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Fundao Nacional de Sade

Manual Prtico de
Anlise de gua
4 edio

Braslia, 2013

Copyright 2004 Fundao Nacional de Sade.


Todos os direitos reservados. permitida a reproduo parcial ou total desta obra, desde
que citada a fonte e que no seja para venda ou qualquer fim comercial.
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na pgina: http://www.saude.gov.br/editora
Tiragem: 4 edio 2013 %.000 exemplares
Elaborao, distribuio e informaes:
MINISTRIO DA SADE
Fundao Nacional de Sade
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Coordenao de Controle da Qualidade da gua
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Tel.: (61) 3314-6670 / 6396
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Editor:
Coordenao de Comunicao Social
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CEP: 70070-040, Braslia DF
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Impresso no Brasil / Printed in Brazil
Ficha Catalogrfica
Brasil. Fundao Nacional de Sade.
Manual prtico de anlise de gua / Fundao Nacional de Sade 4. ed. Braslia
: Funasa, 2013.
150 p.
ISBN
1. Anlise da gua. 2. Controle da qualidade da gua. 3. Consumo de gua (Sade
ambiental). I. Ttulo. II. Srie.
CDU 628
Ttulos para indexao:
Em ingls: Practical manual on water analysis
Em espanhol: Manual prctico de anlisis de agua

Sumrio
Apresentao..................................................................5
Exame bacteriolgico da gua.........................................7
Introduo.................................................................9
Bactrias do grupo coliforme..................................11
Material utilizado em bacteriologia.........................13
Preparo do material de vidro...................................14
Preparao dos meios de cultura.............................15
Modo de usar a gua de diluio quando for
determinar o NMP de coliformes.............................17
Coleta de amostras de gua para exames
bacteriolgicos........................................................18
Procedimentos para o exame..................................21
-- Coliformes totais TM.........................................21
-- Coliformes termotolerantes TM.........................26
-- Contagem de bactrias heterotrficas...................28
-- Coliformes totais MF.........................................29
-- Coliformes termotolerantes MF..........................32
-- Coliformes totais e Escherichia coli......................36
Esterilizao............................................................38
Anlises fsico-qumicas da gua ..................................41
Anlises Titulomtricas............................................43
-- Alcalinidade total.................................................43
-- Gs carbnico livre..............................................46
-- Cloretos...............................................................48
-- pH.......................................................................54
Anlises colorimtricas...........................................56
-- Cloro residual livre...............................................56
-- Cor.......................................................................57

-- Alumnio..............................................................59
-- Turbidez...............................................................63
-- Temperatura.........................................................67
-- Fluoretos..............................................................68
-- Coleta e preservao de amostras para anlise
fsico-qumicas.....................................................73
-- Ensaio de coagulao (Jar-test).............................74
-- Determinao do teor de cloro ativo....................80
Preparao dos reagentes utilizados nas anlises
constantes nesse manual...............................................83
Reagentes para alcalinidade....................................85
Reagentes para CO2................................................87
Reagentes para anlise de cloretos..........................89
Reagentes para anlise de dureza............................91
Reagentes para anlise de alumnio........................94
Reagentes para anlise de fluoretos.........................96
Regras gerais para corrigir as solues tituladas......99
Limpeza de material de vidro no laboratrio.........100
Relao de materiais de laboratrio de anlise
de gua.................................................................102
Biossegurana em laboratrio...............................107
Apndice A Coleta e preservao de amostras
para contagem de clulas de cianobactrias e
cianotoxinas................................................................ 111
Apndice B Determinao de Giardia sp e
Cryptosporidium sp em gua.......................................119
Bibliografia..................................................................143
Elaborao..................................................................147

Apresentao
Esse manual, elaborado de forma e linguagem simples, tem
como objetivo auxiliar pessoas que trabalham nos laboratrios de controle da qualidade da gua de estaes de
tratamento de pequeno e mdio portes no desenvolvimento
de suas atividades dirias.
A ideia surgiu da necessidade de se ter no laboratrio um
instrumento de consulta que pudesse acompanhar os passos
do tcnico a todo instante e em qualquer lugar.
Nele esto descritos os procedimentos mais comuns realizados rotineiramente no laboratrio de uma Estao de
Tratamento de gua (ETA). Todas as tcnicas adotadas nesse
manual atendem ao Artigo 22 da Portaria n 2.914/2011 do
Ministrio da Sade, estando de acordo com as normas nacionais e internacionais mais recentes, tais como: I) Standard
Methods for the Examination of Water and Wastewater de
autoria das instituies American Public Health Association
(APHA), American Water Works Association (AWWA) e
Water Environment Federation (WEF); II) United States Environmental Protection Agency (USEPA); III) Normas publicadas pela International Standartization Organization (ISO);
e Metodologias propostas pela Organizao Mundial da
Sade (OMS). Para qualquer procedimento abordado aqui
que necessite de um conhecimento mais profundo, deve-se
consultar os grandes compndios que tratam do assunto.
A primeira parte do manual aborda os exames bacteriolgicos envolvendo a pesquisa de coliformes totais e termotolerantes, inclusive Escherichia coli, e a contagem padro
de bactrias heterotrficas, desde a preparao do material
a ser utilizado, passando pela realizao dos ensaios, at
a emisso de resultados. Na segunda parte, esto descritas
as tcnicas das anlises fsico-qumicas e testes de rotina de

uma ETA e, finalmente, a preparao de todos os reagentes


utilizados. Foram includos, tambm, alguns procedimentos
de biossegurana em laboratrio, bem como uma relao de
equipamentos e materiais de laboratrio.
No Apndice I, so apresentadas as tcnicas de coleta e
preservao de amostras para contagem de clulas de cianobactrias e cianotoxinas. No Apndice II, a tcnica de
determinao de Giardia sp e Cryptosporidium sp em gua
pela tcnica de filtrao, separao imunomagntica e microscopia de imunofluorescncia.
Acredita-se que os parmetros aqui descritos so suficientes
para monitorar o controle da qualidade da gua distribuda
para consumo humano.
O exame da gua destinada ao consumo humano de fundamental importncia, uma vez que permite aferir a ausncia
ou no de micro-organismos ou substncias qumicas nela
presentes, que podem ser prejudiciais sade das pessoas.

