Medicin dentar

Biofilm Ring Test o nou metodologie de

evaluare in vitro a eficacitii apelor de
gur
Carola Pentelescu1, Ada Delean1, Dan Pop1,
Viorica Teodorescu3, Laureniu Pascu2
Catedra de Odontologie
Catedra de Protetic Dentar
1,2
Facultatea de Medicin Dentar, Universitatea de Medicin i Farmacie Iuliu
Haieganu, Cluj-Napoca
3
Catedra de Odontologie, Facultatea de Medicin Dentar, Universitatea Ovidius,
Constana
1
2

Rezumat
Biofilmul plcii dentare reprezint factorul etiologic principal al cariei dentare
i bolii parodontale. Prevenia cariei dentare i a afeciunilor parodoniului marginal
vizeaz ndeprtarea biofilmelor orale existente i prevenirea formrii acestora. Apele
de gur sunt mijloace ieftine, uor de utilizat, scopul lor fiind combaterea biofilmelor
i prevenirea apariiei gingivitei. Testarea in vitro a agenilor antiplac trebuie s
precead utilizarea clinic a acestora. Aceasta se realizeaz pe modele experimentale
care imagineaz biofilme create in vitro. Un astfel de model experimental este tehnica
Biofilm Ring Test. Principiul metodei const n adiia unor bile magnetice la soluia
bacterian. Odat cu formarea biofilmelor, bilele magnetice sunt ncorporate n
matricea exopolizaharidic. Dup incubare, biofilmele sunt supuse unui proces de
magnetizare i scanate ntr-un dispozitiv special. Pe baza imaginilor obinute se
calculeaz un Indice de Formare a Biofilmelor (BFI), valorile acestuia indicnd
prezena sau absena biofilmelor. Astfel este posibil depistarea rapid, precis i
reproductibil a biofilmelor.
Cuvinte cheie: biofilme orale, ageni antimicrobieni, Biofilm Ring Test.
Biofilm Ring Test a new Technique of in vitro
evaluation of mouthrinses
Abstract
Oral biofilms are the etiological factor for dental caries and periodontal disease.
Prevention should focus on the removal of existing oral biofilms and inhibition of
new biofilm formation. Mouthrinses are efficient antiplaque and antigingivits agents.
Mouthrinses are tested in vitro before their clinical use. Biofilm models that mimic in
vivo conditions are used for this purpose. Biofilm Ring Test represents a new device
for in vitro biofilm evaluation. The principle of the method consists of the addition of
magnetic microbeads to the bacterial solution. During biofilm formation the beads
are incorporated in the exopolisaccharide matrix. After incubation the biofilms are
read with a special scanner prior and after magnetization. Based on the readings a
Biofilm Forming Index (BFI) is calculated. The BFI values are indicating the presence
or absence of biofilms. The Biofim Ring Test technique is a rapid, precise and
reproducible method for biofilm detection.
Keywords: oral biofilms, antimicrobial agents, Biofilm Ring Test.
Articol intrat la redacie n data de: 27.05.2012
Primit sub form revizuit n data de: 06.06.2012
Acceptat n data de: 11.06.2012
Adresa pentru coresponden: carollinchen@yahoo.com

