inginerie
ecologic [236, 242]. Condiiile de realizare a tehnicii extraciei n ap fierbinte sub presiune
depind n principal de compuii int i aplicaiile int. De exemplu, condiiile supercritice sau
condiiile aproape critice pot fi utilizate pentru oxidarea n ap supercritic, hidroliz, i
transformrile moleculare, cum ar fi conversia biomasei, n timp ce condiiile subcritice sunt
ideale pentru extragerea compuilor benefici sntii, inclusiv antioxidanilor. Din biomasa
cianobacteriilor aceast metod de extragere asigur obinerea n primul rnd, a extractelor cu
coninut nalt de ficobiliproteine [103,104].
Extracia asistat de ultrasunet (EAU) i extracia asistat de microunde (EAM) sunt dou
tehnici ecologice foarte actuale. Tehnica EAU folosete cavitaionarea acustic pentru a provoca
perturbarea pereilor celulari, reducerea dimensiunii particulelor, i mbuntirea contactului
ntre solvent i compuii int. Tehnica EAM utilizeaz radiaii de microunde care cauzeaz
micarea moleculelor polare i rotaia dipolilor pentru a nclzi solventul i pentru a promova
42

transferul compuilor

int din matricea probei n solvent [256]. Ambele metode ofer

posibilitatea de a utiliza mai muli solveni cu polariti diferite. De fapt, ambele tehnici asigur
o extracie extrem de rapid, cu evitarea degradrii compuilor labili. Ambele tehnici sunt rapide,
folosesc cantiti mici de solveni i sunt rentabile. Prin urmare, dezvoltarea ambelor metode ar
putea reprezenta un punct cheie n dezvoltarea tehnologiilor durabile de obinere a produselor
antioxidante.

Aceste dou tehnici, n special EAU este aplicat pentru a obine compuii

antioxidani liposolubili, iar compararea eficacitii acestei metode cu EFS a artat, c acestea
acioneaz practic la parametri egali [149].
Tehnologiile elaborate, aprobate n practica de cercetare

i propuse pentru aplicare

industrial permit recuperarea unor produse calitative din biomasa cianobacterian. n acelai
timp, necesitatea aplicrii unui echipament costisitor i a unor chimicale scumpe limiteaz din
punct de vedere economic aplicarea lor industrial [15]. n prezent exist cerere pronunat din
partea diferitor companii n ceea ce ine de tehnologiile simple, ieftine i eficiente de obinere
din biomasa vegetal a preparatelor antioxidante, dar n pofida eforturilor considerabile ale
cercettorilor numrul de implementri n acest domeniu este destul de redus, ceea ce denot
necesitatea unor propuneri mai atractive pentru producere.
1.4. Utilizarea antioxidanilor din cianobacterii
Cianobacteriile produc o varietate enorm de substane cu aciune antioxidant n scopul
de a se proteja de efectele negative generate de SRO. Extragerea i utilizarea lor n calitate de
remedii profilactice ori terapeutice ofer celulelor organismului uman posibilitatea de a se
proteja de aciunea radicalilor liberi [221]. Din gama larg de produse antioxidante ale
cianobacteriilor cele mai cunoscute pentru efectele lor benefice sunt compuii fenolici,
vitaminele C i E, carotenoizii i ficobiliproteinele [37, 47] .
Ficobiliproteinele (ficoeritrina, ficocianina i aloficocianina) din componena biomasei
cianobacteriilor, n primul rnd a spirulinei, se utilizeaz pe larg datorit proprietilor
remarcabile ca colorani i marcheri fluoresceni [184]. Fiind complet lipsii de toxicitate, n
calitate de colorani acetia pot fi parte component a alimentelor, inclusiv a celor care sunt
destinate copiilor i grupurilor de populaie cu necesiti speciale, precum i n componena
produselor cosmetice, inclusiv a celor hipoalergice. Datorit emisiei fluorescente specifice
ficobilinele din biomasa cianobacteriilor, dup purificarea lor, sunt aplicate pentru realizarea
diferitor tehnici de microscopie fluorescent, teste biomedicale de imunodiagnostic, n care
apar n calitate de marcheri specifici siguri pentru sntatea omului.

Datorit aciunii

antioxidante ficobiliproteinele se manifest ca ageni antiinflamatori, care reduc edemul, scad


43

nivelul histaminelor, activitatea mieloperoxidului, precum i nivelul prostaglandinei PGE2 i


leucotrienei LTB4 n esuturile inflamate [117]. n sistemele vii aceti pigmeni au aciune de
inhibiie a radicalilor hidroxil, alcoxil i peroxil. Ficocianina reduce de asemenea i nivelul
factorului necrozei tumorilor (TNF-) i are efect neuroprotector. n prezent aceti compui sunt
propui pentru utilizarea n terapia fotodinamic a tumorilor [216]. Aceste substane i au
efectul lor benefic i n prevenirea strilor canceroase n calitate de remediu profilactic [126,
131].
-carotenul pigment prezent n toate cianobacteriile este aprobat spre utilizare n
componena alimentelor i produselor cosmetice n
ficobiotehnologia,

statele care dezvolt intens

aa ca SUA, Israelul, Austria, Germania, Portugalia .a. Pornind de la

utilizarea lui n calitate de colorant, pe durata mai multor cercetri s-a demonstrat, c acest
pigment, fiind inclus n formule alimentare ori cosmetice ofer nu numai culoare, ci i protecie
contra procesului de oxidare acelui produs, n componena cruia se regsete. n cercetrile
biomedicale i clinice a fost demonstrat, c -carotenul este indispensabil n asigurarea unui
nivel normal al vederii, dar i a statutului imun la om, este un remediu profilactic eficient n
cazul cancerului, aterosclerozei, maladiilor coronariene .a. Plasma sangvin a omului n mod
obligatoriu conine caroten, n timp ce celulele corpului sunt incapabile de a realiza sinteza
acestui compus. Deci, fiind un element esenial, aportul lui cu alimentele este strict necesar. De
aici reiese cerina nalt fa de aceti compui pe piaa mondial. Cantitile de carotenoizi
comercializai anual se estimeaz valoric la peste 800 mln dolari USA [27].
Extractele din cianobacteriile Spirulina platensis, Nostoc linckia, posed aciune
hipolipemiant, antioxidant, antiinflamatoare i sunt indicate n hipercolesterolemie, maladii
cardiovasculare, infecii virale, .a. [57, 182].
Majoritatea obiectelor ficologice, care au fost introduse n procesul de producere
industrial prezint un grad nalt de siguran att pentru organismul uman, ct i pentru mediul
ambiant. n anul 2011, Comitetul de Experi n domeniul Informrii despre Suplimentele Dietice
(DSI-EC Dietary Supplements Information Expert Committee) al Conveniei Farmacopeice a
SUA a apreciat spirulina pentru cel mai nalt posibil grad de siguran i a declarat consumul de
spirulin absolut sigur pentru om, ceea ce este un argument suplimentar n utilizarea resurselor
acvatice preferenial celor terestre n procesul de obinere a antioxidanilor pentru uzul uman ori
animal [15].
Biomasa cianobacteriilor conine cantiti importante de enzime antioxidante, chiar dac
nu sunt superproductori ai acestor substane, compui fenolici activi, aminoacizi i oligopeptide
cunoscute prin efectele lor antioxidante. Consumul de biomas ori de preparate obinute n baza
44

ei constituie un beneficiu pentru sntatea omului, cu condiia c sunt luate sub control aspectele
ce in de prezena elementelor toxice ori cu efect prooxidant. Odat cu creterea continu a
cererii pentru noi surse de antioxidani naturali n studiu sunt incluse tot mai multe specii de
cianobacterii. Nostoc linckia, care i-a avut ntrebuinare doar n calitate de biofertilizator, ori ca
produs alimentar n zone geografice foarte mici, poate deveni un obiect ficobiotehnologic de
valoare pentru obinerea produselor antioxidante, att datorit componenei biomasei, ct i
cerinelor minime n procesul de cultivare industrial.

1.5. Concluzii la capitolul 1


1. n prezent sunt dezvoltate i implementate numeroase tehnologii de cretere intensiv a
diferitor specii de microalge i cianobacterii, care sunt utilizate n diferite domenii ale economiei.
Printre cele mai intens studiate n acest sens sunt

speciile de

Dunaliella, Arthrospira i

Haematococcus. Cianobacteriilor din genul Nostoc li se atrage o atenie mult mai mic, cu toate
c acestea sunt extrem de nepretenioase, au o rat de cretere acceptabil pentru cultivare
industrial i o componen valoroas a biomasei.
2. Biomasa cianobacteriilor prezint o varietate enorm de componente, ce posed
activitate antioxidant; efectul protector al crora este

asigurat de sinergismul acestora.

Sistemele antioxidante complexe se caracterizeaz prin activitate mai nalt comparativ cu cea a
substanelor pure. n special, aceasta se refer la rezultatele in vivo, fapt pentru care tot mai muli
cercettori pledeaz pentru complexe antioxidante, iar eforturile majore se concentreaz pe
descifrarea mecanismelor de interaciune a elementelor complexului n asigurarea proteciei
antioxidante.
3. Actualmente exist cerere pronunat din partea diferitor companii n ceea ce ine de
tehnologiile simple, ieftine

i eficiente de obinere din biomasa vegetal a preparatelor

antioxidante, dar n pofida eforturilor considerabile ale cercettorilor, numrul de implementri


n acest domeniu este destul de redus, ceea ce denot necesitatea unor propuneri mai atractive
pentru producere.
4. Nostoc linckia este un obiect biotehnologic de perspectiv pentru obinerea preparatelor
complexe cu efect antioxidant i antiradicalic datorit faptului c biomasa conine cantiti
biotehnologic importante de ficobiliproteine i polizaharide sulfatate, dar i de carotenoizi,
compui fenolici, glutation, enzime antioxidante primare i secundare, chelatori ai metalelor.
5. Tehnologiile complexe de obinere a antioxidanilor din biomasa de Nostoc linckia
trebuie s includ att etapele tradiionale ce asigur producerea de biomas, dar i cele de
extragere a componentelor active i de valorificare a deeurilor produse.
45

Problema de cercetare, care a fost formulat n rezultatul studiului bibliografic const n


identificarea elementelor-cheie a procesului biotehnologic de cultivare a cianobacteriei Nostoc
linckia cu scopul producerii preparatelor cu efect antioxidant i de valorificare a reziduului de
biomas.
Direciile de rezolvare a problemei de cercetare constau n depistarea compuilor i a
procedeelor specifice, care asigur activarea sistemelor de protecie antioxidant n cultura de
nostoc i aciunea crora nu se asociaz cu acumularea produselor degradrii oxidative;
elaborarea tehnologiilor de obinere a preparatelor complexe cu efect antioxidant i antiradicalic
din biomasa de nostoc, crescut n condiii de sintez dirijat; elaborarea tehnologiilor de
utilizare a reziduului de biomas rmas dup extragere n cadrul bionanotehnologiilor i
tehnologiilor moderne de protecie a mediului ambiant.
Scopul lucrrii const n elaborarea tehnologiei complexe nonpoluante de cultivare a
cianobacteriei Nostoc linckia, de obinere a preparatelor cu efect antioxidant.
Obiectivele lucrrii sunt: Monitorizarea modificrilor biochimice i activitii antioxidante
a biomasei i extractelor din ea pe durata dezvoltrii culturii statice de Nostoc linckia;
Evidenierea indicatorilor biotehnologici cu tangen la ciclul vital, utili pentru obinerea
preparatelor antioxidante din biomasa de Nostoc linckia; Stabilirea parametrilor biotehnologici
optimi de extragere i pstrare pe termen lung a componentelor cu efect antioxidant din biomasa
de nostoc; Elucidarea particularitilor modificrii coninutului de componente antioxidante n
biomasa cianobacteriei Nostoc linckia n condiii de stres oxidativ indus prin aciunea compuilor
Fe(III); Studiul posibilitii valorificrii reziduului de biomas de Nostoc linckia dup extragerea
componentelor antioxidante; Elaborarea tehnologiei complexe de cultivare a Nostoc linckia, de
obinere a preparatelor cu efect antioxidant i de utilizare a reziduului de biomas n calitate de
matrice pentru bionanosintez i n calitate de biosorbent n purificarea mediului.

46

2. ACTIVITATEA ANTIOXIDANT I COMPONENA BIOCHIMIC A BIOMASEI


DE NOSTOC LINCKIA PE DURATA CICLULUI VITAL
Speciile, inclusiv cele de cianobacterii supravieuiesc azi doar datorit faptului c sunt
adaptate n spaiu i timp la mediul lor fizic, geologic, chimic i biologic. Ele se adapteaz
continuu, i deci, evolueaz, ori n caz contrar dispar. Adaptrile obinute sunt extrapolate i n
cazul transferului culturilor de cianobacterii n condiii tehnologice, atunci cnd sunt supuse
standardizrilor n scopul obinerii biomasei i produselor de extragere. n condiii tehnologice
orice cultur parcurge aceleai etape care mpreun formeaz ciclul de dezvoltare al culturii
discontinue sau ciclul vital. Ciclul vital este o expresie generalizat a adaptrii speciei n baza
celei mai rudimentare expresii ale paternului de specie. Determinativele genetice ale ciclului
vital prezint un lan de dovezi ale supravieuirii speciei pe parcursul istoriei evolutive. [15, 59,
229]. Evaluarea ciclului vital este important i pentru aprecierea fezabilitii energetice i
ecologice a proceselor biotehnologice cu implicarea cianobacteriilor. Studiul, evaluarea i
aprecierea ciclului vital presupune nu doar monitorizarea modificrii numerice, ci i schimbrile,
care intervin n activitatea fiziologic a celulelor i se exprim n modificri biochimice, care pot
fi detectate prin aplicarea unor teste uzuale.
n condiii metabolice normale, cianobacteriile, ca unicele procariote capabile de
fotosintez, produc n mod constant oxigen molecular, iar n procesul respiraiei necesit
prezena acestuia ca acceptor final de electroni. Aceste procese redox sunt corelate cu formarea
speciilor reactive de oxigen SRO (superoxid anionul O2-, peroxidul de hidrogen H2O2, radicalul
OH i oxigenul singlet 1O2), considerate drept produi inevitabili ai prezenei oxigenului
molecular n celul. n consecin, principalele surse generatoare de SRO la cianobacterii sunt
lanul fotosintetic i cel respirator transportor de electroni, i nsui fotosistemul I i fotosistemul
II la nivelul membranelor tilacoidale. Orice condiie fiziologic (de exemplu vrsta culturii,
exigenele de mediu) ce induce un dezechilibru n ansamblul de reacii productoare de putere
reductoare (NADPH) i de energie (ATP) va genera specii reactive de oxigen, iar efectul lor
cumulativ va determina instalarea unui stres oxidativ. Din moment ce starea redox a celulei i
lanul transportor de electroni moduleaz multe procese celulare eseniale, i SRO sunt o parte
integrant a unor reele de semnalizare, nivelul celular al diferitelor specii reactive de oxigen
trebuie s fie bine controlat. Pentru a menine statutul antioxidant pe parcursul creterii i
dezvoltrii, cianobacteriile adopt numeroase mecanisme care i gsesc expresia n modificri n
antenele lor colectoare, evoluia n tranziiile de stare, schimbri n stoichiometria PS II la PS I,
disiparea excesului de energie pe cale non-fotochimic de ctre pigmenii accesorii ca
ficobiliproteine i, drept bariere mai avansate - enzime pentru detoxicare, activarea unor gene,
47

respectiv apariia unor noi produse de biosintez implicate n rezisten i asigurarea


supravieuirii [71, 135]. Nu n ultimul rnd, caracterele morfologice ale cianobacteriilor
filamentoase (teaca mucopolizaharidic, hormogoniile, achinetele, heterocistele) intervin ca i
factori de adaptare la condiiile de mediu i determin iniierea proceselor de migrare (evadare)
i motilitate, precum i apariia unor compartimente caracteristice ce preiau anumite funcii cnd
este afectat integritatea celular. n consecin, multitudinea de strategii ntreprinse de
cianobacterii pentru a stopa formarea ori propagarea SRO se reflect n activitatea biosintetic a
culturii. Astfel, intensitatea sintezei componentelor cu aciune antioxidant i antiradicalic se
modific esenial pe parcursul ciclului de dezvoltare al culturii. Raportul cantitativ al acestor
principii biologic active determin caracterul aciunii antioxidante a biomasei i respectiv a
extractelor sau a preparatelor complexe obinute n baza acestei biomase. n scopuri
biotehnologice este foarte important stabilirea perioadelor de recoltare optime pentru obinerea
unui complex antioxidant eficient.
Ciclurile vitale implic strategii de cretere cu utilizarea diferitor medii la diferite etape.
Diferite specii se caracterizeaz n acest sens prin variate adaptri, care n esena lor sunt
destinate asigurrii creterii culturii. Creterea numeric poate fi apreciat ca diviziune a
celulelor individuale sau ca cretere n mrime a coloniilor/trihoamelor att din contul mririi
numrului de celule ca rezultat al diviziunii, ct i din contul producerii polizaharidelor, ce
prezint o matrice pentru structura spaial format. n dependen de specie, n timp de o zi pot
avea loc n mediu de la 1 la 3 diviziuni. n linii generale, cu ct volumul individual al celulelor
este mai mare, cu att rata de cretere a culturii este mai nalt, dar n dependen de condiii,
chiar n cadrul unei i aceleiai tulpini de cianobacterii rata de cretere pe durata ciclului vital
poate varia n limite foarte largi. n condiii naturale ciclul vital este determinat de un complex
polifactorial care include

cantitatea de nutrieni i biodisponibilitatea lor, fotoperiodismul,

calitatea i cantitatea luminii, temperatura, salinitatea, turbulena i alte caracteristici de mediu.


Astfel, n condiii naturale pentru marea majoritate a culturilor este caracteristic o alternan a
fazelor de cretere activ i a celor de repaos, ultimele fiind o adaptare la condiiile nefavorabile
de mediu. n condiii de laborator ori cele industriale povara majoritii factorilor variabili n
natur este scoas prin meninerea artificial a unor condiii mai mult ori mai puin constant,
determinante devenind caracterele ereditare, care determin procesele de reproducere i
dezvoltare n condiiile unui mediu constant limitat. Astfel, scopul prezentului capitol const n
monitorizarea modificrilor biochimice i evoluiei statutului antioxidant al culturii statice a
cianobacteriei Nostoc linckia pe parcursul ciclului vital n condiii de laborator i industriale.

48

2.1. Materiale i metode de studiu


Obiect al studiului a fost tulpina cianobacteriei Nostoc linckia (Roth) Born et Flah CNMCB-03 depozitat n Colecia Naional de Microorganisme Nepatogene a R. Moldova.
Pentru cultivare mediul de nutriie Gromov 6 optimizat cu urmtoarea componen:
macroelemente (g/l) - KNO3-0,5, K2HPO4-0,45, NaHCO3-0,05, MgSO47H2O-0,1, CaCl2-0,11.
microelemente (mg/l) - ZnSO47H2O - 0,05, MnSO4 - 2, H3BO3 - 0,85, (NH4)6Mo7O244H2O2,25, FeSO4 7H2O - 4, Co(NO3)2H2O - 0,009, EDTA - 4,75.
Cultivarea a fost efectuat n baloane Erlenmayer cu meninerea urmtorilor parametri:
pH-ul 6,8-7,2, temperatura 25-27 oC, intensitatea luminii de 2000-3000 lx, agitare periodic
lent. Cantitatea de inocul a fost de 0,2 g/l n recalcul la BAU. Prelevarea de probe s-a efectuat
cu strictee la intervale de timp de 24 ore, pentru a exclude variaiile circadiene care intervin n
statutul oxidativ al culturii microalgale.
Determinarea productivitii nostocului a fost efectuat spectrofotometric n baza curbei
de calibrare, ce reprezint corelaia dintre densitatea optic i cantitatea de BAU:
BAU (g/L) = 0,88 E590

(1)

unde:
0.88 coeficientul de recalcul a BAU
E590 densitatea optic a probei la 590 (0 E 0.2),
- diluia probei.
n continuare, biomasa nostocului se separ prin centrifugare de lichidul cultural timp de 6
min la 4000 rotaii per minut, se spal timp de 3-5 min cu soluie de acetat de amoniu de 2,02,5% pentru nlturarea srurilor minerale, stabilit dup pierderea fraciei de molecule medii
din celule, la splarea cu soluie de diferite concentraii.
Obinerea extractelor. Extractul hidric i cel alcoolic au fost obinute prin extragere n ap
distilat i, respectiv, n alcool de 96 % reieind din raportul biomas (mg): extractant (ml) de
5:1. Aceste tipuri de extracte permit extragerea unui complex antioxidant care conine fraciile
lipo - i hidrosolubile, iar efectul antioxidant final al extractelor este unul sumativ. Extractul
hidric - biomasa cianobacterian a fost dezintegrat prin congelare-decongelare repetat.
Extragerea se face n ap distilat. Extractul etanolic - extragerea a fost efectuat timp de 24 ore
la temperatura camerei n tuburi din mas plastic tip Eppendorf, la agitare continu. Extractele
obinute au fost separate de biomas prin centrifugare i pstrate la temperatura +40C.
Determinarea capacitii antiradicalice cu utilizarea radicalului DPPH. Radicalul
DPPH (1,1 difenil-2-picril hidrazil) de culoare violet, utilizat n calitate de substrat, este redus
prin adiionare de atomi de hidrogen cu obinerea de 1,1 difenil-2-picril hidrazin de culoare
49

galben. Pentru determinarea activitii antioxidante a soluiilor hidrice i etanolice obinute din
biomasa Nostoc linckia se prepar soluia etanolic de 0,6 M DPPH (radical). Pentru aceasta
2,4 mg DPPH se dizolv n 100 ml etanol. Solubilizarea este anevoioas i se efectueaz cu
utilizarea agitatorului magnetic. Se obine soluia DPPH cu absorbana de 0,62-0,66. Stabilitatea
soluiei este de maximum 6 ore. Amestecul reagent const din 0,3 ml soluie etanolic extract
antioxidant i 2,7 ml soluie DPPH (sau 0,1 ml prob la 3 ml reagent DPPH). Probele se
amestec bine prin agitare. Incubarea se petrece la ntuneric la temperatura camerei, timp de 60
minute. Incubarea peste 60 minute este inutil. Absorbana se msoar la lungimile 515- 517 nm
(maximumul nregistrat). n calitate de prob oarb se utilizeaz etanolul n concentraia
corespunztoare n care este solubilizat 0,3 ml extract antioxidant pentru a exclude componenta
color a probelor propriu-zise. Reducerea valorilor extinciei (% Inhibiie) a soluiei de DPPH se
calculeaz conform ecuaiei:
% Inhibiie =(Abst=0 - Abst=60 min)/Abst=0 * 100,

(2)

unde Abst=0min este valoarea absorbanei soluiei 0,06 mM DPPH i Abst=60 min este valoarea
absorbanei soluiei DPPH dup 60 min incubare cu extractele antioxidante [28, 34].
Determinarea capacitii antiradicalice cu utilizarea radicalului cation ABTS+. Metoda
de determinare a capacitii antiradicalice cu aplicarea ABTS (2,2 azinobis 3-etilbenzotiazolin6-acidului sulfonic) este cunoscut i utilizat pe larg pentru stabilirea activitii antioxidante a
substanelor, indiferent de natura lor [201]. n baza metodei date se determin activitatea
antioxidant att a substanelor pure, ct i a complexelor antioxidante. Radicalul ABTS este
generat prin oxidarea ABTS (2,2 azinobis 3-etilbenzotiazolin-6-acidului sulfonic), iar reducerea
lui are loc prin mecanismul de adiionare de electroni. n calitate de echivalent pentru calculul
cantitativ n aceast metod se utilizeaz troloxul, compus cu activitatea antiradicalic similar
tocoferolului, dar care, fiind lipsit de lanul fitil, este hidrosolubil. Rezultatele testului pot fi
exprimate n % Inhibiie (pentru compararea rezultatelor n interiorul testului) i TEAC (trolox
equivalent antioxidant activity) pentru compararea cu antioxidanii de alt natur.
Oxidarea ABTS n scopul formrii radicalului cation ABTS se realizeaz cu utilizarea
persulfatului de potasiu. Pentru aceasta se prepar soluia stoc a reagentului ABTS de 7 mM n
ap deionizat, la care se adaug persulfatul de potasiu n concentraia de 2,45 mM n raport de
1:1. Reacia de formare a radicalului ABTS decurge la ntuneric, la temperatura camerei timp de
cel puin 12-16 ore. Soluia de lucru se prepar din soluia stoc de ABTS, care se dizolv n
etanol sau ap distilat pn la stabilizarea valorii absorbanei la 0,700 0,020 uniti la
lungimea de und de 734 nm.

50

Amestecul reactant const din 0,3 ml extract antioxidant i 2,7 ml soluie ABTS. Reacia
de reducere decurge la temperatura camerei timp de 6 min, iar procentul de inhibiie se
calculeaz conform ecuaiei:
% Inhibiie =(Abst=0 - Abst=6 min)/Abst=0 * 100,

(3)

unde Abst=0min este valoarea absorbanei de 0,700 0,020 la 734 nm a soluiei ABTS+, iar
Abst=6 min este valoarea absorbanei dup incubare.
Valoarea indicelui TEAC este exprimat n mM Trolox/g(mg) substan activ (biomas),
utiliznd curba de calibrare pentru Trolox. Intervalul liniar pentru curba de calibrare este de 20 1000 M Trolox (r2 = 0,9976).
Evaluarea capacitii de reducere a reagentului Folin-Ciocalteu [150, 223] are la baz
transferul

de

electroni

produs

mediul

alcalin

cu

reducerea

complexului

acid

fosfomolibdenic/fosfovolframic n rezultatul cruia are loc formarea cromogenului care se


determin spectrofotometric. Din soluia Folin-Ciocalteu de 4N se prepar soluia de lucru prin
diluarea reagentului de 10 ori cu ap bidistilat.
La extractele antioxidante (0,3 ml) se adug 1,5 ml reagent Folin-Ciocalteu i 1,2 ml
carbonat de sodiu de 7,5%. Amestecurile se agit i se incubeaz timp de 5 min la 50 0C. n
proba martor n loc de extract se adaug solventul corespunztor (etanolul, apa). Dup rcirea
probelor se msoar absorbana lor la 760 nm. Capacitatea de reducere a radicalului Folin Ciocalteu se exprim n echivalent acid galic la mg/g substan activ sau biomas. Curba de
calibrare pentru acidul galic este linear n intervalul 0,01-0,1 mg/ml (n=6, r2=0,999).
Evaluarea capacitii antioxidante prin metoda reducerii reagentului fosfomolibdenic
(CRFM). n baza testului CRFM activitatea antioxidant a probei se determin indirect,
spectrofotometric, n baza reaciei de oxido-reducere, n timpul creia are loc reducerea Mo(VI)
n Mo(V) cu formarea complexului verde fosfat/Mo(V) i are la baz transferul de electroni n
mediul acid. Utilitatea metodei date const n posibilitatea testrii antioxidanilor solubilizai n
solveni foarte variai, cu grad diferit de polaritate [194]. Reagentul fosfomolibdenic se prepar
reieind din urmtoarea compoziie: 0,6 M acid sulfuric, 28 mM sodiu fosfat i 4 mM amoniu
molibdat. Pentru realizarea testului la 0,3 ml soluie etanolic extract antioxidant se adaug 2,7
ml soluie reagent fosfomolibdenic. Amestecurile se incubeaz la 950C timp de 90 min. Probele
se rcesc pn la temperatura camerei, se msoar extincia lor la 695 nm. n calitate de control
negativ se utilizeaz solventul. Capacitatea antioxidant se exprim n mg trolox la g substan
activ sau biomas. Calculul se efectueaz n baza curbei de calibrare pentru trolox. Deoarece
metoda dat presupune testarea activitii antioxidante a extractelor etanolice, testului CRFM
sunt supuse doar extractul hidro-etanolic de 55% i cel etanolic.
51

Estimarea gradului de peroxidare a lipidelor (testul dialdehidei malonice). Pentru


aprecierea nivelului de dialdehid malonic (DAM) n biomasa de nostoc se procedeaz n
modul urmtor: la 1 ml biomas cu concentraia de 5 mg/ml se adaug 2 ml soluie acid
tiobarbituric de 0,65% preparat n soluie 20% acid tricloracetic. Amestecul reactant este supus
incubrii la 950C timp de 20 min. Probele se rcesc i se determin densitatea optic la lungimile
de und de 532 nm i 600 nm. Absorbana determinat la 600 nm exclude turbiditatea
nespecific [100].
Determinarea cantitativ a ficobiliproteinelor a fost efectuat conform metodei
spectrofotometrice elaborat de Boussiba i Richmond n modificaia [245, 246]. Metoda este
bazat pe determinarea absorbanei extractului hidric, obinut n rezultatul procedurii de
congelare-decongelare repetat a biomasei de nostoc standardizate dup concentraie.
Absorbana extractelor a fost msurat la lungimile de und 565, 620 i 650 nm, ce reprezint
maximumul de absorbie a ficoeretrinei, ficocianinei i aloficocianinei, respectiv, iar
concentraiile au fost calculate folosind ecuaiile 4-6:
Ficoeretrina (mg/ml) = [E565 0.572 (E620) + 0.246 (E650)] / 5.26

(4)

Ficocianina (mg/ml) = [E620 0.666 (E650)] / 3.86

(5)

Aloficocianina (mg/ml) = [E650 0.05 (E620)] / 4.65

(6)

unde: E este coeficientul de extincie, msurat la 565, 620 i 650 nm.


Coninutul de ficobiliproteine sumare n biomasa de nostoc s-a determinat prin suma
cantitii de ficoeretrin, ficocianin i aloficocianin [77].
Coninutul de proteine n biomas, a fost determinat spectrofotometric prin metoda
propus de Lowry [147]. Metoda se bazeaz pe extracia proteinelor cu NaOH 0,1N. La 0,1 ml
prob (biomas de nostoc 5,0 mg/ml) s-a adaug 0,9 ml NaOH 0,1N i timp de 30 min are loc
extracia. Dup care din soluia dat s-a luat 0,1 ml i s-a adaugat 0,4 ml ap distilat i 2,0 ml
amestec (reactiv A - carbonat de sodiu 2% n 0,1N hidroxid de sodiu - i reactiv B - sulfatul de
cupru 0,5% de citrat de sodiu 1,0%, care s-a preparat prin amestecarea a 49,0 ml reactiv - cu 1,0
ml reactiv B s-a agitat bine i s-a lsat n repaos 10 min la temperatura camerei. Apoi s-au
adugat 0,2 ml reagentul Folin i s-a agitat energic. Proba s-a lsat timp de 30 min pentru
dezvoltarea coloraiei i s-a msurat absorbana soluiei la spectrofotometru la lungimea de und
750 nm n cuve cu grosimea stratului de 1,0 cm.
Coninutul de proteine n % din BAU s-a determinat dup formula:
E750500,32100%/m, (7)

(7)

unde: E750 absorbana probei la lungimea de und 750 nm;


0,32 coeficientul de recalcul a cantitii de peptide n mg/ml;
52

50 diluia probei
m masa probei absolut uscate (mg).
Coninutul de glucide a fost determinat prin metoda colorimetric cu utilizarea reactivului
antronic, standard-D-glucoza [288, 292]. Metoda este bazat pe deshidratarea hexozelor n
prezena acidului sulfuric concentrat, urmat de condensarea acestora cu antron, care rezult cu
obinerea unei coloraii albastre-verzui. n scopul dat la 0,25 ml prob supus cercetrii s-au
adugat 2,50 ml soluie antron (50,0 mg antron recristalizat n 100,0 ml H2SO4 de 66%).
Amestecul s-a agitat minuios, apoi eprubetele s-au transferat pe baia cu ap n fierbere i s-au
lsat n decurs de 30 min. Apoi, eprubetele cu probe s-au rcit sub ap curgtoare i s-au lsat la
ntuneric pentru expoziie timp de 30 min. Soluiile colorate s-au colorimetrat la fotocolorimetru
la lungimea de und de 620 nm n cuve de 0,5 cm.
Coninutul de glucide s-a determinat dup formula:
E6201001,25/m,

(8)

unde: E620 - absorbana soluiei la lungimea de und 620 nm;


1,25 coeficientul de recalcul a cantitii de glucide n mg/ml;
m masa probei absolut uscate, mg.
Determinarea cantitativ a lipidelor generale s-a realizat prin metoda colorimetric,
bazat pe determinarea produselor de degradare a lipidelor utiliznd setul de reageni: acizii
sulfuric i fosforic concentrat, vanilin (LAHEMA) [38, 112, 121]. n scopul menionat la 0,5 ml
prob (concentraia 7,0 mg/ml) s-a adugat 1,5 ml H2SO4(c). Proba s-a supus hidrolizei la baia
de ap timp de 10 minute. Apoi proba s-a rcit pn la temperatura camerei. La 0,5 ml de
hidrolizat colectat s-a adugat 1,5 ml amestec fosfovanilinic (trei pri H3PO4(c) amestecat cu o
parte soluie 0,6% de vanilin cu ap). Dup agitare s-a lsat la ntuneric timp de 45 minute la
temperatura camerei. Extincia s-a msurat la fotocolorimetru, la lungimea de und de 560 nm n
cuv de 10,0 mm.
Coninutul de lipide generale s-a calculat conform formulei:
E560100/0,96m,

(9)

unde: E560 - absorbana soluiei la lungimea de und 560 nm;


0,96 coeficientul de recalcul a cantitii de lipide generale (mg/ml);
m masa probei, (mg).

53

2.2. Modificarea cantitii i calitii biomasei de Nostoc linckia pe durata ciclului vital n
condiii de producere i de laborator
Culturile microbiene statice sunt caracterizate prin stabilitatea ciclului vital, care poate fi
reflectat n forma unui grafic curba de cretere. Cunoaterea evoluiei populaiei microbiene
are o deosebit importan pentru stabilirea perioadelor de recoltare industrial att a biomasei,
ct i a metaboliilor primari i secundari. Productivitatea este unul din parametrii principali ce
caracterizeaz creterea i dezvoltarea cianobacteriilor [17].
Anterior au fost efectuate astfel de cercetri pentru cultura de Porphyridium cruentum i
cea de Haematococcus pluvialis [11, 15]. Porfiridiumul are acelai tip de comportament pe
durata ciclului vital att n condiii standard, ct i n condiii de stres oxidativ, dar amplitudinea
modificrilor care au loc n activitatea antioxidant a extractelor este mai pronunat n condiii
de stres. Conform rezultatelor obinute, modificarea producerii de biomas (reducere, sporire) pe
durata celor trei faze ale ciclului vital al hematococului celule mobile verzi, citi bruni i citi
roii demonstreaz c n condiii de stres oxidative provocat de compuii coordinativi ai
cobaltului cu bazele Shiff are loc o acumulare intens de biomas, iar n condiii de stres are loc
o acumulare mai pronunat a carotenoizilor [11]. Sinteza carotenoizilor intervine drept unul din
factorii de baz care determin statutul antioxidant al microalgei. Acumularea lor n exces
prezint o reacie de rspuns a celulelor la prezena complexelor metalice care provoac stare de
stres oxidativ. De asemenea producerea de carotenoizi prezint un rspuns de neutralizare a
radicalilor liberi, care se formeaz n avalan n asemenea condiii. n cazul hematococului pe
durata ciclului vital doar o analiz comparativ a proceselor de acumulare a biomasei i de
sintez a carotenoizilor poate oferi o informaie veridic despre starea culturii. Evidenierea
etapelor vulnerabile ale ciclului vital nu este posibil doar n baza unui singur indicator a
cantitii de biomas la momentele reale de timp studiate. Din aceste considerente evaluarea
productivitii urmeaz a fi realizat doar n paralel cu ali indicatori, care caracterizeaz starea
funcional a celulelor. n cazul microalgei Haematococcus pluvialis un astfel de indicator este
cantitatea de caroten n biomas la etapa de celule verzi, iar la etapa de aplanospori cantitatea
de aplanospori [11].
n cazul nostocului care se caracterizeaz prin varietate mare a componentelor biomasei se
monitorizeaz att procesul de acumulare a biomasei, ct i modificarea coninutului
principalilor compui din componena acestei biomase. Aceste modificri pot oferi informaii
utile despre statutul biomasei de nostoc pe durata dezvoltrii culturii statice.

54

n reprezentarea grafic a dinamicii acumulrii de biomas n cultura static de Nostoc


linckia, n condiii de laborator i de producere pot fi evideniate fazele specifice, cunoaterea
crora are o importan major pentru biotehnologie (Figura 2.1). n condiii de laborator se
pornete de la un unocul de 0,2 g/L, iar n cele industriale de la 0,4 g/L, ceea ce este dictat de
specificul aplicrii sistemelor industriale.