Exame bacteriolgico da gua


Coliformes totais
Coliformes termotolerantes
Bactrias heterotrficas

Introduo

A deteco e quantificao de todos os micro-organismos


patognicos potencialmente presentes na gua trabalhosa,
demanda tempo, os custos so elevados e nem sempre se
obtm resultados positivos ou que confirmem a presena
dos micro-organismos.
O objetivo do exame microbiolgico da gua fornecer
subsdio a respeito da sua potabilidade, isto , ausncia de
risco de ingesto de micro-organismos causadores de doenas, geralmente provenientes da contaminao pelas fezes
humanas e outros animais de sangue quente. Vale ressaltar
que os micro-organismos presentes nas guas naturais so,
em sua maioria, inofensivos sade humana. Porm, na
contaminao por esgoto sanitrio esto presentes micro-organismos que podero ser prejudiciais sade humana.
Os micro-organismos patognicos incluem vrus, bactrias,
protozorios e helmintos.
Na tabela esto relacionadas algumas doenas veiculadas
pela gua e seus agentes.
Doenas
Origem bacteriana entes
Febre tifoide e paratifoide
Disenteria bacilar
Clera
Gastroenterites agudas e Diarreias

Origem viral
Hepatite A e E
Poliomielite
Gastroenterites agudas e
crnicas

Origem parasitria
Disenteria amebiana
Gastroenterites

Agentes patognicos
Salmonella typhi
Salmonella parathyphi A e B
Shigella sp
Vibrio cholerae
Escherichia coli enterotxica Campylobacter
Yersnia enterocoltica
Salmonella sp
Shigella sp
Vrus da hepatite A e E
Vrus da poliomielite
Vrus Norwalk
Rotavirus
Enterovirus
Adenovirus

Entamoeba histolytica
Girdia lmblia
Cryptosporidium

Fonte: OPAS, 1999


Manual Prtico de Anlise de gua

A gua potvel no deve conter micro-organismos patognicos e deve estar livre de bactrias indicadoras de contaminao fecal. Como indicadores de contaminao fecal, so
eleitas como bactrias de referncia as do grupo coliforme.
O principal representante desse grupo de bactrias chama-se
Escherichia coli.
A razo da escolha desse grupo de bactrias como indicador
de contaminao da gua deve-se aos seguintes fatores:
a. So encontradas nas fezes de animais de sangue
quente, inclusive dos seres humanos.
b. So facilmente detectveis e quantificveis por
tcnicas simples e economicamente viveis, em
qualquer tipo de gua.
c. Sua concentrao na gua contaminada possui
uma relao direta com o grau de contaminao
fecal desta.
d. Tem maior tempo de sobrevivncia na gua que
as bactrias patognicas intestinais, por serem
menos exigentes em termos nutricionais, alm
de serem incapazes de se multiplicarem no ambiente aqutico ou se multiplicarem menos que
as bactrias entricas.
e. So mais resistentes aos agentes tensoativos e
agentes desinfetantes do que bactrias patognicas.
A Portaria n 2.914/2011 do Ministrio da Sade (Portaria de
Potabilidade) estabelece que seja verificada, na gua para
consumo humano para garantir sua potabilidade, a ausncia de coliformes totais e Escherichia coli e determinada a
contagem de bactrias heterotrficas.

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A mesma portaria determina que a contagem de bactrias heterotrficas deva ser realizada como um dos parmetros para
avaliar a integridade do sistema de distribuio (reservatrio
e rede), devendo ser feita em 20% das amostras mensais de
coliformes totais nos sistemas de distribuio, recomendando
que no deva exceder a 500 Unidades Formadoras de Colnias por 1 mililitro de amostra (500 UFC/mL).
Para a conformidade do padro microbiolgico de potabilidade obrigatrio a ausncia de coliformes totais em 100
mL de amostra na sada do tratamento. No entanto, conforme
Anexo I da Portaria MS n 2.914/2011, admite-se a presena
de coliformes totais em apenas 1 amostra mensal para sistemas ou solues coletivas que abastecem menos de 20.000
habitantes e em 5% das amostras mensais em sistemas ou
solues coletivas que abastecem mais de 20.000 habitantes.
Ressalta-se que em ambas as situaes no permitida a
presena de Escherichia coli na gua para consumo humano.

Bactrias do grupo coliforme


Conceitos:
Coliformes totais (bactrias do grupo coliforme) - bacilos
gram-negativos, aerbios ou anaerbios facultativos, no
formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de desenvolver na presena de sais biliares ou agentes tensoativos que
fermentam a lactose com produo de cido, gs e aldedo
a 35,0 0,5oC em 24-48 horas, e que podem apresentar
atividade da enzima - galactosidase. A maioria das bactrias do grupo coliforme pertence aos gneros Escherichia,
Citrobacter, Klebsiella e Enterobacter, embora vrios outros
gneros e espcies pertenam ao grupo.