330

Clujul Medical 2012 Vol. 85 - nr. 3

Articole de orientare
Introducere
Biofilmele au fost descrise din secolul 17, cnd
Leeuwenhoek observa prima oar animaculele din placa
dentar proprie [1]. Dar teoria biofilmului a fost postulat
abia n 1978, cnd cercetri ulterioare privind dinamica
formrii i dezvoltrii biofilmelor au dus la dobndirea
cunotinelor necesare pentru definirea biofilmelor. Astzi
biofilmele sunt definite ca fiind comuniti bacteriene
sesile ataate ireversibil de un substrat sau ntre ele, nglobate ntr-o matrice extracelular de substane polimerice,
pe care celulele bacteriene le-au produs i prezint un
fenotip modificat cu privire la rata de cretere i transcripia
genelor [1]. Orice mediu n care sunt prezente bacterii i
care prezint un flux lichidian este predispus la apariia
biofilmelor [2]. n acest sens, mediul oral reprezint mediul
ideal pentru apariia i instalarea biofilmelor, fiind expus
fluxului salivar constant i prezentnd numeroase i variate
specii bacteriene. Cele peste 700 de specii bacteriene prezente n cavitatea oral [3] se organizeaz la nivelul suprafeelor dentare sub forma plcii dentare. Aceasta reunete
toate caracteristicile structurale i funcionale ale unui
biofilm [4]. Particularitile biofilmului plcii dentare sunt
diversitatea mare de specii bacteriene regsite n acesta
i comunicarea ntre celule sau de la microcomunitate la
macrocomunicate, proces denumit quorum sensing [2].
Scopul acestui proces dinamic desfurat ntre celulele
bacteriene este de a-i semnaliza prezena unele fa de
altele i de a modula expresia genetic ca i rspuns la
modificrile densitii populaionale [2]. Patogenitatea
biofilmului plcii dentare, ca i n cazul altor biofilme,
este consecina rezistenei crescute fa de substanele
antimicrobiene, precum i a incapacitii de a fi fagocitat
de celulele de aprare ale gazdei [2]. Biofilmele orale sunt
unanim acceptate ca fiind factorul cauzal al principalelor
afeciuni ale cavitii orale i anume caria dentar [5] i
boala parodontal [6]. Un loc important n combaterea
acestor afeciuni revine preveniei. OMS atrage atenia
asupra importanei care trebuie acordat preveniei, prin
promovarea unui stil de via ct mai sntos, cu scopul
creterii calitii vieii [7]. De la corelaia demonstrat
de Loe et al. [8] ntre placa dentar i gingivit, pn n
prezent, cercetri microbiologice, imunologice i modele
experimentale de laborator au aprofundat i explicat
corelaia dintre placa dentar i cele dou afeciuni majore
ale cavitii orale [9]. Astfel prevenia cariei dentare i a
afeciunilor parodoniului marginal vizeaz n principal
ndeprtarea biofilmelor orale existente i prevenirea
formrii acestora.
Apele de gur - mijloc complementar de igien oral
ndeprtarea biofilmelor orale de la nivelul suprafeelor dentare se poate realiza profesional n cabinetul
de medicin dentar prin detartraj i periaj profesional.
Dar principala metod de ndeprtare a plcii dentare