Laborator, BAU, g/L

Producere, BAU, g/L

0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0

10

11

12

13

Fig. 2.1. Acumularea biomasei pe parcursul ciclului vital la Nostoc linckia n condiii de
laborator i de producere
n condiii de laborator faza lag, n cursul creia are loc reprogramarea metabolic a
culturii, n cazul nostocului este redus la limite imperceptibile, deoarece a fost utilizat un inocul
consistent, iar inocularea acestuia s-a fcut n mediu de cultur identic cu cel n care a fost
cultivat cultura din inocul. Faza de laten, ca i faza de accelerare a ritmului de cretere nu pot
fi nregistrate ca fluctuaii a cantitii de biomas n condiii de laborator.
Altfel stau lucrurile n condiii de producere. Am menionat deja, c n condiii industriale
adaptarea culturilor are loc mai lent deoarece condiiile industriale nu sunt identice condiiilor de
obinere a inoculului. Ca rezultat, primele dou faze ale ciclului vital n condiii industriale se
depisteaz cu uurin, avnd o exprimare clasic n lipsa ori ritmul extrem de lent al diviziunii
celulare i creterii numerice.
Pentru cultura static de Nostoc linckia faza de multiplicare exponenial n condiii de
laborator este progresiv pn la ziua a 9-a de cultivare, iar n condiii de producere pn la
ziua a 10-a, ceea ce presupune o cretere a culturii la o rat constant pn la epuizarea
substanelor nutritive din mediul de cultivare. La sfritul fazei exponeniale se evideniaz o
perioad de ncetinire a ritmului de cretere a tulpinii, dup care cultura intr n faza staionar
55

(rata de cretere 0). n condiii de producere faza staionar este de durat mai lung. Dac
cultura de laborator ntr n faza de declin ncepnd cu ziua a 12-a, cultura industrial i la cea de
a 13-a zi de cultivare este n faz staionar stabil. Ciclul vital al culturii statice de Nostoc
linckia relev un model de cretere caracteristic, iar durata optim din punct de vedere
biotehnologi este de 12 zile n condiii de producere, i 10 zile n condiii de laborator.
Pe durata ciclului vital se modific i coninutul biochimic al biomasei de nostoc, iar de
aici i caracterul aciunii antioxidante a biomasei i respectiv a extractelor sau a preparatelor
complexe obinute n baza acestei biomase. n scopuri biotehnologice este foarte important
stabilirea perioadelor de recoltare optime pentru obinerea unui complex antioxidant eficient. n
continuare au fost studiate modificrile cantitative n principalele componente ale biomasei de
nostoc (lipide, glucide, proteine, ficobiliproteine, fenoli). Pentru a monitoriza ce schimbri
intervin pe parcursul ciclului vital la nivelul activitii biosintetice au fost determinate
principalele componente ale biomasei de nostoc la fiecare 24 ore de cultivare. n Figura 2.2 sunt
prezentate rezultatele privind dinamica coninutului de fenoli n biomasa de nostoc pe parcursul
ciclului vital.
3.5

Fenoli, laborator

Fenoli, producere

Fenoli, eg acid galic


mg/g biomas

3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
1

5
6
7
8
durata cultivrii, zile

10

11

12

Fig. 2.2. Cantitatea de fenoli n biomasa de Nostoc linckia pe durata ciclului vital n
condiii de laborator i de producere
Coninutul de fenoli n biomasa de nostoc pe durata ciclului vital este un indicator destul
de stabil n timp. Un nivel mai ridicat al acestora se atest la nceputul cultivrii i la finele
acesteia att n condiii de laborator, ct i n cele de producere. Condiiile industriale se
caracterizeaz prin meninerea nivelului iniial nalt de fenoli timp de 3 zile din momentul
inoculrii i printr-o tendin constant de cretere n faza staionar. n condiii de laborator
creterea nivelului de fenoli n biomas are loc doar la intrarea culturii n faza de declin.
56

Ficobiliproteinele constituie o component important a biomasei de nostoc. Fiind


pigmeni fotosintetici (auxiliari) acetia, de rnd cu clorofila i carotenoizii, determin
intensitatea proceselor de biosintez a materiei organice, i deci, asigur creterea biomasei
celulare. Cantitatea ficobiliproteinelor totale n biomasa de Nostoc linckia n ambele cazuri
precutate este n ascensiune uoar de la inoculare i pn la finele etapei de cretere
exponenial, dup care cantitatea lor n biomas ncepe s scad, ceea ce corespunde scderii
intensitii fotosintezei n faza staionar i nceputul celei de declin (Figura 2.3).

Ficobiliproteine, % biomas

Ficobiliproteine, laborator

Ficobiliproteine, Producere

6
5
4
3
2
1
0
1

10

11

12

Fig. 2.3. Cantitatea ficobiliproteinelor totale n biomasa de Nostoc linckia pe durata


ciclului vital n condiii de laborator i de producere
Aceste rezultate de fapt reflect fluctuaiile procesului de fotosintez, care au loc cel mai
intens n etapa de cretere exponenial a culturii. Ca urmare, anume n acest interval de timp
cantitatea pigmenilor auxiliari fotosintetici este maximal.
Cu toate c fa de alte cianobacterii biomasa de Nostoc linckia conine o cantitate mai
joas de proteine, importana acestora, ca i n orice tip de celul este una vital. Fluctuaiile
calorice ale cantitii de proteine poate reflecta acumularea ori utilizarea substanelor de rezerv,
activarea ori inhibarea activitii enzimatice .a. Cantitatea de proteine n biomasa nostocului
este maximal n primele dou zile de cultivare att n condiii de laborator, ct i n cele de
producere i se menine la un nivel nalt pn la jumtatea fazei exponeniale de cretere, dup
care urmeaz o scdere, care este mai pronunat n condiii de laborator. Aceste modificri cel
mai probabil, sunt determinate de micorarea intensitii proceselor enzimatice de protecie,
adaptare i a celor metabolice de baz. Rezultatele sunt prezentate n Figura 2.4.

57

Proteina, % biomas

Laborator

Producere

32
30
28
26
24
22
20
1

10

11

12

Fig. 2.4. Cantitatea proteinelor n biomasa de Nostoc linckia pe durata ciclului vital n
condiii de laborator i de producere
Rezultatele obinute pentru cantitatea de proteine n biomasa de nostoc de-a lungul ciclului
vital nc o dat confirm perioadele optimale pentru recoltarea biomasei. Astfel, n condiii de
laborator la ziua a 12-a de cultivare cantitatea de protein scade simitor, deci recoltarea unei
biomase calitative trebuie efectuat mai devreme, aa cum am recomandat anterior la ziua a
10-a din momentul inoculrii.
Compuii glucidici prezint fracia major a biomasei de nostoc. Pe lng funciile tipice
pe care le au aceti compui n celul, n cazul nostocului acetia mai sunt i componentele
structurale ale capsulei celulare, strns ataate de peretele celular. Funcia de baz ale acestor
polizaharide este de a proteja celulele de nostoc de disecare. Specia Nostoc linckia, fiind o specie
edafic se confrunt n natur adesea cu acest fenomen, iar pe durata procesului evolutiv,
formarea unei capsule strns ataate de peretele celular este un mecanism eficient de protecie i
adaptare. Capsula celular are rol de structur de protecie i fa de ali factori nefavorabili. De
exemplu, aceasta asigur supravieuirea celulelor n medii cu concentraii nalte de compui cu
toxicitate nalt, cum ar fi, de exemplu, metalele grele. Rolul protector al compuilor glucidici
const n sorbia toxicanilor pe site-urile active i diminuarea pe aceast cale, a impactului lor
asupra celulelor. Fiind un component al biomasei cu rol de protecie, n condiii normale
fluctuaiile cantitative a glucidelor nu ar trebui s fie observate.
Rezultatele obinute pe durata studiului ciclului vital la Nostoc linckia confirm acest lucru
(Figura 2.5).

58

Glucide, laborator

Glucide, producere

Glucide, % biomas

70
60
50
40
30
20
10
0
1

6
7
8
durata cultivrii, zile

10

11

12

Fig. 2.5. Cantitatea glucidelor n biomasa de Nostoc linckia pe durata ciclului vital n
condiii de laborator i de producere
Din figur se vede, c pe durata ciclului vital n condiii de laborator se nregistreaz
fluctuaii nensemnate n cantitatea de glucide din biomasa de nostoc. n cazul condiiilor de
producere n primele zile se nregistreaz o scdere esenial a acestui indiciu, cu pn la 34%
fa de condiiile de laborator. Pe durata fazei creterii exponeniale se pstreaz de asemenea un
nivel mai jos cu peste 30 % a glucidelor. Explicaia este n condiiile industriale de cretere, care
includ sisteme cu malaxoare care n permanen mic fluxurile de mediu cu celule de nostoc, iar
n acest proces are loc dispersarea treptat a straturilor exterioare n mediul nutritiv. n condiii
de laborator acest fenomen de asemenea are loc, dar la cote incomparabil mai mici fa de
condiiile de producere.
Ultimul component al biomasei monitorizat n acest compartiment al lucrrii sunt lipidele.
Cianobacteria Nostoc linckia face parte din speciile cu coninut redus de lipide, acestea alctuind
pn la 3 % din biomasa absolut uscat. n asemenea cantiti, lipidelor le revine n special
funcia de parte component a membranelor celulare i a celor funcionale, n deosebi, pe care
sunt localizai ficobilisomii. Rezultatele obinute sunt prezentate n figura 2.6. Se observ
meninerea unui nivel stabil al lipidelor n biomasa de nostoc pe ntreaga durata a ciclului vital.
n condiii de laborator se observ o uoar cretere a cantitii de lipide, ceea ce este tipic pentru
culturile n faz de declin i n proces de degradare.
Astfel, putem concluziona, c att n condiii de laborator, ct i n condiii de producere
cultura static de Nostoc linckia prezint fazele tipice culturilor microbiologice. n condiii de
producere are loc lungirea fazei staionare, fr elemente specifice declinului culturii. n condiii
de laborator, datorit transferului de cultur n condiii similare cu cele pentru obinerea
59

inoculului, faza de laten este practic imperceptibil, iar n condiii de producere are aspect
clasic cu lipsa complet a creterii culturii.
Lipide, laborator

Lipide, producere

Lipide, % biomas

3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
1

6
7
8
durata cultivrii, zile

10

11

12

Fig. 2.6. Cantitatea lipidelor n biomasa de Nostoc linckia pe durata ciclului vital n
condiii de laborator i de producere
Cele mai inerte componente ale biomasei de nostoc pe durata ciclului vital sunt glucidele i
lipidele. Cantitatea acestora, n special pe durata fazei de cretere exponenial i staionar
rmne constant. Cantitatea proteinelor totale i a ficobiliproteinelor descrete n a doua
jumtate a fazei exponeniale de cretere. Astfel, pe durata ciclului vital modificrile cantitative
ale principalelor componente ale biomasei de nostoc au limite destul de restrnse, ceea ce
caracterizeaz cultura de Nostoc linckia ca una cu grad ridicat al homeostaziei. Acest lucru
uureaz semnificativ manipularea culturii n condiii industriale i simplific procedurile din
cadrul tehnologiilor aplicate.
2.3. Modificarea activitii antioxidante a extractelor din biomasa de Nostoc linckia pe
durata ciclului vital
Anterior a fost demonstrat, c valorile testelor antioxidante coreleaz cu componena
biochimic a extractelor care se supun testrii [10, 11, 15]. Cel mai semnificativ dintre studiile
efectuate n laboratorul Ficobiotehnologie este exemplul culturii de Haematococcus pluvialis. n
cazul acestei culturi extractele etanolice din biomas sunt practic monocomponente, deoarece n
cazul fazei de celule verzi acesta este prezentat prin -caroten, iar n cazul aplanosporilor prin
astaxantin. n asemenea condiii ntre valorile testului ABTS i coninutul de carotenoizi n
extracte este o corelare foarte strns, coeficientul de determinare fiind mai mare de 0,9. n
asemenea condiii este absolut suficient determinarea acestor doi carotenoizi la etapele
60

respective pentru a putea face o concluzie real despre starea culturii, fie n condiii normale, fie
n cele de stres oxidativ indus [10]. n cazul altor culturi, inclusiv de Nostoc linckia este necesar
de efectua testele antioxidante a extractelor, care se caracterizeaz prin componen variat, iar
nici unul din componentele lor nu este determinat n formarea valorilor capacitii de inhibiie a
radicalilor.
Pornind de la scopul care st n faa procesului tehnologic de producere a biomasei de
cianobacterii i microalge, este foarte important s cunoatem situaia la moment pentru toi
parametrii care au tangen la acest scop. n cazul nostru, este necesar de a obine un echilibru
ntre cantitatea de biomas obinut i activitatea antioxidant n ea. n aceast parte a lucrrii
sunt reflectate rezultatele cercetrilor orientate spre stabilirea activitii antioxidante a extractelor
din biomasa de nostoc pe durata ciclului de dezvoltare. Au fost aplicate mai multe metode de
determinare a activitii antioxidante, care n prezent sunt aplicate pentru diferite tipuri de
extracte vegetale i care scot n eviden diferite mecanisme de aciune a antioxidanilor din
componena biomasei. Iniial potenialul antioxidant al extractelor din biomasa de nostoc a fost
evaluat cu aplicarea a doi radicali nonbiologici DPPH i ABTS+. Reducerea radicalilor DPPH i
ABTS+, care indic acumularea substanelor cu efect antioxidant, se face n baza mecanismului
transferului de hidrogen (H.) i electroni (e-). Rezultatele obinute pentru cultura crescut n
condiii de laborator sunt prezentate n Figura 2.7.
DPPH

ABTS+
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

Biomasa, g/l

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0

6
zile

10

11

AA, % inhibiie

Biomasa
0.6

12

Fig. 2.7. Activitatea antiradicalic a extractelor hidrice din biomasa de Nostoc linckia
(condiii de laborator) pe parcursul ciclului vital
Testul DPPH este util pentru a compara sau pentru a monitoriza evoluia activitii
antioxidante n obiectele biologice ori pentru a determina eficiena tipului de solvent utilizat
pentru a extrage componentele antioxidante. A fost stabilit, c pe durata ciclului vital, valoarea
61

activitii antioxidante a fraciilor hidrosolubile din biomasa de nostoc obinut n condiii de


laborator oscileaz n limitele a 24,6-35,1 % inhibiie radical DPPH. Fluctuaiile ce se produc pe
parcursul perioadei de cultivare, determinate de o majorare sau o scdere a procentului de
inhibiie de la aceste valori, evideniaz necesitatea adaptrii culturii de nostoc n fazele de
cretere i, respectiv, rspunsul antioxidant al culturii la modificrile metabolice cauzate de
procesele de cretere i dezvoltare.
Cele mai mari valori se nregistreaz dup 24 ore de la inoculare 34,1% inhibiie, i pe
durata zilelor 4-7 ale ciclului de cultivare (30,5-35,1% inhibiie), ce caracterizeaz faza
exponenial de cretere a nostocului considerat una cu activitate biosintetic sporit. O
inhibiie pronunat a radicalului DPPH n prima zi dup inocularea culturii (de la 24,6 %
inhibiie pn la 34,1 % inhibiie), se explic prin activarea mecanismelor de adaptare metabolic
la noile condiii ale mediului. Faza de accelerare a ritmului de cretere (ziua a 3-a) este marcat
de o cretere a inhibiiei radicalului DPPH de la 28,7 la 33,2 %, iar faza de ncetinire a ritmului
de cretere care precede faza staionar (ziua a 8-a) se caracterizeaz prin scderea nivelului de
reducere a radicalului DPPH de la 35,1 % la 28,2 %. Totodat, la ziua a 10-a de cultivare, cnd
cultura este pe platou, fraciile hidrosolubile au manifestat o inhibiie de 32,8 % a radicalului
DPPH. Modificrile produse n etapa de declin au influenat potenialul antioxidant al biomasei
i, ca rezultat, extractele hidrice obinute la ziua a 12-a de cultivare au prezentat cele mai mici
valori de 24 % inhibiie radical DPPH.
A fost stabilit c rezultatele testului DPPH aplicat n studiul extractelor hidrice din biomasa
de Nostoc linckia coreleaz cu fazele de cretere. Valorile maxime ale testului DPPH au fost
nregistrate n prima zi (faza lag), ziua a 4-a (nceputul fazei de cretere exponenial), ziua a 7-a
(mijlocul fazei exponeniale) i ziua a 10-a (faza staionar).
Astfel, prin salturi ale inhibiiei radicalului DPPH sunt marcate momentele cruciale n
dezvoltarea culturii de nostoc trecerea de la o condiie fiziologic la alta. Rezultatele obinute
confirm faptul c testul DPPH reflect obiectiv modificrile statutului antioxidant ale fraciilor
hidrosolubile din biomasa nostocului.
Extractele hidrice obinute n baza biomasei de nostoc au manifestat, de asemenea, o
capacitate nalt de reducere a radicalului cation ABTS+ pe durata ntregului ciclu vital. Ca i n
cazul testului DPPH, testul ABTS permite sesizarea fazei de laten la nceputul ciclului vital.
Astfel, extractele hidrice obinute din biomasa de nostoc, colectat n prima i a doua zi de
cultivare, au manifestat un nivel comparativ redus de inhibiie a radicalului ABTS+ (65,5 i 66,5
% inhibiie, respectiv). La ziua a 3-a de cultivare faza accelerrii creterii se observ un salt
62

negativ al puterii de inhibiie a radicalului pn la valoarea iniial din momentul inoculrii


59,1%. n faza de cretere exponenial dup perioada de adaptare a culturii la condiiile noi de
mediu se observ tendina de sporire a activitii antioxidante a extractelor hidrice din biomasa
de nostoc, care atinge maximul n ziua 7 cu o valoare de 73,9 % inhibiie radical ABTS+. De
remarcat c valorile nregistrate n faza exponenial de cretere a cianobacteriei Nostoc linckia
corespund cu rezultatele altor cercettori, care au fost obinute n screening-ul activitii
antioxidante a unor tulpini de cianobacterii i microalge. Astfel, a fost stabilit c extractele din
Nostoc muscorum asigur un nivel de aproximativ 70 % inhibiie radical ABTS+ [218].
Creterea activitii antioxidante determinat prin testul ABTS, ncepnd cu ziua a 4-a de
cultivare, este specific fazei de cretere exponenial, caracterizat prin intensificarea activitii
biosintetice i, respectiv, prin formarea de SRO, ceea ce intensific sinteza componentelor
antioxidante. n faza staionar, extractele hidrice manifest o activitate antioxidant de 66-69 %
inhibiie radical ABTS+.
Acelai tip de analiz a fost realizat i pentru cultura de nostoc crescut n condiii
industriale. Rezultatele pentru testele DPPH i ABTS sunt prezentate n Figura 2.8.
DPPH

ABTS
80
70
60
50
40

AA, % inhibiie

Biomasa, g/l

Biomasa
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

30
20
0

6
zile

10

11

12

Fig. 2.8. Activitatea antiradicalic a extractelor hidrice din biomasa de Nostoc linckia
(condiii de producere) pe parcursul ciclului vital
Similar biomasei obinute n condiii de laborator, fluctuaii evidente ale activitii
antioxidante sunt caracteristice fazei de laten (cu creterea activitii antiradicalice fa de
ambii radicali testai). n cazul testului DPPH avem o activitate antiradicalic practic pe ntreaga
durat a fazei de cretere exponenial i a perioadei staionare. n cazul testului ABTS se atest
aceiai situaie, cu excepia c mijlocul fazei de cretere exponeniale este marcat printr-o
cretere de scurt durat a activitii antiradicalice fa de radicalul cation. Putem spune c n
63

condiii de producere, odat stabilizat, cultura de Nostoc linckia se caracterizeaz prin indici de
activitate stabili, ceea ce este foarte convenabil n cazul transferului tehnologic.
n continuare, a fost studiat activitatea antioxidant a extractelor etanolice obinute din
aceeai biomas de nostoc pe durata ciclului vital. Testele DPPH i ABTS relev un nivel mai
mic de inhibiie a radicalilor nonbiologici comparativ cu cel nregistrat de extractele hidrice, iar
activitatea antioxidant nu este marcat de fluctuaii valorice importante pe parcursul fazelor de
cretere, cu excepia creterii activitii n primele 24 ore ce caracterizeaz momentul inoculrii
culturii (Figura 2.9).

DPPH

ABTS

Biomasa, g/l

0.6

45
40
35
30
25
20
15
10

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0

6
zile

10

11

AA, % inhibiie

Biomasa

12

Fig. 2.9. Activitatea antiradicalic a extractelor etanolice din biomasa de Nostoc linckia
(condiii de laborator) pe parcursul ciclului vital
n cazul testului DPPH, activitatea antioxidant a extractelor etanolice din biomasa de
nostoc a nregistrat un procent mediu de inhibiie de aproximativ 14-17 % pe durata ciclului
vital. Valorile testului ABTS sunt cuprinse n limitele 33-37 % inhibiie n faza exponenial de
cretere. Se observ o stabilitate a activitii antioxidante prezentat de extractele etanolice din
biomasa de nostoc. Prin urmare, ponderea componentelor antioxidante solubile n alcool poart
un caracter stabil i constant care nu ar depinde de etapa de dezvoltare a culturii statice. La etapa
de iniiere a creterii culturii, testele DPPH i ABTS reflect o singur modificare evident pe
parcursul creia are loc o cretere spectaculoas n prima zi (cu 20 % n cazul testului ABTS), ce
se explic prin aceleai mecanisme de adaptare metabolic ca urmare a inoculrii culturii.
Decalajul nregistrat n etapa de declin a culturii (26 % inhibiie radical ABTS+) se explic prin
activarea proceselor de deteriorare a componentelor celulare ca rezultat al mbtrnirii culturii

64

Din biomasa obinut n condiii de producere de asemenea au fost obinute extractele


etanolice i au fost efectuate testele DPPH i ABTS. Rezultatele obinute sunt prezentate n
Figura 2.10.
DPPH

ABTS
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0

6
zile

10

11

AA, % inhibiie

Biomasa, g/l

Biomasa
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

12

Fig. 2.10. Activitatea antiradicalic a extractelor etanolice din biomasa de Nostoc linckia
(condiii de producere) pe parcursul ciclului vital.
Cn condiii de producere, ca i n cele de laborator, se nregistreaz un salt specific al
activitii antiradicalice pe durata perioadei de laten, atta timp ct are loc adaptarea culturii la
noile condiii, dup care ambele teste nregistreaz valori destul de stabile.
Rezultatele acestor dou teste (DPPH i ABTS) demonstreaz, c cultura de nostoc n
condiii de laborator manifest un comportament mai variat n ceea ce ine de acumularea
componentelor antioxidante hidro- i etanolsolubile. Astfel, prin fluctuaii valorice se manifest
perioada de laten, nceputul i mijlocul fazei de cretere exponenial, perioada de declin. n
condiii de producere este evident o singur variaie a capacitii de reducere a radicalilor liberi
la nceputul ciclului vital. Dup ce cultura s-a adaptat la noile condiii de mediu, activitatea
antiradicalic a extractelor hidrice i etanolice din biomasa de nostoc rmn stabile pn la finele
experienei. Astfel, n zilele a 10-12-a de cultivare a cianobacteriei Nostoc linckia n condiii de
producere se menine practic acelai nivel al biomasei i a activitii antioxidante a acestei
biomase, ceea ce este util n producere.
Pentru a verifica cele constatate cu aplicarea testelor ABTS i DPPH n extractele etanolice
a fost determinat capacitatea de reducere a reagentului fosfo-molobdenic, care permite
evidenierea activitii antioxidante a componentelor lipofile ale extractelor. Rezultatele pentru
extractul din biomasa de nostoc obinut n condiii de laborator sunt prezentate n Figura 2.11.
Testul CRFM de asemenea evideniaz perioadele sensibile pe durata ciclului vital al
nostocului. Astfel, n faza de laten capacitatea de reducere scade de 2,0-3,7 ori, dup care
65

urmeaz o cretere foarte semnificativ de 2,9 ori fa de nivelul iniial care se atest la ziua a
4-a care corespunde nceputului fazei creterii exponeniale. Dup aceasta nivelul de reducere
a reagentului fosfo-molibdenic se menine stabil la valori ntre 52 i 72 mg echivalent acid
ascorbic la gram de biomas. nceputul perioadei de declin este asociat cu scderea radical a

Biomasa

0.6

CRFM

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

Biomasa, g/l

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0

5
6
7
durata cultivrii, zile

10

11

eq acid ascorbic mg/g


biomasa

activitii antioxidante a extractului etanolic de 2,7 ori fa de ziua precedent (a 11-a).

12

Fig. 2.11. Capacitatea de reducere a reagentului fosfo-molibdenic - CRFM (eq acid


ascorbic, mg/g BAU) a extractelor etanolice din biomasa de Nostoc linckia (condiii de
laborator) pe parcursul ciclului de cultivare.
Rezultatele obinute pentru extractul etanolic din biomasa de nostoc obinut n condiii de

Biomasa

0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0

CRFM

5
6
7
8
durata cultivrii, zile

80
70
60
50
40
30
20
10
0
10

11

eq acid ascorbic mg/g


biomasa

Biomasa, g/l

producere sunt prezentate n Figura 2.12.

12

Fig. 2.12. Capacitatea de reducere a reagentului fosfo-molibdenic - CRFM (eq acid


ascorbic, mg/g bm) a extractelor etanolice din biomasa de Nostoc linckia (condiii de producere)
pe parcursul ciclului de cultivare.

66

n condiii de producere are loc aceeai scdere esenial a capacitii antioxidante a


extractului din biomasa aflat n faza de laten i o cretere foarte semnificativ la nceputul
fazei creterii exponeniale. Dup ziua a patra de cultivare activitatea antioxidant a extractelor
etanolice din biomasa de Nostoc linckia rmne la acelai nivel pn la sfritul experienei.
Experienele descrise mai sus au demonstrat, c cei mai stabili parametri pentru cultura de
nostoc n condiii de laborator se obin la ziua a 10-11-a de cultivare, ce corespunde fazei
staionare. Aceast perioad se caracterizeaz prin cel mai nalt nivel al biomasei i cea mai
stabil activitate antiradicalic i antioxidant. n condiii de producere, perioada de recoltare a
biomasei n aceleai scopuri poate fi extins cu mai multe zile, demonstrat n lucrare pn la
ziua a 12-a. Deci, din punct de vedere economic, termenii indicai sunt cei mai avantajoi,
rmne ns de stabilit dac biomasa obinut este sigur pentru utilizarea ulterioar. Anterior a
fost demonstrat, c calitatea biomasei poate fi apreciat n baza testului de determinare a
produselor peroxidrii lipidelor testul DMA [15]. Din aceste considerente pe durata ciclului

DAM, % Lipide

DAM, %Lipide

vital a fost monitorizat nivelul DAM n biomas (Figura 2.13)

20
15
10
5
0

20
15
10
5
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Durata cultivrii, zile

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Durata cultivrii, zile

B
Fig. 2.13. Nivelul DAM n biomasa de Nostoc linckia (condiii de laborator- A; condiii de
producere -B) pe durata ciclului vital.

Conform rezultatelor obinute cel mai nalt nivel de peroxidare al lipidelor are loc la
inoculare i n mijlocul fazei de cretere exponenial. Pe durata fazei staionare (ziua a 10-a i a
11-a) cnd se presupune recoltarea de biomas, nivelul DAM este cel mai jos i nu depete
10,4% din coninutul de lipide totale. n condiii de producere cel mai nalt grad de peroxidare al
lipidelor se atest de la inoculare i pn la intrarea culturii n faza exponenial de cretere.
Dup aceasta pe toat durata ciclului se menine un nivel stabil jos al DAM, ceea ce este dovad
a siguranei biomasei i produselor obinute n baza acesteia.
67

2.4. Concluzii la capitolul 2


1. Att n condiii de laborator, ct i n condiii de producere ciclul vital al culturii statice
de Nostoc linckia relev un model de cretere caracteristic, iar durata optim din punct de
vedere biotehnologi este de 12 zile n condiii de producere, i 10 zile n condiii de laborator.
2. n condiii de laborator, datorit transferului de cultur n condiii similare cu cele pentru
obinerea inocului, faza de laten este practic imperceptibil, iar n condiii de producere are
aspect clasic cu lipsa complet a creterii culturii.
3. Pe durata ciclului vital modificrile cantitative ale principalelor componente ale
biomasei de nostoc au limite destul de restrnse, ceea ce caracterizeaz cultura de Nostoc linckia
ca una cu grad ridicat al homeostaziei. Acest lucru uureaz semnificativ manipularea culturii n
condiii industriale i simplific procedurile din cadrul tehnologiilor aplicate.
4. Rezultatele testelor DPPH, ABTS i CRFM demonstreaz, c cultura de nostoc n
condiii de laborator manifest un comportament mai variat n ceea ce ine de acumularea
componentelor antioxidante hidro-a i etanolsolubile. Astfel, prin fluctuaii valorice se manifest
perioada de laten, nceputul i mijlocul fazei de cretere exponenial, perioada de declin. n
condiii de producere este evident o singur variaie a capacitii de reducere a radicalilor liberi
la nceputul ciclului vital.
5. Cei mai stabili parametri pentru cultura de nostoc n condiii de laborator se obin la ziua
a 10-11-a de cultivare, ce corespunde fazei staionare. Aceast perioad se caracterizeaz prin cel
mai nalt nivel al biomasei i cea mai stabil activitate antiradicalic i antioxidant. n condiii
de producere, perioada de recoltare a biomasei n aceleai scopuri poate fi extins.
6. Nivelul sczut al DAM n biomasa de Nostoc linckia la etapele recomandate pentru
cultivarea biomasei confirm sigurana acestei biomase, precum i a produselor, care ulterior pot
fi obinute din ea.

68

3. EXTRAGEREA I PSTRAREA COMPONENTELOR CU EFECT ANTIOXIDANT


DIN BIOMASA DE NOSTOC LINCKIA
Tehnologiile de obinere a preparatelor antioxidante policomponente din biomasa algelor i
cianobacteriilor, inclusiv Nostoc linckia, sunt de perspectiv datorit variabilitii componentelor
care faciliteaz modelarea rezultatului final. Factorii determinani ai succesului tehnologiilor
ficologice sunt: procesul de cultivare n scopul obinerii biomasei de calitate; procesul de
extragere care asigur obinerea produselor cu proprieti prestabilite; determinarea condiiilor de
pstrare a produselor cu efect antioxidant. Extragerea principiilor bioactive ntotdeauna a fost i
rmne n vizorul cercettorilor, deoarece este un element cheie de care depinde cantitatea i
calitatea produselor ficologice obinute.
Biomasa de nostoc, datorit componenei sale biochimice, este o materie prim conform
scopului de a obine preparate cu efecte antioxidante. n capitolul precedent a fost demonstrat,
c pe durata ciclului vital att tempoul de cretere a cantitii de biomas, ct i activitatea
antioxidant a acesteia, depinde de faza n care este colectat biomasa. Perioadele vulnerabile
sunt, de regul, fazele primare i trecerile de la o stare fiziologic la alta. Cea mai stabil
perioad pe parcursul ciclului vital al nostocului, att n condiii de laborator, ct i n condiii de
producere, este a doua jumtate a fazei de cretere exponenial i nceputul fazei staionare, de
aceea colectarea biomasei n scopul de o utiliza pentru obinerea produselor antioxidante este
anume nceputul fazei staionare. n capitolul precedent testele antioxidante au fost efectuate n
extractele hidric i etanolic. Este cunoscut faptul, c n laboratoare, n scop de cercetare a
componentelor cu diferite efecte biologice din biomasa vegetal, sunt utilizai solvenii organici
polari: acetona, metanolul, etanolul, dimetilsulfoxidul, diclormetanul, precum i amestecuri de
solveni (etanol/eter dietilic, hexan/aceton/etanol; aceton/metanol; diclormetan/metanol) i
solveni nepolari aa ca cloroformul, hexanul, eterul dietilic. Acetona i dimetilsulfoxidul sunt
utilizai nu numai pentru cercetare, ci i n scopul procesrii ulterioare a componentelor extrase.
n acelai timp n mai multe lucrri se indic eficiena n special a extractelor hidro-etanolice [4,
15, 35]. Acest lucru se explic prin componena mult mai variat a acestui tip de extracte, care
conine compui cu proprieti hidrofile i compui cu proprieti lipofile. Astfel, asemenea
extracte pot aciona n diferite medii in vitro i n diferite compartimente celulare in vivo. De
aceea studiul posibilitii utilizrii extragerii hidro-etanolice din biomasa de nostoc pentru
obinerea unei materii prime de calitate pentru producerea antioxidanilor este important att din
punct de vedere fundamental, ct i din punct de vedere pur practic. Aceast abordare mai are i
avantajul oferirii unei soluii suplimentare n ceea ce ine de sigurana produselor obinute.