Manual Prtico de Anlise de gua

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Coliformes termotolerantes - subgrupo das bactrias do


grupo coliforme que fermentam a lactose a 44,5 0,2oC em
24 horas; tendo como principal representante a Escherichia
coli, de origem exclusivamente fecal.
Escherichia coli - bactria do grupo coliforme que fermenta
a lactose e manitol, com produo de cido e gs a 44,5
0,2oC em 24 horas, produz indol a partir do triptofano, oxidase negativa, no hidroliza a ureia e apresenta atividade
das enzimas galactosidase e glucoronidase, sendo considerado o mais especfico indicador de contaminao fecal
recente e de eventual presena de organismos patognicos.
A origem fecal da E. coli inquestionvel e sua natureza
ubqua pouco provvel, o que valida seu papel mais preciso
de organismo indicador de contaminao tanto em guas
naturais quanto tratadas.
A Contagem Padro de Bactrias muito importante durante
o processo de tratamento da gua, visto que permite avaliar
a eficincia das vrias etapas do tratamento.
importante, tambm, conhecer a densidade de bactrias,
tendo em vista que um aumento considervel da populao
bacteriana pode comprometer a deteco de organismos
coliformes. Embora a maioria dessas bactrias no seja
patognica, pode representar riscos sade, como tambm
deteriorar a qualidade da gua, provocando odores e sabores
desagradveis.

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Material utilizado em bacteriologia


a) autoclave;
b) estufa bacteriolgica;
c) estufa de esterilizao e secagem;
d) balana;
e) destilador;
f) banho-maria;
g) contador de colnias;
h) ala de platina com cabo;
i) tubo de Durhan;
j) tubo de ensaio;
k) algodo em rama;
l) meios de cultura;
m) frascos de coleta;
n) pipetas graduadas;
o) pipetador;
p) papel-alumnio;
q) lamparina a lcool ou bico de Bunsen;
r) placas de Petri;
s) pina de ao inox;
t) membranas filtrantes;
u) porta-filtro de vidro ou ao inox;
v) lmpada ultravioleta.

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Preparo do material de vidro


Tubos de ensaio
a) colocar o tubo de Durhan na posio invertida dentro do
tubo de ensaio;
b) tampar o tubo de ensaio com um chumao de algodo
em rama.

Frascos de coleta
a) colocar duas gotas (0,1 mL) de Tiossulfato de Sdio a 10%
dentro do frasco;
b) colocar uma tira de papel-alumnio entre a boca e a tampa
do frasco;
c) envolver a boca e tampa do frasco em papel-alumnio.

Pipetas
a) colocar um pequeno chumao de algodo no bocal da
pipeta;
b) envolv-la em papel-alumnio ou papel-madeira(Kraft).

Placas de petri de vidro


a) envolv-las em papel-alumnio ou papel-madeira.
Nota: Frascos de coleta, pipetas e placas de Petri devem ser esterilizados e antes de serem preparados devem estar limpos e
secos (ver esterilizao pg. 38).

Meios de cultura
a) caldo lactosado;
b) caldo lactosado verde brilhante Bile a 2%;
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c) caldo EC;
d) Plate Count Agar.

Preparao dos meios de cultura


Caldo lactosado de concentrao dupla
a) pesar 26 gramas do meio de cultura e dissolver em 1.000
mL de gua destilada;
b) distribuir em tubos de ensaio (10 mL em cada tubo),
tampar os tubos;
c) esterilizar a 121oC (1 Kg/cm2 de presso) em autoclave
durante 15 minutos;
d) deixar esfriar;
e) guardar no refrigerador (vlido por uma semana).

Caldo lactosado de concentrao simples


a) pesar 13 gramas do meio de cultura desidratado e dissolver em 1.000 mL de gua destilada;
b) distribuir em tubos de ensaio (10 mL em cada tubo),
tampar os tubos;
c) esterilizar a 121oC (1 Kg/cm2 de presso) em autoclave
durante 15 minutos;
d) deixar esfriar;
e) guardar no refrigerador (vlido por uma semana).

Caldo lactosado verde brilhante bile a 2%


a) pesar 40 gramas do meio de cultura desidratado e dissolver em 1.000 mL de gua destilada;
Manual Prtico de Anlise de gua

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b) distribuir em tubos de ensaio (10 mL em cada tubo),


tampar os tubos;
c) esterilizar a 121oC (1 Kg/cm2 de presso) em autoclave
durante 15 minutos;
d) deixar esfriar;
e) guardar no refrigerador (vlido por uma semana).

Meio EC
a) pesar 37,0 gramas do meio desidratado e dissolver em
1000 mL de gua destilada;
b distribuir em tubos de ensaio contendo o tubo Durhan
invertido, 10 mL em cada tubo, tampar os tubos;
c) esterilizar a 121oC (1Kg/cm2 de presso) em autoclave
durante 15 minutos;
d) guardar no refrigerador (vlido por 96 horas).

Plate Count Agar


a) pesar 20,5 gramas do meio de cultura desidratado e dissolver em 1000 mL de gua destilada fria;
b) deixar em repouso durante 5 minutos;
c) aquecer, agitando frequentemente com basto de vidro,
at completa dissoluo do meio (durante o aquecimento
no deixar entrar em ebulio);
d) se necessrio, ajustar o pH para 7,0 com Hidrxido de
Sdio soluo normal (NaOH 1N);
e) distribuir em tubos de ensaio com tampa roscvel (12 mL
em cada tubo);
f) esterilizar a 121oC (1 Kg/cm2 de presso) em autoclave
durante 15 minutos.
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Notas: 1. Esse meio, depois de frio, se solidifica. Fundir em banho-maria antes de us-lo.