rmne periajul dentar efectuat individual la domiciliu. S-a

demonstrat c n timpul periajului dentar nu se realizeaz
igienizarea corect a spaiilor interdentare [10], fiind
necesar utilizarea unor mijloace adjuvante de igienizare
a spaiilor interdentare, cum sunt aa dentar i periuele
interdentare, care permit controlul nivelului de plac din
aceste zone. Studiile au artat c, n medie, n rile Vest
Europene un adult practic periajul dentar n medie un
minut zilnic [9], timp evident insuficient pentru a asigura o
ndeprtare corect a biofilmelor orale. Un alt factor limitant
al eficacitii periajului dentar este lipsa de motivaie
a pacienilor n efectuarea igienizrii orale, precum i
dificultatea medicilor de a motiva pacienii n scopul
meninerii unei igiene orale ct mai corecte. Timpul necesar
pentru a reui motivarea corect a pacientului, exprimat
prin reduceri semnificative ale indicelui de plac este de
3.5 ore [10], interval extrem de lung att pentru medic, ct
i pentru pacient [10]. Pentru a mri eficiena periajului
dentar ntr-un timp mai scurt au aprut periile dentare
electrice. Acestea permit reducerea mai eficient a plcii
dentare, 45% fa de 30% prin periajul manual, necesit un
timp mai scurt de periaj, nu presupun o tehnic complicat
i sunt active i asupra plcii dentare subgingivale [10].
Chiar i n aceste condiii compliana pacienilor fa de
acest instrument de igien oral rmne limitat, ntre 2436% [11], la aceasta adugndu-se i preul de cost relativ
ridicat al acestor dispozitive.
Dificultile de ndeprtare corect a plcii dentare
datorit factorilor mai sus amintii, precum i incidena
mare a gingivitei induse de plac n rndul populaiei,
reprezint argumentul principal n favoarea introducerii
unor mijloace complementare de igien oral. Mai mult,
mucoasa oral este colonizat de un numr mare de
bacterii, majoritatea speciilor prezente n biofilmul plcii
dentare fiind regsite i pe suprafeele mucoasei orale
[12]. Prin exfolierea continu a mucoasei, bacteriile trec n
saliv, fcnd posibil recolonizarea suprafeelor dentare
igienizate, mucoasa servind astfel ca un rezervor permanent
de bacterii [13]. Existena acestor nie la nivelul cavitii
orale, care nu sunt igienizate prin periaj, constituie un alt
argument pentru completarea periajului dentar cu mijloace
suplimentare [13]. Implicaiile bacteriilor orale n apariia
afeciunilor cardiovasculare, a endocarditei bacteriene, a
pneumoniei de aspiraie i asocierea cu nateri premature
[14] reprezint nc un motiv pentru combaterea biofilmelor
orale. Astfel se impune suplimentarea mijloacelor mecanice
de ndeprtare a biofilmelor orale prin introducerea agenilor antimicrobieni. Scopul acestora este de a crete eficiena periajului dentar i de a reduce ncrctura bacterian de
la nivelul cavitii orale. Mecanismul lor de aciune const
fie n prevenirea formrii biofilmelor, fie n distrugerea
biofilmelor deja formate, fie n mpiedicarea creterii i
dezvoltrii biofilmelor sau uciderea anumitor sue bacteriene de la nivelul biofilmelor [15]. Agenii antimicrobieni,
n principal substane chimice, sunt ncorporai n ape de

Clujul Medical 2012 Vol. 85 - nr. 3

331

Medicin dentar
gur, paste de dini, gume de mestecat i altele.
Apele de gur sunt mijloace ieftine ce ofer beneficiul de a fi uor de utilizat, fr a necesita o manualitate
deosebit din partea pacientului. Apele de gur ptrund n
toate zonele cavitii orale, reducnd numrul bacteriilor
att la nivelul suprafeelor dure, ct i la nivelul mucoasei
orale [16]. Scopul lor este de a combate biofilmele orale, de
a preveni apariia gingivitei [9] i progresia parodontopatiei
marginale cronice [16]. Eficacitatea clinic a apelor de
gur a fost demonstrat prin numeroase studii efectuate
pe termen scurt, mediu i lung, care au artat c diversele
substane ncorporate n apele de gur contribuie eficient la
reducerea nivelului de plac i a inflamaiei gingivale [17].
nainte de a fi testai clinic, agenii antiplac sunt testai
in vitro pentru a determina efectul antimicrobian i efectul
asupra biofilmelor orale al acestora.
Testarea eficacitii agenilor
antiplac
O caracterisitic major a bacteriilor care triesc
n biofilme o constituie rezistena acestora fa de agenii
antimicrobieni. Astfel celulele bacteriene din biofilme se
comport diferit fa de agenii antimicrobieni, comparativ
cu celulele n stare planctonic [1]. Apele de gur, n timpul
scurt ct sunt aplicate asupra biofilmelor orale, trebuie s
penetreze matricea extracelular n vederea ptrunderii n
grosimea biofilmelor pentru a fi eficiente asupra bacteriilor
[18]. Din aceste considerente rezultatele obinute prin
testarea efectului antimicrobian asupra celulelor n stare
planctonic vor fi diferite fa de rezultatele obinute prin
testarea aceluiai produs asupra aceleiai sue bacteriene,
cnd aceasta se gsete n interiorul unui biofilm [18].
Pentru a evita aceste neajunsuri i pentru a obine condiii
experimentale mai apropiate de condiiile din cavitatea
oral n timpul cercetrii biofilmelor in vitro, s-au dezvoltat
multiple tehnici experimentale ce urmresc formarea biofilmelor in vitro. Apariia acestor modele experimentale
de formare a biofilmelor in vitro constituie un pas nainte
n cercetarea produselor anti-plac, permind testarea
agenilor antimicrobieni asupra biofilmelor orale [9].
Unele din aceste modele experimentale realizeaz formarea
biofilmelor n stare dinamic, cum ar fi Constant Depth
Film Fermenter, dezvoltat de Pratten et al. [19] sau formarea
biofilmelor n dispozitive speciale, cum sunt spre exemplu
camerele Ludin n care soluia bacterian este angajat
ntr-un flux continuu cu autorul unei pompe peristaltice.
Alte modele experimentale se bazeaz pe formarea static
a biofilmelor. Dintre aceste metode, cea mai cunoscut este
tehnica cristal violet de cercetare a biofilmelor sau modelul
dezvoltat de Guggenheim et al., n care biofilmele sunt
formate pe discuri de hidroxiapatit [20]. O nou tehnic
de cercetare a biofilmelor orale in vitro este Tehnologia
Biofilm Ring Test, dezvoltat de Biofilm Control Saint
Beauzire, Frana.