69

Alcoolul etilic se nltur cu uurin prin evaporare, iar reziduurile lui nu sunt caracterizate prin
toxicitate pentru celulele vii.
Asigurarea pstrrii eficiente a produselor de extracie prezint un alt aspect important al
ficobiotehnologiilor. Acest lucru este n deosebi important atunci, cnd elementele tehnologiilor
date sunt separate spaial, dar mai ales, temporal. n astfel de condiii este necesar de a elabora
procedee eficiente, care asigura conservarea proprietilor biologice ale componentelor extrase.
n cadrul acestui capitol sunt prezentate rezultatele cercetrilor orientate spre clarificarea
acestor dou aspecte importante (extragerea i pstrarea de durat) ale tehnologiei de obinere a
preparatelor antioxidante din biomasa de Nostoc linckia.
3.1. Materiale i metode de studiu
Suplimentar la metodele descrise n capitolul 2 a fost utilizat metoda de stabilire a
activitii antioxidante in vitro a extractelor prin oxidarea lipoproteinelor cu densitate joas.
Acest test specific rspunde la ntrebarea despre posibilitatea utilizrii produsului testat n
calitate de protector al lipoproteinelor de densitate joas (LDL). Lipoproteinele de densitate joas
sub forma oxidat au un rol important n iniierea i progresarea proceselor aterosclerotice.
Antioxidanii cu capacitatea de a reduce radicalii liberi i de a frna evoluia reaciilor oxidative
n mod normal, pot preveni oxidarea LDL, ceea ce indic asupra posibilitii utilizrii
preparatelor n baza lor n acest scop [13].
Oxidarea lipoproteinelor cu densitate joas ex vivo a fost propus iniial pentru stabilirea
statutului antioxidant al organismului. Mai trziu metoda a nceput a fi utilizat n testarea
capacitii antioxidante a diferitor substane i complexe. Capacitatea de inhibiie a oxidrii LDL,
poate fi calificat ca o abilitate a antioxidantului testat de a aciona n mod principial i n
condiii in vivo. Metoda propus include obinerea lipoproteinelor de densitate joas, inducerea
proceselor oxidative i determinarea produselor oxidrii.
Izolarea lipoproteinelor cu densitate joas. Lipoproteinele de densitate joas au fost
obinute din serul sangvin prin metoda sedimentrii cu heparin [290]. La 2 ml ser s-a adugat
400UE heparin (soluie farmacopeic 5000UE/ml) i 150 l clorur de mangan 1M. Proba este
incubat pentru 30 min la 0oC, dup care se centrifugheaz 30 min la 0oC i 12000g (Hettich
22R, micro). Sedimentul este splat cu soluie de clorur de sodiu 0,9% i centrifugat repetat.
Lipoproteinele sedimentate sunt trecute n clorur de sodiu de 1M, astfel ca coninutul de
proteine s fie de 2 g/l.
Oxidarea lipoproteinelor cu densitate joas [22]. La 0,1 ml LDL se adug 10 l soluie
de antioxidant. Dup 5 min de incubare este indus oxidarea LDL prin adiionarea a 33,3 l
70

sulfat de cupru 50 M. Probele sunt incubate pentru 24 ore la 37 oC. Dup incubare, procesul
oxidativ este ntrerupt cu soluie EDTA (concentraia final de 27 mM).
Determinarea substanelor reactive ale acidului tiobarbituric [125]. Valoarea gradului de
oxidare al LDL este determinat prin aprecierea concentraiei produselor de reacie ale acidului
tiobarbituric (dialgehida malonic). La probele cu LDL oxidat se adug 1 ml acid tiobarbituric
0,67% i 1 ml acid tricloracetic de 15%, dup care probele sunt supuse incubrii pentru o or la
95oC. n continuare, probele sunt rcite pe ghea 5 min i centrifugate 15 min la 3000g.
Concentraia complexului dialdehidei malonice cu acidul tiobarbituric este msurat la 535 nm,
iar cantitatea ei este raportat la proteina LDL cu utilizarea coeficientului extinciei molare a
complexului dialdehidei malonice sau n % inhibiie fa de proba martorului negativ. Proba
martor pozitiv conine soluia de LDL n care se induce oxidarea lipidelor cu sulfat de cupru n
lipsa antioxidantului. Pentru excluderea autooxidrii lipidelor se introduce proba control negativ
n care oxidarea lipidelor decurge n lipsa sulfatului de cupru.
3.2. Selectarea solventului optimal pentru obinerea complexelor antioxidante din biomasa
de Nostoc linckia
Elaborarea tehnicilor eficiente de extragere a componentelor antioxidante din biomasa
microalgal prezint un domeniu de interes teoretic i practic. Extragerea componentelor
antioxidante din biomasa nativ este cea mai bun soluie pentru tulpina de Nostoc linckia,
deoarece asigur valorificarea maximal a potenialului acesteia i nu impune cheltuieli
suplimentare pentru prelucrarea i pstrarea ei. Aa cum tehnologiile contemporane tind spre
reducerea costului produsului final, se pune accent pe utilizarea reziduului obinut n alte
tehnologii valoroase. Astfel, biomasa nativ prelucrat va deveni un nou produs tehnologic.
n ultimul timp, tehnicile de extragere a produselor biologic active din biomasa vegetal
pun accent pe produsul final obinut n condiii ecologice cu aplicarea solvenilor nontoxici [153,
233]. Alcoolul etilic rmne a fi cel mai convenabil solvent: este ieftin, reutilizabil, netoxic i
considerat favorabil uzului uman i prietenos mediului. Extractele obinute pot fi utilizate n mod
direct sau n calitate de materie prim pentru tehnologiile de obinere a preparatelor. Fiind un
solvent polar, etanolul este capabil s extrag mai eficient componentele celulare. Polaritatea
etanolului poate fi sporit prin modificarea concentraiei lui. Nu n ultimul rnd, alcoolul este un
conservant bun, astfel evitndu-se reaciile Mayard (browning reactions) pe parcursul pstrrii
produselor obinute.
Majoritatea solvenilor organici ca cloroformul, acetona, hexanul sunt utilizai frecvent n
cercetare i mai puin n producere. De exemplu pentru obinerea fenolilor din biomasa de
71

legume se utilizeaz acetona i metanolul de 50 i 70%, dar a fost demonstrat oportunitatea


nlocuirii lor cu etanolul sau amestecurile hidro-etanolice [134, 232, 263]. Pentru extragerea
carotenului, care din punct de vedere al structurii este un compus nepolar, solventul optimal este
considerat a fi etanolul, randamentul tehnologic fiind unul acceptabil pentru obinerea de
pigment natural, iar tehnologia aplicat este considerat verde sau ecologic pur [254]. Pentru
extragerea astaxantinei din biomasa algei Haematococcus pluvialis se utilizeaz acetona, dar a
fost demonstrat eficiena tehnicii de extragere a pigmentului n etanol [9]. Din biomasa de
Spirulina platensis, cantitatea maximal de antioxidani se obine prin extragerea n etanol [34,
103]. Fenolii din biomasa de Nostoc ellipsosporum sunt extrai cu aplicarea acetonei i etil
acetatului, dar randamentul tehnicii propuse este unul foarte mic. Componenta antioxidant
variat a biomasei de Nostoc linckia a determinat rentabilitatea aplicrii extragerii hidro
alcoolice cu coninut variat al alcoolului n amestecul extractant, care ofer posibilitatea obinerii
unor produse policomponente active [34].
n cercetrile noastre anterioare a fost demonstrat eficiena aplicrii extraciei hidroetanolice pentru obinerea substanelor cu efect antioxidant din biomasa de Porphyridium
cruentum. Activitatea extractelor este dependent de concentraia etanolului n soluie.
Activitatea maxim a fost stabilit pentru extractele hidroetanolice n domeniul de concentraii
55-75%, acestea fiind prezentate prin componente hidro- i etanol solubile [14].
Scopul prezentului studiu a constat n selectarea variantelor optimale de obinere a
preparatelor policomponente cu activitate antioxidant din biomasa cianobacteriei Nostoc
linckia. n calitate de extractant au fost utilizai doi alcooli: metilic i etilic. Metanolul a fost
aplicat n calitate de control, fiind un solvent cu polaritate superioar i care este pe larg utilizat
n extragerea componentelor biologic active, solubile n solveni polari.
n cadrul experienelor au fost monitorizai doi parametri principali: concentraia soluiei
alcoolice, utilizate pentru extragere i durata procesului de extragere. Pentru obinerea extractelor
complexe din biomasa nativ de Nostoc linckia au fost folosite zece concentraii ale alcoolilor:
de 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80% i 96%. Anterior, a fost demonstrat
influena concentraiei solventului asupra procesului de extracie i asupra componenei
produsului obinut [16, 34]. n scopul eficientizrii procesului de extracie durata acestuia a fost
de 6 ore, 12 ore i 24 ore. Raportul dintre biomas i solvent aplicat n ntreaga serie de
experiene a fost de 10 mg biomas la 2 ml solvent. Procesul de extragere a fost realizat n
condiii de temperatur constant (18-200C) i la agitaie permanent. Extractele au fost separate
de biomas prin centrifugare la 3000g timp de 8 min. n extractele obinute a fost determinat
activitatea antioxidant cu aplicarea testului de inhibiie a radicalului ABTS+. Reducerea
72

radicalului cation ABTS+ are la baz mecanismul transferului de hidrogen (H.) i electroni (e-),
iar testul este specific att pentru componentele hidrosolubile, ct i pentru cele liposolubile.
Rezultatele obinute sunt prezentate n Figura 3.1, A-C.
etanol

metanol

40
35
30
25
20
15
10
5
0
10%

20%

30%

40%

50%

55%

etanol

60%

65%

70%

80%

96
(100)%

65%

70%

80%

96%

metanol

40
35
30
25
20
15
10
5
0
10%

20%

30%

40%

50%

55%

etanol

60%

metanol

40
35
30
25
20
15
10
5
0
10%

20%

30%

40%

50%

55%

60%

65%

70%

80%

96%

Fig. 3.1. Activitatea antioxidant (% inhibiie ABTS+) a extractelor etanolice din biomasa
de Nostoc linckia n dependen de concentraia alcoolului i timpul de extracie:
A-6 ore, B-12 ore i C- 24 ore.

73

Analiza rezultatelor testului ABTS, aplicat extractelor obinute n 6 ore a determinat


tendina de cretere a activitii antioxidante a extractelor etanolice n dou serii (Figura 3.1,A).
Prima serie corespunde extractelor cu concentraia etanolului de la 20% la 55%, iar a doua serie
corespunde extractelor cu concentraia etanolului de la 60% la 96%. n primul caz, creterea
activitii antioxidante pornete de la 15% inhibiie ABTS+, determinat pentru extractul
alcoolic de 20%. Extractul din nostoc de 55% etanol reduce 27% din radicalul cation ABTS. n
al doilea caz, activitatea antioxidant a extractului de 60% este de 21% inhibiie ABTS+ i crete
pn la 35% inhibiie ABTS+, activitate caracteristic extractului etanolic de 96%. Alcoolul
metilic a demonstrat o activitate mai joas a extractelor obinute cu aplicarea solventului n
concentraiile de la 20% la 65%, comparativ cu cea a extractelor etanolice. Aceast reducere este
una nesemnificativ, dar trebuie menionat deoarece este un argument n plus n selectarea
solventului optimal. Pentru extractele, obinute cu concentraiile metanolului, de 70-100%, testul
ABTS indic un spor al activitii antioxidante. Acest spor este de asemenea nensemnat. Prin
urmare, etanolul poate substitui metanolul, n calitate de extractant pentru obinerea produselor
antioxidante din biomasa de Nostoc linckia.
Extractele obinute la extragerea timp de 12 ore au nregistrat o activitate antioxidant mai
mare comparativ cu primul lot (Figura 3.1,B). Astfel, activitatea antioxidant a extractelor
etanolice de 20%, 30%, este de 22-24% inhibiie ABTS+, comparativ cu activitatea antioxidant
de 15% inhibiie ABTS+ a variantelor obinute prin extragere timp de 6 ore. Un rezultat identic
a valorilor testului ABTS au fost obinute i n cazul extragerii cu metanol. n cazul duratei de 6
ore a procesului de extragere, creterea concentraiei alcoolului aplicat n extragere de la 10% la
30% duce la reducerea capacitii antioxidante a extractului obinut cu 7-8 uniti % inhibiie. Pe
durata de 12 ore, extractele, obinute cu alcool metilic de 20% i 30% am manifestat o activitate
antioxidant identic, valoarea testului ABTS fiind de 19-29% inhibiie. Activitatea antioxidant
a extractelor de 20-30% etanol crete cu 4-7 uniti, valorile testului antioxidant fiind de 24-27%.
Crete activitatea antioxidant a extractului obinut cu aplicarea etanolului de 60%, valoarea
testului ABTS fiind de 30% inhibiie comparativ cu 21% inhibiie, valoarea determinat pentru
extractul etanolic obinut prin extragere timp de 6 ore. Valoarea testului ABTS, determinat
pentru extractele metanolice de 60% nu s-a modificat. Mrirea duratei de extragere de la 6 ore la
12 ore nu este un factor determinant pentru valorile testului antioxidant a extractului metanolic
de 60%.
Durata de 12 ore a procesului de extragere a sporit activitatea antioxidant a extractului
etanolic de 65%, valorile testului antioxidant fiind de 34% inhibiie. Valorile testului ABTS,
74

determinat pentru extractele alcoolice, obinute prin extragere cu etanol i metanol timp de 12
ore oscileaz ntre 31% i 36% inhibiie. Valorile date sunt comparabile cu cele stabilite pentru
lotul experimental cu durata extragerii de 6 ore. Extractele de 40% , 50% i 55% alcool nu i-au
modificat capacitatea de a reduce radicalul ABTS+ n dependen de durata procesului de
extracie.
Pentru lotul de extracte, obinute n 24 ore, creterea activitii antioxidante a extractelor
din biomasa de nostoc a fost determinat pentru cele de 50% i 70% concentraie etanol (Figura
3.1,C). Activitatea antioxidant a extractelor etanolice de 50% i 70% alcool a crescut cu 3940%. Sunt unicele creteri semnificative ale activitii antioxidante care au depins de durata
contactului dintre biomasa de nostoc i alcoolul etilic. Este evident efectul neutru a alcoolului
metilic, care indiferent de durata procesului de extracie nu modific activitatea antioxidant a
extractului etanolic de 50%. Pentru celelalte tipuri de extracte, durata de extracie peste 12 ore
reduce din activitatea antioxidant a lor. Extractele etanolice de 70%, 80% i 96%, obinute n
mod identic (24 ore de extracie) au determinat valori identice ale activitii antioxidante, egale
32% inhibiie ABTS+. Se evideniaz valorile antioxidante similare determinate pentru
extractele de 80% i 96% (sau 100% pentru metanol), care nu depind de tipul alcoolului. Dac
concentraiile alcoolilor de pn la 70% variaz n dependen de tipul alcoolului, concentraiile
apropiate valorilor absolute nu sunt determinate pentru activitatea antioxidant a extractelor.
Valorile superioare ale activitii antioxidante ale unor extracte, obinute prin extragere cu alcool
metilic nu pot fi un calificativ important n favoarea metanolului. Iat de ce alcoolul etilic este
considerat un extractant eficient pentru obinerea extractelor policomponente antioxidante din
biomasa de Nostoc linckia.
Pentru extractele etanolice, obinute din biomasa de nostoc n 6 ore, extractele de 55% i
96% prezint cea mai mare activitate antioxidant de 27% i 35% inhibiie ABTS+.
Pentru extractele etanolice, obinute din biomasa de nostoc n 12 ore, extractele de 50%,
70%, 80% i 96% prezint cea mai mare activitate antioxidant de 28 - 35% inhibiie ABTS+,
iar n cazul celor obinute n 24 ore, extractul de 50% a redus 32% radical ABTS +. n scopul
obinerii extractelor cu activitate antioxidant sporit din biomasa de nostoc, cu utilizarea
etanolului n calitate de extractant, cele mai convenabile sunt concentraiile alcoolului de 50%,
70%, 80% i 96%. Cea mai mare activitate antioxidant, n majoritatea cazurilor, a fost
nregistrat pentru extractele obinute prin extracia de 12 ore.
Pentru a stabili rolul determinant al alcoolului a fost efectuat analiza corelaional dintre
activitatea antioxidant a extractelor i concentraia alcoolului etilic utilizat. n cazul duratei de
75

extragere de 6 ore, corelarea dintre concentraia etanolului i valorile testului ABTS este nalt,
coeficientul de determinare fiind R2 = 0,79 pentru alcoolul metilic i de R2 = 0,81 pentru alcoolul
etilic (Figura 3.2). Prin urmare, n condiiile de extragere cu durata procesului de 6 ore, este
evident legtura direct proporional ntre concentraia etanolului utilizat la extragere i

40
35
30
25
20
15
10
5
0

y = 0.2811x + 7.8247
R = 0.7971

ABTS, % inhibiie

ABTS, % Inhibiie

activitatea antioxidant a extractelor obinute.

40
35
30
25
20
15
10
5

y = 0,2512x + 9,0806
R = 0,8101

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Concentraie metanol, %

Concentraia etanol, %

Fig. 3.2. Activitatea antioxidant a extractelor metanolice i etanolice din biomasa de Nostoc
linckia CNM-CB-03 dup 6 ore de extragere n dependen de concentraia alcoolului.
Extractul etanolic de 96%(100%) prezint cea mai mare valoare a testului antioxidant
ABTS i este de 35-36% inhibiie. Valori ntre 20%-25% inhibiie ABTS+ au fost stabilite
pentru extractele din nostoc de 40%, 50% i 60%, 65%, 70% alcool. Valori de 15% inhibiie
ABTS+ sunt specifice extractelor de 20% i 30% alcool. Concentraia de 55% etanol i cele de
80-96(100)% etanol sunt cele mai indicate n obinerea de extracte antioxidante din biomasa de
nostoc n condiiile extraciei de 6 ore.
Extractele obinute n 12 ore au valori ale testului antioxidant mai mari de 20% inhibiie
ABTS+ (Figura 3.3). Extractele alcoolice de 96(100)% prezint, ca i n cazul extractelor de 6
ore, cea mai mare valoare a testului antioxidant ABTS i este de 32-34% inhibiie. Dependena
dintre concentraia alcoolului, utilizat la extragere i valorile testului ABTS este exprimat prin
coeficientul de determinare de R2 = 0,79 pentru metanol i R2 = 0,60 pentru etanol. Prin urmare
n 80% de cazuri de extragere cu metanol timp de 12 ore i 60% de cazuri, n condiiile de
extragere timp de 12 ore cu etanol, concentraia alcoolului determin activitatea antioxidant a

76

extractelor. Alcoolul metilic a stabilit o implicare mai mare n procesul de extragere a

40
35
30
25
20
15
10
5
0

ABTS, % inhibiie

ABTS, % inhibiie

componentelor antioxidante.

y = 0.1863x + 13.519
R = 0.6879

y = 0,1395x + 18,457
R = 0,6037

40
35
30
25
20
15
10
5

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0

50
100
150
Concentraia metanol, %

Concentraia etanol, %

Fig. 3.3. Corelarea dintre concentraia etanolului i activitatea antioxidant a extractelor hidroetanolice din biomasa de Nostoc linckia obinute prin extragere timp de 12 ore.
Dependena stabilit nu poate fi determinant n stabilirea tipului de alcool, deoarece
valorile testului ABTS sunt mai reduse, situndu-se n regiunea valorilor de 15% inhibiie
(Figura 3.3). Concentraiile de 50-55% etanol i cele de 70-96% etanol sunt cele mai indicate n
obinerea de extracte antioxidante din biomasa de nostoc n condiiile extraciei de 12 ore.
n cazul duratei de extragere de 24 ore, corelarea dintre concentraia alcoolului i valorile
testului ABTS este exprimat prin coeficientul de determinare de R2 = 0,79 pentru metanol i R2

40
35
30
25
20
15
10
5
0

ABTS, % inhibiie

ABTS, % inhibiie

= 0,58 pentru etanol (Figura 3.4).

y = 0.2433x + 8.8944
R = 0.79
0

40
35
30
25
20
15
10
5

y = 0.1976x + 14.127
R = 0.5813

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

50
100
150
Concentraia metanol, %

Concentraia etanol, %

Fig. 3.4. Corelarea dintre concentraia etanolului i activitatea antioxidant a extractelor hidroetanolice din biomasa de Nostoc linckia obinute prin extragere timp de 24 ore.
77

Activitatea antioxidant a extractelor nu depete 34% inhibiie radical, dar nu au fost


stabilite valori ale testului ABTS sub 15% inhibiie. Extractul din biomasa de nostoc, obinut
prin extragerea cu etanol de 50% a artat cea mai mare valoare a testului ABTS. Creterea
concentraiei alcoolului etilic cu 5-15% a redus activitatea antioxidant a extractelor. Pentru
extractele etanolice de 70%, 80% i 96%, valorile testului ABTS sunt identice de 32% inhibiie
radical. Concentraiile de 50% etanol i cele de 70-96% etanol sunt cele mai indicate n obinerea
de extracte antioxidante din biomasa de nostoc n condiiile extraciei de 24 ore. Prin urmare
factorul concentraiei etanolului este unul determinant n obinerea extractelor antioxidante din
biomasa de nostoc.
n rezultatul studiului efectuat putem face urmtoarele concluzii: Alcoolii metilic i etilic
sunt buni extractani pentru obinerea de complexe antioxidante din biomasa nativ de Nostoc
linckia; Pentru a exclude solvenii toxici din tehnicile de obinere a complexelor antioxidante din
biomasa de nostoc, alcoolul etilic este cel mai indicat solvent; Concentraiile alcoolului de 80%
i 96(100)% determin activitatea antioxidant sporit identic pentru extractele obinute n 6, 12
i 24 ore; Concentraia de 50%-55% etanol este determinant n obinerea de extracte
antioxidante din biomasa de nostoc n condiiile extraciei de 6, 12 i 24 ore; Concentraia
etanolului este unul din factorii determinani n obinerea extractelor antioxidante din biomasa de
nostoc; Durata de extracie de 12 ore este avantajoas pentru obinerea de extracte antioxidante
din biomasa nativ de nostoc.
n continuare au fost efectuate cercetri de optimizare a extragerii de ficobiline din
biomasa de nostoc. Pigmenii ficobilinici sunt solubili n ap. Sunt cunoscute tehnici de obinere
a ficobilinelor din biomasa cianobacteriilor prin extragerea fracionat [106]. Alcoolul de 1020% este aplicat n extragerea ficobilinelor din biomasa algal [287] i este considerat un
extractant optimal deoarece randamentul este unul mare i este evitat procesul de congelare a
extractului, condiiile fiind unele aseptice. n cazul biomasei de Nostoc activitatea antioxidant a
extractului hidric este nalt - de 54% inhibiie (Figura 3.5), urmat de valorile sczute de 22,7%
i 15,4% inhibiie ale extractelor de 10% i 20%. Astfel, n condiiile unei extrageri cu etanol de
10% i 20% a principiilor bioactive din biomasa nativ de Nostoc, activitatea antioxidant a
extractelor obinute este redus comparativ cu activitatea extractelor hidrice.
n scopul obinerii de extracte active au fost efectuate extrageri succesive din biomasa
cianobacteriei cu aplicarea n calitate de solvent a apei i a etanolului n concentraiile aplicate
anterior, durata extragerii a fost de 6 ore. Obinerea succesiv a extractelor hidric i etanolice cu
concentraia alcoolului de 10% i 20% din biomasa de nostoc au favorizat obinerea unor
rezultate mai bune, dect n cazul extractelor simple. Activitatea antioxidant a extractului de
78

10% a crescut cu 85%, iar a celui de 20% - cu peste 100% comparativ cu extragerea separat din
biomasa de Nostoc.

ABTS+, %inhibiie

60
50
40
30
20
10
0
H2O

10%

20%

30%
40%
55%
Concentraia etanolului

65%

80%

96%

Fig. 3.5. Activitatea antioxidant (% inhibiie ABTS+) a preparatelor, obinute prin extragere
succesiv din biomasa de Nostoc linckia.
Prin urmare, obinerea extractului hidric condiioneaz biomasa de Nostoc, favoriznd
extragerea ulterioar cu aplicarea etanolului de 10 i 20%. Extragerile succesive ulterioare pentru
variantele cu soluie hidro-etanolic cu concentraia de la 30 la 96% au redus mult din activitatea
antioxidant iniial a lor, valorile testului ABTS fiind puin peste 20% inhibiie. Astfel,
activitatea antioxidant a extractului de 55% a sczut cu 20%, a celui de 65% cu 26%, iar
activitatea antioxidant a extractului de 96% s-a redus cu 42%. Prin urmare este rentabil
aplicarea extragerii succesive pentru a obine extracte hidro-etanolice cu coninut mic de etanol
din biomasa de Nostoc.
3.3 Stabilirea condiiilor de conservare a proprietilor antioxidante ale extractelor hidroetanolice obinute n baza biomasei de Nostoc linckia
Antioxidanii obinui pe cale sintetic, n marea lor parte sunt protejai de aditivi.
Preparatul antioxidant monocomponent poate fi supus degradrii doar n condiii de pstrare
neadecvate: vase din plastic sau sticl transparente, temperaturi ridicate. Pentru produsele
antioxidante policomponente condiiile de pstrare, chiar dac sunt determinante nu pot
mpiedica degradarea lor. Iat de ce una din cele mai serioase piedici ale tehnologiilor de
obinere a produselor antioxidante este degradarea n timp a proprietilor antioxidante. n scopul
aprecierii evoluiei n timp a capacitii antioxidante a extractelor hidro-etanolice, obinute din
biomasa nativ de nostoc acestea au fost pstrate timp de 3 luni n condiii diferite.
79

n rezultatul experienelor anterioare au fost evideniate extractele de 65% i 96% obinute


la extragere cu etanol de 65 i 96% cu durata extragerii de 6 ore i extractele hidric i etanolic de
10 i 20% obinute prin extragere succesiv. Anume aceste preparate antioxidante, obinute n
baza biomasei de Nostoc au fost supuse testului de pstrare. Pentru aceasta, preparatele native au
fost pstrate timp de 3 luni n condiii de frigider (40C) n vase din sticl fumurie. Periodic a fost
determinat activitatea antioxidant a preparatelor cu aplicarea testului ABTS (Figura 3.6).
ABTS+, %inhibiie

70

extragere

60

24 ore

48 ore

30 zile

90 zile

50
40
30
20
10
0
Extract 65%

Extract 96%

Extract HO

Extract 10%

Extract 20%

Fig. 3. 6. Modificarea activitii antioxidante a extractelor etanolice n baza biomasei de Nostoc


pe durata pstrrii la temperatura de +40C
Rezultatele monitorizrii activitii antioxidante a extractelor selectate a scos n eviden
necesitatea modificrii condiiilor de pstrare. Astfel, n primul rnd devine evident durata
redus a pstrrii extractelor n condiii de +40C care este de 30 zile. Pentru toate extractele,
activitatea antioxidant se reduce spre a 3-a lun de pstrare. Extractele etanolice de 65% i 96%
etanol pierd 10-13% din capacitatea de a reduce radicalul ABTS+. Acelai lucru este specific i
pentru extractul etanolic de 10%, activitatea antioxidant a cruia se reduce cu 14%. Cel mai
instabil, la condiiile de pstrare de +40C s-a dovedit a fi extractul hidric, activitatea antioxidant
spre sfritul termenului de testare fiind de 18,2% inhibiie, ceea se este cu 66,7% mai puin fa
de activitatea antioxidant a extractului nativ. Extractul etanolic de 20% pierde 26,6% din
capacitatea antioxidant. Cu toate c coninutul ficobilinelor n extractele de 10% i 20% a fost
identic, extractul de 20% etanol pierde dublu din activitatea antioxidant spre sfritul perioadei
de pstrare. Prin urmare capacitatea extractiv a etanolului aplicat n concentraia de 10% este
mai mare comparativ cu cea a etanolului de 20% i componena antioxidant a extractului de
10% favorizeaz pstrarea activitii antioxidante.
Au fost modificate condiiile de pstrare a extractelor din biomasa de nostoc, cu
meninerea probelor n vase din plastic la temperatura de 00C. Efectul influenei condiiilor
termice de pstrare a extractelor devine vizibil (Figura 3.7).

80

ABTS, %inhibiie

70

extragere

24 ore

48 ore

30 zile

90 zile

60
50
40
30
20
10
0
Extract 65%

Extract 96%

Extract HO

extract 10%

Extract 20%

Fig. 3.7. Modificarea activitii antioxidante a extractelor etanolice n baza biomasei de Nostoc
pe durata pstrrii la temperatura 00C.
Dup 90 zile de pstrare, activitatea antioxidant a extractelor practic nu s-a modificat.
Valorile testului ABTS sunt identice celor determinate n extractele native. Pentru extractul
etanolic de 96% este determinat o oscilare a activitii antioxidante pe durata primelor 30zile de
pstrare, valorile testului ABTS au crescut cu 12%, dup care au revenit la cele iniiale. Aceste
oscilaii sunt determinate de componena antioxidant a extractului etanolic de 96%. Perioada de
30 zile a devenit perioada de stabilizare a extractelor.
Problema meninerii

activitii

antioxidante,

pe durat pstrrii,

a extractelor

policomponente din biomasa microalgelor i cianobacteriilor, inclusiv i din Nostoc linckia


rmne a fi actual. Condiiile de congelare nu sunt cele mai optimale pentru loturi mari de
extracte antioxidante. A fost iniiat un studiu pentru a stabili posibilitatea utilizrii
antioxidanilor, aplicai n calitate de ageni protectori/stabilizatori ai activitii antioxidante a
extractelor etanolice din biomasa de Nostoc linckia.
n scopul fortificrii efectului antioxidant i pentru minimalizarea proceselor de oxidare au
fost propuse variante de preparate antioxidante suplimentate cu antioxidani cunoscui ca
tocoferolul, troloxul i acidul ascorbic. Antioxidanii au fost selectai n msura aplicrii lor
extractelor antioxidante cu coninut variat al etanolului. Astfel, preparatul n baza extractelor
etanolice de 65% i 96% a fost suplimentat cu tocoferol, preparatul n baza extractului hidric a
fost suplimentat cu trolox i acid ascorbic. Pentru a evita suprapunerea efectului antioxidant al
substanelor active, doza suplimentelor antioxidante a fost selectat de 1 g/ml, 10 g /ml i 100
g /ml. n mod identic au fost selectate condiiile de pstrare a preparatelor timp de 3 luni n
condiii de frigider (40C) n vase din sticl fumurie. Periodic a fost determinat activitatea
antioxidant a preparatelor cu aplicarea testului ABTS. Rezultatele obinute au fost prezentate n
Figurile 3.8 - 3.10. n primul rnd a fost stabilit o majorare relativ, cu 15%, a activitii
81

antioxidante a extractelor suplimentate cu tocoferol, aplicat n concentraiile de 1,0 g/ml i 10


g/ml (Figura 3.8). Pentru varianta de extract complexat cu 100 g/ml tocoferol, activitatea

ABTS, %inhibiie

antioxidant a crescut cu 20%.


90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

iniial

Preparat nativ

2 ore

24 ore

48 ore

+ tocoferol 1 g/ml

30 zile

90 zile

+ tocoferol 10 g/ml

+ tocoferol 100 g/ml

Fig. 3.8. Modificarea activitii antioxidante a extractului etanolic de 96% n baza biomasei de
Nostoc linckia, suplimentat cu tocoferol (g/ml), pe durata pstrrii la temperatura de +40C.
Analiza rezultatelor testului de pstrare a extractului de 96% etanol a determinat existena
unei perioade de stabilizare att pentru extractul etanolic nativ, ct i pentru variantele de
extracte complexate cu tocoferol, aplicat n trei concentraii. n primele 30 zile de pstrare,
activitatea antioxidant a extractelor suplimentate cu tocoferol, n concentraia de 1 g /ml a
crescut cu 56%. Valoarea testului ABTS este de 81% inhibiie. Pentru variantele de extracte
etanolice suplimentate cu tocoferol n concentraia de 10 i 100 g/ml, activitatea antioxidant a
extractelor a crescut cu 30-32%. Valoarea testului ABTS este de 69% i 73% inhibiie.
Reducerea nensemnat a activitii antioxidante peste 24 ore de pstrare a fost stabilit pentru
extractul nativ, cu 10 %, i pentru extractul etanolic complexat cu tocoferol n concentraia 10
g/ml cu 12%. Extractul etanolic, care conine 1 g/ml tocoferol a prezentat o stabilitate
antioxidant pe durata primelor 24 ore de pstrare. O reducere semnificativ, cu 21%, a
activitii antioxidante a fost stabilit pentru varianta de extract etanolic, suplimentat cu tocoferol
n concentraia 100 g/ml. Cele mai vizibile modificri ale activitii antioxidante a extractelor
etanolice din biomasa de nostoc se produc n urmtoarele 24 ore. Pentru extractul etanolic nativ
i varianta extractului etanolic suplimentat cu tocoferol n doza de 10 g/ml, valorile activitii
antioxidante revin la cele iniiale i sunt de 48% i 51% inhibiie radical ABTS+. Activitatea
antioxidant a extractului suplimentat cu 1 g/ml tocoferol a crescut cu 28%, iar activitatea
antioxidant a extractului suplimentat cu 100 g/ml tocoferol a crescut cu 10%. Spre sfritul
perioadei de 30 zile, activitatea antioxidant a extractelor a crescut, procesul de stabilizare fiind
82

finalizat. Valorile testului antioxidant ABTS ale extractului nativ i a variantelor suplimentate cu
tocoferol n concentraiile de 10 g/ml i 100 g/ml s-au majorat cu 30-33%. Un spor cu 56% a
fost determinat pentru varianta extractului etanolic din nostoc suplimentat cu 1,0 g/ml
tocoferol. Dup trei luni de pstrare n condiiile testate, extractele n baza biomasei de Nostoc au
pierdut din capacitatea de a reduce radicalul ABTS+. Suplimentele de tocoferol n concentraiile
de 1,0 i 10 g/ml au redus activitatea antioxidant cu 30-32% n varianta de extract etanolic de
96%. Pentru varianta de extract etanolic suplimentat cu 100 g/ml tocoferol, activitatea
antioxidant s-a redus cu 45%. Prin urmare putem afirma c tocoferolul suplimentat extractelor
etanolice obinute n baza biomasei de nostoc posed capacitatea de a fortifica activitatea
antioxidant a extractelor. Cele mai bune rezultate au fost stabilite pentru variantele de extract
suplimentate cu tocoferol n concentraia de 1 g/ml. Cea mai stabil variant a extractului
etanolic suplimentat cu tocoferol este varianta cu aplicarea concentraiei de 10 g/ml tocoferol.
Pentru aceast variant perioada lipsit de variaii este de 48 ore, iar sporul activitii
antioxidante, specific duratei de 30 zile este unul moderat. Reducerea activitii antioxidante a
extractelor etanolice native i a celor suplimentate cu tocoferol neag implicarea acestuia n
procesul de deteriorare a componenei antioxidante a extractului etanolic de 96% n baza
biomasei de nostoc.
Un set identic de cercetri a fost efectuat cu extractul hidro-etanolic, obinut din biomasa
de nostoc cu aplicarea etanolului, concentraia de 65% (Figura 3.9)
70

iniial

2 ore

24 ore

48 ore

30 zile

90 zile

ABTS, % inhibiie

60
50
40
30
20
10
0
Preparat nativ

+ tocoferol 1 g/ml

+ tocoferol 10 g/ml

+ tocoferol 100 g/ml

Fig. 3.9. Modificarea activitii antioxidante a extractului etanolic de 65% n baza biomasei de
Nostoc linckia, suplimentat cu tocoferol, pe durata pstrrii la temperatura de +40C.
Suplimentarea extractelor hidro-etanolice de 65% alcool cu tocoferol n concentraia de 1,0
g/ml a sporit activitatea antioxidant a extractului cu 16%, valorile testului ABTS crescnd de
la 38% inhibiie la 44% inhibiie. Suplimentarea extractelor hidro-etanolice din nostoc cu 10
83

g/ml tocoferol a sporit activitatea antioxidant a extractului cu 26%, valorile testului ABTS+
fiind de 48% inhibiie. Cele mai evidente modificri au fost determinate pentru varianta de
suplimentare a extractului cu 100 g/ml tocoferol. Sporul activitii antioxidante a fost cu 53%.
Se poate presupune o implicare agresiv a tocoferolului n procesul de stabilizare i deteriorare a
componenei i activitii antioxidante a extractelor complexate. Dar varianta dat a manifestat
cel mai mare grad de stabilizare. Spre sfritul duratei de pstrare nu au fost determinate reduceri
ale activitii antioxidante.
Rezultatele obinute au demonstrat neimplicarea tocoferolului n procesul de stabilizare a
extractelor hidro-etanolice din biomasa de nostoc. n primele 30 zile de pstrare activitatea
antioxidant a extractului nativ i a variantelor complexate cu tocoferol nu au suferit modificri.
activitatea antioxidant a variantelor testate nu s-a modificat. Valorile testului ABTS fiind la
nivelul iniial.
Spre sfritul perioadei de pstrare, 90 zile, s-au redus valorile testului antioxidant ABTS
pentru extractul nativ cu 14% i pentru variantele de suplimentare cu tocoferol n concentraia
de 1,0 g/ml i 10 g/ml cu 32% i 37% respectiv.
Prin urmare putem spune ca implicarea tocoferolului n procesul de stabilizare i de
deteriorare a componenei i a activitii antioxidante a extractelor etanolice din biomasa de
nostoc depinde n primul rnd de tipul extractului. Dac pentru extractele antioxidante etanolice,
tocoferolul a fost unul din factorii de stabilizare n timp a activitii antioxidante, atunci pentru
extractele hidro-etanolice de 65% alcool, tocoferolul nu s-a manifestat n calitate de stabilizator.
Aceast neimplicare a fost precedat de un spor considerabil al activitii antioxidante a
extractelor hidro-etanolice complexate. n continuare a fost determinat implicarea dozelor de
tocoferol suplimentate la extracte n procesul de stabilizare a extractelor. Pentru variantele de
extracte etanolice complexate, concentraiile de 10 g/ml i 100 g/ml tocoferol au fost
semnificative. Concentraia de 1,0 g/ml tocoferol a modificat esenial activitatea antioxidant a
extractului etanolic supus testului de pstrare. Pentru variantele de extracte hidro-etanolice
complexate, toate concentraiile au avut un efect similar de stabilizare. Concentraia de 100
g/ml tocoferol s-a manifestat ca un stabilizator al activitii antioxidante a extractului hidroetanolic de 65%, activitate care a fost majorat de tocoferolul suplimentat.
Extractul hidric, obinut bin biomasa de nostoc a fost suplimentat cu acid ascorbic i trolox,
aplicate n concentraie de 1,0 g/ml. Complexele antioxidante obinute au fost supuse testului
de pstrare la temperatura +40C. Complexarea extractului hidric cu acid ascorbic a sporit
activitatea antioxidant a extractului cu 10% (Figura 3.10).