2. Devido variedade de meios de culturas existentes no
mercado, seguir sempre as instrues do fabricante, que
vm estampadas no rtulo do frasco.

gua de diluio
Soluo 1
- pesar 34 gramas de fosfato de potssio monobsico
(KH2PO4) e dissolver em 500 mL de gua destilada, ajustar
o pH para 7,2 com soluo hidrxidos de sdio, soluo
1N e diluir a 1 litro com gua destilada. Normalmente
so necessrios 175 mL de NaOH 1N para elevar o pH.
Soluo 2
- pesar 81,1 gramas de cloreto de magnsio hexahidratado
(MgCl2.6H2O) e dissolver em 1 litro de gua destilada.
Soluo 3
- adicionar 1,25 mL da soluo 1 e 5 mL da soluo 2 a
1 litro de gua destilada. Distribuir em tubos de ensaio
em quantidade que, aps autoclavao, assegurem um
volume de 9 0,2 mL.
- esterilizar em autoclave a 121oC (1Kg/cm2 de presso)
durante 15 minutos.

Modo de usar a gua de diluio quando for


determinar o NMP de coliformes
a) tomar 1 tubo de ensaio contendo 9 0,2 mL de gua de
diluio esterilizada;
b) adicionar 1 mL da amostra de gua a ser examinada;
c) misturar bem. Est pronta a diluio 1:10;
Manual Prtico de Anlise de gua

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d) tirar da diluio acima, com pipeta esterilizada, 1 mL e


inocular no tubo contendo caldo lactosado de concentrao simples. (diluio 1:100).

Coleta de amostras de gua para exames


bacteriolgicos
A coleta de amostra um dos passos mais importante para
a avaliao da qualidade da gua. Portanto, essencial que
a amostragem seja realizada com precauo e tcnica para
evitar todas as fontes de possvel contaminao.
As amostras devem ser coletadas em frascos de vidro branco,
boca larga, com tampa de vidro esmerilhada, bem ajustada,
capacidade de 125 mL, previamente esterilizados ou saco
plstico estril, descartvel, contendo pastilha de tiossulfato
de sdio.
Os frascos para a coleta de guas cloradas devem receber,
antes de serem esterilizados, 0,1 mL (2 gotas) de tiossulfato
de sdio a 10%.

Procedimentos para coleta em residncias


a) lavar as mos com gua e sabo;
b) limpar a torneira do usurio com um pedao de algodo
embebido em lcool, 70% e/ou hipoclorito de sdio
100mg/L;
c) abrir a torneira e deixar escorrer a gua durante 1 ou 2
minutos;
d) coletar a amostra de gua;
e) encher com pelo menos 3/4 de seu volume;

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Fundao Nacional de Sade

f) tampar o frasco, identific-lo, anotando endereo, hora,


e nome do coletor, etc;
g) marcar o frasco com o nmero da amostra, correspondente ao ponto de coleta;
h) preencher a ficha de identificao da amostra de gua;
i) colocar o frasco da amostra na caixa de isopor com gelo;
j) lacrar, identificar e enviar a caixa para o laboratrio.
O tempo de coleta e a realizao do exame no devem
exceder 24 horas.
Nota: Alm de residncias as amostras podem ser coletadas em
hospitais, escolas, torneiras pblicas e pontos considerados
vulnerveis. No caso de utilizao do hipoclorito de sdio
para desinfeco da torneira, deve-se remov-lo completamente antes da coleta.

Manual Prtico de Anlise de gua

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Fases do procedimento

Fonte: OMS, 1998 (adaptado)

Outros locais de coleta


Nas estaes de tratamento, as amostras podem ser coletadas na captao, chegada da gua bruta antes do canal da
Parshall, nos decantadores, na sada dos filtros e nos reservatrios de gua tratada.

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Fundao Nacional de Sade

Procedimentos para o exame


Coliformes totais
Mtodo dos tubos mltiplos (TM)
Material necessrio
a) tubo de ensaio;
b) estante para tubo de ensaio;
c) tubo de Durhan;
d) pipeta graduada de 10 mL;
e) pipeta graduada de 1 mL;
f) bico de Bunsen ou lamparina a lcool;
g) caldo Lactosado de concentrao dupla;
h) caldo Lactosado de concentrao simples;
i) caldo Lactosado Verde Brilhante Bile a 2%;
j) gua de diluio;
k) ala de platina com cabo de Kolle;
l) estufa bacteriolgica.

Execuo do teste
Teste presuntivo
a) tomar uma bateria contendo 15 tubos de ensaio distribudos de 5 em 5;
b) nos primeiros 5 tubos, (os que contm caldo lactosado
de concentrao dupla) inocular, com pipeta esteriliManual Prtico de Anlise de gua

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zada, 10 mL da amostra de gua a ser examinada, em


cada tubo. (Diluio 1:1);
c) nos 10 tubos restantes (os que contm caldo lactosado
de concentrao simples), inocular nos 5 primeiros 1
mL da amostra (Diluio 1:10) e nos 5 ltimos tubos,
inocular 0,1 mL da amostra, em cada tubo. (Diluio
1:100). Ver pgina 15;
d) misturar;
e) incubar a 35 0,5oC durante 24/48 horas;
f) se no final de 24/48 horas, houver a formao de gs
dentro do tubo de Durhan, significa que o teste presuntivo foi Positivo. Neste caso, fazer o teste confirmativo.
Se no houver a formao de gs durante o perodo de
incubao, o exame termina nessa fase e o resultado
do teste considerado negativo.
Observao: No lugar do caldo lactosado pode ser usado o
caldo Lauril Triptose.
Teste confirmativo
a) tomar o nmero de tubos do teste presuntivo que deram
Positivos (formao de gs) nas 3 diluies 1:1; 1:10 e
1:100;
b) tomar igual nmero de tubos contendo o meio de
cultura verde brilhante Bile a 2%;
c) com a ala de platina, previamente flambada e fria,
retirar de cada tubo positivo uma poro de amostra
e inocular no tubo correspondente contendo o meio
verde brilhante. Esse procedimento chama-se repicagem;
d) identificar os tubos;
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Fundao Nacional de Sade

e) incubar durante 24/48 horas a 35 0,5oC;


f) se no final do perodo de 24/48 horas houver a formao de gs dentro do tubo de Durhan o teste
considerado positivo. Caso no haja formao de gs,
o teste considerado negativo.