332

Tehnologia Biofilm Ring Test

Dispozitivul Biofilm Ring Test cuprinde un set de
aparate necesare pentru formarea i evaluarea biofilmelor.
Kit-ul complet de efectuare a analizei biofilmului prin
tehnologia Biofilm Ring Test cuprinde:
- Un flacon Toner 0.05 sau 0.06, care conine soluia
cu bile magnetice;
- Un flacon soluie de contrast;
- 12 barete de polistiren a cte 8 godeuri fiecare;
- Un dispozitiv de magnetizare care prezint 96
de poziii. n dispozitivul de magnetizare pot fi aezate
12 barete a cte 8 godeuri fiecare, deci pot fi magnetizate
12 barete odat. Baretele de polistiren sunt aezate n
dispozitivul de magnetizare, astfel nct centrului fiecrui
godeu s i corespund unui centru de magnetizare;
- Un scanner special Biofilm Reader (Saint
Beauzire, France), utilizat pentru lecturarea baretelor
nainte i dup magnetizare;
- Un calculator dotat cu un software special, n care
vor fi stocate si analizate datele primite de la scanner;
- Un software special Biofilm Control Elements
(Saint Beauzire, France), conceput special pentru compararea imaginilor i calcularea Indicelui de Formare a
Biofilmului BFI.
Principiul metodei
Principiul metodei Biofilm Ring Test a fost descris
pe larg de Chavant et al. [21]. Se bazeaz pe adiia la soluia
bacterian a unor bile magnetice cu diametrul de 5 sau 6
microni. Bilele magnetice se gsesc n soluia de Toner,
iar proporia de adugare a Tonerului la soluia bacterian
este de 1%. Amestecul soluie bacterian-bile magnetice va
fi inoculat n barete de polistiren a cte 8 godeuri fiecare.
Soluia bacterian este apoi incubat timpul necesar pentru
formarea biofilmelor, specific pentru fiecare bacterie n
parte. Se vor respecta de asemenea condiiile de aerobioz
sau anaerobioz necesare dezvoltrii biofilmelor bacteriene. Odat cu iniierea formrii biofilmelor bacteriile
vor sintetiza matricea exopolizaharidic. Bilele magnetice
adugate la soluia bacterian vor fi cuprinse n interiorul
matricii exopolizaharidice, fiind reinute astfel ferm n
interiorul biofilmului. Dup perioada de incubare n godeuri
se va aduga un lichid de contrast care va permite lecturarea
baretelor n scannerul special Biofilm Reader. Dup prima
lectur datele culese de scanner vor fi trimise n calculator,
fiind interpretate i stocate de software-ul special Biofilm
Control Elements. Baretele vor fi introduse apoi n
dispozitivul special de magnetizare i vor fi magnetizate
timp de 1 minut. Bilele care nu au fost reinute n matricea
exopolizaharidic n timpul formrii biofilmului, vor fi
atrase spre centrul godeului, formnd un inel de culoare
roie. Dup magnetizare se va efectua o a doua lectur care
va permite detectarea bilelor magnetice depuse pe baza
godeului (Fig. 1). Datele culese dup aceast a doua lectur
vor fi transmise, interpretate i stocate de asemenea n