84

ABTS, % inhibiie

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

iniial

2 ore

nativ

24 ore

48 ore

30 zile

+ vit C 0,001

90 zile

+ trolox 0,001

Fig. 3.10. Modificarea activitii antioxidante a extractului hidric n baza biomasei de


Nostoc linckia, suplimentat cu acid ascorbic i trolox, pe durata pstrrii la temperatura de +40C.
n primele 48 ore activitatea antioxidant a extractului complexat cu acid ascorbic nu a
suferit modificri. Extractul hidric nativ a pierdut 12% din capacitatea de a reduce radicalul
ABTS. Tendina de reducere a activitii antioxidante a extractului nativ se pstreaz n
continuare. Astfel, dup pstrare timp de 30 zile, activitatea antioxidant scade cu 55%, iar spre
sfritul perioadei de pstrare, valorile testului ABTS+ reprezint doar 33% din valoarea iniial.
Pentru extractul hidric, suplimentat cu acid ascorbic, dup perioada de 30 zile a fost
nregistrat un spor cu 23% a activitii antioxidante. Dup 90 zile, extractul complexat cu acid
ascorbic pierde din activitatea antioxidant. Valorile testului ABTS+ se reduc de la 60%
inhibiie la 56% inhibiie. Prin urmare, spre finele perioadei de pstrare, activitatea antioxidant
a extractului hidric suplimentat cu 1,0 g/ml acid ascorbic nu se reduce. Putem presupune
perioada de 30 de zile ca fiind suficient pentru stabilizare.
n experiena de suplimentare a extractului hidric din nostoc cu antioxidantul sintetic trolox
a fost determinat lipsa unor modificri a activitii antioxidante n primele 24 ore. Valorile
testului ABTS rmn neschimbate, i care sunt similare valorilor testului antioxidant a
extractului hidric nativ. Dup durata de 48 ore de pstrare, activitatea antioxidant a crescut cu
26%. Creterea valorilor testului ABTS a fost determinat i dup 30 zile de pstrare. Astfel
dup o lun de pstrare a extractului hidric complexat cu 1,0 g/ml trolox, activitatea
antioxidant a crescut cu 64%. Dup 90 zile, valorile testului antioxidant se reduc, dar rmn la
nivelul valorilor antioxidante determinate dup 48 ore de pstrare. Spre deosebire de variantele
de extracte etanolice i hidro-etanolice complexate cu tocoferol, unde dup perioada de 90 zile
de pstrare activitatea antioxidant a extractelor complexate se reduce esenial, identic probelor
native, activitatea antioxidant a variantelor extractelor hidrice complexate cu antioxidani
85

sintetici rmne a fi superioar probelor native. Suplimentarea extractelor hidrice, obinute n


baza biomasei de nostoc cu antioxidani sintetici poate fi o condiie de pstrare a extractelor n
lipsa congelrii.
Extractul hidro-etanolic, obinut bin biomasa de nostoc, de asemenea, a fost suplimentat cu
acid ascorbic i trolox n concentraie de 1,0 g/ml. Complexele antioxidante obinute au fost
supuse testului de pstrare la temperatura +40C. Suplimentarea extractului hidro-etanolic de 10%
alcool cu acid ascorbic a sporit activitatea antioxidant a extractului cu 18% (Figura 3. 11).
80

iniial

2 ore

24 ore

48h

30 zile

90 zile

ABTS, % inhibiie

70
60
50
40
30
20
10
0
nativ

+ vit C 0,001

+ trolox 0,001

Fig. 3.11. Modificarea activitii antioxidante a extractului hidro-etanolic de 10% n baza


biomasei de Nostoc linckia, suplimentat cu acid ascorbic i trolox, pe durata pstrrii la
temperatura de +40C.
Similar experienei cu suplimentarea extractului hidric n baza biomasei de nostoc, n
primele 48 ore activitatea antioxidant a extractului hidro-etanolic complexat cu acid ascorbic nu
a suferit modificri. Extractul hidro-etanolic nativ menine capacitatea de a reduce radicalul
ABTS+ pe durata a 30 zile de pstrare.
Pentru varianta de extract hidro-etanolic, suplimentat cu 1,0 g/ml acid ascorbic, dup
perioada de 30 zile a fost determinat o cretere a activitii antioxidante cu 19%. Dup 90 zile,
activitatea antioxidant a extractului complexat cu acid ascorbic rmne neschimbat. Valorile
testului ABTS rmn la 60% inhibiie. Prin urmare, spre finele perioadei de pstrare, activitatea
antioxidant a extractului hidric suplimentat cu 1,0 g/ml acid ascorbic nu se reduce. Ca i n
cazul probelor extractului hidric suplimentat cu acid ascorbic, pentru variantele complexate ale
extractului hidro-etanolic de 10% putem presupune perioada de 30 de zile ca fiind suficient
pentru stabilizare.
n experiena de suplimentare a extractului hidro-etanolic din nostoc cu trolox a fost
determinat lipsa unor modificri a activitii antioxidante n primele 24 ore. Ca i n variantele
complexate ale extractului hidric, valorile testului ABTS rmn neschimbate i sunt similare
86

valorilor testului antioxidant a extractului hidro-etanolic nativ. Dup durata de 48 ore de pstrare,
activitatea antioxidant a crescut cu 26%. Aceeai cretere a activitii antioxidante a fost
stabilit i pentru varianta de extract hidric suplimentat cu trolox. Creterea valorilor testului
ABTS a fost determinat i dup 30 zile de pstrare. Astfel dup o lun de pstrare a extractului
hidric complexat cu 1,0 g/ml trolox, activitatea antioxidant a crescut cu 49%. Dup 90 zile,
valorile testului antioxidant se reduc, dar rmn la nivelul valorilor antioxidante determinate
dup 48 ore de pstrare. Modificrile activitii antioxidante a extractului hidro-etanolic
suplimentat cu 1,0 g/ml trolox, pe durata perioadei de pstrare sunt similare modificrilor
activitii antioxidante a extractului hidric suplimentat cu trolox. Prin urmare, troloxul poate fi
acceptat n calitate de stabilizator i conservant al activitii antioxidante a extractelor hidric i
hidro-etanolic de 10% din biomasa de nostoc.
Capacitatea complexelor antioxidante de a reduce radicalii i de a preveni oxidarea poate fi
verificat prin aplicarea metodei de determinare a produselor degradrii acidului tiobarbituric. n
acest scop, n calitate de substrat uor oxidabil au fost utilizate cteva tipuri de uleiuri vegetale,
lipsite de adaos antioxidant. n calitate de antioxidant a fost utilizat extractul etanolic obinut n
baza biomasei de nostoc prin extragere n alcool etilic timp de 12 ore.
Nivelul de oxidare a uleiurilor a fost stabilit prin metoda determinrii cantitii dialdehidei
malonice acumulate, iar activitatea antioxidant a fost determinat prin metoda reducerii
radicalului DPPH.
n studiu au fost incluse patru tipuri de uleiuri vegetale care se deosebesc dup componena
acizilor grai i respectiv dup capacitatea de autooxidare. Raportul diferit dintre acizii grai
mono- i polienici determin gradul de incorporare a produsului antioxidant: ulei din semine de
in, produs la fabrica Aromavit, Moscova, Rusia, seria de producere 010514; ulei din olive
IBERICA, produs de Olive Line S.L., Madrid, Spania, seria L:7885; ulei din porumb, produs
Unilever, Hamburg, Germania, seria L 315400916; ulei din floarea soarelui, produs la AO
Floarea soarelui, Bli, Moldova, seria 22.10.2013/4.
Oxidarea acizilor grai a fost indus termic cu expunerea uleiurilor la 1000C timp de 60
min. n continuare au fost determinate produsele reactive ale acidului tiobarbituric (testul MDA).
Pentru incorporarea extractului antioxidant (extract etanolic 96%), obinut pe baz de
biomas de nostoc, la 6 ml ulei s-au adugat 3 ml preparat. Pentru a spori incorporarea
antioxidanilor amestecul obinut a fost emulsionat prin agitare timp de 60 min. Separarea
uleiului de restul de preparat s-a produs timp de 24 ore la temperatura camerei. Reziduul etanolic
a fost nlturat prin decantare. Probele experimentale de ulei cu complex antioxidant i probele
control de ulei au fost supuse oxidrii n condiii identice. n continuare a fost efectuat testul
87

MDA. Pentru a separa uleiul de substratul reactant, la probe a fost introdus cloroform n
cantitate de 3 ml. Uleiul a fost eliminat prin decantare.
Nivelul de oxidare a uleiurilor a fost monitorizat prin cuantificarea MDA. Rezultatele
determinrii produselor de reacie ale acidului tiobarbituric sunt prezentate n Figura 3. 12.
Ulei nativ

Ulei cu prepatat AON

Ulei nativ oxidat

Ulei AON oxidat

2.5
2
1.5
1
0.5
0
Ulei olive

Ulei in

Ulei porumb

Ulei floarea soarelui

Fig. 3.12. Testul MDA, determinat pentru uleiurile vegetale native i suplimentate cu
antioxidant, extract etanolic de 96% n baza biomasei de Nostoc linckia.
Din rezultatele prezentate se vede, c complexul antioxidant, obinut prin extragere
etanolic din biomasa de nostoc este un factor important de protecie a uleiurilor vegetale, n
special a celui de in i de porumb.
n lipsa oxidrii induse a uleiurilor, testul DAM a determinat implicarea antioxidanilor n
procesul de reducere a procesului oxidativ indus de condiiile de desfurare a metodei. Cu 22%
au sczut valorile testului DAM pentru uleiurile de olive i in cele suplimentate cu complex
antioxidant i 48% au sczut valorile testului DAM pentru uleiul din semine de floarea soarelui
suplimentat cu antioxidant. Uleiul de porumb a fost mai puin receptibil. Rezultatele stabilite nu
pot fi analizate doar din punct de vedere al coninutului uleiurilor vegetale, substrat pentru
reaciile de oxidare. Astfel, componena polienic a uleiurilor din semine de floarea soarelui i
porumb sunt asemntoare dup raportul acizilor grai. Coninutul dublu de acid oleic C18:19
din uleiul de porumb poate fi un factor de conservare a uleiului, efectul cruia s-a suprapus peste
cel al antioxidanilor. Uleiul de in i de olive sunt absolut diferite dup componena acizilor
grai. Uleiul de in conine peste 50% acid linolenic C18:33 i care lipsete n uleiul de olive.
Uleuil de olive conine 75% acid oleic. Uleiul de in este uor oxidabil, dar rezultatele testului
DAM au artat o reacie de protecie a uleiurilor de in i olive identic n variantele suplimentate
cu complex antioxidant din nostoc.

88

Cu totul diferit au reacionat uleiurile vegetale suplimentate cu complex antioxidant din


biomasa de nostoc la condiiile de stres oxidativ indus. Cel mai mic grad de oxidare a fost
determinat pentru uleiul de olive. A fost stabilit o reducere cu 42% a valorilor testului MDA.
Urmeaz uleiul de in pentru care complexul antioxidant a protejat 51% ulei. O cantitate care
formeaz 87% din uleiul de porumb i 70% din uleiul de floarea soarelui au fost protejate de
extractul antioxidant din biomasa de nostoc.
Prin urmare a fost demonstrat capacitatea extractelor etanolice, obinute n baza biomasei
native de nostoc de a proteja uleiurile vegetale de oxidare.
Pentru aprecierea eficienei extractelor antioxidante din nostoc n calitate de protectori ai
uleiurilor vegetale a fost aplicat testul DPPH. Pentru realizarea lui n calitate de solvent a fost
selectat acetona. Perioada de incubare a probelor a fost de 20 min, dup care a fost nregistrat
absorbana probelor la 517 nm. A fost introdus proba control pentru uleiul nativ. Prin testul de
reducere a radicalului DPPH a fost verificat activitatea antioxidant a extractului etanolic de
96% din nostoc Transferul de componente antioxidante n uleiuri a fost realizat prin
emulsionarea a 3 ml ulei cu 1 ml extracte. Dup separarea fraciilor, uleiul a fost dizolvat n
aceton i efectuat testul DPPH. Rezultatele testului DPPH sunt prezentate n Figura 3. 13.

DPPH, % inhibiie

100

nativ

AO Nostoc

84

80
64
60
40

59.6

50.5
27.8

26.9

23.9

29

20
0
Ulei olive

Ulei in

Ulei porumb

Ulei FS

Fig. 3.13. Activitatea antioxidant (DPPH, % inhibiie) a uleiurilor vegetale native i


suplimentate cu antioxidant, extract etanolic de 96% n baza biomasei de Nostoc linckia.
Este evident sporul activitii antioxidante a uleiurilor suplimentate cu complexul
antioxidant din nostoc. Cel mai puin a fost influenat uleiul de olive. Activitatea antioxidant a
uleiului de olive suplimentat cu complex antioxidant a crescut cu 82%. Valoarea testului DPPH
este de 40,5% inhibiie radical. De 2,4-2,5 ori a sporit activitatea antioxidant a uleiurilor de in i
porumb, respectiv. De aproape 3 ori a crescut activitatea antioxidant a uleiului de floarea
soarelui suplimentat cu complex antioxidant din biomasa de nostoc. Valoarea testului DPPH a
crescut de la 29% inhibiie la 84% inhibiie radical. Prin urmare, complexul antioxidant, obinut
89

n baza biomasei de nostoc prin extragere cu etanol absolut posed capacitatea de amplificare a
valorilor testului antioxidant.

3.4. Concluzii la capitolul 3


1. Activitatea antioxidant a extractelor din nostoc este determinat de natura
extractantului utilizat i condiiile derulare a procesului de extragere.
2. Alcoolul etilic este un solvent recomandat pentru obinerea preparatelor antioxidante din
biomasa de nostoc, rezultatele obinute cu utilizarea lui fiind comparabile cu cele obinute cu
utilizarea metanolului. n acelai timp etanolul se caracterizeaz printr-un nivel nalt de siguran
fa de alcoolul de referin i deci este mai indicat pentru obinerea produselor antioxidante din
biomasa cianobacterian.
3. Activitatea extractelor hidro-etanolice din nostoc este dependent de concentraia
soluiei aplicate, iar cele mai nalte valori sunt obinute pentru extractele de 55-70%, n care sunt
prezente att componentele cu proprieti hidrofile, ct i cu cele lipofile.
4. n scopul sporirii activitii antioxidante ale extractelor obinute cu soluie etanolic de
10-20% se aplic o pre tratare cu ap distilat. Acest procedeu duce la sporirea activitii
antioxidante a extractelor hidro-etanolice cu 85 - 100%.
5. Suplimentarea extractelor din nostoc cu tocoferol este eficient pentru pstrarea de
durat a extractelor hidro-etanolice de 65%, i nu poate fi aplicat n cazul extractelor etanolice.
6. Termenul de pstare a extractelor hidrice i hidro-etanolice de 10 i 20% poate fi mrit
prin suplimentarea extractelor cu trolox ori acid ascorbic.
7. Complexul antioxidant obinut prin extragere etanolic din biomasa de nostoc are
capacitatea de a proteja uleiurile vegetale (n special de in i porumb) de oxidarea agresiv,
indus de condiiile de pstrare. Implicarea componentelor antioxidante din biomasa de nostoc n
procesul de protecie oxidativ este susinut de testele antioxidante nespecifice care au
demonstrat creterea activitii antioxidante a uleiurilor vegetale suplimentate cu complex
antioxidant din nostoc.

90

4. ELABORAREA TEHNOLOGIILOR COMPLEXE NONPOLUANTE DE


CULTIVARE A NOSTOC LINCKIA I DE OBINERE A PREPARATELOR
ANTIOXIDANTE
Cutarea surselor noi de antioxidani naturali cu potenial n profilaxia i tratamentul
diferitor maladii umane este o tendin actual a biotehnologiei moderne. n ultimii ani sinteza
biologic a antioxidanilor atrage atenia ca alternativ a sintezei chimice n primul rnd din
considerente de siguran, precum i datorit posibilitii de a modela preparate complexe cu
activitate antioxidant i antiradicalic nalt. Relaia strns dintre ficobiotehnologie,
biotehnologia microbiologic i chimia compuilor coordinativi ofer oportuniti mari n
aceast direcie.
Cianobacteriile posed numeroase mecanisme de protecie antioxidant, ce includ
componente enzimatice i nonenzimatice capabile s nlture efectele speciilor reactive ale
oxigenului [203-205]. Activitatea antioxidant nalt a cianobacteriilor se datoreaz distribuirii
lor cosmopolite n diverse nie ecologice, fiind dotate evolutiv cu mai multe mecanisme de
meninere a viabilitii dect majoritatea organismelor biologice. Ficobiliproteinele ca
antioxidani non-enzimatici absorb i asigur disiparea energiei de excitare sub form de cldur
i transferul eficient al energiei absorbite de centrele de reacie fotosintetice, n scopul de a
reduce producia de oxigen singlet 1O2 [250]. Aceti compui sunt viu colorai, cu capacitate
nalt de absorbie i fluorescen datorit cromoforilor bilinici, iar n linii generale toi sunt
antioxidani, care reduc intensitatea stresului oxidativ prin meninerea mediului redox sau
modularea sistemului de semnalizare intracelular [118, 173, 227].
Randamentul ficobiliproteinelor poate fi maximizat prin controlul sau optimizarea
factorilor nutritivi i de mediu [156, 220, 222]. Compuii coordinativi ai metalelor cu diferii
liganzi atrag atenia anume prin capacitatea lor de a modela procesele biosisntetice n celulele
vii, chiar i fiind aplicai n concentraii foarte joase [49]. Ca xenobiotici pentru organismele vii,
aceti compui pot genera stres oxidativ de diferit intensitate, care foarte des este asociat cu o
cretere iniial a activitii antioxidante a celulelor. Pe aceast cale compuii coordinativi ai
metalelor de tranziie pot servi ca modulatori n procesul de sintez dirijat a compuilor cu
proprieti antioxidante n obiectele de interes biotehnologic.
Fierul este un element esenial al mai multor complexe proteice, care sunt implicate n
procesul de fotosintez, n calitate de co-factori redox. Elementele fotosistemei I a
cianobacteriilor i citocromul b6f conin cantiti considerabile de fier i se sintetizeaz n celule
n cantiti mici n caz de insuficien de metal [73]. La cianobacterii n biosinteza
ficobiliproteinelor este implicat ficocianin-ferredoxin oxidoreductaza (PcyA) care mediaz
91

reducerea atipic a biliverdinei IX [72]. Astfel, proprietile redox datorit crora fierul este un
co-factor eficient duc, de asemenea, la interaciuni oxidative, din care rezult radicali liberi
periculoi pentru celule. Astfel, cantitatea de fier n celule trebuie foarte strict controlat, misiune
care este ndeplinit de ctre familia proteic a ferritinelor.
Din punct de vedere comercial sunt produse naturale valoroase cu utilizri multiple n
calitate de nutraceutice i produse farmaceutice, componente alimentare, colorani pentru
cosmetice, marcheri n biomedicin. Utilizarea ficobilinelor n calitate de colorani naturali fr
potenial toxic ori oncogen este o alternativ actual fa de produsele sintetice [180, 203-205].
Numeroase studii arat, c datorit proprietilor lor ficobilinele normalizeaz imunitatea, inhib
dezvoltarea

tumorilor,

ncetinesc

procesul

de

mbtrnire

dezvoltarea

bolilor

neurodegenerative [41, 157, 250, 260].


4.1. Modificarea activitii antioxidante la Nostoc linckia sub influena compuilor
coordinativi ai fierului (III) cu bazele Schiff i cu aminoacizii
n calitate de inductori ai acumulrii principiilor bioactive cu efect antioxidant n biomasa
de Nostoc linckia au fost utilizate dou clase principial diferite de compui coordinativi ai
fierului compui ai Fe(III) cu aminoacizii i compui ai Fe(III) cu bazee Schiff. Selectarea
acestor dou clase a fost fondat pe ncercarea de a compara reaciile de rspuns ale culturii de
nostoc la aciunea unor compui cu grad diferit de toxicitate. Ambele tipuri de compui conin
fierul metal cu valen variabil, unul dintre principalele elemente metalice responsabile n
sistemele vii de declanarea reaciilor de oxidare i formare a radicalilor liberi. Din start am
considerat c prezena metalului deja poate fi un element de control al activitii antioxiante n
biomasa de nostoc. Liganzii prezentai prin aminoacizi sunt elemente prietenoase mediului
celular, capabile s atenueze efectele negative ale metalului, iar liganzii prezentai prin bazele
Schiff, din contra, datorit potenialului lor toxic nalt, pot amplifica efectele negative ale
metalului. Prin compararea efectelor acestor dou clase de substane asupra nostocului speram s
contribuim la tezaurul de cunotine acumulat cu referire la procesele de anihilare a consecinelor
stresului oxidativ, elaborarea preparatelor cu efecte antioxidante, confirmarea siguranei
biomasei ficologice cu bioelemente acumulate n procesele biotehnologice .a.
Parametrii monitorizai n cadrul acestor experiene au fost: biomasa cianobacterian,
coninutul de ficobiliproteine n biomas (i n extractele hidrice) ca component cu efect
antioxidant i pondere maximal cantitativ, activitatea antioxidant a extractelor hidrice i
etanolice, determinat prin aplicarea diferitor metode.

92

4.1.1. nfluena compuilor coordinativi ai Fe(III) cu aminoacizii asupra parametrilor


biotehnologici la Nostoc linckia
Experienele din acest subcapitol au fost efectuate cu utilizarea culturii de Nostoc linckia
trecut prin 3 pasaje pe mediu lipsit de fier, care n mod normal se adaug n form de complex
FeEDTA. Pentru adugarea compuilor coordinativi la mediul de cultivare s-au preparat soluii
apoase standard cu concentraia de 1mg/ml. Compuii au fost adugai la mediul nutritiv pn la
inocularea culturii, concentraiile utilizate fiind de la 10 la 40 mg/l cu intervalul ntre variante de
10 mg/l. Aceast schem experimental a fost aplicat i anterior pentru alte culturi ficologice
Dunaliella salina i Porphyridium cruentum, i a permis de a evidenia anumite elemente
comune n reaciile de rspuns ale acestor dou obiecte valoroase. Este cu att mai interesant de a
aplica schema propus n cercetrile din aceast lucrate, c aici avem n calitate de obiect de
studiu un organism principial deosebit reprezentant al procariotelor. n Tabelul 4.1 sunt date
formulele compuilor utilizai n studiu, abrevierile utilizate n continuare la prezentarea i
analiza rezultatelor, concentraiile lor utilizate n studiu i coninutul fierului n probele apicate
[8, 15].
Tabelul 4.1. Concentraiile compuilor coordinativi ai Fe(III) cu aminoacizii, aplicate n
studiu i coninutul de fier n ele [8, 15]
Compusul

Abrevierea
utilizat

Masa
molar

[Fe(III)Gly]

797,7

[Fe(III)D,LAla]

899,7

[Fe3O(LAla)6(H2O)3](NO3)4H2O

[Fe(III)L,Ala]

899,7

[Fe3O(Gly)6(H2O)3](NO3)73,5H2O

[Fe(III)Gly]7+

1185

[Fe3O(Ala)6(H2O)3](NO3)73,5H2O

[Fe(III)Ala]7+

1260

[Fe3O(Gly)6(H2O)3](NO3)3H2O

[Fe3O(L,DAla)6(H2O)3](NO3)4H2O

93

Concentraia
compusului
mg/l
M
10
12,54
20
25,08
30
37,62
40
50,17
10
11,11
20
22,23
30
33,34
40
44,45
10
11,11
20
22,23
30
33,34
40
44,45
10
8,44
20
16,88
30
25,32
40
33,76
10
7,94
20
15,88
30
23,81
40
31,75

Colectarea biomasei cianobacteriene s-a produs la a 10-a zi de cultivare n condiiile


menionate anterior, dup care biomasa s-a standardizat i s-a supuns extragerii hidrice, hidroetanolice cu concentraia alcoolului n amestecul extractant de 55% i etanolice. Aceste tipuri de
extragere au fost selectate n baza rezultatelor prezentate n capitolul 3, unde a fost demonstrat,
c aceste tipuri de extracte sunt cele mai active din punct de vedere al activitii antiradicalice i
i pstreaz proprietile n condiii adecvate de stocare.
Toate extractele utilizate n studiu au fost standardizate dup substana uscat n aa mod,
ca extractele supuse testrii s conin 1 mg substan uscat la 1 ml. La prima etap n extracte
a fost determinat activitatea lor antiradicalic prin aplicarea testului ABTS+.
Rezultatele testului pentru extractele obinute din biomasa de Nostoc linckia, crescut pe
mediu cu adaos de compui coordinativi n patru concentraii testate i din biomasa probei
martor sunt prezentate n Figurile 4.1 i 4.2.
ABTS H2O

ABTS 55%

ABTS 96%
50
40
30
20
10

% Inhibitie

Biomasa g/L

Biomasa g/l
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

0
10

20

30

[Fe(III)Gly]

40

10

concentraia, mg/L

20

30

40

[Fe(III)Gly]7+

Fig.4.1. Productivitatea i activitatea antiradicalic (test ABTS) a extractelor din biomasa de


Nostoc linckia obinut pe medii cu adaos de glicinat de fier(III).
Dup cum se poate observa din Figura 4.1, ambii glicinai ai fierului (III) n diferite
concentraii au provocat o cretere moderat a cantitii de biomas acumulat. Cel mai
pronunat s-a nregistrat n varianta experimental cu adaos de 40 mg/L [Fe(III)Gly], cnd
cantitatea de biomas obinut a fost cu 23% mai mare dect n cazul probei martor. Activitatea
antiradicalic fa de ABTS n toate 3 tipuri de extracte studiate (hidric, etanolic i hidroetanoloc de 55%) a fost mai joas dect activitatea extractelor obinute din biomasa martorului.
Rezultate similare au fost obinute i n cazul compusului [Fe(III)Gly] 7+. i n acest caz biomasa
este la nivelul probei martor ori o depete neesenial pe aceasta, iar activitatea antiradicalic a
extractelor este la nivelul activitii extractelor din biomasa standard, ori mai joas ca aceasta.
Cele mai joase rezultate au fost nregistrate pentru extractele hidro-etanolice de 55%, care n
variantele experimentale nregistreaz valori semnificativ mai joase dect n cazul martorului.
94

Rezultatele obinute n cazul suplimentrii mediului nutritiv cu compui ai fierului cu L,D-

Biomasa g/l

0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

ABTS H2O

ABTS 55%

ABTS 96%

60
50
40
30
20

% Inhibitie

Biomasa g/l

Alaninat, L-Alaninat i -Alaninat sunt prezentate n Figura 4.2.

10
0
10 20 30 40
[Fe(III)D,L,Ala]

10 20 30 40 M
[Fe(III)L,Ala]
Concentraia, mg/L

10

20

30 40 M
[Fe(III)Ala]7+

Fig.4.2. Productivitatea i activitatea antiradicalic (test ABTS) a extractelor din biomasa de


Nostoc linckia obinut pe medii cu adaos de alaninai de fier(III).
Ca si n cazul examinat mai sus, n cazul alaninailor de fier nu au fost nregistrate efectele
dorite adic o cretere semnificativ a activitii antioxidante. Att biomasa, ct i activitatea
antiradicalic fa de radicalul cation ABTS nu s-au deosebit semnificativ n variantele
experimentale de rezultatele obinute pentru proba martor.
Urmtorul test cruia au fost supuse extractele hidro-etanolic i etanolic din nostoc a fost
testul de evaluare a capacitii antioxidante prin metoda reducerii reagentului fosfomolibdenic
(CRFM). Deoarece metoda dat presupune testarea activitii antioxidante a extractelor
etanolice, testului CRFM sunt supuse doar extractul hidro-etanolic de 55% i cel etanolic.
Rezultatele obinute sunt prezentate n Figurile 4.3 i 4.4.
CRFM 55%

CRFM 96%

0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

60
50
40
30
20
10

mg Trolox/ g BAU

Biomasa g/L

Biomasa g/l

0
10

20
30
[Fe(III)Ser]

40

M
10
Concentraia, mg/L

20

30
40
[Fe(III)Ser]7+

Fig.4.3. Productivitatea i capacitatea de reducere a reagentului fosfomolibdenic a extractelor din


biomasa de Nostoc linckia obinut pe medii cu adaos de glicinat de fier(III).
95

Extractele obinute din biomasa de nostoc crescut pe mediu cu adaos al glicinailor de fier
(Figura 4.3) au manifestat o capacitate de reducere a reagentului fosfomolibdenic practic identic
sau mai joas comparativ cu biomasa standard. n cazul primului glicinat [Fe(III)Gly] extractul
hidro-etanolic de 55% din biomasa de nostoc n toate variantele experimentale a manifestat o
capacitate de reducere a reagentului fosfomolibdenic substanial mai joas fa de extractele din
biomasa martor. Valorile maximale ale capacitii de reducere a reagentului fosfo-molibdenic
pentru extractele etanolice i hidro-etanolice au fost nregistrate n cazul biomasei martor,
acestea atingnd 55-56 mg echivalent Trolox la gram de biomas de nostoc. Astfel, testul CRFM
a confirmat rezultatele obinute prin aplicarea testului ABTS glicinaii de Fe(III) nu provoac o
cretere a activitii antioxidante n biomasa de nostoc.
n Figura 4.4. sunt prezentate rezultatele similare obinute pentru alaninaii de fier (III).
CRFM 55%

CRFM 96%
60
50
40
30
20
10

mg Trolox/ g BAU

Biomasa g/l

Biomasa g/l
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

0
10

20

30

40

[Fe(III)D,L,Ala]

10

20

30

40

[Fe(III)L,Ala]
Concentraia, mg/L

10

20

30

40

[Fe(III)Ala]7+

Fig.4.4. Productivitatea i capacitatea de reducere a reagentului fosfomolibdenic a extractelor din


biomasa de Nostoc linckia obinut pe medii cu adaos de alaninai de fier(III).
Extractele obinute din biomasa de nostoc crescut pe medii cu adaos de alaninai de fier
(Figura 4.4) au prezentat o capacitate de reducere a reagentului fosfomolibdenic la nivelul
martorului, sau chiar mai joas. Cea mai evident scdere a capacitii antioxidante a extractelor
obinute din biomasa probelor experimentale se nregistreaz pentru toi trei compui la
concentraia de 40 mg/L.
n continuare cele trei tipuri de extracte din biomasa de nostoc au fost studiate cu aplicarea
metodei de evaluare a capacitii antioxidante prin metoda reducerii reagentului FolinCiocalteu (CRFC). Aceast metod are la baz principiul transferului de electroni produs n
mediul alcalin cu reducerea complexului acid fosfomolibdenic/fosfovolframic cu formarea
cromogenului care se determin colorimetric. Capacitatea antioxidant se exprim n echivalent

96

acid galic la cantitatea de biomas. Calculul se efectueaz dup curba de calibrare pentru acidul
galic.
Rezultatele obinute n procesul de monitorizare a activitii antioxidante a extractelor n
baza reaciei de reducere a reagentului Folin Ciocalteu sunt prezentate n Figurele 4.5 i 4.6.
Glicinaii de fier nu au indus efectele dorite n biomasa de nostoc, valorile testului de reducere a
reagentului Folin-Ciocalteu fiind comparabile cu cele obinute n cazul probei martor. Ca i n
cazul reagentului fosfomolibdenic, cele mai joase rezultate s-au nregistrat n extractele obinute
din biomasa, care a crescut n prezena celei mai nalte concentraii a compuilor (40 mg/L). n
special acest lucru se observ n cazul extractului hidric i hidro-etanolic de 55% (Figura 4.5).
CRFC H2O

CRFC 55%

CRFC 96%
5

0.6

mg acig galic/g BAU

Biomasa g/L

Biomasa g/l
0.8

0.4

0.2

0
10

20

30

40

10

20

30

Concentraia, mg/L

[Fe(III)Ser]

40

[Fe(III)Ser]7+

Fig.4.5. Productivitatea i capacitatea de reducere a reagentului Folin-Ciocalteu a extractelor din


biomasa de Nostoc linckia, obinut la cultivare n prezena glicinailor de Fe(III).
Rezultatele obinute n cadrul testului de reducere a reagentului Folin-Ciocalteu pentru
extractele hidrice, hidro-etanolice de 55% i etanolice din biomasa de nostoc crescut n prezena
alaninailor de fier (III) sunt prezentate n Figura 4.6.
CRFC H2O

CRFC 55%

CRFC 96%
5
4
3
2
1
0

10

20

30

40

[Fe(III)D,L,Ala]

10

20

30

40

[Fe(III)L,Ala]
Concentraia, mg/L

10

20

30

40

mg acid galic/ g BAU

Biomasa g/L

Biomasa g/l
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

[Fe(III)Ala]7+

Fig.4.6. Productivitatea i capacitatea de reducere a reagentului Folin-Ciocalteu a extractelor din


biomasa de Nostoc linckia, obinut la cultivare n prezena alaninailor de Fe(III).

97

Extractele etanolice i hidro-etanolice obinute din biomasa de nostoc crescut pe mediu cu


adaos de alaninai de fier (III) n linii generale au artat o capacitate de reducere a reagentului
Folin Ciocalteu comparabil cu activitatea extractelor din biomasa standard. Activitatea
extractelor hidrice din biomasa de nostoc n variantele experimentale a fost mai joas dect
activitatea extractelor obinute din biomasa martorului, crescut pe mediul standard.
Rezultatele obinute n cadrul acestui studiu difer semnificativ de rezultatele obinute cu
utilizarea acelorai compui pentru cultura microalgei roii Porphyridium cruentum. n cazul
porfiridiumului practic pentru toi compuii cu fier trivalent i aminoacizi au fost nregistrate
creteri semnificative ale activitii antioxidante a tuturor tipurilor de extracte obinute. Astfel, n
seria menionat de cercetri valorile activitii antioxidante a extractelor din biomasa variantelor
experimentale n medie au depit activitatea extractelor din biomasa martorului de 1,4-1,7 ori,
iar n unele cazuri peste 3 ori [15]. Nostoc linckia s-a manifestat mult mai inert, fr a prezenta
variaii semnificative att n procesul de acumulare a biomasei, ct i n valorile activitii
antioxidante ale acesteia. Astfel, compuii coordinativi ai Fe(III) cu glicinaii i alaninaii nu sau manifestat n calitate de inductori ai strii de stres oxidativ ori de intensificare a proceselor de
acumulare a componentelor cu aciune antioxidant n biomasa de nostoc.
4.1.2. Influena compuilor coordinativi ai Fe(III) cu bazele Schiff asupra parametrilor
biotehnologici la Nostoc linckia
Scopul cercetrilor descrise n aceast parte a lucrrii a constat n studiul posibilitii de
sporite a activitii antioxidante a nostocului prin intermediul dirijrii biosintezei de ficobiline n
biomas. n calitate de reglatori au fost utilizai 4 compui ai fierului cu bazele Schiff obinui
prin condensarea 2,6 diacetilpiridinei cu hidrazida acidului izonicotinic (H2L1) i hidrazida
acidului nicotinic (H2L2), sintezai de cercettorii Institutului de Chimie sub conducerea dlui
prof. Bulhac Ion. n Tabelul 4.2 sunt indicate formulele, concentraiile molare i coninutul de
metal, care au fost utilizate n experiene.
Procesul de cretere la Nostoc linckia i sinteza metaboliilor primari i secundari sunt
dependente n mod direct de compoziia mediului de cultur. Compuii fierului (III) cu bazele
Schiff au fost inclui n mediul nutritiv la prima zi a ciclului de cultivare n concentraii la 1 la 20
mg/L. Biomasa s-a recoltat la a zecea zi, iar dup standardizare n ea au fost determinate
activitatea antioxidant i cantitatea de ficobiliproteine n extractele hidrice obinute din aceast
biomas. Rezultatele pentru compusul [Fe(H2L1)(H2O)2](NO3)31.5H2O sunt prezentate n Figura
4.7.

98

Tabelul 4. 2. Compuii fierului (III) cu baze Schiff utilizai n cercetare


Compusul coordinativ

M,
g/mol

1
mg/L

5
mg/L

10
mg/L

15
mg/L

20
mg/L

CM10-6, mol/L
[Fe(H2L1)(H2O)2](NO3)31.5H2O

706.343

1.41

7.08

14.15

21.23

28.31

[Fe(H2L1)(H2O)1.5(CH3OH)0.5](
ClO4)32H2O

834.701

1.20

5.99

11.98

17.94

23.96

[Fe(H2L2)(H2O)2](NO3)35H2O

769.397

1.30

6.50

13.00

19.49

25.99

809.673

1.23

6.17

12.35

18.52

24.70

Fe(H2L )(H2O)2](ClO4)3H2O

250

85
75
65
55
45
35
25
15

200
150
100
50
0
M

10

15

y = 4,4855x + 50,827
R = 0,9604

ABTS

20

ABTS, % inhibitie

Biomass

ABTS, % Inhibitie

Ficobiliproteinele, biomasa,
%M

Phycobiliproteins

85
80
75
70
65
60
55
50
2

Ficobiliproteine, % BAU

Fig. 4.7 . Coninutul total al ficobilinelor (% BAU) i corelarea ntre valoarea testului ABTS n
extractele hidrice din biomasa de Nostoc linckia n prezena [Fe(H2L1)(H2O)2](NO3)31.5H2O.
Cele mai mari valori au fost obinute la adugarea cantitii de 15 mg/L ale acestui
compus, ceea ce a determinat creterea coninutului de ficobiliproteine cu 132% comparativ cu
proba martor. Cantitatea de 5 mg/L asigur o cretere a cantitii de ficobiliproteine cu 60%. n
ceea ce ine de activitatea antioxidant a extractelor hidrice obinute din biomasa crescut n
prezena diferitor concentraii ale compusului n aceste dou cazuri avem o inhibiie de 70 i
80% respectiv a radicalului cation ABTS. n celelalte concentraii nu au fost observate careva
modificri ale coninutului de ficobiline n biomas. De asemenea i cantitatea de biomas nu se
modific sub influena acestui compus. n cazul acestui compus valorile testului ABTS n
extractul apos din biomasa de nostoc este n corelare cu coninutul ficobilinelor, coeficientul de
determinare fiind R2=0.96.