Fases de teste

Inocular em CL ou CLT e
inocular por 24 2 hs a 35
0,50C
(A) Formao de gs ou crescimento forte.
Confirmar em VB a 35 0,50C
durante 24/48 horas

1) No produz gs.
Ausncia do grupo
coliforme

2) Produz gs.
Grupo coliforme
confirmado.

(B) Ausncia de gs ou produo duvidosa. Incubar por


+ 24 horas

1) Produo de gs ou
produo duvidosa e crescimento forte.
Confirmar como em (A)

2) Ausncia de gs. teste


negativo para o grupo
coliforme

Nota: CL = caldo lactosado


CLT = caldo lauril triptose
VB = verde brilhante bile a 2%

Manual Prtico de Anlise de gua

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Expresso dos resultados


a) os resultados so expressos em NMP (Nmero Mais Provvel) /100 mL de amostra.
b) para se determinar o NMP, verifica-se a combinao formada pelo nmero de tubos positivos que apresentaram
as diluies 1:1; 1:10 e 1:100 no Teste Confirmativo.

Exemplo:
a) nos 5 tubos da diluio 1:1, obtiveram-se 3 tubos positivos;
b) nos 5 tubos da diluio 1:10, obtiveram-se 2 tubos positivos;
c) nos 5 tubos da diluio 1:100, obteve-se 1 tubo positivo;
d) formou-se, portanto, a combinao 3-2-1;
e) determina-se o NMP consultando a Tabela 1.
Se no quiser trabalhar com 15 tubos para determinar o
NMP. fazer apenas 5 tubos na diluio 1:1 (10 mL do meio
de cultura + 10 mL da amostra) e calcular o NMP. consultando a tabela 2.

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Fundao Nacional de Sade

Tabela 1 NMP. com limite de confiana de 95% para vrias


combinaes de resultados positivos quando 5 tubos so
usados para cada diluio (10 mL, 1,0 mL e 0,1 mL)
Combinao
de positivos

NMP./100 mL

0-0-0
0-0-1
0-1-0
0-2-0
1-0-0
1-0-1
1-1-0
1-1-1
1-2-0
2-0-0
2-0-1
2-1-0
2-1-1
2-2-0
2-3-0
3-0-0
3-0-1
3-1-0
3-1-1
3-2-0
3-2-1
4-0-0
4-0-1
4-1-0
4-1-1
4-1-2
4-2-0
4-2-1
4-3-0
4-3-1
4-4-0
5-0-0
5-0-1
5-0-2
5-1-0
5-1-1
5-1-2
5-2-0
5-2-1
5-2-2
5-3-0
5-3-1
5-3-2
5-3-3
5-4-0
5-4-1
5-4-2
5-4-3
5-4-4

<2
2
2
4
2
4
4
6
6
4
7
7
9
9
12
8
11
11
14
14
17
13
17
17
21
22
26
26
27
33
34
23
30
40
30
50
60
50
70
90
80
110
140
170
130
170
220
280
350

Limites
Inferior

Superior

1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
2.0
2.0
1.0
2.0
2.0
3.0
3.0
5.0
3.0
4.0
4.0
6.0
6.0
7.0
5.0
7.0
7.0
9.0
12
9.0
12
12
15
16
9
10
20
10
20
30
20
30
40
30
40
60
80
50
70
100
120
160

10
10
13
11
15
15
18
18
17
20
21
24
25
29
24
29
29
35
35
40
38
45
46
55
63
56
65
67
77
80
86
110
140
120
150
180
170
210
250
250
300
360
410
390
480
560
690
820

Manual Prtico de Anlise de gua

25

Continuao da tabela 1
Combinao
de positivos

NMP./100 mL

5-5-0
5-5-1
5-5-2
5-5-3
5-5-4
5-5-5

240
300
500
900
1600
1600

Limites
Inferior

Superior

100
100
200
300
600
-

940
1300
2000
2900
5300
-

Fonte: APHA, 1985

Tabela 2 NMP. com limite de confiana de 95% para os


resultados positivos quando 5 pores de 10 mL so examinadas
Combinao
de positivos

NMP./100 mL

0
1
2
3
4
5

< 2,2
2,2
5,1
9,2
16,0
>16,0

Limites
Inferior

Superior

0
0,1
0,5
1,6
3,3
8,0

6,0
12,6
19,2
29,4
52,9
Infinito

Fonte: APHA, 1985

Coliformes termotolerantes
Mtodo dos tubos mltiplos (TM)
Material necessrio
a) tubos de ensaio com Meio EC;
b) bico de Bunsen ou lamparina a lcool;
c) ala de platina;
d) banho-maria.

26

Fundao Nacional de Sade

Execuo do ensaio
a) tomar todos os tubos do Teste Presuntivo que deram
Positivos (Formao de gs) e todos os tubos negativos
em que houve crescimento aps 48 horas, nas 3 diluies (1:1; 1:10 e 1:100);
b) transferir, com ala de platina flambada e fria, uma
poro para os tubos de ensaio contendo o meio EC;
c) misturar e deixar todos os tubos em banho de gua
durante 30 minutos;
d) incubar em banho-maria a 44,5 0,2oC durante 24
2 horas;
e) se no final de 24 horas ou menos houver a formao
de gs, est indicada a presena de coliformes termotolerantes;
f) calcular o NMP consultando a tabela 1.
Nota: Esse ensaio deve ser realizado simultaneamente ao Teste
Confirmativo para Coliformes Totais.
Observao: Fazer esse exame toda vez que forem realizados
testes confirmativos para coliformes totais.