Clujul Medical 2012 Vol. 85 - nr. 3

Articole de orientare
calculator. Din compararea imaginilor obinute dup prima
i cea de-a doua lectur pentru fiecare godeu se va calcula
o valoare denumit Indice de Formare a Biofilmului BFI.
Astfel un BFI inferior lui 2 indic formarea complet a
biofilmului, un BFI superior lui 7 arat absena biofilmului,
iar valorile intermediare se traduc prin biofilme n curs de
formare [21].

un potenial inhibitor al formrii biofilmelor de

Streptococcus. mutans, prin inhibarea semnalelor de tip
quorum sensing trimise de aceste bacterii [22].
Tehnologia Biofilm Ring Test este o tehnic rapid
de studiu a dezvoltrii biofilmelor, fiind potrivit i pentru
studiul dinamic al formrii biofilmelor, aa cum arat
Nagant et al. [23].

Fig. 1 Ilustreaz imaginea afiat de calculator dup a doua

scanare a baretei. Godeurile 1,3,4,7,8 arat absena complet
a biofilmului. Inelul rou la baza godeului apare ca urmare a
atraciei bilelor magnetice n aceast arie n timpul magnetizrii.
n godeurile 2,5,6 lipsa inelului rou exprim prezena unui
biofilm complet format.

Concluzii
Avantajele acestei metode sunt simplitatea de
manipulare, rapiditatea i reproductibilitatea foarte mare
[21]. Este o tehnic care nu necesit metode laborioase,
care nu implic multiple faze de laborator sau tehnici
sofisticate i nici o tehnologie foarte extins de laborator.
Face posibil efectuarea unui numr mare de teste simultan
i permite testarea concomitent a mai multor produse
asupra biofilmelor n aceleai condiii experimentale.

Metode de cercetare a biofilmelor

orale cu tehnologia Biofilm Ring Test
Tehnica Biofilm Ring Test poate fi aplicat n
mai multe moduri n vederea cercetrii efectului agenilor
antiplac asupra biofilmelor orale.
O prim metod o constituie pretratarea suprafeelor
godeurilor o anumit perioad de timp cu produsul care
urmeaz s fie testat. Apoi din godeuri se elimin produsul
testat i se aplic soluia bacterian. Baretele se vor incuba
n condiii corespunztoare perioada de timp necesar
formrii biofilmelor. n urmtoarea etap, baretele vor fi
lecturate i se vor interpreta rezultatele n funcie de valorile
BFI obinute. n absena formrii biofilmelor, BFI mai mare
dect 7, produsul poate fi considerat ca un produs eficient
n inhibarea adeziunii bacteriilor pe suprafeele pretratate.
O alt modalitate de testare a aciunii produselor
asupra biofilmelor const n formarea iniial a biofilmelor
pe suprafaa godeurilor. n acest sens soluia bacterian
va fi inoculat n godeuri i acestea vor fi incubate timpul
necesar respectnd condiiile de cretere a bacteriilor.
Ulterior soluia bacterian va fi eliminat prin aspirare
atent i n godeuri va fi inoculat produsul de testat i lsat
sa acioneze asupra biofilmelor o anumit perioad de timp.
Baretele vor fi ulterior lecturate cu scannerul special, iar
rezultatele vor fi interpretate n funcie de valorile BFI. Prin
aceast metodologie de lucru se poate analiza capacitatea
produsului testat de a detaa biofilmele deja formate de la
nivelul suprafeelor unde acestea s-au constituit.
Un alt mecanism de aciune care poate fi testat prin
tehnologia Biofilm Ring Test este acela al unor substane
de a interfera cu formarea biofilmelor. n acest sens soluia
bacterian este mixat cu produsul de testat, iar acestea vor
fi inoculate concomitent n godeuri i incubate n condiii
optime. Dup lecturarea baretelor cu scanner-ul special,
rezultatele sunt corelate cu valorile BFI. Un studiu a fost
efectuat n acest sens cu furanona C30 care s-a dovedit a fi