99

Datele prezentate n Figura 4.8 reflect cantitatea de pigmeni ficobilinici i capacitatea


antiradicalic fa de radicalul cation ABTS a extractelor hidrice din biomasa de nostoc obinut
la cretere n prezena compusului [Fe(H2L2)(H2O)2](NO3)35H2O.
Efectul de sporire a acumulrii de ficobiline a fost observat pentru toate concentraiile de
compus utilizate n studiu. Concentraiile de la 1 la 15 mg/L au dus la creterea cantitii de
ficobiliproteine cu 40-70% fa de martor, iar la concentraia de 20 mg/L aceast cretere a fost
de 2,7 ori. n acest caz nivelul de inhibiie a ABTS+ a atins valoarea de 92%. La concentraiile
compusului de 1 i 5 mg/L nivelul de inhibiie a radicalului este de aproximativ 80%. n celelalte
variante experimentale activitatea antiradicalic a extractului hidric din biomas a fost la nivelul
martorului. Analiza corelaional a stabilit o relaie strns ntre coninutul de ficobiliproteine i
activitatea antiradicalic a extractelor hidrice din biomasa de nostoc, coeficientul de determinare

Biomass

300

95
85
75
65
55
45
35
25
15

250
200
150
100
50
0
M

10

15

y = 6.9278x + 39.872
R = 0.7504

ABTS
ABTS, % inhibitie

Phycobiliproteins

ABTS, %Inhibitie

Ficobiliproteine, biomasa, %M

(R2) fiind de 0.75 (Figura 4.8).

95
90
85
80
75
70
65
60
55
50
2

20
Ficobiliproteine, %BAU

Concentraia, mg/L

Fig. 4.8. Coninutul total al ficobilinelor (% BAU) i corelarea ntre valoarea testului ABTS n
extractele hidrice din biomasa de Nostoc linckia n prezena [Fe(H2L2)(H2O)2](NO3)35H2O.
A fost de asemenea stabilit efectul de stimulare a procesului de acumulare a
ficobiliproteinelor n biomasa de nostoc la cretere n prezena concentraiilor mici de 1, 5 i
10mg/L

ale compusului [Fe(H2L1)(H2O)1.5(CH3OH)0.5](ClO4)32H2O (Figura 4.9). n acest

interval coninutul de ficobiliproteine n biomas acrescut direct proporional concentraiei de


compus, pornind de la o cretere de 40% la concentraia de 1 mg/L i terminnd cu dublarea
acestei valori la concentraia de 10 mg/L. Aceasta este cantitatea maximal de ficobiliproteine
obinute n experiena cu utilizarea compusului dat. Nivelul de biomas n variantele
experimentale a fost identic probei martor. Valoarea maxim a inhibiiei radicalului cation ABTS
100

a fost de 77%, nregistrat n extractul hidric din biomasa obinut la cretere n prezena a 5 i 10
mg/L de compus. Coeficientul de determinare ntre parametrii studiai a fost de 0,854, ce indic
o corelare puternic ntre ei.

250

85
75
65
55
45
35
25
15

200
150
100
50
0
M

10

15

y = 6.6747x + 41.818
R = 0.8541

ABTS

ABTS, % inhibitie

Biomass

ABTS % Inhibitie

Ficobiliproteine, biomasa, %M

Phycobiliproteins

85
80
75
70
65
60
55
50
2

20

4
6
Ficobiliproteine, %BAU

concentraia, mg/L

Fig. 4.9 . Coninutul total al ficobilinelor (% BAU) i corelarea ntre valoarea testului ABTS n
extractele hidrice din biomasa de Nostoc linckia n prezena
[Fe(H2L1)(H2O)1.5(CH3OH)0.5](ClO4)32H2O.
Compusul [Fe(H2L2)(H2O)2](ClO4)3H2O de asemenea nu a indus modificarea nivelului de
acumulare a biomasei de nostoc, dar n toate concentraiile aplicate a dus la mrirea coninutului
de ficobiline cu 30-40% fa de coninutul acestora n proba martor (Fig. 4.10). Creterea
cantitii de ficibiliproteine n extractul hidric din biomasa de nostoc cu 30% nu a afectat practic
deloc activitatea antiradicalic a acestuia. Astfel, n toate variantele experimentale activitatea
antiradicalic a extractelor fa de radicalul cation ABTS a avut valori care nu s-au deosebit
esenial de activitatea antiradicalic a extractelor din biomasa standard. Coeficientul de
determinare ntre parametrii monitorizai a fost de 0,45, ceea ce denot o corelare slab ntre
coninutul de ficobiline i activitatea antiradicalic a extractului hidric.
n experienele descrise compuii coordinativi ai Fe(III) cu bazele Shiff au fost adugai la
mediul nutritiv n diferite concentraii pentru a induce un stres oxidativ n cultura de Nostoc
linckia. Aceasta, rspunde la rndul ei prin modificarea proceselor de sintez a factorilor de
protecie, printre care i ficobiliproteinele. Este cunoscut, c aceti compui acioneaz ca
substane ce sting radicalii liberi ori rup lanul de oxidare prin intermediul reaciilor de transfer
de electroni ori hidrogen [118]. De fapt, atunci cnd factorul de stres devine critic, n calitate de
reacie de rspuns primar, unele tulpini de cianobacterii, inclusiv Nostoc linckia, i-au dezvoltat
mecanisme de protecie de prima linie, ce presupun evitarea condiiilor nocive. Acestea includ
101

migrarea n straturile superficiale ale mediului nutritiv n condiii de laborator sau sinteza de
polizaharide extracelulare care pot aciona ca factori de chelare a metalelor. Mai mult,
exopolizaharidele pot reduce metalul, n special prin aciunea grupelor funcionale chimice,
depozitndu-l n form de nanoparticule. Aceasta ofer o perspectiv important pentru
nelegerea mecanismelor responsabile pentru transportul ionilor metalici i meninerea
concentraiei homeostatice.

200
75
150
55

100
50

35

15
M

1
5
10 15
Concentraia, mg/L

y = 4.2178x + 48.797
R = 0.455

ABTS

20

ABTS, % inhibitie

Biomass

ABTS, % Inhibitie

Ficobiline, biomasa, %M

Phycobiliproteins

69
67
65
63
61
59
57
55
2.5

3
3.5
4
Ficobiliproteine, % BAU

4.5

Figura 4.10. Coninutul total al ficobilinelor (% BAU) i corelarea ntre valoarea testului ABTS
n extractele hidrice din biomasa de Nostoc linckia n prezena [Fe(H2L2)(H2O)2](ClO4)3H2O.

Rezultatele obinute demonstreaz modificri evidente n coninutul de ficobiliproteine n


biomasa nostocului. n cazul compusului [Fe(H2L1)(H2O)2](NO3)31.5H2O, creterea nivelului de
pigmeni are loc la un nivel normal al productivitii, deci nu putem afirma despre existena unui
stres oxidativ. Creterea cantitii de ficobiliproteine n acest caz poate fi o reacie la necesitatea
de a activa procesele de asimilare a energiei luminii. n acelai timp corelarea strns ntre
coninutul de ficobiline i activitatea antioxidant a extractului hidric indic asupra faptului, c
aceti pigmeni prezint componentul antioxidant dominant n extract.
n cazul [Fe(H2L2)(H2O)2](NO3)35H2O, cel mai nalt nivel al ficobiliproteinelor a fost
nregistrat la concentraia de 20 mg/L 250% fa de martor. n acelai timp, cantitatea de
biomas a fost la nivelul martorului, deci nu putem afirma, c n acest caz ficobiliproteinele au
acionat doar ca elemente implicate n fotosintez. Corelaia ntre coninutul de ficobiliproteine
i activitatea antioxidant a extractelor hidrice este mai joas, ceea ce vorbete despre prezena a
mai multor componente antioxidante, afar de pigmenii studiai. Putem presupune, c un
coninut sporit de ficobiliproteine la concentraia maxim a compusului este o reacie de
protecie antioxidant i una de intensificare a fotosintezei i productivitii la Nostoc linckia.
102

n cazul compusului [Fe(H2L1)(H2O)1.5(CH3OH)0.5](ClO4)32H2O la concentraia de 1,5 i


10 mg/L s-a produs o cretere a coninutului de ficobiliproteine i a activitii antioxidante a
extractului hidric. Putem presupune, c n aceste condiii are loc o intensificare a sintezei
ficobilinelor i a componentelor antioxidante n biomasa de nostoc. La concentraii mai mari ale
compusului, nivelul ficobilinelor n biomas este ca i n proba martor. Aceasta, pe fonul unui
nivel sczut uor de productivitate, poate fi o dovad de includere a altor sisteme de protecie
antioxidant dect cele bazate pe acumularea excesiv a acestor pigmeni.
n cazul [Fe(H2L2)(H2O)2](ClO4)3H2O a fost nregistrat cel mai mic nivel al corelrii ntre
coninutul de ficobiline i activitatea antioxidant a extractului hidric, dar i cel mai jos nivel al
ficobiliproteinelor n biomasa probelor experimentale. n condiiile unei productiviti i
activiti antioxidante la nivelul probei martor, putem presupune c acest compus are o aciune
practic neutr fa de nostoc.
In concluzie putem afirma, c compuii coordinativi ai Fe(III) cu bazele Shiff au avut un
efect stimulator asupra procesului de acumulare a ficobiliproteinelor n biomasa de Nostoc
linckia. Efectul de stimulare depinde de doza aplicat, i n cazul a trei compui, concentraia de
20 mg/L a fost determinat ca fiind una de intensitate moderat. Rezultatele obinute
demonstreaz existena unei corelaii ntre coninutul ficobiliproteinelor i valorile testului ABTS
ale extractelor hidrice din biomas experimental de Nostoc linckia. Prin urmare, este posibil s
se modifice activitatea antioxidant a biomasei de nostoc, aplicnd concentraii sczute de
stimuli chimici. In variantele noastre cel mai nalt nivel de corelaie ntre parametrii studiai a
fost observat n cazurile de stimulare a creterii nostocului (compusul [Fe (H2L1) (H2O) 2]
(NO3) 3 1.5H2O) sau inhibarea acestui proces (compusul [ Fe (H2L1) (H2O) 1.5 (CH3OH)
0,5] (ClO4) 3 2H2O). Mai neutr este aciunea factorilor externi n prezena crora corelaia
dintre coninutul ficobiliproteinelor i activitatea antioxidant a extractelor apoase este joas.
Aceast concluzie sugereaz funcii duble ale pigmenilor ficobilinici pentru cultura de nostoc att fotosintetic, ct i de protecie antioxidant. Intensitatea acestor aspecte funcionale este
determinat de natura i aciunea factorilor externi care influeneaz cultura.
4.1.3. Utilizarea compusilor noi cu schelet hibrid terpenic i azaheterociclic pentru sporirea
activitii antioxidante la Nostoc linckia
Cercetrile efectuate de noi pe alte culturi ficologice au demonstrat, c n cazul aplicrii
unor compui cu potenial toxic, dar n cantiti foarte joase, se poate obine o stare de stress
moderat, care duce la acumularea intens a compuilor antioxidani n biomas, fr a duce la
103

deteriorarea componentelor celulare. Astfel, compusul Sulfato-bis(nicotinoilhidrazon)-2,6diacetilpiridin-cobalt(II) monometanol trihidrat asigur creterea substanial a activitii
antioxidante a extractelor din biomasa de Porphyridium cruentum [1].
n acest compartiment al lucrrii sunt descrise rezultatele testrii a doi compui chimici
noi cu schelet hibrid terpenic i azaheterociclic, sintezai de ctre cercettorii Institutului de
Chimie al AM sub conducerea dr. hab. Arcu Aculina.
Ca compus iniial pentru sinteza N-(8,13-biciclohomofarneseno-ilamino)carbazolului (4)
a servit acidul 8,13-biciclohomofarnesenic (1), care a fost obinut din sclareolida (5) comercial
accesibil, cu un randament total de 60%. La tratarea acidului (1) cu clorura de oxalil (COCl)2 a
fost sintetizat in situ cloranhidrida (2), care a fost introdusa in reacie cu N-aminocarbazolul (3),
n rezultatul creia a fost obinut N-(8,13-biciclohomofarnesenoilamino)carbazolul (4) cu un
randament de 60% (Figura 4.11).
19

CO2H

12

COCl

CO
HN

11
16

(COCl) 2
C6H6

NH2

1
7

17

22

N
28

23
24

27
25

4 (60%)

14

15

21

26

13

10

CH2Cl2, 200C, 10 h;
, 5 h

20

18

Fig. 4.11. Schema de obinere a N-(8,13-biciclohomofarneseno-ilamino)carbazolului.


Procedeul de obinere a compusului este simplu n executare, substanele iniiale accesibile,
randamentul constituie 60% fa de cel teoretic calculat. Compusul este stabil n contact cu aerul.
Ca compus iniial pentru sinteza 1-(8,13-biciclohomofarnesenoil)-3-amino-1,2,4-triazolului
(4) a servit acidul 8,13-biciclohomofarnesenic (1), care a fost obinut din

sclareolida (5)

comercial accesibil, cu un randament total de 60%. La tratarea acidului (1) cu clorura de oxalil
(COCl)2 a fost sintetizat in situ cloranhidrida (2), care a fost introdusa in reacie cu 3-amino1,2,4-triazolul (3), n rezultatul creia a fost obinut amida acidului biciclohomofarnesenic (4)
cu un randament de 58% (Figura 4.12).
17

12

CO2H

CO

COCl

11

NH2

(COCl) 2
C6H6
1

NH

CH2Cl2, 200C, 3 h

N (1)
N

10
3

15

14

13

(2)

N(4)

O
18

NH2

4 (58%)

Fig. 4.12. Schema de obinere a 1-(8,13-biciclohomofarnesenoil)-3-amino-1,2,4triazolului.


104

Procedeul de obinere a compusului este simplu n executare, substanele iniiale


accesibile, randamentul constituie 58% fa de cel teoretic calculat. Compusul este stabil n
contact cu aerul. Aceti compui n cantitate de 50-100 mg/L

asigur sporirea activitii

antioxidante a extractelor etanolice de 70% cu 23-42% fa martor. Rezultatele obinute sunt


prezentate n Tabelul 4.3.
Tabelul 4.3. Activitatea antioxidant a extractului etanolic de 70% n baza biomasei de Nostoc
linckia, rezultate la cultivarea n prezena stimulatorilor chimici
Compusul chimic
Martor

Concentraia
compusului g/L
-

Activitatea antioxidant,
% inhibiie DPPH
28,030,72

0,050
0,060
0,100
0,050
0,060
0,100

60,141,09
67,441,15
59,162,04
64,350,98
76,411,69
71,241,48

1-(8,13Biciclohomofarnesenoil)-3amino-1,2,4-triazolul
N-(8,13biciclohomofarnesenoilamino)
carbazolul

Datele tabelului demonstreaz creterea activitii antioxidante a extractului etanolic de


70% alcool etilic cu concentraia de 1 mg/ml substana activ, obinut n baza biomasei de nostoc
de 2,11-2,73 ori fa de varianta martor. Odat cu creterea activitii antioxidante a extractului
etanolic crete i valoarea biomasei de nostoc n calitate de productor de substane antioxidante.
Prin urmare compuii

1-(8,13-Biciclohomofarnesenoil)-3-amino-1,2,4-triazolul

i N-

(8,13-biciclohomofarnesenoil-amino)carbazolul prezint interes pentru biotehnologie n calitate


de stimulatori ai activitii antioxidante a biomasei cianobacteriei Nostoc linckia. Aceste
rezultate au stat la baza eloborrii i obinerii a dou brevete de invenie n colaborare cu colegii
chimiti care au realizat sinteza compuilor - Brevet MD 4326, Brevet MD 4327 [2,3].
4.2. Utilizarea reziduului de biomas de Nostoc linckia dup extragerea antioxidanilor
pentru sinteza nanoparticulelor de argint
Unul dintre cele mai moderne aspecte ale nanotehnologiilor este sinteza biologic a
nanoparticulelor proces, ce nu implic medii i reageni toxici, este prietenos mediului i ofer
posibiliti considerabile de a lrgi domeniile lor de aplicare prin introducere n consumul uman
i animal. Cele mai studiate nanoparticule sunt cele provenite din metale nobile, nanoparticulele
de metal fiind testate i aplicate n tiina materialelor, fizic, chimie, electronic,
optoelectronic, medicin si biochimie. Nanoparticulele de argint sunt cunoscute pentru
105

proprietile lor de a fi inerte i, n special, de a nu interaciona cu oxigenul molecular. n special


acestea sunt apreciate pentru proprietile lor dezinfectante i antimicrobiene, efectul antiviral,
imunomodulator i capacitatea de a stopa procesul de malignizare a esuturilor afectate.
Sinteza nanoparticulelor cu compoziie, dimensiuni i form determinat este una din cele
mai importante sarcini ale nanotehnologiei [116]. n prezent gama metodelor, care permit de a
obine nanoparticule de argint (AgNP) este destul de larg. Printre acestea putem numra:
metoda de sintez chimic, electrochimic, radiaia, metoda fotochimic i sinteza biologic [87,
109, 166, 178, 253, 255]. Bionanosinteza poate fi realizat n foarte multe variante, n special n
funcie de materialul biologic utilizat n proces. Pentru biosinteza nanoparticulelor metalice sunt
utilizate n special diferite specii de microorganisme, caracterizare prin rat de cretere nalt i
deci, prin eficien nalt n procesele biosintetice. Diferite tulpini de fungi filamentoi realizeaz
biosinteza preferenial pe suprafaa miceliului. De asemenea este intens studiat capacitatea de
bionanosintez a drojdiilor, actinomicetelor, diferitor specii de bacterii la care nanobiosinteza are
loc att pe suprafaa celulelor, ct i n interiorul lor [116].
Plantele prezint o enorm perspectiv pentru bionanosintez, n special datorit unei
varieti largi de metabolii cum ar fi flavonoizii, cetonele, terpenoizii, aldehidele, amidele i
acizii carboxilici, care se pot include n procesul de bioreducere, care de fapt i determin
biosinteza nanoparticulelor metalice, inclusiv a celor de argint. Printre avantajele invocate de
susintorii acestor obiecte pentru bionanosintez sunt: disponibilitatea lor, lipsa potenialului
patogen, sinteza rapid, colectarea simpl. Printre speciile de plante cu ajutorul crora a fost deja
realizat biosinteza AgNP sunt Cinnammum camphora, Aloe vera, Cycas, Jatropha curcas,
Magnifera indica, Syzygium aromaticum [24, 40, 110, 132, 133, 186]. Fiind apropiate de plante
prin capacitatea de a realiza fotosinteza, cianobacteriile prezint i ele nanofabrici potrivite
pentru obinerea nanoparticulelor metalice. Fiind dotate cu sisteme enzimatice oxido-reductoare
performante, aceste obiecte realizeaz cu uurin reaciile, care stau la baza proceselor de
nanosintez a particulelor, inclusiv a celor de argint. Aciunea antibacterian a nanoparticulelor
de argint depinde n mare msur de dimensiunea, forma i stabilitatea nanoparticulelor [155].
Astfel, activitatea antibacterian crete odat cu micorarea dimensiunilor nanoparticulelor.
Agregarea particulelor sintetizate duce la reducerea considerabil a activitii acestora. Rata
formrii intracelulare a nanoparticulelor precum i dimensiunea acestora poate fi dirijat prin
modificarea condiiilor n care are loc acest proces, cum ar fi modificarea pH-lui mediului de
reacie, temperaturii, concentraia diferitor substraturi, timpul de contact al biomasei cu soluia
reactant .a. Acelai principiu de manipulare a formei i dimensiunilor nanoparticulelor obinute
prin biosintez poate fi aplicat i n cazul sintezei extracelulare a acestora [81].
106

Scopul cercetrilor efectuate la aceast etap de lucru a constat n obinerea biomasei de


nostoc i realizarea experienei de evideniere a procesului de biosintez a nanoparticulelor de
argint de ctre aceast cultur.

Pentru realizarea bionanosintezei a fost utilizat biomasa

rezidual dup extragerea componentelor antioxidante. n calitate de precursor pentru biosinteza


nanoparticulelor de argint a fost utilizat soluia standard de AgNO3 cu concentraia de 100mg/L.
Amestecul reactant s-a preparat din 10 ml biomas rezidual standardizat (50 mg/ml) i
100 ml soluie standard de azotat de argint. Incubarea sistemului reactant plasat pe un agitator
orbital setat la 200 rotaii/min, la temperatura camerei timp de 72 ore. Prelevarea probelor de
biomas pentru aprecierea procesului de biosintez a nanoparticulelor i de monitorizare a
modificrilor biochimice n biomas au fost efectuate la 24, 48 i 72 ore de la nceputul
experienei. Pentru a stabili modificrile n concentraia argintului n soluie produse dup 24,
48 i 72 ore de interaciune cu nitratul de a argint a fost aplicat metoda spectrometriei atomice
de absorbie (AAS), iar modificarea coninutului de argint n biomas a fost apreciat prin
aplicarea metodei de analiz de activare cu neutroni (NAA). Aceste cercetri au fost realizate la
Institutul Unificat de Cercetri Nucleare din Dubna, Rusia n cadrul unui acord de colaborare
ntre aceast instituie i Institutul de Microbiologie i Biotehnologie al Academiei de tiine a
Moldovei. Rezultatele obinute au fost comparate cu rezultatele obinute pentru biomasa nativ
obinut ntr-un ciclu de experiene anterioare realizate n laboratorul Ficobiotehnologie [36].
Pentru a monitoriza concentraia argintului n mixul reactant, din acesta s-au prelevat probe
imediat dup prepararea soluiei de contact i dup intervalele stabilite de 24 ore, 48 i 72 ore.
Prelevarea iniial este necesar, din cauz c, concentraia argintului n soluie nu va fi cea de
100 mg/l, deoarece o parte din argint este sedimentat de ionii Cl- reziduali, iar alta se fixeaz la
contactul imediat am biomasei cu soluia de azotat de argint. Rezultatele obinute n comparaie
cu datele pentru biomasa nativ sunt date n Tabelul 4.4.
Rezultatele obinute arat, c cantitatea de argint n soluie scade pe parcursul primelor 24
de ore i rmne constant pn la sfritul experienei, att n experiena efectuat cu utilizarea
biomasei native, ct i cu reziduul de biomas rmas dup extragerea principiilor bioactive.
Totodat, concentraia argintului n biomasa de nostoc crete, modificrile principale n
coninutul argintului producndu-se n primele 24 ore de interaciune cu nitratul de argint.
rezultatele obinute n experiena cu reziduul de biomas sunt mai nalte comparativ cu biomasa
nativ. Acest lucru se datoreaz faptului, c n procesul de extragere are loc activarea site-urilor
active de pe suprafaa peretelui celular care se produce prin eliminarea particulelor fixate pe siteurile, care pot realiza aceast fixare.

107

Tabelul 4.4. Modificarea coninutului de argint n soluia reactant i n biomas pe


durata biosintezei nanoparticulelor
Concentraia argintului
Soluie, mg/L

Condiiile
experienei

Biomas, mg/g

Iniial

24 ore

48 ore

72 ore

Iniial

24 ore

48 ore

Biomas nativ +
soluie AgNO3 [36]

60,50,2

23,30,9

23,03,0

23,60,4

6,00,9

43,50,7

44,93,1 45,22,2

Biomas rezidual
+ soluie AgNO3

64,01,1

15,30,8

14,61,7

14,70,6

6,51.0

48,92,6

49,61,4 50,7 0,9

72 ore

Prin urmare, se poate rezuma c concentraia argintului crete n biomas n prima zi a


contactului cu sursa de argint, iar explicaiile pot fi urmtoarele: n prima faz, numit rapid
ionii de argint sunt absorbii prin implicarea grupurilor funcionale active astfel ca: amino,
carboxil, sulfhidril, fosfat i tiolice care leag metalul.
Este cunoscut faptul, c nanoparticulele de argint posed absorbie specific n diapazonul
lungimilor de und de 420-440 nm, de aceea n calitate de test primar al procesului de sintez a
nanoparticulelor de argint n probele prelevate au fost nregistrate spectrele de absorbie, care
sunt prezentate n Figura 4.13.
Pe spectrele obinute se vede clar maximum-ul de absorbie aprut suplimentar n zona
specific nanoparticulelor (indicat cu sgei). De asemenea, se mai observ mrirea intensitii
acestui pic. Formarea nanoparticulelor poate fi determinat de asemenea de modificarea culorii
culturii. La contactul biomasei de nostoc cu soluia de azotat de argint s-a modificat culoarea

Absorbana, uniti

mixului format dintre biomas i soluia de azotat de argint din verde-brun n brun-glbui.

Fig. 4.13. Spectrele de absorbie a probelor de biomas prelevate la 24, 48 i 72 ore de


la nceputul experienei.

108

Probele de biomas de nostoc au fost supuse vizualizrii cu aplicarea metodei microscopiei


electronice de baleiaj. n Figura 4.14 sunt prezentate imaginile, care demonstreaz formarea
conglomeratelor de nanoparticule de argint pe suprafaa celulelor. Trihoamele de nostoc sunt
nconjurate de un strat de exopolizaharide, care poate rmne legat covalent cu structurile
membranei citoplasmatice, ori poate fi splat n mediul extracelular n dependen de condiiile
create. Anume acest strat este gazda conglomeratelor de nanoparticule metalice.

Fig. 4.14. Conglomerate de nanoparticule de argint situate extracelular pe suprafaa


capsulei polizaharidice la Nostoc linckia.
De asemenea, pentru a investiga mostrele de biomas de nostoc cu Ag NP a fost aplicat
metoda de difracie cu raze X. n Figura 4.15. este prezentat difractograma paternului de
nanoparticule sintetizate de ctre Nostoc linckia, procesate conform metodei Rietveld.

Fig. 4.15. Difractograma paternului de nanoparticule de argint n biomasa de nostoc.


Difractograma demonstreaz prezena cristalelor de argint de form cilindric cu
parametrii structurii de 4.0980.004, caracteristic argintului. Rezultatele obinute arat clar c
nanoparticulele de argint formate prin reducerea ionilor de Ag (I) sunt de natur cristalin.

109

Astfel, la concentraia soluiei de azotat de argint de 100 mg/L utilizate pentru procesul de
sintez a nanoparticulelor de ctre cianobacteria Nostoc linckia mrimea nanopraticulelor care
sunt cilindrice este de 4-5 nm. Generaliznd datele referitoare la modificarea coninutului de
argint n biomasa rezidual de nostoc i n amestecul reactant soluie de azotat de
argint+biomas rezidual, celor de spectrometrie i microscopie electronice de baleiaj se poate
afirma cu siguran, c biomasa rezidual de Nostoc linckia rmas dup extragerea produselor
cu proprieti antioxidante este o matrice potrivit pentru producerea nanoparticulelor de argint.
Nanoparticulele obinute prin procedura de biosintez cu utilizarea biomasei reziduale de nostoc
pot fi folosite att n stare pur, ct i n componena biomasei. Utilizarea nanoparticulelor n
stare pur presupune extragerea i purificarea lor, ceea ce implic cheltuieli suplimentare.
n linii generale, rezultatele obinute indic asupra posibilitii utilizrii biomasei reziduale
de Nostoc linckia dup extragerea componentelor antioxidante n calitate de matrice pentru
sinteza nanoparticulelor de argint. Timpul optimal de contact al reziduului cu soluia ce conine
ionii de argint este de 24 de ore, deoarece n continuare nu mai are loc acapararea argintului din
mediu.
4.3. Utilizarea biomasei reziduale de Nostoc linckia n calitate de biosorbent
Biosorbia este un proces rapid i reversibil de recuperare a metalelor din soluii, care
amintete adsorbia ori chiar schimbul de ioni [79]. ncepnd cu anii 90 ai secolului trecut
biosorbia ncepe a fi recunoscut drept metod biologic tiinific argumentat de epurare a
apelor reziduale, util n special pentru recuperarea metalelor grele din soluii diluate. Primele
lucrri n acest domeniu au fost consacrate selectrii materialelor biologice cu proprieti de
biosorbent. Unele tipuri de biosorbeni, cum ar fi biomasa de cianobacterii, alge, mucegaiuri,
drojdii, bacterii pot lega cantiti foarte mari de poluani din mediu, n unele cazuri de pn la
50% sau chiar egale cu greutatea biomasei [248]. Unii biosorbeni pot lega i colecta o gam
larg de metale grele fr prioriti specifice, n timp ce alii posed specificitate pentru anumite
tipuri de metale. n calitate de biosorbeni poate fi utilizat biomasa rezidual a proceselor
industriale, biomasa organismelor disponibile n cantiti mari n natur; i biomasa
organismelor cu cretere rapid, n special cultivate n scopuri concrete. n exemplele de mai sus
cheltuielile pentru obinerea unui biosorbent eficient sunt minimale, ceea ce asigur un interes
practic fa de biosorbie.
Procesul de biosorbie al metalelor implic faza solid materialul biologic i faza lichid
apa cu poluanii dizolvai n ea. Fixarea ionilor metalici are loc prin mai multe ci: prin
adsorbie, schimbul de ioni; complexarea ionilor cu componentele biomasei, atracia
110

electrostatic sau microprecipitarea. Adsorbia fizic a poluanilor, n special a metalelor cu


sarcin pozitiv, are loc prin implicarea unor interaciuni intermoleculare (van der Waals forces)
fr formarea legturilor chimice. Acest mecanism are o contribuie modest n procesul de
biosorbie i elimin doar o mic parte a metalelor din soluii [45, 259]. Schimbul de ioni se
produce prin nlocuirea unor ioni mobili de alii (de exemplu cei metalici) cu aceeai sarcin.
Schimbul de cationi are loc n biopolimeri, iar cele mai convenabile grupuri funcionale, capabile
s formeze legturi cu acetia sunt grupurile carboxil, fosfaii organici, sulfaii organici.
Schimbul de anioni n biopolimeri pot avea loc pe variate grupuri organice cu coninut de azot.
n structura proteinelor aminogrupurile, grupurile imidazol i guanidina sunt centre cu sarcin
pozitiv. Rolul acestui mecanism poate fi demonstrat prin mai multe exemple. Astfel n cazul
interaciunii succesive a biosorbentului cu soluiile diferitor metale, indiferent de ordinea n care
acestea se succed, o parte a metalului care a interacionat primul este rentoars n soluie, atunci
cnd sorbentul ntr n contact cu al doilea metal. Acest lucru este posibil doar n condiiile unui
schimb de ioni [183, 259]. Efectul pozitiv al pretratrii biosorbentului cu acid asupra capacitii
de biosorbie a metalelor este de asemenea o dovad a rolului schimbului de ioni n acest proces
[159]. Formarea compuilor compleci ai metalelor complexarea - se produce prin legarea lor
cu grupurile funcionale ale membranei celulare, peretelui celular i capsulei. Acest proces are
loc prin formarea unui complex din pri componente mai simple. n cazul metalocomplexelor,
una dintre componentele participante este un ion metalic. Atunci cnd ntre ionul metalic i
grupurile vecine se formeaz legturi covalente structura format este un compus coordinativ al
metalului cu componentele celulare [165].
Un alt proces implicat n recuperarea metalelor din soluiile apoase este precipitarea.
Venind n contact cu metalele toxice microorganismele pot reaciona prin formarea unor
compui specifici (ca de exemplu metionina, fitochelatinele .a) [219]. Precipitarea de asemenea
mai poate fi cauzat i de interaciunea ntre metale i compuii prezeni pe suprafaa celulelor.
n dependen de tipul de biomas care acioneaz ca biosorbent n procesul de biosorbie
poate fi inclus oricare din mecanismele menionate independent ori n paralel. Toate
mecanismele descrise mai sus pot avea loc simultan, completndu-se reciproc i asigurnd
eficiena procesului de acumulare a ionilor metalici din soluii.
Deoarece procesul de biosorbie este realizat de biomasa moart/inactiv, acesta are loc
extracelular. n acest caz grupurile funcionale anionice prezente n peptidoglicanul, fosfolipidele
i lipopolizaharidele cianobacteriilor sunt componentele primare responsabile pentru caracterul
anionic al procesului de legare a ionilor metalici pe peretele celular. Exopolizaharidele care

111

formeaz capsula celular la bacterii abund de grupri funcionale anionice, datorit crora sunt
considerate factori de chelare pentru recuperarea ionilor din soluiile hidrice [55, 214, 217].
Factorii determinani ce afecteaz biosorbia sunt concentraia iniial a metalelor,
temperatura, pH-ul i concentraia biomasei n soluie. Temperatura nu influeneaz biosorbia
dac variaz n limitele 20-350C. Unul din factorii determinani ai procesului de biosorbie este
pH-ul, care influeneaz activitatea grupelor funcionale ale biomasei i competiia ionilor
metalici [107, 199, 247.
Modificarea pH-ului duce la substituirea cationilor pe site-urile active i afecteaz gradul
de ionizare a biomasei de spirulin n timpul biosorbiei. Mediul acid, pH=1,5, faciliteaz
absorbia practic total a Cr(VI) din mediu de ctre biomasa de spirulin, 50% din cantitatea
cromului fiind absorbit n primele minute de contact a biomasei cu metalul [85]. Biomasa
cianobacteriei Nostoc muscorum acumuleaz cromul la pH-ul= 3 [95]. Pentru Cr(III), condiia
optimal pentru sorbia lui de ctre biomasa de spirulin este pH=6. De pH-ul soluiei depinde i
biosorbia Ag(I) n biomasa de spirulin, astfel, la pH=8,6 constanta biosorbiei o depete pe
cea determinat pentru pH=5,5, iar capacitatea de biosorbie este de 1,5 ori mai mare [80].
Biosorbia rapid a plumbului pn la 74%, are loc n primele 12 min, apoi n 24 ore ajunge la
concentraia de 95% a ionilor adsorbii. nlturarea mai eficient a ionilor de plumb din mediu
(<81,18%) i crom (<98,8%) are loc la t=45oC, pH=4 i pH=2, respectiv. Biosorbia plumbului
depinde de concentraia lui n soluie i de pH, astfel, concomitent cu creterea concentraiei
metalului scade capacitatea de absorbie. pH-ul determin activitatea grupelor funcionale n
procesul sorbiei Cu2+, Cd2+ i Cr3+ n biomasa de spirulin. Astfel pH 25 faciliteaz activitatea
grupurilor carboxil; pH 59 a grupurilor carboxil i grupurilor fosfate i pH 912 a
grupurilor carboxil, fosfate i hidroxilice (or aminice).
Activitatea i prezena gruprilor funcionale depinde n mare msur de condiiile de
obinere a biomasei. Astfel a fost demonstrat eficiena net superioar a biomasei obinute n
condiii fotoautotrofe de a fixa ionii de Cu2+, Cd2+ i Cr3+ [45]. Tot pentru Cd a fost demonstrat
ca o condiie optim de fixare a ionilor n biomasa de spirulin este pH-ul de 7,0, cnd n primele
5 min se acumuleaz 78% metal. La Spirulina platensis i Aphanothece flocculosa sorbia
ionilor de mercur are loc la pH-ul=6,0. Prezena ionilor de Co2+, ,Ni2+ i Fe3+ faciliteaz sorbia
mercurului n biomasa cianobacteriilor. Biosorbia Pb2+ n celul este un proces rapid, ionii fiind
adsorbii la suprafaa celulei [50, 86]. Asimilarea rapid a metalelor grele de ctre celulele vii
este foarte semnificativ atunci cnd celulele sunt implicate n procesele de bioremediere [43].
Procesul de sorbie depinde n mare msur de raportul dintre concentraia metalului i
coninutul de biomas. Astfel, Spirulina platensis n concentraia de 1-2 g/l absoarbe eficient
112

cadmiul din soluia cu concentraia metalului 100-200 mg/l, iar pentru 4 g biomas fac fa unei
concentraii a metalului de 600-800 mg/l [225, 226]. Concentraia cromului de 141.96 mg/l este
fixat complet de cantitatea de 2,45 g/L biomas de spirulin, iar pentru fixarea a 100 mg Cr(VI)
este nevoie de 2,4 g biomas de spirulin [85].
Este foarte important tipul de biomas selectat pentru procesul de biosorbie. Forma
rehidratat a biomasei de spirulin este superioar formei uscate de biomas n sorbia Cr(III)
[145] i Cu(II) [226]. Biosorbia metalelor este strns dependent de tipul ionilor metalici,
numrul de sarcini, afinitatea i legturile cu acest metal. Statutul biomasei, tipul biomaterialelor,
proprietile metalelor, condiiile mediului ambiant, pH-ul, toate influeneaz mecanismul
biosorbiei metalelor. Ionii metalelor legate pe suprafa pot fi nlocuii cu ali ioni, ageni de
chelatare sau acizi, ceea ce face posibil reciclarea biosorbentului i utilizarea lui repetat.
Astfel, biosorbia metalelor de ctre diferite tipuri de biomasa prezint un fenomen cu nalt
potenial de aplicare n tehnologiile de biopurificare i bioremediere a mediului, n special a
apelor contaminate.
4.3.1. Utilizarea biomasei reziduale de nostoc n calitate de biosorbent pentru purificarea
apelor reziduale contaminate cu crom i nichel.
Cromul i nichelul nimeresc n mediul nconjurtor din mai multe procese tehnologice, aa
ca mineritul, industriile de rafinare, industria de galvanizare, industria de prelucrare a pielii,
conservarea lemnului, producerea de oel inoxidabil, aliaje i catalizatori. Cromul este un
poluant metalic care persist n mediul acvatic n cea mai mare parte n form hexavalent [Cr
(VI)] i trivalent [Cr (III)]. Cromul hexavalent este foarte solubil n ap i carcinogenic pentru
om. Nichelul este un element esenial pentru om i animale, datorit importanei sale n cile
metabolice. Dei, acesta este un micronutrient i / sau cofactor esenial, nichelul este unul dintre
cele mai toxice metale grele la concentraie mare i este un cancerigen uman bine-cunoscut [95].
Scopul cercetrilor, rezultatele crora sunt prezentate n continuare a constituit stabilirea
capacitii de biosorbie a biomasei reziduale de Nostoc linckia comparativ cu biomasa nativ
fa de crom i nichel, dar i fa de microcomponentele metalice prezente n apele reziduale.
Experienele au fost efectuate n colaborare cu cercettorii Institutului Unificat de Cercetri
Nucleare, Dubna. Apele reziduale utilizate n cercetare au fost colectate de la Asociaia
tiinific de producere ATOM din Dubna. Primul tip de ape contaminate predominant cu crom
conineau acest metal n cantitate de 9,4 mg/L, iar cel de-al doilea tip de ape, contaminate cu
nichel, conineau metalul n cantitate de 14,1 mg/L. Au fost efectuate dou serii de experiene
cu biomas nativ de nostoc i cu biomas rezidual obinut dup extragerea principiilor
113

antioxidante din ea [264]. n ambele cazuri condiiile de lucru au fost urmtoarele. 25 ml


biomas de nostoc (cu concentraia de 6,5 g/L) s-au introdus n baloane de sticl cu volumul de
250 ml, care conineau 100 ml ape reziduale. Baloanele s-au plasat pe agitator orbital setat la
100 rotaii per minut. Probele au fost colectate la 5, 15 i 30 min de contact. Biomasa a fost
centrifugat, dup care a fost determinat nivelul de metale n ea. Determinarea metalelor n
biomas a fost efectuat de ctre colegii din Dubna cu aplicarea metodei de analiz
multielemental cu activarea neutronilor. Rezultatele obinute pentru apele reziduale cu coninut
nalt de crom sunt prezentate n Tabelul 4.5.
Tabelul 4.5. Coninutul elementelor n biomasa nativ i rezidual de nostoc n
dependen de timpul de contact cu apele reziduale ce conin crom
Coninutul
elementului n
biomas, g/g
Cr
Fe
Ni
Zn
K
Cr
Fe
Ni
Zn
K