Manual Prtico de Anlise de gua

27

Contagem de bactrias heterotrficas


Material necessrio
a) placa de Petri;
b) pipeta graduada;
c) bico de Bunsen ou lamparina a lcool;
d) plate Count Agar;
e) estufa bacteriolgica;
f) contador de colnias.
Execuo do ensaio
a) transferir, com pipeta estril, 1 mL da amostra para uma
placa de Petri previamente esterilizada;
b) entreabrir a placa e adicionar o meio de cultura, previamente fundido e estabilizado em banho-maria a
44-46oC, contido no tubo de ensaio;
c) homogeneizar o contedo da placa em movimentos
circulares moderados em forma de (), em torno de
10 vezes consecutivas;
d) quando o meio de cultura se solidificar, incubar a placa
em posio invertida a 35 0,5oC durante 48 3 horas;
e) no final do perodo de incubao, fazer a contagem das
colnias com o auxlio de um contador de colnias.
Expresso dos resultados
Os resultados so expressos como nmero de colnias
de bactrias/mL ou Unidades Formadoras de Colnias
(UFC)/mL.
28

Fundao Nacional de Sade

Notas:
a) antes de iniciar os exames, desinfetar a bancada do laboratrio usando uma soluo de lcool etlico a 70% ou
outro desinfetante que no deixe resduo;
b) todas as amostras a serem examinadas devem ser homogeneizadas pelo menos 25 vezes;
c) no esquecer de flambar a boca dos tubos de ensaio
contendo meios de cultura, antes de us-los;
d) o tiossulfato de sdio a 10% colocado nos frascos de
coleta para neutralizar a ao do cloro;
e) as placas de Petri devem ser colocadas na posio invertida para evitar a condensao de gua na superfcie do
gar;
f) fazer a contagem padro de bactrias heterotrficas,
sempre em duplicata.

Coliformes totais
Mtodo da membrana filtrante (MF)
Material necessrio
a) equipamento de filtrao com porta-filtro;
b) placa de Petri esterilizada de 47 mm;
c) filtros de membrana de 47 mm e porosidade de
0,45m, com carto absorvente;
d) meio de cultura (m Endo Broth MF);
e) gua de diluio estril;
f) pina de ao inox;
Manual Prtico de Anlise de gua

29

g) copo de ao inox;
h) bico de Bunsen ou lamparina a lcool;
i) bomba de vcuo (seringa);
j) estufa bacteriolgica.
Execuo do ensaio
a) com a pina, colocar cuidadosamente na placa de Petri
um carto absorvente;
b) com pipeta esterilizada colocar 1,8 mL do meio de
cultura no carto absorvente e tampar a placa;
c) colocar a membrana filtrante no porta-filtro, com a
pina previamente flambada e fria;
d) agitar o frasco contendo a amostra, pelo menos 25
vezes;
e) destampar e flambar a boca do frasco;
f) verter, cuidadosamente, 100 mL de amostra no porta-filtro, evitando que a gua respingue sobre as bordas
superiores;
g) ligar a bomba de vcuo (seringa) e fazer a suco;
h) depois de filtrada a amostra, lavar 3 vezes as paredes
do funil com gua de diluio estril com pores de
20 mL aplicando vcuo;
i) aps a lavagem e filtrao, aliviar o vcuo e remover
o funil do suporte;
j) com a pina flambada e fria, remover o filtro do suporte
e coloc-lo na placa de Petri, antes preparada, com o
lado quadriculado para cima;

30

Fundao Nacional de Sade

k) tampar a placa de Petri e incub-la invertida a 35oC


durante 24 2 horas;
l) aps o perodo de incubao, examinar o filtro fazendo
a contagem das colnias.
Leitura dos resultados
As colnias indicativas de coliformes totais tpicas tm uma
cor rosa a vermelho escuro, com brilho metlico.
O brilho pode aparecer no centro ou na periferia da colnia. As no coliformes aparecem com colorao vermelho-clara ou escura sem o brilho metlico caracterstico.
Observao: s vezes, quando o disco est muito mido e a fonte de luz muito intensa, as colnias de no coliformes podem aparecer com um brilho falso, causando erros. Isso poder ser contornado usando-se
fonte de luz mais difusa ou secando o filtro antes de
ser examinado.

Preparo do meio de cultura


Material necessrio
a) meio de cultura desidratado (m Endo Broth MF);
b) gua destilada;
c) lcool etlico a 95%;
d) frasco Erlenmeyer de 125 mL;
e) vidro de relgio;
f) bico de Bunsen ou lamparina a lcool.

Manual Prtico de Anlise de gua

31

Tcnica
a) pesar 4,8 gramas do meio desidratado;
b) transferir para o Erlenmeyer;
c) adicionar aos poucos 100 mL de gua destilada contendo 2 ml de lcool etlico a 95%;
d) aquecer em banho-maria ou no bico de Bunsen at o
incio da fervura (no deixar ferver);
e) deixar esfriar;
f) distribuir 1,8 mL em cada placa.
Observaes: 1. Preparar somente a quantidade necessria para
uso. Esse meio pode ser adquirido em ampolas de 2
mL, porm o custo muito elevado. mais econmico prepar-lo no laboratrio.
2. Em substituio ao meio m Endo Broth MF pode
r ser utilizado o meio slido (LES Endo agar).