Bibliografie
1. Donlan M, Costerton WJ. Biofilms: Survival Mechanisms
of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology
Reviews, 2002; 15:167193
2. Thomas JC, Lindsay A, Nakaishi BS. Managing the complexity
of a dynamic biofilm. JADA, 2006; 137(Suppl 3):10-15
3. Sokransky S, Haffajee A. Periodontal microbial ecology.
Periodontology, 2000 2005; 38:135187
4. Marsh PD. Dental Plaque as a Microbial Biofilm. Caries Res,
2004; 38:204211
5. ten Cate J. Biofilms, a new approach to the microbiology of
dental plaque. Odontology, 2006; 94:1-9
6. Newman M.G, Takei H, Caranza F. Caranzas Clinical
Periodontology, Saunders Company, 9th Edition,
7.
Petersen PE. WHO global policy for improvement of oral health
World Health Assembly 2007. Journ Dent Res 2008;58:115121
8. Loe H, Theilande E, Jensen B. Experimental gingivitis in man.
Journ Period Res ,1967;2: 282-289
9. Baehni P, TakeuchiY. Anti-plaque agents in the prevention of
biofilm-associated oral diseases. Oral Diseases, 2003; 9 (Suppl
1): S23S29
10. Petersilka G, Ehmke B, Flemmig T. Antimicrobial effects of
mechanical debridement. Periodontology, 2000 2002; 28:56-71
11. McCracken G, Janssen J, Heasman L, et al. Assessing
adherence with toothbrushing instructions using a data logger
toothbrush. Br Dent J, 2005; 198:29-32;
12. Mager DL, Ximenez-Fyvie LA, Haffajee AD, Socransky SS.
Distribution of selected bacterial species on intraoral surfaces. J
Clin of Period, 2003; 30:644654.
13. Barnett M. The rationale for the daily use of an antimicrobial
mouthrinse. JADA, 2006;137( Suppl 3):16S-21S
14. Suzuki N, Yoshida A, Nakano Y. Quantitative Analysis of
Multi-Species Oral Biofilms by TaqMan Real-Time PCR. Clin
Med Res, 2005; 3: 176185
15. Wilson M. Susuceptibility of oral bacterial biofilms to
antimicrobial agents. J. Med Microb, 1996; 44 : 79-87
16. Lamster I. The Antimicrobial mouthrinses and the management
of periodontal diseases: Introduction to the supplement. JADA,
2006; 137(Suppl 3):5S-9S

Clujul Medical 2012 Vol. 85 - nr. 3

333

Medicin dentar
17. Gunsolley J. A meta-analysis of six month clinical studies
of anti-plaque and anti-gingivitis agents. JADA, 2006;137:16491657
18. Barnett M. The role of therapeutic antimicrobial mouthrinses
in clinical practice. Control of supragingival plaque and gingivitis.
JADA, 2003; 134:699-704
19. Pratten J, Wills K, Barnett P, Wilson M. In vitro studies of the
effect of antiseptic-containing mouthwashes on the formation and
viability of S sanguis biofilm formation. Journ of Appl Microb,
1998; 84:1149-1155
20. Guggenheim B, Giertsen E, Schupbachl P, Shapiro S.

334

Validation of an in vtro biofilm modelof supragingival plaque. J

Dent Res, 2001; 80:363-370
21. Chavant P, Gaillard-Martinie B, Talon R, Hbraud M,
Bernardi T. A new device for rapid evaluation of biofilm formation
potential by bacteria. J Microbiol Methods, 2007; 68:605-612.
22. Wang Y, Wang Q, Hu Y. Effect of furanone C-30 on initial
biofilm formation of Streptococcus mutans. Oral Biomedicine,
2012; 3: 1-4
23. Nagant C, Tr-Hardy M, Devleeschouwer M, Dehaye JP.
Study of the initial phase of biofilm formation using a biofomic
approach. J Microbiol Methods, 2010; 82:243-248

Clujul Medical 2012 Vol. 85 - nr. 3