0; Martor

Timpul de contact, min


5 min
15 min

Biomasa nativ (Zinicovscaia 2014)


12.51.3
74556
80667
159 11
990 69
967 67
50 4.5
260 23
300 27
9.3 0.8
70 6.3
80 7.2
213002532
3777447
3500420
Biomasa rezidual
10.52.3
81267
82682
150 33
1016 64
1088 34
32 3
295 33
345 43
6.8 1.1
76 4.2
85 2.2
4501436
4334276
4409328

30 min
79833
937 65
303 27
82 7.3
2906348
83023
1100 45
348 47
92 3.7
4396284

Din rezultatele prezentate n tabel se observ, c ambele tipuri de biomas sunt biosorbeni
eficieni pentru crom. Coninutul cromului n biomasa de nostoc este foarte nensemnat i
constituie 12,5 g/g de biomas nativ i 10,5 g/g de reziduu de biomas. n primele 5 min de
contact al biomasei cu apele reziduale ce conin crom concentraia acestui metal n biomasa
nativ crete de 59,6 ori iar n cea rezidual de 80 ori. Prolongarea timpului de contact al
biomasei cu soluia metalic n ambele cazuri este ineficient, deoarece cantitatea metalului nu
mai crete n continuare. Merit a fi menionat faptul, c nici procesul de desorbie la contactul
de durat nu are loc. Aceasta sugereaz concluzia, c biomasa de nostoc reine eficient i stabil
cromul n componena sa i deci, ar putea fi un biosorbent eficient pentru ape reziduale de acest
tip. Analiza chimic a apelor reziduale utilizate n experiene a artat, c acestea mai conin de
asemenea i cantiti considerabile de fier, nichel i zinc,
114

cantitatea crora a fost i ea

monitorizat n cadrul experienelor de biosorbie. Rezultatele obinute demonstreaz, c n


paralel cu cromul din ape, biomasa nativ i rezidual de nostoc acumuleaz activ i aceste 3
metale. Astfel n biomasa rezidual de nostoc dup 5 min de contact cu apele reziduale ce conin
crom, concentraia de fier crete de 6,8 ori, cantitatea de Ni de 9,2 ori, iar cea de zinc de 11,2
ori fa de aceeai biomas pn la contactul ei cu poluanii.
Astfel, biomasa rezidual de Nostoc linckia acioneaz n calitate de biosorbent pentru
metalele grele practic identic cu biomasa nativ utilizat n acelai scop, ceea ce este foarte
important n tehnologiile de producere a antioxidanilor, oferind o soluie foarte convenabil de
utilizare a materialelor secundare, care de fapt, constituie deeuri ale producerii. Diferenele
evidente care sunt observate n aceste dou cazuri se refer la coninutul de potasiu n biomas,
cantitatea cruia n biomasa nativ este de 5 ori mai mare ca n cea rezidual. Acest fapt are
explicaie foarte simpl, deoarece acest element este tipic pentru celulele vii, fiind concentrat n
ele pentru a asigura potenialul membranar. Odat cu moartea celulelor, pompele membranare i
nceteaz activitatea, ceea ce duce la eliberarea potasiului n mediu.
Acelai tip de cercetare a fost realizat i pentru apele reziduale contaminate preponderent
cu nichel. Rezultatele obinute sunt prezentate n Tabelul 4.6.
Tabelul 4.6. Coninutul elementelor n biomasa nativ i rezidual de nostoc n
dependen de timpul de contact cu apele reziduale ce conin nichel
Coninutul
elementului n
biomas, g/g
Ni
Fe
Cr
Zn
K
Ni
Fe
Cr
Zn
K

0; Martor

Timpul de contact, min


5 min
15 min

Biomasa nativ (Zinicovscaia 2014)


50 4.5
65223
69632
159 11
490 19
512 27
12,5 1.3
48.6 2.3
52.4 3.1
9.3 0.8
82 4.5
86 6.5
213002532
3623507
3700518
Biomasa rezidual
32,0 3,0
70822
72639
150 33
512 31
520 2
10,5 3
54 2,4
56 4,6
6.8 1.1
79 4.3
84 5.2
4501436
4505316
4475353

30 min
70128
520 26
52.3 2.8
88 7.0
3226451
73054
534 43
60 3,7
88 1.7
4507291

Datele din tabel demonstreaz, c att biomasa nativ, ct i cea rezidual de nostoc
acumuleaz activ pe durata primelor 5 minute de contact cu metalele grele. Astfel, n biomasa
nativ concentraia nichelului crete de 13,8 ori, iar n cea rezidual de 22,1 ori. De asemenea,
n biomasa de nostoc crete i concentraia celorlalte elemente monitorizate pe durata
115

experienei. n biomasa rezidual coninutul de fier cterte de 3,4 ori, cel de crom de 5,1 ori, iar
cel de zinc de 11,6 ori.
Generaliznd rezultatele analizate mai sus putem concluziona, c biomasa rezidual de
Nostoc linckia, obinut n rezultatul extragerii componentelor antioxidante, este un biosorbent
eficient pentru crom i nichel din apele reziduale contaminate cu metale grele. n paralel,
biomasa acumuleaz i alte elemente poluante prezente n soluia de contact. Pornind de la
faptul, c biosorbia n general este un proces biotehnologic ieftin, i innd cont, c n acest
subcapitol noi propunem utilizarea biomasei reziduale, care de fapt este un deeu al producerii de
baz, putem afirma, c o asemenea utilizare a nostocului este foarte rentabil pentru includere n
calitate de element al tehnologiilor de bioremediere a mediilor acvatice poluate cu metale grele.
4.3.2. Bioacumularea microcomponentelor metalice din soluii polimetalice
n cadrul proiectului bilateral Bioacumularea si recuperarea microcomponentelor metalice
din lamul rezultat la solubilizarea alcalin a uraniului din minereu, cu ajutorul cianobacteriilor
si microalgelor a fost studiat capacitatea culturilor de microalge i cianobacterii de a acumula
ionii uranil din reziduurile industriei de prelucrare a minereului uranifer. n paralel a fost studiat
compoziia complex a apelor i a fost stabilit, c acestea, suplimentar la elementele radioactive
mai conin i metale simple n cantiti ce depesc substanial dozele maximal admisibile. n
cadrul proiectului au fost elaborate tehnologii de utilizare a biomasei native a microalgelor i
cianobacteriilor pentru recuperarea microcomponentelor metalice din aceste ape. Pornind de la
faptul, c procesul de biosorbie este pur chimic, de scurt durat i poate derula att pe culturi
vii, ct i pe material organic neviu, n acest compartiment al lucrrii am decis s evalum
capacitatea de biosorbie a reziduului de biomas de nostoc rmas dup extragerea
componentelor bioactive cu efect antioxidant n soluii polimetalice, ce simuleaz dup
componen apele rezultate de la solubilizarea alcalin a uraniului. Variantele experimentale au
coninut doar soluiile srurilor de metale, n care metalele sunt prezente n cantiti echivalente
celor, care au fost determinate n condiii reale.
Au fost efectuate experiene n care a fost modificat durata de contact a biomasei
reziduale cu soluia, ce conine microcomponente metalice. Contactul ntre soluiile studiate i
biomasa de nostoc a fost realizat prin adugare la soluia de cercetat a biomasei reziduale de
nostoc n cantitate de 10 g biomas absolut uscat la un litru de soluie de cercetat. Dup
expirarea timpului de contact biomasa rezidual de nostoc a fost separat de soluia reactant.
Pentru a determina cantitatea de fier, 5g prob supus cercetrii s-a trecut ntr-un balon
cotat cu capacitatea de 10 ml, dizolvat n 5 ml ap, volumul s-a adus la cot cu ap i s-a
116

amestecat. 0,25 ml soluie obinut s-a trecut ntr-un pahar Berzelius din sticl termorezistent i
s-a adugat 0,5 ml de soluie HClO4 de 57 % i 0,25ml de HNO3 concentrat, dup care s-a
nclzit la baia de nisip la o temperatur de 135 0C timp de 2-3 ore, pn cnd soluia a devenit
transparent. Pentru a oxida Fe(II) n Fe(III), la soluia mineralizat s-a adugat

0,2ml HCl

concentrat, 0,1 ml HNO3 concentrat i 0,05 ml H2O2 de 30% i s-a amestecat. La proba oxidat
s-au adugat 3,0 ml soluie de HCl (1:1) i 1,0 ml soluie KSCN(20%) i s-au amestecat. Soluia
colorat n rou s-a citit la spectofotometru la lungimea de und 495nm.
Cantitatea de Fe n preparat s-a determinat conform formulei :
% Fe= (Ax *0,053)/(m1-W)*100% ,

(10)

unde: Ax- absorbana soluiei de cercetat; m- masa preparatului, g; W- pierderea n mas la


uscare,%; 0,053 coeficient de recalcul a cantitii de fier, obinut din curba de calibrare.
Construirea curbei de calibrare. ntr-o serie de baloane cotate cu volumul de 10 ml s-au
luat de la 0,25-3,5 ml soluie standard de (NH4)2FeSO4*6H2O ce conine Fe 0,02 mg/ml i s-au
adugat cte 3,0 ml soluie de HCl(1:1) i 1,0 ml soluie de KSCN de 20% i s-au amestecat. S-a
restabilit volumul soluiei din fiecare balon cotat, dup care densitatea optic a probelor a fost
determinat la lungimea de und de 495 nm.
Pentru a determina cantitatea de zinc, biomasa rezidual de nostoc s-a resuspendat n ap
distilat pn la concentraia final a biomasei de 10 g/l. Masa celular s-a supus dezintegrrii
prin aciunea ultrasunetului la o frecven de 22 kHz, timp de 30 sec de 4 ori. ntr-un pahar
Berzelius din sticl termorezistent s-au luat 0,1 ml de biomas dezintegrat, la care s-a adugat
0,1 ml de soluie HClO4 de 57 % i 0,1 ml de HNO3 concentrat, apoi s-a nclzit la baia de nisip
la o temperatur de 135 0C timp de 80 min, pn cnd soluia a devenit transparent. Dup rcire
la temperatura camerei proba s-a adus la un volum de 1 ml. Dup, la 1 ml de soluie supus cercetrii
s-a adugat n scopul separrii zincului de ceilali cationi prezeni n soluie 2 ml soluie de
mascare constituit din: tampon acetat tiosulfat (se prepar prin adugarea la 1 ml soluie
tampon acetat 2M cu pH 5 a 25 ml soluie de tiosulfat de sodiu de concentraie 50%). Dup ce sa amestecat, s-a adugat 2 ml soluie de ditizon n tetraclorura de carbon de 510

M cu

coninut de ionol de 0.15% cu rol de agent de solubilizare pentru ditizon n tetraclorura de


carbon. Proba s-a agitat timp de un minut, dup ce faza organic de culoare rou-aprins s-a
separat i citit la spectrofotometru utiliznd lungimile de und, respectiv: 538 nm pentru
ditizonatul de zinc i 620 nm pentru ditizon pur (pondere de participare). Utilizarea celor dou
lungimi de und: maximumul de la 538 nm i cel de la 620 nm pentru stabilirea ponderii de
participare a ditizonei a permis determinarea ditizonatului de zinc mpreun cu ditizona.
Calculul cantitii de zinc (mg/% ) s-a efectuat n baza relaiei:
117

CZn(mg%) =[ Aextract - KAextract ]100 /33,3m


538

(11)

620

unde: Aextract - este densitatea optic a extractului la lungimea de und 538 nm;
538

Aextract - este densitatea optic a extractului la lungimea de und 620 nm;


620

K este constanta ce reprezint raportul dintre densitatea optic la 538 nm i 620 nm


pentru ditizon pur (ponderea de participare ); 33,3 - este coeficientul de recalcul al cantitii de
zinc, determinat din valorile seriei de diluii ale soluiei-etalon de zinc n 0,3NHCl ce conine
zinc n concentraia de 10mcg/cm3, preparat dintr-o soluie ZnCl2 de 0,01%; m masa probei
luat pentru determinare n g.
Pentru a determina cantitatea de crom, ntr-o retort Kjieldalh de 100cm3 s-au luat 0,5
ml biomas cu concentraia de 10 g/dm, dezintegrat n prealabil sub aciunea ultrasunetului de
22 kh/min, timp de 5 min., la care s-au adugat 0,5 ml soluie HClO4 57% i 0,25 ml soluie
HNO3 concentrat apoi s-au supus mineralizrii pe baia de nisip la o temperatur de 135 timp de
20-30 min. pn cnd soluia a devenit transparent, nclzirea a fost continuat nc 5-10 min
pn la evaporarea complet a soluiei. Restul uscat s-a dizolvat n 10 ml n soluie (NH4)2S2O8
de 0,2%, s-a adugat 1, 2 picturi soluie H2SO4 i s-a fiert pe baia de ap timp de 30 min. Apoi
s-au adugat 0,2 ml soluie H2SO4 2N, 0,2 ml soluie 0,1% difenilcarbazid n alcool etilic de
96% i s-a agitat bine. Dup 15 min soluia colorat n roz-violet

a fost determinat

spectrofotometric la lungimea de und 540 nm n cuve de 10 mm. Calculul cantitii de Cr n


mg/ml s-a efectuat dup formula:
C=A540 k

(12)

unde: A - absorbana probei la 540 nm; k - coeficientul de recalcul a cantitii de crom


determinat din curba de etalonare, utiliznd K2Cr2O7 n calitate etalon.
Cantitatea de cupru s-a determinat prin reacia de formare a compusului complex a
cuprului cu reactivul dietilditiocarbamat de natriu de culoare galben. La 25 ml prob (care
conine mai puin de 0, l mg cupru) s-au adugat consecutiv: 8,0 ml citrat de natriu (50%); 1,25
ml trilon B (3%); 2,5 ml NH4OH (25%); 0,63 ml gelatin (0,5%) (proaspt pregtit); 2,5 ml
dietilditiocarbamat de natriu (0,1%). Dup s-a determinat densitatea optic la 453 nm. Cantitatea
de cupru s-a determinat dup curba de calibrare.
Acumularea fierului (III) n biomasa rezidual de nostoc n dependen de perioada de
contact poate fi urmrit pe Figura 4.16, n care bioacumularea este exprimat n procent din
valoarea maximal obinut n seria dat de experiene.

118

Din imagine se observ, c pe durata a primelor 5 min de contact a biomasei cu soluia ce


conine metale, are loc o cretere constant a prii de metal absorbit de ctre biomas. Valoarea
maximal a fierului acumulat n biomas se atinge la 15 min de contact cu biomasa rezidual de
nostoc. Contactul de mai departe a biomasei reziduale de nostoc cu soluia hidric cu coninut de

Gradul de retenie, %
dun valoare maximal

metale.
Biosorbia Fe(III)
100
80
60
40
20
0
0

15
30
Timpul de contact, minute

40

50

Fig. 4.16. Biosorbia Fe(III) n biomasa rezidual de nostoc n dependen de timpul de


contact cu soluia de simulare.
Sorbia zincului se produce aproximativ la fel ca i acumularea fierului. Astfel, durata
creterii lente a cantitii de zinc adsorbit de biomasa rezidual de nostoc este de 5 min.
Cantitatea maximal a zincului acumulat nregistrndu-se la 15 min de contact cu biomasa

Gradul de retenie, % dun


valoare maximal

rezidual de nostoc (Figura 4.17).


Bioacumularea Zn(II)
100
80
60
40
20
0
0

10

15
30
Timpul de contact, minute

40

50

Fig. 4.17. Biosorbia Zn(II) n biomasa rezidual de nostoc n dependen de timpul de


contact cu soluia de simulare.
Graficul care reflect procesul de biosorbie a cromului (III) este asemntor ca form cu
cel care reflect biosorbia fierului i zincului, maximul de retenie fiind nregistrat la 15 min
contact cu biomasa rezidual de nostoc (Figura 4.18).
119

Gradul de retenie, %
dun valoare maximal

Bioacumularea Cr(III)
100
80
60
40
20
0
0

15
30
Timpul de contact, minute

40

50

Fig. 4.18. Biosorbia Cr(III) n biomasa rezidual de nostoc n funcie de timpul de


contact cu soluia de simulare.
Biosorbia cromului de ctre biomasa rezidual de nostoc atinge valoarea maximal deja la
15 min de contact i se prezint a fi la fel de eficient ca i bioacumularea elementelor studiate
anterior la contactul de scurt durat cu nostocul.
Procesul de biosorbie a Cu(II) este reflectat pe Figura 4.19.

Gradul de retenie, % dun


valoare maximal

Bioacumularea Cu(II)
100
80
60
40
20
0
0

15
30
Timpul de contact, minute

40

50

Fig. 4.19. Biosorbia Cu(II) n biomasa rezidual de nostoc n dependen de timpul de


contact cu soluia de simulare.
Astfel, procesul de recuperare a ionilor de Cu2+ decurge mai lent, comparativ cu alte
microelemente metalice studiate, atingnd maximul de intensitate la 30 min de la punerea n
contact a soluiei cercetate cu biomasa de nostoc.
Din datele Tabelului 4.7, se poate deduce c cel mai nalt nivel de retenie se determin,
pentru Cu(II). Pentru acest element biomasa rezidual de nostoc asigur acumularea a circa 90%
din cantitatea prezent n soluia reactant, la timpul de contact de 15-30 min.
120

Tabelul 4.7. Coninutul de metale n soluie pn la i dup contactul cu biomasa


rezidual de nostoc
Concentraia

Concentraia

Nivelul de

Timpul util de

iniial, mg/l

final, mg/l

recuperare, %

contact, min

Fe(III)

3190322

1238215

61,2

15

Zn(II)

88,62,2

24,201,9

72,7

15

Cr(III)

75,84,3

23,402,4

69,1

15

Cu(II)

148,424,6

20,840,2

85,9

30

Metalul

n baza rezultatelor obinute a fost elaborat un regulament de recuperare a


microcomponentelor metalice din soluii hidrice, care include dou etape:

Obinerea biomasei reziduale;

Recuperarea microcomponentelor metalice prin contactul direct al

biomasei

reziduale de Nostoc linckia cu soluia ce conine microcomponentele metalice.


Contactul ntre soluiile contaminate i biomasa rezidual de nostoc se face prin adugare
la soluia contaminat a biomasei reziduale de nostoc n cantitate de 10g biomas absolut uscat
la un litru de soluie. Timpul de contact este de 30 min, deoarece el asigur o retenie maximal a
fierului (III), zincului (II), cromului (III) i a cuprului (II). Dup expirarea timpului de contact
biomasa de nostoc se filtreaz.
Aa dar, procedeul de bioacumulare i recuperare a microcomponentelor metalice de
biomas rezidual de Nostoc linckia, asigur conform regulamentului elaborat, acumularea n
biomas a 61,2% din fier (III), 72,7% din zinc (II), 69,1% din crom (III) i 85,9% din cupru (II)
prezente n soluia contaminat.

4.4. Tehnologia complex de cultivare a cianobacteriei Nostoc linckia, de obinere a


preparatelor antioxidante i de utilizare a reziduului de biomas
Rezultatele investigaiilor expuse n aceast lucrare au permis a integra toate
componentele i operaiunile tehnologice ntr-un flux tehnologic complex de cultivare a
cianobacteriei Nostoc linckia, de obinere a preparatelor antioxidante din biomasa acesteea i de
utilizare a reziduului de biomas.
Componenta tehnologica principal n cadrul fluxului tehnologic integrat elaborat este
redat de procedeele de cultivare a cianobacteriei Nostoc linckia care permit obinerea cantitii
maximale de biomas cu un statut antioxidant nalt. n expunerea rezultatelor acestei lucrri s-a
121

demonstrat c atingerea acestui obiectiv este posibil datorit utilizrii unor compui
coordinativi

noi:

1-(8,13-Biciclohomofarnesenoil)-3-amino-1,2,4-triazol

N-(8,13-

biciclohomofarnesenoilamino) carbazol, [Fe(H2L1)(H2O)2](NO3)31.5H2O (unde L1 - hidrazida


acidului izonicotinic) i [Fe(H2L2)(H2O)2](NO3)35H2O (unde L2 - hidrazida acidului
inicotinic), compui care suplimentai la mediul de cultivare al nostocului asigur creterea
potenialului antioxidant al biomasei acestei cianobacterii.
Cea de a doua component a fluxului tehnologic este redat de etapele de obinere din
biomasa de nostoc cu un potenial antioxidant nalt a noilor preparatelor antioxidante. Aceste
etape includ extragerea componentelor antioxidante din biomas, standardizarea i condiionarea
preparatelor NostocAntiOx-1, NostocAntiOx-2, NostocAntiOx-3 i NostocAntiOx-4.
Cea de a treia component tehnologic reprezint biomasa rezidual care rezult din
primele dou etape tehnologice de obinere a biomasei i a complexelor antioxidante i
constituie un agent eficace de purificare a apelor reziduale cu coninut de metale, asigurnd
recuperarea componentelor metalice: fier (III), zinc (II), crom (III) i cupru (II), precum i o
matrice conform pentru biosinteza nanoparticulelor de argint.
Astfel, rezumativ principiile tehnologice care asigur eficacitatea acestor etape sunt:
Utilizarea n calitate de productor a tulpinii cianobacteriei Nostoc linckia CNM-CB-03.
Mediul nutritiv pentru cultivarea tulpinii cianobacteriei Nostoc linckia CNM-CB-03 care
asigur necesitile fiziologice a culturii pentru o cretere i dezvoltare i respectiv, producere
bun de biomas cianobacterian;
Aplicarea metodelor de intensificare a statutului antioxidant al biomasei cianobacteriei
Nostoc linckia CNM-CB-03 prin utilizarea

compusului 1-(8,13-Biciclohomofarnesenoil)-3-

amino-1,2,4-triazol

n cantitate de 0,05-0,06mg/l; a compusului N-(8,13-biciclohomo-

farnesenoilamino)

carbazol

cantitate

de

0,06-0,1mg/L;

compusului

[Fe(H2L )(H2O)2](NO3)31.5H2O (unde L1 - hidrazida acidului izonicotinic) n cantitate de 15


mg/L i a compusului [Fe(H2L2)(H2O)2](NO3)35H2O (unde L2 - hidrazida acidului inicotinic),
n cantitate de 20 mg/L.
Caracteristica productorului: Cianobacteria Nostoc linckia (Roth) Born. et Flah. CNMCB-03 formeaz trihomi rectilinii sau curbai, solitari sau reunii n mnunchiuri flotante, iar pe
mediul agarizat formeaz colonii gelatinoase n care trihomii sunt dispui dens sau lax. Trihomii
sunt nconjurai de o teac mucilaginoas incolor. Celulele vegetative au form de butoiae cu
lungimea de 4,0-5,0, de culoare albastr - verzuie cu nuan cafenie slab pronunat. Sunt
prezeni heterocitii, de obicei intercalari, mai rar terminali, solitari, aproape sferici, de 6,5-7,5
122

n diametru. Se nmulete prin spori, hormogonii i fragmentarea trihomilor. Se reproduc nu


numai indivizii maturi, dar i reprezentanii aflai la etapele intermediare de dezvoltare,
formarea achinetelor observndu-se chiar i n mugurii tineri ai hormogoniilor. nmugurirea
achinetelor provoac un nou ciclu de dezvoltare, care poate demara imediat sau dup o perioad
de repaos. Tulpina poate fi pstrat i pe mediul mineral lichid la o iluminare de zi i la
temperatura camerei, reinocularea culturii efectundu-se peste 2 luni. Biomasa uscat de Nostoc
linckia (Roth), cultivat pe mediul Gromov 6, conine protein 15-25%, polizaharide 3550%, ficoeritrin 2,0-4,0%, ficocianin 0,5-1.0%, aloficocianin 0,5-1,0%, lipide 2%,
caroten 0,2-0,4%, xantofile -0,4-0,7%.
Etapele de producere a biomasei de nostoc i de obinere a preparatelor antioxidante sunt
redate grafic de Figurile 4.20 i 4.21. Etapele procesului de recuperare a microcomponentelor
metalice prin utilizarea biomasei reziduale de Nostoc linckia rezultat din primele dou etape de
producere a biomasei i a preparatelor antioxidante sunt redate grafic de Figura 4.22.
Astfel, etapele tehnologice de producere a biomasei de nostoc, de extragere a complexului
antioxidant se deruleaz n succesiunea urmtoare:
1. Procesul tehnologic de cultivare a cianobacteriei Nostoc linckia n scopul obinerii
biomasei cu un statut antioxidant nalt include realizarea procedurilor operaionale:
Prepararea mediului nutritiv MN-1cu urmtoarea compoziie: macroelemente: g/l: KNO3
1,0, K2HPO4 0,2, MgSO47H2O 0,2, CaCl2 0,15, NaHCO3 0,2; microelemente, mg/l:
soluia 1- ZnSO47H2O 0,22, MnSO4 1,81, CuSO45H2O 0,079, soluia 2 - NaBO34H2O
2,63, (NH4)6Mo7O244H2O 1,0, Fe SO47H2O 9,3, CaCl2 1,2, Co(NO3) 2H2O 0,02,
EDTA 10,0. 0,05; MnSO45H2O-0,3; H3BO3-0,6; MoO3-0,02. n cazul compuilor 1-2
compusul cu fier se exclude.
Introducerea vectorilor de cretere a potenialului antioxidant al biomasei:
1.

compusul coordinativ 1-(8,13-Biciclohomofarnesenoil)-3-amino-1,2,4-triazol

cantitate de 0,050-0,060mg/l suplimentat n prima zi de cultivare;


2.

compusul N-(8,13-biciclohomo-farnesenoilamino) carbazol n cantitate de 0,06-

0,1mg/l adugat n prima zi de cultivare;


3.

compusul

[Fe(H2L1)(H2O)2](NO3)31.5H2O

(unde

L1

hidrazida

acidului

izonicotinic) n cantitate de 15 mg/L adugat n prima zi de cultivare;


4.

compusul [Fe(H2L2)(H2O)2](NO3)35H2O (unde L2 - hidrazida acidului inicotinic), n

cantitate de 20 mg/L adugat n prima zi de cultivare.


Inocularea suspensiei de nostoc n concentraie de 0,20-0,30g/l recalcul la biomas
absolut uscat;
123

Cultivarea nostocului n fotobioreactor cu

capacitatea de 50L volum cultur

cianobacterian cu meninerea parametrilor: temperatura 20-250C, iluminarea constant


2000-3000 lx i pH-ul-6,8-7,2;
Separarea culturii de nostoc de mediul de cultur cu obinerea biomasei i standardizarea
ei la concentraia de 50g/l.
2. Procesul tehnologic de obinere a preparatelor antioxidante NostocAntiOx-1 i
NostocAntiOx-2 din biomasa de nostoc include realizarea procedurilor operaionale:

Adugarea la biomasa de nostoc a principiului extractant de componente antioxidante:


alcool etilic de 70% n raport de 1:2v/v;

Extragerea complexului de componente antioxidante din biomasa de nostoc prin agitare


timp de 6 ore la ntuneric;

Centrifugarea complexului hidro-etanolic la 3000 rot/min timp de 15 min;

Colectarea complexului hidro-etanolic de componente antioxidante;

Standardizarea complexului hidro-etanolic la concentraia de 1,0%;

Condiionarea complexului hidro-etanolic de componente antioxidante;

Liofilizarea complexului de componente antioxidante.


n rezultatul acestor dou procese tehnologice se obin dou noi preparate antioxidante:

preparatul NostocAntiOx-1 cu o capacitate de inhibiie a radicalului DPPH la nivelul de 6067% i preparatul NostocAntiOx-2 cu o capacitate de inhibiie a radicalului DPPH la nivelul
de 71-76%.
3. Procesul tehnologic de obinere a preparatelor antioxidante NostocAntiOx-3 i
NostocAntiOx-4 din biomasa de nostoc include realizarea procedurilor operaionale:
Congelarea-decongelarea repetat a biomasei de nostoc n scopul facilitrii extragerii hidrice
a componentelor antioxidante
Adugarea la biomasa de nostoc a principiului extractant de componente antioxidante: ap
distilat n raport de 1:2v/v;
Extragerea antioxidanilor din biomasa de nostoc prin agitare timp de 6 ore la ntuneric;
Centrifugarea complexului hidric de la 3000 rot/min timp de 15 min;
Colectarea complexului hidric de componente antioxidante;
Standardizarea complexului hidric de componente antioxidante la concentraia de 1,0%;
Condiionarea complexului hidric de componente antioxidante;
Liofilizarea complexului de componente antioxidante.

124

n rezultatul acestor dou procese tehnologice se obin dou noi preparate antioxidante:
preparatul NostocAntiOx-3 cu o capacitate de inhibiie a radicalului cation ABTS la nivelul
de 80-83% i preparatul NostocAntiOx-4 cu o capacitate de inhibiie a radicalului cation
ABTS la nivelul de 90-95%.
4. Procesul tehnologic de recuperare a microcomponentelor metalice prin utilizarea
biomasei reziduale de Nostoc linckia include realizarea procedurilor operaionale.
Prepararea sistemului reactant: biomas + soluie reactant prin adugarea reieind din
cantitatea de 10g biomas rezidual absolut uscat a 1,0 litru de soluie reactant;
Meninerea contactului maxim al biomasei reziduale de nostoc cu soluia reactant prin
agitare timp de 30 min;
Separarea reziduului de biomas de soluia reactant prin centrifugare ori filtrare;
Controlul calitii filtratului i deversarea n caz de necorespundere normelor sanitare sau
recuperare repetat n caz contrar.
Respectarea condiiilor tehnologice a procesului asigur un randament de recuperare la
nivelul a 61,2% din fier (III), 72,7% din zinc (II), 69,1% din crom (III) i 85,9% din cupru (II)
5. Procesul tehnologic de biosintez a nanoparticulelor de argint utiliznd n calitate
de matrice bomasa rezidual de nostoc include:
Standardizarea biomasei reziduale la concentraia de 50 mg/ml;
Prepararea soluiei standard de AgNO3 cu concentraia de 100mg/L.
Prepararea sistemului reactant de contact: soluie de AgNO3 + biomas de nostoc. La 10
ml biomas standardizat se adaug 100 ml soluie standard de azotat de argint.
Incubarea sistemului reactant plasat pe un agitator orbital setat la viteza de rotaie de 200
rotaii/min, la temperatura camerei timp de 24 ore;
Prelevarea probelor de biomas pentru aprecierea procesului de biosintez a
nanoparticulelor prin nregistrarea spectrului de absorbie.
Separarea biomasei reziduale cu nanoparticule prin centrifugare i stocarea ei pentru
utilizarea ulterioar.

125

Cianobacteria Nostoc linckia CNM-CB-03


I. Obinerea biomasei de nostoc cu un statut antioxidant nalt
1-(8,13Biciclohomofarneseno
il)-3-amino-1,2,4triazol
0,050-0,060g/L
1-a zi de cultivare

Prepararea mediului nutritiv MN-1:


macroelemente: g/l: KNO3 1,0, K2HPO4 0,2,
MgSO47H2O 0,2, CaCl2 0,15, NaHCO3 0,2;
microelemente, mg/l: ZnSO47H2O 0,22, MnSO4
1,81, CuSO45H2O 0,079, NaBO34H2O 2,63,
(NH4)6Mo7O244H2O 1,0, Fe SO47H2O 9,3,
CaCl2 1,2, Co(NO3) 2H2O 0,02, EDTA 10,0.
0,05; MnSO45H2O-0,3; H3BO3-0,6; MoO3-0,02.

N-(8,13biciclohomofarnesen
oilamino) carbazol
0,060-0,100g/L
1-a zi de cultivare

Inocularea suspensiei de nostoc:


0,20-0,30g/L BAU
Parametri: temperatura 20-25oC, iluminarea constant 37-55moli fotoni/m2/s;
pH = 6,8-7,2
Biomasa de nostoc materie prim
pentru obinerea preparatelor antioxidante
II. Obinerea preparatelor antioxidante
Adugarea la biomasa de nostoc a alcoolului etilic de 70% (1:2v/v)

Extragerea complexului de componente antioxidante prin agitare timp


de 6 ore la ntuneric
Centrifugarea amestecului biomas + alcool etilic de 70% la 3000
rot/min timp de 15 min

Colectarea extractului hidro-etanolic antioxidant


Standardizarea extractului hidro-etanolic antioxidant
Condiionarea extractului hidro-etanolic n flacoane

Liofilizarea extractului hidro-etanolic

Preparatul NostocAntiOx-1:
60-67 %inhibiie DPPH

Preparatul NostocAntiOx-2:
71-76%inhibiie DPPH

Fig. 4.20. Schema realizrii tehnologiei complexe de cultivare a cianobacteriei Nostoc linckia
i de obinere a preparatelor antioxidante NostocAntiOx-1 i NostocAntiOx-2.