Coliformes termotolerantes
Mtodo da membrana filtrante (MF)
Material necessrio
a) equipamento de filtrao com porta-filtro;
b) placa esterilizada de 47 mm;
c) filtros de membrana de 47 mm e porosidade de
0,45m, com carto absorvente;
d) meio de cultura (m FC Broth Base);
e) gua de diluio estril;
f) pina de ao inox;
g) copo de ao inox;
32

Fundao Nacional de Sade

h) bico de Bunsen ou lamparina a lcool;


i) bomba de vcuo (seringa);
j) estufa bacteriolgica ou banho-maria.
Preparo do meio de cultura
Material necessrio
a) meio de cultura desidratado (m FC Broth Base);
b) gua destilada;
c) cido roslico a 1% em NaOH 0,2 N;
d) frasco Erlenmeyer de 125 mL;
e) vidro de relgio;
f) bico de Bunsen ou lamparina a lcool.
Tcnica
a) pesar 3,7 gramas do meio desidratado;
b) transferir para o Erlenmeyer;
c) dissolver o meio pesado, em 100 mL de gua destilada;
d) adicionar 1 mL da soluo de cido roslico a 1%;
e) aquecer at a ebulio;
f) deixar esfriar;
g) distribuir 2,0 ml em cada placa.
Observaes: 1. Preparar somente a quantidade necessria para
uso;

2. Esse meio pode ser adquirido em ampolas de 2
mL, porm o custo muito elevado. mais econmico prepar-lo no laboratrio.
Manual Prtico de Anlise de gua

33

3. Para preparar o cido roslico a 1% dissolver 1


grama do cido em 100 mL de NaOH 0,2 N.
4. Para preparar o NaOH 0,2 N diluir 20 mL da
soluo 1N para 100 mL de gua destilada.
5. O cido roslico dura 2 semanas ou menos,
quando guardado na geladeira (2 a 10oC). Descarte-o quando a colorao mudar de vermelho-escuro
para marrom.
6. Esse meio pode ser solidificado adicionando 1,2
a 1,5% de agar antes da ebulio.

Execuo do ensaio
a) com a pina, colocar cuidadosamente na placa de Petri
um carto absorvente;
b) com pipeta esterilizada colocar 2,0 mL do meio de
cultura no carto absorvente e tampar a placa;
c) colocar a membrana filtrante no porta-filtro, com a
pina previamente flambada e fria;
d) agitar o frasco contendo a amostra, pelo menos 25
vezes;
e) destampar e flambar a boca do frasco;
f) verter, cuidadosamente, 100 mL de amostra no porta-filtro, evitando que a gua respingue sobre as bordas
superiores;
g) ligar a bomba de vcuo (seringa) e fazer a suco;
h) depois de filtrada a amostra, lavar 3 vezes as paredes
do funil com gua de diluio estril com pores de
20 mL aplicando vcuo;
i) aps a lavagem e filtrao, aliviar o vcuo e remover
o funil do suporte;

34

Fundao Nacional de Sade

j) com a pina flambada e fria, remover o filtro do suporte e coloc-lo dentro da placa de Petri, com o lado
quadriculado para cima;
k) tampar a placa de Petri e incub-la invertida a 44,5
0,2oC durante 24 2 horas;
l) encerrado o perodo de incubao, examinar o filtro
fazendo a contagem das colnias;
m) as colnias indicativas de coliformes termotolerantes
aparecem de cor azul. As no coliformes aparecem
com colorao clara ou rsea.

Esterilizao do conjunto de filtrao no campo


a) umedecer cuidadosamente o anel de asbesto situado
na base do suporte, com meia tampa de lcool metlico
(tampa do frasco de lcool);
b) atear fogo;
c) colocar a cuba de ao por cima do funil quase o tampando;
d) aps aquecer a cuba at o suportvel pela mo, tampar
o suporte;
e) esperar 15 minutos, aproximadamente e ento remover
a cuba e lavar o funil com gua de diluio estril a fim
de remover qualquer resduo txico.
Observaes: 1. A combusto incompleta do metanol provoca a
formao de aldedo frmico que o agente esterilizante.

2. O suporte do filtro deve estar estril no incio de
cada srie de filtrao e essa srie no deve ultrapassar mais de 30 amostras. A cada srie de filtrao efetuar o exame de 100 mL da gua de diluio
para controle da esterilidade do porta-filtro.
Manual Prtico de Anlise de gua

35

3. Os meios de cultura preparados para uso com


membrana filtrante valem por 96 horas quando
guardados em refrigerador com temperatura entre
2 a 10oC;
4. O conjunto de filtrao tambm pode ser esterilizado em autoclave.

Coliformes totais e Escherichia coli


Teste de presena/ausncia
Mtodo do substrato cromognico
A opo da metodologia para a realizao dos exames
bacteriolgicos da gua recai naquele procedimento que
melhor se adequar s condies do laboratrio, devendo-se, no entanto, adotar como padro as metodologias,
frequncias e interpretao de resultados estabelecidas e
recomendadas pela legislao em vigor.
Os mtodos de Tubos Mltiplos (TM) e Membrana Filtrante
(MF) ainda so largamente utilizados, entretanto a opo
pelo mtodo de Substrato Cromognico-Fluorognico Definido comumente adotado pela facilidade de manuseio,
bem como por ter relativo custo/benefcio j comprovado.
O mtodo baseado nas atividades enzimticas especficas
dos coliformes ( galactosidade) e E. coli ( glucoronidase). Os meios de cultura contm nutrientes indicadores
(substrato cromognico) que, hidrolisados pelas enzimas
especficas dos coliformes e/ou E. coli, provocam uma mudana de cor no meio. Aps o perodo de incubao, se a
cor amarela observada, coliformes totais esto presentes.
Se a fluorescncia azul observada sob luz ultravioleta
(UV) 365 nm, E. coli est presente.