126

Cianobacteria Nostoc linckia CNM-CB-03


I. Obinerea biomasei de nostoc cu un statut antioxidant nalt
[Fe(H2L1)(H2O)2]
(NO3)31.5H2O (unde
L1 - hidrazida acidului
izonicotinic) n
cantitate de 15 mg/L
1-a zi de cultivare

Prepararea mediului nutritiv MN-1:


macroelemente: g/l: KNO3 1,0, K2HPO4 0,2,
MgSO47H2O 0,2, CaCl2 0,15, NaHCO3 0,2;
microelemente, mg/l: ZnSO47H2O 0,22, MnSO4
1,81, CuSO45H2O 0,079, NaBO34H2O 2,63,
(NH4)6Mo7O244H2O 1,0, CaCl2 1,2, Co(NO3)
2H2O 0,02, EDTA 10,0. 0,05; MnSO45H2O0,3; H3BO3-0,6; MoO3-0,02.

[Fe(H2L2)(H2O)2](NO
3)35H2O (unde L2 hidrazida acidului
inicotinic), n
cantitate de 20 mg/L
1-a zi de cultivare

Inocularea suspensiei de nostoc:


0,20-0,30g/L BAU
Parametri: temperatura 20-25oC, iluminarea constant 37-55moli fotoni/m2/s;
pH = 6,8-7,2
Biomasa de nostoc materie prim
pentru obinerea preparatelor antioxidante
II. Obinerea preparatelor antioxidante
Adugarea la biomasa de nostoc a apei distilate (1:2v/v)

Extragerea complexului de componente antioxidante prin agitare timp


de 6 ore la ntuneric
Centrifugarea amestecului biomas + ap distilat la 3000 rot/min timp
de 15 min

Colectarea extractului hidric antioxidant


Standardizarea extractului hidric antioxidant
Condiionarea extractului hidric n flacoane
Liofilizarea extractului hidric

Preparatul NostocAntiOx-3:
+
80-83 % inhibiie ABTS

Preparatul NostocAntiOx-4:
+
90-95% inhibiie ABTS

Fig. 4.21. Schema realizrii tehnologiei complexe de cultivare a cianobacteriei Nostoc linckia
i de obinere a preparatelor antioxidante NostocAntiOx-3 i NostocAntiOx-4.

127

Cianobacteria Nostoc linckia CNMN-CB-03


Soluie ce conine
microcomponente
metalice

RECUPERAREA
MICROCOMPONENTELOR

METALICE

Reziduu de biomas
rezultat din tehnologia de
obinere a preparatelor
antioxidante

Ape reziduale de diferit


provenien;
Soluii de simulare n cazul
experienelor model

Prepararea sistemului reactant: biomas +soluie reactant


10g biomas absolut uscat + 1,0 litru de soluie reactant

Recuperarea microcomponentelor metalice:


Parametri: Durata de contact a componentelor sistemului reactant- 30 min
Reziduu biomas de nostoc: recuperare a 61,2% din fier (III), 72,7% din zinc (II), 69,1% din
crom (III) i 85,9% din cupru (II)
Fig. 4.22. Schema realizrii procesului de recuperare a metalelor din lamul rezultat la
solubilizarea alcalin a uraniului prin aplicarea oxidrii preventive.

4.4. Concluzii la capitolul 4


1. Compuii fierului cu bazele Shiff care au n componena ligandului hidrazidele acidului
nicotinic i izonicotinic asigur o cretere semnificativ a activitii antioxidante a biomasei,
aceasta, n mare msur, determinat de sporirea coninutului de ficobiliproteine, care
constituie una din componentele majore ori chiar dominante a extractului hidric din biomasa
de nostoc.
2. Proprietile noilor compui 1-(8,13-Biciclohomofarnesenoil)-3-amino-1,2,4-triazolul i N(8,13-biciclohomofarnesenoil-amino)carbazolul prezint interes pentru biotehnologie n
calitate de stimulatori ai activitii antioxidante a biomasei cianobacteriei Nostoc linckia,
mrind activitatea antioxidant (extract hidro-etanolic) de 2,11-2,73 ori fa de martor.
3. Biomasa rezidual de Nostoc linckia obinut dup extragerea componentelor antioxidante
poate fi utilizat n calitate de matrice pentru sinteza nanoparticulelor de argint.
128

4. Biomasa rezidual de Nostoc linckia, obinut n rezultatul extragerii componentelor


antioxidante, este un biosorbent eficient pentru crom i nichel din apele reziduale
contaminate cu aceste metale grele.
5. Biomasa rezidual a cianobacteriei Nostoc linckia, obinut n rezultatul tehnologiilor de
obinere a complexelor antioxidante se prezint n calitate de agent de purificare a apelor
reziduale cu coninut de metale, asigurnd acumularea n biomas a 61,2% din fier (III),
72,7% din zinc (II), 69,1% din crom (III) i 85,9% din cupru (II).
6. Cele 4 noi preparate antioxidante: NostocAntiOx-1, NostocAntiOx-2, NostocAntiOx-3 i
NostocAntiOx-4 se obin conform unei biotehnologii originale complexe i promoveaz o
capacitate de inhibiie nalt a radicalilor liberi.

129

CONCLUZII GENERALE I RECOMANDRI


Realizarea cercetrilor i analiza rezultatelor obinute n cadrul tezei de doctor
Biotehnologia cultivrii sursei de antioxidani cianobacteria Nostoc linckia au condus la
formularea urmtoarelor concluzii:
1.

Modificrile cantitative ale principalelor componente ale biomasei de nostoc pe durata

ciclului vital se nscriu n limite destul de restrnse, ceea ce caracterizeaz Nostoc linckia ca o
cultur cu grad ridicat al homeostaziei, ceea ce uureaz semnificativ manipularea culturii n
condiii industriale i simplific procedurile din cadrul tehnologiilor aplicate.
2.

Cei mai stabili parametri pentru cultura de nostoc n condiii de laborator se obin la

nceputul fazei staionare. Aceast perioad se caracterizeaz prin cel mai nalt nivel al biomasei,
cea mai stabil activitate antiradicalic i antioxidant i nivel jos al dialdehidei malonice, de
aceea este recomandat pentru colectarea biomasei n scopul obinerii preparatelor antioxidante
cu un grad nalt de siguran.
3.

Extractele hidrice i hidro-etanolice cu coninut sczut de etanol din biomasa de nostoc

se caracterizeaz prin activitate antiradicalic pronunat, iar stabilitatea lor poate fi asigurat de
cantiti minime de trolox ori acid ascorbic.
4.

Stabilitatea extractelor hidro-etanoloce cu coninut nalt de etanol poate fi asigurat

prin aplicarea tocoferolului.


5.

Complexul antioxidant obinut prin extragere etanolic din biomasa de nostoc are

capacitatea de a proteja uleiurile vegetale (n special de in i porumb) de oxidarea agresiv,


indus de condiiile de pstrare. Implicarea componentelor antioxidante din biomasa de nostoc n
procesul de protecie oxidativ este susinut de testele antioxidante nespecifice care au
demonstrat creterea activitii antioxidante a uleiurilor vegetale suplimentate cu complex
antioxidant din nostoc.
6.

Cultura de Nostoc linckia se caracterizeaz printr-un prag nalt de sensibilitate la

aciunea xenobioticelor, de aceea modificarea statutului antioxidant al biomasei poate fi realizat


prin influena unor compui cu potenial toxic nalt.
7.

Compuii fierului cu bazele Shiff care au n componena ligandului hidrazidele

acidului nicotinic i izonicotinic asigur o cretere semnificativ a activitii antioxidante a


biomasei, aceasta, n mare msur, determinat de sporirea coninutului de ficobiliproteine, care
constituie una din componentele majore ori chiar dominante a extractului hidric din biomasa de
nostoc.
8.

Proprietile noilor compui

1-(8,13-Biciclohomofarnesenoil)-3-amino-1,2,4-triazol

i N-(8,13-biciclohomofarnesenoil-amino)carbazolul prezint interes pentru biotehnologia


130

cianobacteriei Nostoc linckia n calitate de stimulatori al activitii antioxidante a biomasei,


mrind activitatea antioxidant a extractului hidro-etanolic de 2,11-2,73 ori fa de martor.
9.

Biomasa rezidual de Nostoc linckia, poate fi utilizat n calitate de matrice pentru

procesul de biosintez a nanoparticulelor de argint i ca biosorbent eficient pentru metalele grele


n sisteme policomponente, ceea ce ofer soluii originale pentru realizarea tehnologiilor de
remediere a mediului ambiant.
10. Tehnologia complex de cultivare a cianobacteriei Nostoc linckia este bazat pe
cunoaterea i aplicarea particularitilor i necesitilor specifice ale culturii, componentele ce
asigur obinerea preparatelor antioxidante i este orientat spre siguran i stabilitate, iar
componentele de utilizare a biomasei reziduale n scopul bioremedierii mediului transform
aceast tehnologie n una durabil i prietenoas mediului.
Problema tiinific important soluionat n lucrare const n identificarea
elementelor-cheie a procesului biotehnologic de cultivare a cianobacteriei Nostoc linckia cu
scopul producerii preparatelor cu efect antioxidant i valorificrii reziduului de biomas.
Aportul personal: n materialele care reflect coninutul brevetelor de invenie autoarei i
revine cota parte n corespundere cu lista autorilor. Toate celelalte rezultatele obinute, analiza
lor, generalizrile i concluziile aparin autoarei.
Recomandri practice
1.

Se recomand utilizarea cianobacteriei Nostoc linckia n calitate de surs ieftin i

sigur de substane cu efect antioxidant.


2.

Se recomand utilizarea biomasei reziduale de nostoc, rmas de la extragerea

antioxidanilor n calitate de biosorbent eficient pentru metalele grele i ca matrice pentru sinteza
nanoparticulelor de argint.
3.

Se recomand utilizarea preparatelor elaborate pentru prevenirea rncezirii uleiurilor

vegetale preioase.
Sugestii privind cercetri de perspectiv
1.

Este oportun de a realiza testarea in vivo a aciunii preparatelor antioxidante i

antiradicalice elaborate.
2.

Este indicat elaborarea preparatelor n baza polizaharidelor sulfatate din biomasa de

Nostoc linckia

131

BIBLIOGRAFIE
1.

2.

3.

4.

5.
6.

7.
8.
9.
10.

11.

12.
13.
14.

Brevet de invenie MD 4253 C1, MD, C07F15/06. Sulfato-bis(nicotinoilhidrazon)-2,6diacetilpiridin-cobalt(II) monometanol trihidrat i procedeu de cultivare a microalgei
Porphyridium cruentum cu utilizarea acestuia / Rudic V., Danilescu O., Bulhac I., Cepoi
L., Rudi L., Bologa O., Rija A., Miscu V., Chiriac T., Valua A. (MD). Cererea depus
11.05.2012, BOPI nr.10/2013.
Brevet de invenie MD 4326 B1, MD, C07D 209/86. Compusul N-( D 8,13 biciclohomofarnesenoilamino)carbazol i procedeu de cultivare a cianobacteriei Nostoc
linckia cu utilizarea acestuia / Cucicova C., Rudic V., Arcu A., Cepoi L., Rudi L., Secara
E., Valua A., Barb A., Miscu V., Vlad P., Chiriac T. (MD). Cererea depus 22.10.2013,
Brevet de invenie MD 4327 B1, MD, C07D 249/14. Compusul 1-( D 8,13 biciclohomofarnesenoil)-3-amino-1,2,4-triazol i procedeu de cultivare a cianobacteriei
Nostoc linckia cu utilizarea acestuia / Cucicova C., Rudic V., Arcu A., Cepoi L., Rudi L.,
Secara E., Valua A., Barb A., Miscu V., Chiriac T. (MD). Cererea depus 22.10.2013.
Brevet de invenie MD 146 Z, MD, C12N 1/12. Procedeu de extragere a astaxantinei din
biomasa de Haematococcus pluvialis. Brevet/ Miscu V., Cepoi L., Rudi L., Cojocari A.,
Rudic V. (MD) Cererea depus 09.09.2009.
Cepoi L. Pigmenii fotosintetici la Porphyridium cruentum n condiii de stres oxidativ
indus. In: Academos. 2014, vol. 4(35), p.116-120.
Cepoi, L. Statutul antioxidant n corelare cu componena biochimic a biomasei unor
microalge n condiii de tehnologii intensive. In: V International Conference Actual
Problems in Modern Phycology. Chiinu, Moldova, November 3-5, 2014, p. 30-37.
Costache T. A. Investigarea potenialului de utilizare a populaiei autohtone de microalge
pentru obinerea de biocombustibili: Rezumatul tezei de doctorat. Bucureti 2013, 32 p.
Iaco Iu. Tehnologii de obinere a preparatelor lipidice din biomasa algei verzi Dunaliella
salina: Autoref. tezei dr. t. biologice. Chiinu, 2012, 29 p.
Miscu V. Biotehnologii de obinere a preparatelor pe baz de astaxantin din
Haematococcus pluvialis: Autoref. tezei dr. t. biologice. Chiinu, 2010, 28 p.
Rudi L., Cepoi L., Miscu V., Chiriac T., Valua A., Djur S., Sadovnic D., Rudic V.
Determinarea dependenei corelaionale dintre valorile testului ABTS i coninutul de
carotenoizi n extractele etanolice din biomasa algei verzi Haematococcus pluvialis. n:
Buletinul Academiei de tiine a Moldovei. tiinele vieii. 2013, nr.3(321), p. 146-153.
Rudi L., Cepoi L., Miscu V., Chiriac T., Valua A., Codreanu S., Sadovnic D., Rudic V.
Producerea de biomas i carotenoizi de ctre alga verde Haematococcus pluvialis pe
durata ciclului vital sub influena metalocomplexelor Co (II) cu bazele Schiff. n: Buletinul
AM, tiinele vieii. 2014, nr. 2 (323), p.163-171.
Rudic V. i alii. Ficobiotehnologie-cercetri fundamentale i realizri practice. Chiinu:
Elena V.I., 2007. 364 p.
Rudic V., i alii. Evaluarea capacitii unor remedii naturiste de a contracara oxidarea
lipidelor in vitro. In: Medicina alternativ. 2010, vol.15, p.16-24.
Sadovnic D., Cepoi L., Rudi L., Valua A., Chiriac T., Codreanu S., Miscu V., Cojocari
A. Activitatea antioxidant a preparatului etanolic n baza biomasei de Porhyridium

132

15.

16.

17.

18.
19.
20.
21.

22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.

31.

cruentum. In: V International Conference Actual Problems in Modern Phycology.


Chiinu, Moldova, November 3-5, 2014, p. 89-94.
Sadovnic D. Tehnologii de obinere a preparatelor antioxidante i antiradicalice din
biomasa algei roii Porphyridium cruentum CNM-AR-01. Tez de dr. n biologie. Chiinu,
2014, 159 p.
Valua A. Activitatea antioxidant a extractelor etanolice din biomasa cianobacteriei
Nostoc linckia CNM CB-03. n: Buletinul Academiei de tiine a Moldovei. tiinele
vieii. 2014, nr. 1(322), p. 133-139.
Valua A. Activitatea antiradicalic a extractelor din cianobacteria Nostoc linckia pe
durata ciclului vital. n: Buletinul Academiei de tiine a Moldovei. tiinele vieii. 2013,
nr. 3(322), p.154-167.
Abdulqader G. et al. Arthrospira platensis from lake Kossorom (Chad) and its household
usage among the Kanembu. In: J. Appl. Phycol. 2000, Vol. 12, p. 493498.
Acien F. G., Fernandez Sevilla J.M., Molina Grima E. Photobioreactors for the production
of microalgae. In: Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 2013, vol.12, p.131-151.
Acien F.G. et al. Production cost of a real microalgae production plant and strategies to
reduce it. In: Biotechnol. Adv. 2012, vol. 30, nr. 6, p. 13441353.
Asan-Ozusaglam M., Cakmak Y.S., Kaya M. Bioactivity and Antioxidant Capacity of
Anabaenopsis sp. (Cyanobacteria) Extracts. In: J. Algal Biomass Utln. 2013, vol.4, nr. 3, p.
5058.
Astadi I. et al. In vitro antioxidant activity of anthocyanins of black soybean seed coat in
human low density lipoprotein (LDL). In: Food Chemistry. 2009, vol.112, p. 659-663.
Balazy M., Nigam S. Aging, lipid modifications and phospholipasesNew concepts. In:
Ageing Research Reviews. 2003, vol. 2, p. 209291.
Bar H., et al. Green synthesis of silver nanoparticles using latex of Jatropha curcas. In:
Colloids Surf. A. 2009, vol. 339, p. 134139.
Becker E.W. Microalgae: biotechnology and microbiology. Cambridge University Press,
1994. 293 p.
Behera B.C. et al. Determination of antioxidative potential of lichen Usnea ghattensis in
vitro. In: LWT. 2006, vol. 39, p. 80-85.
Borowitzka M.A. High-value products from microalgaetheir development and
commercialisation. In: J Appl Phycol. 2013, vol. 2, p.743756.
Brand-Williams W., Cuvelier M. E., Berset C. Use of a free radical method to evaluate
antioxidant activity. In: Lebensmittel-Wissenschaft and Technologies. 1995, vol. 28, p. 25-30.
Bremus Ch., et al. The use of microorganisms in L-ascorbic acid production. In: Journal of
Biotechnology. 2006, vol. 124, p. 196205.
Brito D., et al. Biomass and pigments production of the mixed culture of microalgae
(Hyaloraphidium contortum and Chlorella vulgaris ) by cultivation in media based on
commercial fertilizer. In: The Annals of the University Dunarea de Jos of Galati. 2013,
Fascicle VI Food Technology, vol. 37, nr.1, p. 85-97.
Brown G. C., Borutaite V. Inhibition of mitochondrial respiratory complex I by nitric
oxide, peroxynitrite and S-nitrosothiols. In: Biochimica et Biophysica Acta, 2004, vol.
1658, p. 4449.

133

32.

33.

34.

35.

36.

37.

38.
39.

40.
41.

42.

43.
44.
45.

46.
47.

Carballo-Cardenas E.C. et al. Vitamin E (a-tocopherol) production by the marine


microalgae Dunaliella tertiolecta and Tetraselmis suecica in batch cultivation. In:
Biomolecular Engineering. 2003, vol. 20, p. 139 147
Carocho M. et al. A Review on Anti- oxidants, Prooxidants and Related Controversy:
Natural and synthetic compounds. Screening and Analysis Methodologies and Future
Perspectives. In: Food and Chemical Toxicology. 2013, vol. 51, p. 15-25.
Cepoi L. et al. Antioxidative activity of ethanol extracts from Spirulina platensis and
Nostoc linckia measured by various methods. In: Analele Universitii din Oradea,
Fascicula Biologie. 2009, Tom XVI/2, p. 43-48.
Cepoi L. Antioxidant Activity in Haematococcus pluvialis Cells During the Vital Cycle.
In: International Scientific Conference on Microbial Biotechnology(2nd edition). Chiinu,
Moldova, October 9-10, 2014, p. 25-28.
Cepoi L., Zinicovscaia I., Rudi L., Chiriac T., Valuta A., Duca Gh., Kirkesali E.
Biochemical changes in cyanobacteria during the synthesis of silver nanoparticles. In:
Canadian Journal of Microbiology. 2015, vol. 61, nr. 1, p.13-21.
Cha K. et al. Optimization of Pressurized Liquid Ex- traction of Carotenoids and
Chlorophylls from Chlorella vulgaris. In: Journal of Agricultural and Food Chemistry.
2010, vol. 58, nr. 2, pp. 793-797.
Chabrol E., Charonnet R. Une novelle reaction pour letude des lipides. In: Presse Med.
1937, vol. 45, p. 1713-1714.
Chacon T.L., Gonzalez-Marino G.E. Microalgae for Healthy food possibilities and
chal-lenges. In: Comprehensive reviews in food sciences and food safety. 2010, vol. 9, p.
655-675.
Chandra P.S., et al. Synthesis of gold nanotriangles and silver nanoparticles using Aloe
vera plant extract. In: Biotechnol. Progr. 2006, vol. 22, p. 577583.
Chang C.J. et al. A novel phycobiliprotein alleviates allergic airway inflammation by
modulating immune responses. In: American Journal of Respiratory and Critical Care
Medicine. 2011, vol. 183, p. 15-25.
Cheirsilp B., Torpee S. Enhanced growth and lipid production of microalgae under
mixotrophic culture condition: Effect of light intensity, glucose concentration and fedbatch cultivation. In: Bioresource Technology. 2012, vol. 110, p. 510516.
Chen H, Pan S. Bioremediation potential of spirulina: toxicity and biosorption studies of
lead. In: J Zhejiang Univ. 2005, vol. 6B, nr. 3, p.171-174.
Chen H., Jiang J.G. Osmotic responses of Dunaliella to the changes of salinity. In: J. Cell.
Physiol. 2009, vol. 219, p. 251258.
Chojnacka K., Chojnacka A., Gorecka H. Biosorption of Cr3+, Cd2+ and Cu2+ ions by blue
green algae Spirulina sp.: kinetics, equilibrium and the mechanism of the process. In:
Chemosphere. 2005, vol. 59. p. 7584.
Choochote W., Suklampoo L., Ochaikul D. Evaluation of antioxidant capacities of green
microalgae. In: Journal of Applied Phycology. 2013, vol. 26, nr. 1, p. 43-48.
Christaki E. et al. Functional Properties of Carotenoids Originating from Algae. In: Journal
of the Science of Food and Agriculture. 2013, vol. 93, nr. 1, p. 5-11.

134

48.

49.

50.
51.
52.
53.

54.

55.

56.
57.
58.
59.

60.
61.

62.

63.

Cifuentes A.S. et al. Reappraisal of physiological attributes of nine strains of Dunaliella


(Chlorophyceae): growth and pigment content across a salinity gradient. In: Journal of
Phycology. 2001, vol. 37, p. 334344.
Clapco S. et al. The effect of some metal complexes of oxime ligands on proteolytic
activity of Fusarium gibbosum CNMN FD 12 strain. In: Analele Universitii din Oradea,
Fascicula Biologie, 2013, Tom XX/1, p. 53-58.
Converti A., Lodi A., Solisio C. Spirulina platensis biomass as adsorbent for copper
removal. In: Ciencia y Tecnologia Alimentaria. 2005, vol. 5, nr. 002, p. 85-88.
Cornish M.L., Garbary D.J. Antioxidants from macroalgae: potential application in human
health and nutrition. In: Algae. 2010, vol. 25, nr.4, p. 155-171.
Cysewski G.R. Commercial production of Spirulina. In: 2nd Algae World. Brussels,
Belgium, 31th May1st June 2010.
Danxiang H., Yonghong B., Zhengyu H. Industrial production of microalgal cell-mass and
secondary products species of high potential: Nostoc. In: Handbook of microalgal
culture: biotechnology and applied phycology (ed. Richmond A.). Blackwell Publishing
2004, p. 304311.
Danxiang H., et al. Biology and biotechnology of edible Nostoc, In: Handbook of
Microalgal Culture: In: Applied Phycology and Biotechnology, 2nd edition (ed. Richmond
A., Hu Q.). 2013, p.433-444.
De Philippis R., Colica G., Micheletti E. Exopolysaccharide-producing cyanobacteria in
heavy metal removal from water: molecular basis and practical applicability of the
biosorption process. In: Applied Microbiol Biotechnol. 2011, vol. 92, p. 697-708.
Delavari Amrei H., et.al. Using fluorescent material for enhancing microalgae growth rate
in photobioreactors. In: J. Appl. Phycol. 2015, vol. 27, p. 6774.
Deng R. T., ChowT.J. Hypolipidemic, Antioxidant, and Antiinflammatory Activities of
Microalgae Spirulina. In: Cardiovascular Therapeutics, 2010, vol. 28, nr. 4, 2010, p.33-45.
Desai S. H., Atsumi S. Photosynthetic approaches to chemical biotechnology. In: Current
Opinion in Biotechnology. 2013, vol. 24, p. 81-86.
Dufour J., Moreno J., Rodrguez R. Life Cycle Assessment of Biodiesel Production from
Microalgae Oil: Effect of Algae Species and Cultivation System. In: M. Finkbeiner (ed)
Towards Life Cycle Sustainability Management. Springer Science+Business Media B.V.,
2011. p. 437- 442.
Durackov Z. Oxidants, antioxidants and oxidative stress. In: Gvozdjkov, A., Ed.,
Mitochondrial Medicine. New York: Springer Science+ Business Media, 2008. p. 19-54.
Durmaz Y. Vitamin E (-tocopherol) production by the marine microalgae
Nannochloropsis oculata (Eustigmatophyceae) in nitrogen limitation. In: Aquaculture. 2007,
vol. 272, p. 717722.
Duval B., Shetty K., Thomas W.H. Phenolic compounds and antioxidant properties in the
snow alga Chlamydomonas nivalis after exposure to UV light. In: Journal of Applied
Phycology. 2000, vol.11, p. 559566.
Faize M. et al. Involvement of cytosolic ascorbate peroxidase and Cu/Zn-superoxide
dismutase for improved tolerance against drought stress. In: Journal of Experimental
Botany. 2011, vol. 62, p.25992613.

135

64.
65.
66.

67.

68.
69.
70.

71.

72.
73.

74.
75.

76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.

Fasseas M.K. et al. Antioxidant activity in meat treated with oregano and sage essential
oils. In: Food Chemistry. 2007, vol. 106, 88-1194.
Fauchot J. et al. Influence of UV-B radiation on nitrogen utilization by a natural
assemblage of phytoplankton. In: Journal of Phycology. 2000, vol. 36, p. 484496.
Fernandez F.G.A., Fernandez-Sevilla J.M., Grima E.M. Photobioreactors for the
production of microalgae. In: Rewiews in Environmental Science and Biotechnology.
2013, vol. 12, p. 131151.
Fernandez-Sevilla J.M., Fernandez F.G.A., Grima E.M. Biotechnological production of
lutein and its applications. In: Applied Microbiology and Biotechnology. 2010, vol. 86, p.
2740.
Ferreira L.S. et al. Arthrospira (Spirulina) platensis cultivation in tubular photobioreactor:
use of no-cost CO2 from ethanol fermentation. In: Appl. Energy. 2012, vol. 92, p. 379385.
Fistarol G.O., Legrand C. and Graneli E. Allelopathic effect on a nutrient-limited
phytoplankton species. In: Aquatic Microbial Ecology. 2005, vol. 41, p. 153161.
Fournadzhieva P., Pillarsky P. Mass culture and application of algae in Bulgaria. In:
Abstracts of the 6th Int. Conf. on Applied Algology. Ceske Budejovice, Czech Republic.
1993, p. 20.
Foyer C. H., Noctor G. Oxidant and antioxidant signalling in plants: a re-evaluation of the
concept of oxidative stress in a physiological context. In: Plant, Cell and Environment.
2005, vol. 28, p. 10561071.
Frankenberg N., Lagarias J.C. Phycocyanobilin:Ferredoxin Oxidoreductase of Anabaena
sp. PCC 7120. In: The J of Biol Chem. 2003, vol. 278, nr. 11, p. 9219-9226.
Fraser J.M. et al. Photophysiological and Photosynthetic Complex Changes during Iron
Starvation in Synechocystis sp. PCC 6803 and Synechococcus elongatus PCC 7942. In:
PLOS ONE. 2013, vol. 8, nr. 3, p. 1-11.
Fulda S. et al. Physiology and proteomics of drought stress acclimation in sunflower
(Helianthus annuus L.). In: Plant Biol. 2011, vol. 13, nr. 632642.
Gaber A. et al. Glutathione peroxidase-like protein of Synechocystis PCC 6803 confers
tolerance to oxidative and environmental stresses in transgenic Arabidopsis. In:
Physiologia Plantarum, 2006, vol. 128, p. 251-262.
Gantar M. et al. Isolation, characterization and antioxidative activity of C-phycocyanin
from Limnothrix sp. strain 37-2-1. In: Journal of Biotechnology. 2012, vol. 159, p. 21 26.
Gantt E., Lipschultz C.A. Phycobilisomes of Porphyridium cruentum pigments analisis. In:
Biochemistry. 1974, vol.13, p.14-20.
Garca-Malea M.C. et al Production of astaxanthin by Haematococcus pluvialis: taking the
one-step system outdoors. In: Biotechnol. Bioeng. 2009, vol. 102, p. 651657.
Gavrilescu M. Removal of Heavy Metals from the environment by biosorption. In:
Engineering in Life Sciences. 2004, vol. 4, nr. 3, p. 219-232.
Gelagutashvili E. Comparative Study on Heavy Metals Biosorption by Different Types of
In: Bacteria Open. Journal of Metal. 2013, vol. 3, p. 62-67.
Gericke M. Pinches A. Biological synthesis of metal nanoparticles. In: Hydrometallurgy.
2006, vol. 83, p. 132140.
Ghadouani A. et al. Effects of Microcystis aeruginosa and purified microcystin-LR on the
feeding behavior of Daphnia pulicaria. Limnol. In: Oceanogr. 2004, vol. 49, p. 666679.
136

83.

Gill S.S., Tuteja N. Reactive oxygen species and antioxidant machin ery in abiotic stress
tolerance in crop plants. In: Plant Physiology and Biochemistry. 2010, vol. 4, p. 8909
8930.
84. Goiris K. et al. Antioxidant potential of microalgae in relation to their phenolic and
carotenoid content. In: Journal of Applied Phycology. 2012, vol. 24, p.14771486.
85. Gokhale S.V., Jyoti K.K., Lele S.S. Kinetic and equilibrium modeling of chromium (VI)
biosorption on fresh and spent Spirulina platensis/Chlorella vulgaris biomass. In:
Bioresources Technology. 2008, vol. 99, nr. 9, p. 3600-3608.
86. Gong R., Ding Y., Liu H. Lead biosorption and desorption by intact and pretreated
Spirulina maxima biomass. In: Chemosphere. 2005, vol. 58, p. 125-130
87. Gopinathan P., Ashok A. M., Selvakumar R. Bacterial flagella as biotemplate for the
synthesis of silver nanoparticle impregnated bionanomaterial. In: Applied Surface Science
2013, vol. 276, p. 717722.
88. Gray M.I. et al. Development of liquid chromatography/mass spectrometry methods for
the quantitative analysis of herbal medicine in biological fluids: a review. In: Biomedical
Chromatography. 2010, vol. 24, nr.1, p. 91103.
89. Greve C. B., Pulz O. The Biotechnology of Cyanobacteria. In: Ecology of cyanobacteria II.
Their diversity in space and time (ed. Whitton B.A), Springer. 2012, p.707-739.
90. Grobbelaar J. Physiological and technological considerations for optimising mass
algalcultures. In: Journal of Applied Phycology. 2000, vol. 12, p. 201206.
91. Grobbelaar J. Algal nutrition (mineral nutrition), In: Handbook of Microalgal Culture:
Biotechnology and Applied Phycology (ed. Richmond A.). 2004, p. 97-116.
92. Grobbelaar J. Factors governing algal growth in photobioreactors: the open versus
closed debate. In: Journal of Applied Phycology. 2009, vol. 21, p. 489 492.
93. Grobbelaar J. Mass production of microalgae at optimal photosynthetic rates. In: Agricultural and Biological Sciences: "Photosynthesis", (ed Zvy Dubinsky). 2013, p.357-371.
94. Gupta V. et al. New insights into the biodiversity and applications of cyanobacteria (bluegreen algae) - Prospects and challenges. In: Algal Research. 2013, vol. 2, p. 7997.
95. Gupta V.K., Rastogi A. Sorption and desorption studies of chromium (VI) from nonviable
cyanobacterium Nostoc muscorum biomass. In: Journal of Hazardous Materials. 2008, vol.
154, p. 347354.
96. Hajimahmoodi M. et al. Evaluation of antioxidant properties and total phenolic contents of
some strains of microalgae. In: Journal of Applied Phycology, 2010, vol. 22, p. 4350.
97. Halliwell B., Gutteridge J. M. C. Free radicals in biology and medicine (3rd ed.). Oxford:
Oxford University Press, 2002. 936 pp.
98. Han P-P. et al. Comparative metabolomic analysis of the effects of light quality on
polysaccharide production of cyanobacterium Nostoc flagelliforme. In: Algal Research.
2015, vol. 9, p. 143-150.
99. Hashtroudi M.S. et al. Analysis of Anabaena vaginicola and Nostoc calcicola from
Northern Iran, as rich sources of major carotenoids. In: Food Chemistry. 2013, vol. 136,
nr. 34, p. 1148-1155.
100. Heath R.L., Packer L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts. I. Kinetics and
stoichiometry of fatty acid peroxidation. In: Archice of Biochemistry Biophysics, 1968,
vol. 125, p. 180-198.
137

101. Heining M. et al. Internal illumination of photobioreactors via wireless light emitters: a
proof of concept. In: Journal of Applied Phycology, 2015, vol. 27, p. 5966.
102. Hernndez I. et al. Antioxidant Defenses Against Drought Stress. In: R. Aroca (ed.), Plant
Responses to Drought Stress, Springer-Verlag Berlin Heidelberg. 2012, p. 231-258.
103. Herrero M. et al. Optimization of accelerated solvent extraction of antioxidants from
Spirulina platensis microalga. In: Food Chemistry. 2005, vol. 93, p. 417423.
104. Herrero M. et al. Capillary electrophoresis-mass spectrometry of Spirulina platensis
proteins obtained by pressurized liquid extraction. In: Electrophoresis. 2005, vol. 26, p.
42154224.
105. Hibertson B.M. et al. Oxidative stress in health and disease: The therapeutic potential of
Nrf2 activation. In: Molecular Aspects of Medicine. 2011, vol. 32, Issues 46, p. 234246.
106. Hirata T. et al. Antioxidant activities of phycocyanobilin prepared from Spirulina
platensis. In: Journal of Applied Phycology. 2000, vol. 12, nr. 3-5, p. 435-443.
107. Hiren D., Arabinda R., Kothari I.L. Biosorption of Cadmium by Live and Dead Spirulina: IR
Spectroscopic, Kinetics, and SEM Studies. In: Current Microbiology. 2007, vol. 54, p, 213-218.
108. Hosikian A. et al. Chlorophyll extraction from Microalgae: a Review on the process
engineering aspects. International Journal of Chemical Engineering. 2010, Article ID
391632, 11 pages. doi: 10.1155/2010/391632 .
109. Hu R. et al. Metallic nanostructures as localized plasmon resonance enhanced scattering
probes for multiplex dark field targeted imaging of cancer cells. In: J. Physical Chemistry.
C Nanomaterials and Interfaces. 2009, vol.113, p. 26762684.
110. Huang J. et al. Biosynthesis of silver and gold nanoparticles by novel sundried
Cinnamomum camphora leaf. In: Nanotechnology. 2007, vol.18, p. 111.
111. Ibanez E. et al. Extraction and Characterization of Bioactive Compounds with Health
Benefits from Marine Resources: Macro and Micro Algae, Cyanobacteria, and
Invertebrates. In: M. Hayes (ed.), Marine Bioactive Compounds: Sources, Characterization
and Applications, Springer Science+Business Media, 2012, p.55-90
112. Inouye L.S., Lotufo G. R. Comparison of macro-gravimetric and micro-colorimetric lipid
determination methods. In: Talanta. 2006, vol. 70, nr. 3, p. 584587.
113. Jahns P., Holzwarth A.R. The role of the xanthophyll cycle and of lutein in photoprotection of photosystem II. In: Biochimica et Biophysica Acta. 2012, vol.1817, p.182
193.
114. Jamuna B.A., Rai V. R. Evaluation of the antimicrobial activity of three medicinal plants
of South India. In: Malaysian Journal of Microbiology. 2011, vol.7, p. 14-18.
115. Janknegt P.J. et al. A comparison of quantitative and qualitative superoxide dismutase
assays for application to low temperature microalgae. In: Journal of Photochemistry and
Photobiology B: Biology. 2007, vol. 87, p. 218226.
116. Jebali A., Ramezani F., Kazemi B. Biosynthesis of Silver Nanoparticles by Geotricum sp.
In: Journal of Cluster Sciences. 2011, vol. 22, p.225232.
117. Jesus Raposo M. F., Morais R.M.S.C., Morais A.M.M.B. Health application of bioactive
compounds from marine microalgae. In: Life Sciences. 2013, vol. 93, p.479-486.
118. Ji L.L., Cui G.Y, Zhao X.X. Antioxidant activities of phycobiliproteins isolated from wild
Nostoc commune. In: Advances in Biomedical Engineering. 2011, vol. 3-5, p. 34-43.

138

119. Johnson E.M., Kumar K., Das D. Physicochemical parameters optimization, and
purification of phycobiliproteins from the isolated Nostoc sp. In: Bioresource Technology.
2014, vol. 166, p. 541-554
120. Johnson K., Admassu W. Mixed algae cultures for low cost environmental compensation
in cultures grown for lipid production and wastewater remediation. In: Journal of Chemical
Technology and Biotechnology. 2013, p. 992998.
121. Johnson K.R., Ellis G., Toothill C. The sulfophosphovanillin reaction for serum lipids: a
reappraisal. In: Clinical Chemistry. 1977, vol. 23, nr. 9, p. 16691678.
122. Kaka A., Dnmez G. Isolation of Dunaliella spp. from a hypersaline lake and their ability
to accumulate glycerol. In: Bioresources Technology. 2008, vol. 99, p.83488352.
123. Kancheva V.D. Phenolic antioxidants radical-scavenging and chain-breaking activity: a
comparative study. In: European Journal of Lipid Science and Technology., 2009, vol.111,
p.10721089.
124. Karawita R.et al. Protective effect of enzymatic extracts from microalgae against DNA
damage induced by H2O2. In: Marine Biotechnology. 2007, vol. 9, p.479490.
125. Ke P. J., Woyewod A. D. Microdetermination of thiobarbituric acid values in marine lipids
by a direct spectrophotometric method with a monophasic reaction system. In: Analytica
Chimica Acta. 1979, vol. 106, nr. 2, p. 279 -284
126. Kelman D. Antioxidant Activity of Hawaiian Marine Algae. In: Marine Drugs. 2012,
vol.10, nr.2, p. 403-416.
127. Kepeki R.A., Saygideger S.D. Enhancement of phenolic compound production in
Spirulina platensis by two-step batch mode cultivation. In: Journal of Applied Phycology,
2012, vol. 24, p.897905.
128. Kesheri M., Richa K.M, Sinha R.P. Antioxidants as natural arsenal against multiple
stresses in cyanobacteria. In: International Journal of Pharma and Bio Sciences. 2011, vol.2,
nr.2, p. B168-B187.
129. Klein B.C. et al. Microalgae as natural sources for antioxidative compounds. In: Journal of
Applied Phycology. 2012, vol. 24, nr. 11331139.
130. Klejdus B.L. et al. Hyphenated technique for the extraction and determination of isofl
avones in algae: ultrasound-assisted supercritical fl uid extraction followed by fast
chromatography with tandem mass spectrometry. In: Journal of Chromatography. 2010,
vol. A 1217, nr. 51, p. 79567965.
131. Ku C.S. et al. Health Benefits of Blue-Green Algae: Prevention of Cardiovascular Disease and
Nonalcoholic Fatty Liver Disease. In: Journal of Medicinal Food. 2013, vol. 16, nr. 2, p. 103-111.
132. Kumar A.S. et al. Biosynthesis of gold and silver nanopartcles by natural precursor clove
and their functionalisation with amine group. In: Journal of Nanoparticles Researces. 2010,
vol.12, p. 16671675.
133. Kumar M. et al. Biochemical responses of red alga Gracilaria corticata, (Gracilariales,
Rhodophyta) to salinity induced oxidative stress. In: Journal of Experimental Biology and
Ecology. 2010, vol. 391, p.27-34.
134. Lafka T. I. et al. Phenolic and antioxidant potential of olive oil mill wastes. In: Food
Chemistry. 2011, vol. 125, p. 92-98.
135. Latifi A., Ruiz M., Zhang C. C. Oxidative stress in cyanobacteria. In: FEMS Microbiology
Reviews. 2009, vol. 33, p. 258278
139

136. Lee Y.K. Algal nutrition (Heterotrofic carbon nutrition). In: Handbook of microalgal
culture: biotechnology and applied phycology (ed. Richmond A.), Blackwell Publishing,
2004. p. 116-125.
137. Lee Y.K. Commercial production of microalgae in the Asia-Pacific. In: Journal of Applied
Phycology. 1997, vol. 9, p. 40311.
138. Lee Y.K. Microalgal mass culture systems and methods: Their limitation and potential. In:
Journal of Applied Phycology. 2001, vol. 13, p. 307315.
139. Lee Y.K. et al. Design and performance of an a-type tubular photobioreactor for mass
cultivation of microalgae. In: Journal of Applied Phycology. 1995, vol. 7, p. 4751.
140. Leopoldini M., Russo N., Toscano M. The molecular basis of working mechanism of
natural polyphenolic antioxidants. In: Food Chemistry. 2011, vol.125, nr.2, p.288-306.
141. Leya T. et al. Response of arctic snow and permafrost algae to high light and nitrogen
stress by changes in pigment composition and applied aspects for biotechnology. In: FEMS
Microbiology Ecology. 2009, vol. 67, p. 432443.
142. Li H., et al. Antioxidant and moisture-retention activities of the polysaccharide from
Nostoc commune. In: Carbohydrate Polymers. 2011, vol. 83, p. 18211827.
143. Li H.B. et al. Evaluation of antioxidant capacity and total phenolic content of different
fractions of selected microalgae. In: Food Chemistry. 2007, vol. 102, p.771776.
144. Liu Z.Y., Wang G.C., Zhou B.C. Effect of iron on growth and lipid accumulation in
Chlorella vulgaris. In: Bioresources Technology. 2008, vol. 99, p. 47174722.
145. Lodi A. et al. Chromium (III) removal by Spirulina platensis biomass. In: Chemical
Engineering Journal. 2008, vol. 136, nr. 2-3, p. 151-155.
146. Lpez A. et al. The effects of solvents on the phenolic contents and antioxidant activity of
Stypocaulon scoparium algae extracts. In: Food Chemistry. 2011, vol. 125, p. 11041109.
147. Lowry O.H. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent. In: Journal of
Biological Chemistry. 1951, vol. 193, p. 265275.
148. Lushchak V.I. Adaptive response to oxidative stress: Bacteria, fungi, plants and animals.
In: Comparative Biochemistry and Physiology, Part C. 2011, vol. 153, p.175 190.
149. Macas-Snchez M.D. et al. Comparison of supercritical fl uid and ultrasound-assisted
extraction of carotenoids and chlorophyll a from Dunaliella salina. In: Talanta. 2009, vol.
77, nr.3, p. 948952.
150. Magalhaes M. et al. Methodological aspects about in vitro evaluation of antioxidant
properties. In: Analytica chimica acta. 2008, vol. 613, p. 119.
151. Mahdi E., Fariba K. Cancer treatment with using cyanobacteria and suitable drug delivery
system. In: Annals of Biological Research. 2012, vol.3, nr. 1, p.622-627.
152. Manivannan K., Anantharaman P., Balasubramanian Th. Evaluation of antioxidant
properties of marine microalga Chlorella marina (Butcher, 1952). In: Asian Pacific Journal
of Tropical Biomedicine. 2012, vol. 2, nr.1, p.S342-S346.
153. Mao L. C. et al. Antioxidant properties of water and ethanol extracts from hot air-dried
and freeze-dried daylily flowers. In: European Food Research and Technology.
2006, vol. 222, nr.3-4, p 236-241.
154. Markou G., Nerantzis E. Microalgae for high-value compounds and biofuels production: A
review with focus on cultivation under stress conditions. In: Biotechnology Advances.
2013, vol. 31, p. 15321542.
140

155. Martinez-Castanon G.A. et al. Synthesis and antibacterial activity of silver nanoparticles
with differentsizes. In: J. Nanopart. Res. 2008, vol.10, p.13431348.
156. Maurya S.S., Maurya J.N., Pandey V.D. Factors regulating phycobiliprotein production in
cyanobacteria. In: International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences.
2014, vol. 3, nr. 5, p. 764-771.
157. McCarty M.F., Barroso-Aranda J., Contreras F. Oral phycocyanobilin may diminish the
pathogenicity of activated brain microglia in neurodegenerative disorders. In: Medical
Hypotheses. 2010, vol. 74, nr. 3, p. 601-605.
158. Menzyanova N. G. et al. Season variability of iron effects on periodic culture of
microalgae Dunaliella viridis Teod. In: Frontiers of Biology in China. 2009, vol.4, nr. 3, p.
328336.
159. Micheletti E. et al. Selectivity in the heavy metal removal by exo-polysaccharideproducing
cyanobacteria. In: Journal of Applied Microbiology. 2008, vol. 105, p. 8894.
160. Min T. Production of Spirulina in Myanmar (Burma). In: Bulletine de lInstitute de
Oceanographique de Monaco. 1993, vol. 12, p.17578.
161. Moheimani N.R, Borowitzka M.A Limits to productivity of the alga Pleurochrysis
carterae (haptophyta) grown in outdoor raceway ponds. In: Biotechnology and
Bioengineering. 2007, vol. 96, p. 2736.
162. Moreno J. et al. Outdoor cultivation of a nitrogen-xing marine cyanobacterium Anabaena
sp. ATCC 33047. In: Biomolecular Engineering. 2003, vol. 20, p. 191197.
163. Morgan-Kiss R.M. et al. Adaptation and acclimation of photosynthetic microorganisms to
permanently cold environments. In: Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2006, vol.
70, p. 222252.
164. Munir N. et al. Algae: A potent antioxidant source. In: Sky Journal of Microbiology
Research. 2013, vol. 1, nr.3, p. 22 31.
165. Naja G., Volesky B. The Mechanism of Metal Cation and Anion Biosorption. Chapter 3.
In: P. Kotrba et al. (eds.), Microbial Biosorption of Metals, Springer Science-Business
Media B.V. 2011, DOI 10.1007/978-94-007-0443-5-3.
166. Nayak R.R. et al. Green synthesis of silver nanoparticle by Penicillium purpurogenum
NPMF: the process and optimization. In: Journal of Nanoparticles Research. 2011, vol.13,
p. 31293137.
167. Ngo D. H. et al. Marine food-derived functional ingredients as potential antioxidants in the
food industry: An overview. In: Food Research International. 2011, vol. 44, p. 523529.
168. Nicolaisen K., Schkeiff E. Iron dependency of, and transport by, cianobacteria. In: Iron
uptake and homeostasis in microorganisms (ed.Cornelis P., Andrews S.C.), 2010. p. 203-229.
169. Nieto A. F. et al. Pressurized liquid extraction: a useful technique to extract
pharmaceuticals and personal-care products from sewage sludge. In: TrAC Trends in
Analytical Chemistry. 2010, vol 29, p. 752764.
170. Nishiyama Y., Allakhverdiev S.I., Murata N. Protein synthesis is the primary target of
reactive oxygen species in the photoinhibition of photosystem II. In: Physiology of Plants.
2011, vol.142, p.3546.
171. Ogura R. et al. Biochemical characterization of an L-tryptophan dehydrogenase from the
photoautotrophic cyanobacterium Nostoc punctiforme. In: Enzyme and Microbial
Technology. 2014, vol. 60, p. 40-46
141

172. Olaizola M. Commercial production of astaxanthin from Haematococcus pluvialis using


25,000-liter outdoor photobioreactors. In: Journal of Applied Phycology. 2000, vol.12, p.
499506.
173. Olvera-Ramirez R., et al. Antioxidant effect of phycobiliproteins on proteins and DNA
exposed to a reactive oxygen species generating system. In: The FASEB Journal. 2013,
vol. 27, p.890- 895.
174. Onofrejov T. et al. Bioactive phenols in algae: the application of pressurized-liquid and
solid-phase extraction techniques. In: Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis.
2010, vol.51, nr.2, p. 464470.
175. Oren A. et al. Microalgae and cyanobacteria of the Dead Sea and its surrounding springs.
In: Isr. J. Plant. Sci. 2008, vol. 56, p.113.
176. Oxidative Stress and Diseases. Edited by Volodymyr I. Lushchak and Dmytro V.
Gospodaryov, Publisher: InTech. 2012, p. 367-410.
177. Pade N., Hagemann M. Salt acclimation of cyanobacteria and their application in
biotechnology. In: Life (Basel, Switzerland). 2014, vol. 5, nr. 1, p. 25-49.
178. Pandey S., Goswami G. K., Nanda K. K. Green synthesis of biopolymersilver
nanoparticle nanocomposite: an optical sensor for ammonia detection. In: International
Journal of Biological Macromolecules. 2012, vol. 51, p. 583589.
179. Pandey U., Pandey J. Enhanced production of biomass, pigments and antioxidant capacity
of a nutritionally important cyanobacterium Nostochopsis lobatus. In: Bioresource
Technology. 2008, vol. 99, p. 45204523
180. Pandey V. D., Pandey A., Sharma V. Biotechnological applications of cyanobacterial
phycobiliproteins. In: International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences.
2013, vol. 2, nr. 9, p. 89-97.
181. Pangestuti R., Kim S. K. Biological activities and health benefit effects of natural pigments
derived from marine algae. In: Journal of Functional Foods. 2011, vol.3, p. 255 266.
182. Park H. J. et al. Randomized Double-Blind, Placebo-Controlled Study to Establish the
Effects of Spirulina in Elderly Koreans. In: Annals of Nutrition and Metabolism. 2008,
vol. 52, nr. 4, p. 322-328.
183. Pereira S. et al. Using extracellular polymeric substances (EPS) producing cyanobacteria
for the bioremediation of heavy metals: do cations compete for the EPS functional groups
and also accumulate inside the cell? In: Microbiology. 2011, vol. 157, p. 451-458.
184. Perez-Garcia O. et al. Heterotrophic cultures of microalgae: metabolism and potential
products. In: Water Resources. 2011, vol. 45, nr. 1, p.1136.
185. Pinto E. et al. Heavy metal - induced oxidative stress in algae. In: Journal of Phycology.
2003, vol. 39, p.1008 1018.
186. Philip D. Biosynthesis of Au, Ag and Au-Ag nanoparticles using edible mushroom extract.
In: Spectrochimica Acta, part A. 2009, vol. 73, p. 374381.
187. Platenik J. et al. Quinolinic acide iron(II) complexes: slow autoxidation, but enhanced
hydroxyl radical production in the Fenton reaction. In: Free Radicals Reearch. 2001, vol.
34, p. 445-459.
188. Plaza M., Cifuentes A., Ibanez E. In the search of new fuctional food ingredients from
algae. In: Trends in Food Science and Technology. 2008, vol. 19, p. 31-39.

142

189. Pokorny J. Are natural antioxidants better and safer that synthetic antioxidants? In:
Eur. Journal of Lipid Science and Technology. 2007, vol. 109, p. 629642.
190. Posten C. Design principles of photo-bioreactors for cultivation of microalgae. In:
Engineering and Life Science. 2009, vol. 9, p. 165177.
191. Pourova J. et al. Reactive oxygen and nitrogen species in normal physiological processes.
In: Acta Physiologica, 2010, vol. 198, p. 15-35.
192. Pradedova E.F., Isheeva O.D., Salyaev R.K. Classification of the Antioxidant Defense
System as the Ground for Reasonable Organization of Experimental Studies of the
Oxidative Stress in Plants. In: Russian Journal of Plant Physiology. 2011, vol. 58, nr.2,
p.210-217.
193. Prasanna R. et al. Rediscovering Cyanobacteria as valuable sources of bioactive
compounds. In: Applied Biochemistru and Microbiology. 2010, 46(2), p. 133147.
194. Prieto P., Pineda M., Aquilar M. Spectrophotometric qantitation of antioxidant capacity
through the formation of a phosphomolybdenum complex: specific application to the
determination of vitamin E. In: Analytical Biochemistry. 1999, vol. 269, p. 337-341.
195. Pulz O., Broneske J., Waldeck P., IGV GmbH Experience Report, Industrial production of
microalgae under controlled conditions: innovative prospects, In: Handbook of microalgal
culture: aplied phycology and biotechnology, 2nd edition (ed. Richmond A., Hu Q.), 2013,
p. 445-460.
196. Pulz O., Scheibenbogen K. Photobioreactors: design and performance wit respect to light
energy input. In: Advances in biochemical engineering/biotechnoogy (ed. T. Scheper),
Springer 1998, p. 123152.
197. Pulz O. Photobioreactors: production systems for phototrophic microorganisms. In:
Applied Microbiology and Biotechnology. 2001, vol. 57, p. 287293.
198. Radmann E.M., Reinehr C.O., Costa J.A.V. Optimization of the repeated batch cultivation
of microalga Spirulina platensis in open raceway ponds. In: Aquaculture. 2007, vol. 265,
p. 118126.
199. Rajiv K. A. et al. Biosorption of Pb2+ and Zn2+ by Non-Living Biomass of Spirulina sp. In:
Indian Journal of Microbiology. 2011, vol. 50, nr. 4, p. 438442.
200. Ramel F. et al. Chemical quenching of singlet oxygen by carotenoids in plants. In: Plant
Physiology, 2012, vol. 158, p.12671278.
201. Re R. et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization
assay. In: Free Radical Biology & Medicine. 1999, vol.10, p. 1231-1237.
202. Remirez D., Ledon N. Role of histamine in the inhibitory effects of phycocyanin in
experimental models of allergic response. In: Mediators Inflamm. 2002, nr. 11, p. 81-85.
203. Richa K.M., Sinha R.P. Antioxidants as natural arsenal against multiple stresses in
cyanobacteria. In: Internatiuonal Journal of Pharmacy and Biological Sciences. 2011, vol.
2, nr. 2, p. 168-187.
204. Richa K.M. et al. Biotechnological potentials of phycobiliproteins. In: Internatiuonal
Journal of Pharmacy and Biological Sciences. 2011, vol. 2, nr. 4, p. 446-454.
205. Richa Rastogi R.P. et al. Biotechnological potential of mycosporine-like amino acids and
phycobiliproteins of cyanobacterial origin. In: Biotechnology, Bioinformatics and
Bioengineering. 2011, vol. 1, nr. 2, p. 159-171.

143

206. Richmond A. Principles for attaining maximal microalgal productivity in photobioreactors:


an overview. In: Hydrobiologia. 2004, vol. 512, p. 3337.
207. Richmond A., Biological Principles of Mass Cultivation of Photoautotrophic Microalgae,
In: Handbook of microalgal culture: aplied phycology and biotechnology, 2nd edition (ed.
Richmond A., Hu Q.), 2013, p.169-204.
208. Richmond A., Cheng-Wu Z. Optimization of a at plate glass reactor for mass production
of Nannochloropsis sp.outdoors. In: Journal of Biotechnology. 2001, vol. 85, nr. 3, p. 259
269.
209. Rodriguez-Garcia I., Guil-Guerrero J.L. Evaluation of the antioxidant activity of three
microalgal species for use as dietary supplements and in the preservation of foods. In:
Food Chemistry. 2008, vol. 108, p. 10231026.
210. Romero D. M., Ros de Molina M.C., Juarez A.B. Oxidative stress induced by a
commercial glyphosate formulation in a tolerant strain of Chlorella kessleri. In:
Ecotoxicology and Environmental Safety. 2011, vol. 74, p.741747.
211. Roney B.R. et al. Consumption of Nostoc soup: a potential for BMAA exposure from
Nostoc cyanobacteria in China? In: Amyotroph. Lateral. Scler. 2009, vol. 10(S2), p. 4449.
212. Saha G. M. Design and Analysis for Bioassays. In: Design Workshop Lecture Notes, ISI,
Kolkata 2002, p. 61-76.
213. Scanlan D.J. et al. Ecological genomics of marine picocyanobacteria. In: Microbiol. Mol.
Biol. R. 2009, vol. 73, p. 249299.
214. Schiewer S., Wong M.H. Ionic strength effects in biosorption of metals by marine algae.
In: Chemosphere.2000, vol. 41, p. 271-282.
215. Schreckenbach K. et al. Der ein uss von mikroalgen (Spirulina platensis) in
trockenmischfutter auf karpfen (Cyprinus carpio). In: Fischer Teichwirt. 2001, vol. 1, p.
1013.
216. Sekar S., Chandramohan M. Phycobiliproteins as a commodity: trends in applied research,
patents and commercialization. In: Journal of Applied Phycology. 2008, vol. 20, p.113136.
217. Shailendra P., Beronda L. Determining cell shape: adaptive regulation of cyanobacterial
cellular differentiation and morphology. In: Trends in Microbiol. 2011, vol. 19, p. 278-285.
218. Shanab S. et al. Aqueous extracts of microalgae exhibit antioxidant and anticancer
activities. In: Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2012, p. 608-615.
219. Sharma G. et al. Effect of carbon content, salinity and pH on Spirulina platensis for
phycocyanin, allophycocyanin and phycoerythrin accumulation. In. Journal of Microbial &
Biochemical Technology. 2014, vol. 6, nr. 4, p. 202-206.
220. Sharma N.K. et al. Sustainability and cyanobacteria (blue-green algae): facts and
challenges. In: Journal of Applied Phycology. 2010, vol. 23, nr.6, p. 10591081.
221. Shebis Y. et al. Natural Antioxidants: Function and Sources. In: Food and Nutrition
Sciences. 2013, vol.4, p.643-649.
222. Simeunovi J. et al. Impact of nitrogen and drought on phycobiliprotein content in
terrestrial cyanobacterial strains. In: Journal of Applied Phycology. 2013, vol. 25, p. 597
607.
223. Singleton V. L., Rossi J.A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdicphosphotungstic acid reagent. In: American J Enology and Viticulture. 1965, vol. 16, p.
144-158.
144

224. Sivonen K., Brner T. Bioactive compounds produced by cyanobacteria. In: The
cyanobacteria. Molecular biology, genomics and evolution (ed. Herrero A., Flores E.).
2008. Norfolk: Caister Academic Press, 2008, p. 159197.
225. Solisio C., Lodi A., Torre P. Copper removal by dry and re-hydrated biomass of Spirulina
platensis. In: Bioresource Technology. 2006, vol. 97, p. 1756-1760.
226. Solisio C. et al. Cadmium biosorption on Spirulina platensis biomass. In: Bioresour
Technology. .2007, vol. 99, nr. 13, p. 5933-5937.
227. Sonani R.R. et al. Concurrent purification and antioxidant activity of phycobiliproteins
from Lyngbya sp. A09DM: An antioxidant and anti-aging potential of phycoerythrin in
Caenorhabditis elegans. In: Process Biochemistry. 2014, vol. 49, nr. 10, p. 17571766.
228. Spolaore P. et al. Commercial applications of microalgae. In: Journal of Biosciences and
Bioengineering. 2006, vol. 101, p. 8796.
229. Steidinger K.A., Garcces E. Importance of Life Cycles in the Ecologyof Harmful
Microalgae. In: Ecological Studies (Edna Graneli and Jefferson T.Turner (Eds.). vol. 189:
Ecology of Harmful Algae. 2006. Springer-Verlag: Berlin Heidelberg, 2006, p. 37-49.
230. Steinbrenner J., Linden H. Regulation of two carotenoid biosynthesis genes coding for
phytoene synthase and carotenoid hydroxylase during stress-induced astaxanthin formation
in the green alga Haematococcus pluvialis. In: Plant Physiology. 2001, vol. 125, p. 810817.
231. Su J., Jia S., Chen X., Yu H. Morphology, cell growth, and polysaccharide production of
Nostoc agelliforme in liquid suspension culture at different agitation rates. In: Journal of
Applied Phycology. 2008, vol. 20, nr. 3, p. 213217.
232. Sulaiman Sh. F. et al. Effect of solvents in extracting polyphenols and antioxidants of
selected raw vegetables. In: Journal of Food Composition and Analysis. 2011, vol. 24, p.
506515.
233. Sumazian Y. et al. Antioxidant activities, flavonoids, ascorbic acid and phenolic contents
of Malaysian vegetables. In: Journal of Medicinal Plants Research. 2010, vol. 4, nr. 10, p
881-890.
234. Takaichi S. Carotenoids in algae: distributions, biosyntheses andfunctions. In: Marine
Drugs. 2011, vol.9, p.11011118.
235. Tang D. et al. CO2 biofixation and fatty acid composition of Scenedesmus obliquus and
Chlorella pyrenoidosa in response to different CO2 levels. In: Bioresource and
Technology. 2010, vol. 102, p. 3071-3076.
236. Teo C.C. et al. Pressurized hot water extraction (PHWE). In: Journal of Chromatography.
2008, vol. A 1217, p. 24842494.
237. Tian J., Yu J. Changes in ultrastructure and responses of antioxidant systems of algae
(Dunaliella salina) during acclimation to enhanced ultraviolet-B radiation. In: Journal of
Photochemistry and Photobiology: Biology. 2009, vol. 97, p. 152160.
238. Torzilo G. et al. A two-plane tubular photobioreactor for outdoor culture of Spirulina, In:
Biotechnology and Bioengineering. 1993, vol. 42, p. 891.
239. Tredici M.R. Mass production of microalgae: photobioreactors. In: Handbook of
microalgal culture: biotechnology and applied phycology (ed. Richmond A.). Blackwell
Science, 2004, p. 178-215.
240. Tredici M.R., Chini Zittelli G. Efficiency of sunlight utilization: tubular versus flat
photobioreactors. In: Biotechnology and Bioengineering. 1998, vol. 57, p. 187197.
145

241. Tripathi B.N. et al. Oxidative stress in Scenedesmus sp. during short- and long-term
exposure to Cu2+and Zn2+. In: Chemosphere. 2006, vol. 62, p.538544.
242. Turner C., Ibaez E. Pressurized hot water extraction. In Enhancing Extraction Processes
in the Food Industry (ed. N. Lebovka, E. Vorobiev, and F. Chemat). Boca Ratn FL:
Taylor & Francis Group, LLC, 2011. p.65-74.
243. Tyszka M., Fraser S.E, Jacobs R.E. Magnetic resonance microscopy: recent advances and
applications. In: Current Opinion in Biotechnology. 2005, vol. 16, nr. 1, p. 9399.
244. Ugwu C.U., Ogbonna J.C., Tanaka H. Improvement of mass transfer characteristics and
roductivities of inclined tubular photobioreactors by installation of internal static mixers.
In: Applied Microbiology and Biotechnology. 2002, vol. 58, p. 600607.
245. Valuta A. et al. Phycobiliprotein accumulation in cyanobacterium Nostoc linckia and
modification of antioxidant activity. In: The Annals of Oradea University, Biology
Fascicle. 2015, Tom XXII, nr. 1, p. 13-19.
246. Valua A. et al. Impact of iron (III) Schiff base complexes on phycobiliprotein
accumulation in cyanobacteruimn Nostoc linckia. In: International Scientific Conference
on Microbial Biotechnology (2nd ed.). Chiinu, Moldova, October 9-10, 2014, p. 90-92.
247. Vannela R., Verma S. Co2+, Cu2+ and Zn2+ accumulation by cyanobacterium Spirulina
platensis. In: Biotechnolology Progress. 2006, vol. 22, nr. 5, p. 1282-1293.
248. Vijayaraghavan K., Yun Y.S. Bacterial biosorbent and biosorbtion. In: Biotechnology
Advances. 2008, vol. 26, p. 266-291.
249. Vonshak A. Laboratory techniques for the cultivation of microalgae. In: Handbook of
microalgal mass culture (ed. Richmond A.). CRC Press, 1986. p. 117-145.
250. Wada N., Sakamoto T., Matsugo S. Multiple roles of photosynthetic and sunscreen
pigments in cyanobacteria focusing on the oxidative stress. In: Metabolites. 2013, vol. 3,
p. 463-483.
251. Wang P., Wong M.H., Tam N.F.Y. Antioxidant responses of two microalgae, Selenastrum
capricornutum and Chlorella sp., to estradiol and ethinylestradiol. In: Journal of Applied
Phycology. 2013, vol. 25, p.891 903.
252. Wang H.M. et al. Identifi cation of anti-lung cancer extract from Chlorella vulgaris C-C
by antioxidant property using supercritical carbon dioxide extraction. In: Process
Biochemistry. 2010, vol,45, p. 18651872.
253. Wang S. et al. Ionic-liquid-assisted facile synthesis of silver nanoparticle-reduced graphene
oxide hybrids by gamma irradiation. In: Carbon. 2013, vol.55, p. 245252.
254. Wijngaard H. et al. Techniques to extract bioactive compounds from food by-products of
plant origin. In: Food Research International. 2012, vol. 46, nr. 2, p. 505513.
255. Yin B. et al. Electrochemical synthesis of silver nanoparticles under protection of poly(Nvinylpyrrolidone). In: Journal Physical Chemistry, part B. 2003, vol. 107, p. 88988904.
256. Ying Z., Han X., Li J.. Ultrasound-assisted extraction of polysaccharides from mulberry
leaves. In: Food Chemistry. 2011, vol.127, p. 12731279.
257. Yoshimura H. et al. The role of extracellular polysaccharides produced by the terrestrial
cyanobacterium Nostoc sp. strain HK-01 in NaCl tolerance. In: Journal of Applied
Phycology. 2012, vol. 24, p. 237243.

146

258. Yu H., Jia S., Dai Y. Growth characteristics of the cyanobacterium Nostoc agelliforme in
photoautotrophic, mixotrophic and heterotrophic cultivation. In: Journal of Applied
Phycology. 2009, vol. 21, nr. 1, p. 127133.
259. Zabochnicka-Swiatek M, Krzywonos M. Potential of Biosorption and Bioaccumulation
Processes for Heavy Metal Removal. In: Polish Journal of Environmental Studies. 2014,
vol. 23, nr. 2, p. 551-561.
260. Zhang L. X. et al. Anti-cancer effects of polysaccharide and phycocyanin from Porphyra
yezoensis. In: Journal of Marine Science and Technology. 2011, vol. 19, nr. 4, p. 377-382.
261. Zhang Z. et al. An industrial-size flat plate glass reactor for mass production of
Nannochloropsis sp. (Eustigmatophyceae). In: Aquaculture. 2001, vol. 195, p. 3549.
262. Zhekisheva M. et al. Accumulation of oleic acid in Haematococcus pluvialis
(Chlorophyceae) under nitrogen starvation or high light is correlated with that of
astaxanthin esters. In: Journal of Phycology. 2002, vol. 38, p. 325-331.
263. Zhongrui Li et al. Preparation and antioxidant property of extract and semipurified
fractions of Caulerpa racemosa. In: Journal of Applied Phycology. 2012,vol. 24, nr. 6, p.
1527-1536.
264. Zinicovscaia I.,Cepoi L., Valuta A., Rudi L., Culicov O., Frontasyeva M., Kirkesali E.,
Pavlov S., Mitina T. Nostoc Linckia as Biosorbent of Chromium and Nickel from
Electroplating Industry Wastewaters. In: Journal of Materials Science and Engineering.
2014, vol. 4, nr. 8, p.242-247.
265. Zittelli G.C. et al. Photobioreactors for mass cultivation of microalgae, In: Handbook of
microalgal culture: aplied phycology and biotechnology, 2nd edition (ed. Richmond A., Hu
Q.). 2013, p. 225-266.
287. .., .. - , Spirulina platensis. : .
2010, . 81, c. 17 - 22.
288. ., .
. : . 1966, .96-98.
289. . . A :
. :
. 2007, .3, 12, . 6-26.
290. 2151403, , G01N33/92.
.
.., .., ..; :
. . 20.06.2000.
291. .. . :, 2007.
140 .
292. ., ., . .
:, 1975. 411 .

147

ANEXE

148

Anexa 1.
Brevete de invenie MD 4253, MD4326, MD 4327

149

150

151

Anexa 2.
Act de implementare a tehnologiei de obinere a preparatului antioxidant NostocAntiOx.

152

153

Anexa 3.
Diplome la Saloane de Invenii i Expoziii Internaionale.

154

155

156

157

DECLARAIA PRIVIND ASUMAREA RSPUNDERII

Subsemnata, declar pe rspundere personal c materialele prezentate n teza de doctorat


sunt rezultatul propriilor cercetri i realizri tiinifice. Contientizez c, n caz contrar,
urmeaz s suport consecinele n conformitate cu legislaia n vigoare.

Valua Ana

Data

158

CV al autorului
Nume, prenume:
Valua Ana
Data i locul naterii:
22 noiembrie, s. Horodite, r-ul Clrai, R. Moldova
Studii:
2000-2003
Institutul de Microbiologie al AM, doctorand
specialitatea Biotehnologie.
2001-2003
Universitatea de Stat din Moldova, Institutul de Instruire
continu, student
1995-2000
Universitatea de Stat din Moldova, Facultatea de Biologie
i Pedologie, student
Activitatea profesional:
2013-prezent
Institutul de Microbiologie i Biotehnologie al AM, laboratorul
Ficobiotehnologie, cerc. t.
2006-2013
Institutul de Microbiologie i Biotehnologie al AM, Colecia Naional de
Microorganisme Nepatogene, cerc. t.
2004-2006
Institutul de Microbiologie al AM, cerc. t. st.
Domeniile de activitate tiinific:
Ficobiotehnologie. Sinteza orientat a principiilor bioactive de ctre cianobacterii i microalge.
Elaborarea tehnologiilor de obinere a biomasei microalgale cu coninut sporit de substane
biologic active (pigmeni, polizaharide, lipide, .a.). Elaborarea tehnologiilor de obinere a
preparatelor de origine microalgal cu multiple proprieti terapeutice.
Lucrri tiinifice publicate 24, dintre care:
Articole: n reviste cu factor de impact 2, n reviste recenzate - 5, dintre care 2 n monoautorat,
n culegeri de articole -2, teze i rezumate la forurile tiinifice - 14;
Brevete de invenie: 3 .
Participri la foruri tiinifice internaionale:
1. V International Conference Actual Problems in Modern Phycology, Chiinu, Moldova,
November 3-5, 2014.
2. VI international young scientists conference Biodiversity. Ecology. Adaptation.
Evolution., dedicated to 150 anniversary from the birth of Vladimir Lipskiy, may 13-17,
2013, Odesa, Ukraine.
3. International Interdisciplinary Scientific Scientific Conference Biologically active
substances and materials: Fundamental and Applied Problems, May 27-June 1, 2013,
Svet, AR Crimea, Ukraine.
4. PONTUS
EUXINUS, , 50
.
, , 2013.
5. 2nd International Conference on Nanotechnologies and Biomedical Engineering, Chisinau,
Republic of Moldova, April 18-20, 2013.

159

The 6th Edition of European Exchibition of Creativity and Innovation EUROINVENT


2014, Iasi, Romania, 22-24 mai 2014.
7. International Conference dedicated to the 55-th anniversary from the foundation of the
Institute of Chemistry of the Academy of Sciences of Moldova. Chiinu, Moldova, May
28-30, 2014.
8. Salonul Internaional de Invenii i Inovaii INVENTIKA, Bucureti, Romnia,15-18
octombrie 2014.
9. Al III-lea Simpozion naional cu participare internaional Biotehnologii avansate
realizri i perspective, 24-25 octombrie 2013, Chiinu, Moldova.
Participri la proiecte tiinifice naionale i internaionale:
1. Stabilirea dinamicii activitii antioxidante i acumulrii radicalilor liberi pe durata ciclului
de cultivare al spirulinei n condiii de laborator i de producere (2015-2018).
2. 14.518.02.02A Tehnologii cost eficiente de obinerea nanoparticulelor de argint cu
utilizarea cianobacteriilor i microalgelor ca suport (2014-2015).
3. 11.817.08.18F Stabilirea mecanismelor de modificare a statutului oxidativ i a
componenei biochimice a biomasei unor microalge sub aciunea metalocomplexelor n
scopul obinerii preparatelor antioxidante (2011-2014).
4. 11.817.04.11A Evaluarea i valorificarea potenialului microbiologic pentru elaborarea
tehnologiilor agriculturii durabile (2011-2014).
5. 13.820.18.05/RoA Compusi coordinativi ai elementelor de tranzitie pe baza de liganzi
polidentati flexibili ca agenti biologic activi siprecursori pentru materiale oxidice (20132014).
6. Organizarea unei infrastructuri experimentale pentru ntreinerea i valorificarea coleciei
de microorganisme cu multiple utiliti biotehnologice (2010).
7. 06.411.017A Valorificarea i conservarea resurselor microbiene prin biotehnologii
competitive clasice i modern (2006-2010).
8. 08.819.04.03F Studiul procesului de metanogenez i elaborarea tehnologiilor de sintez a
vitaminei B12 de uz furajer (2008-2009).
Premii i meniuni:
1.
Bursa de excelen a Federaiei Mondiale a Savanilor (FMS) (2002-2003).
2.
The 6th Edition of European Exchibition of Creativity and Innovation EUROINVENT
2014, Iasi, Romania, 22-24 mai 2014.- Medalie de Aur.
3.
Salonul Internaional de Invenii i Inovaii INVENTIKA, Bucureti, Romnia,15-18
octombrie 2014. - Medalie de argint.
4.
Salonul Internaional de Invenii i Inovaii INVENTIKA, Bucureti, Romnia, 15-18
octombrie 2014. - Medalie de bronz.
Date de contact:
Valua Ana, cercettor tiinific,
Laboratorul Ficobiotehnologie
Institutul de Microbiologie i Biotehnologie
al Academiei de tiine a Moldovei
MD 2028, str. Academiei 1, bir.256
Tel.: +373 (22) 72 57 54,
e-mail: annavaluta@yahoo.com
6.

160