36

Fundao Nacional de Sade

Alm da maior preciso, esse mtodo tem como vantagem


o tempo de resposta, j que a determinao simultnea de
coliformes (totais) e E. coli efetuada aps incubao das
amostras a 35oC por 24 horas, no havendo necessidade
de ensaios confirmativos.
Material necessrio
a) recipiente de coleta de vidro ou de plstico;
b) substrato cromognico (ONPG)/fluorognico (MUG);
c) estufa bacteriolgica;
d) lmpada ultravioleta de 365 nm.
Execuo do ensaio
a) coletar a amostra (100mL) em um frasco estril ou saco
de coleta contendo tiossulfato de sdio a 10% para
gua tratada;
b) no prprio frasco ou saco adicionar o contedo de 1
(um) frasconete contendo o substrato cromognico;
c) fechar o frasco ou o saco e agitar levemente, no precisa
dissolver totalmente, essa dissoluo ocorrer de forma
natural;
d) incubar a 35,0 0,5oC durante 24 horas.

Interpretao e expresso dos resultados


Decorridas 24 horas de incubao, retirar da estufa o material e observar visualmente o frasco ou saco. Se apresentar
colorao amarelada, o resultado presena de Coliformes
Totais na amostra.

Manual Prtico de Anlise de gua

37

Com o auxlio de uma lmpada ultravioleta 365 nm, observar se existe fluorescncia azul nas amostras que desenvolveram colorao amarelada aproximando a lmpada
ao frasco. Se a amostra apresentar colorao amarelada
e fluorescncia com a luz UV-365 nm significa que h
presena de Escherichia coli na amostra examinada.
Caso a amostra permanea transparente, o resultado
negativo, tanto para Coliformes Totais como para E. coli.
Expressar o resultado como: Presena ou Ausncia de
Coliformes Totais ou Escherichia coli.
Nota: A fluorescncia azul ocorre somente na presena da luz ultravioleta, ao tirar o frasco da frente da luz ele volta a ficar
amarelo.

Esterilizao
Os seguintes materiais devem ser esterilizados: frascos de
coleta de amostra, pipetas, placas de Petri de vidro, frascos
e tubos com gua de diluio e meios de cultura.

Procedimentos para a esterilizao


a) preparar todo o material;
b) verificar se o nvel da gua dentro da autoclave est acima
das resistncias. Completar se necessrio;
c) colocar todo o material dentro do depsito metlico e
tampar a autoclave;
d) apertar as travas da tampa duas a duas para no permitir
sada de vapor pela borda do aparelho. Ligar o aparelho
na tomada;
e) ligar a chave seletora de temperatura na posio Mximo;
38

Fundao Nacional de Sade

f) abrir imediatamente a vlvula de escape de vapor;


g) quando comear a sair vapor por essa vlvula, esperar
trs minutos e fech-la;
h) nesse instante, o ponteiro do manmetro comear a
subir;
i) quando o ponteiro atingir a marca de 1Kg/cm de presso, a temperatura dever estar em 121oC. Deixar nesta
posio durante 20 minutos;
j) se a presso continuar subindo, coloque a chave seletora
de temperatura da autoclave, na posio mdia e fique
observando;
k) depois de 20 minutos, o material j estar esterilizado;
Observao: Normalmente as autoclaves possuem uma chave
seletora de temperatura que indica trs posies
Mnima, Mdia e Mxima, justamente para manter a presso e temperatura dentro da faixa utilizada. Serve, tambm, para ligar e desligar o aparelho.
Atualmente existem autoclaves microprocessadas
que realizam as etapas, ou seja, o ciclo de esterilizao e descontaminao automaticamente, aps
programao do usurio.

l) desligar o aparelho e esperar que o ponteiro do manmetro atinja a posio 0. Esse procedimento poder ser
acelerado abrindo-se lentamente a vlvula de escape de
vapor;
Ateno: No abrir essa vlvula de uma vez!
m) quando o ponteiro do manmetro atingir a posio 0 e
no estiver mais saindo vapor pela vlvula, abrir a tampa
do aparelho e retirar o material.
Nota: Existem vrios modelos de autoclaves no mercado. importante seguir sempre as instrues do fabricante.
Manual Prtico de Anlise de gua

39

Anlises fsico-qumicas da gua


Titulomtricas
Colorimtricas

Anlises Titulomtricas
Alcalinidade total
A alcalinidade total de uma gua dada pelo somatrio
das diferentes formas de alcalinidade existentes, ou seja,
a concentrao de hidrxidos, carbonatos e bicarbonatos,
expressa em termos de carbonato de clcio. Pode-se dizer
que a alcalinidade mede a capacidade da gua em neutralizar os cidos.
A medida da alcalinidade de fundamental importncia
durante o processo de tratamento de gua, pois em funo do seu teor que se estabelece a dosagem dos produtos
qumicos utilizados.
Normalmente, as guas superficiais possuem alcalinidade
natural em concentrao suficiente para reagir com o sulfato de alumnio nos processos de tratamento. Quando a
alcalinidade muito baixa ou inexistente h a necessidade
de se provocar uma alcalinidade artificial com aplicao
de substncias alcalinas, tal como cal hidratada ou barrilha
(carbonato de sdio) para que o objetivo seja alcanado.
Quando a alcalinidade muito elevada, procede-se ao contrrio, acidificando-se a gua at que se obtenha um teor de
alcalinidade suficiente para reagir com o sulfato de alumnio ou outro produto utilizado no tratamento da gua.

Mtodo de determinao
Titulao com cido Sulfrico

Manual Prtico de Anlise de gua

43

Material necessrio
a) pipeta volumtrica de 50 mL;
b) frasco Erlenmeyer de 250 mL;
c) bureta de 50 mL;
d) fenolftalena;
e) indicador metilorange;
f) mistura Indicadora de verde de bromocresol/vermelho
de metila;
g) soluo de cido sulfrico 0,02 N;
h) soluo de tiossulfato de sdio 0,1 N.
Tcnica
a) tomar 50 mL da amostra e colocar no Erlenmeyer;
b) adicionar 3 gotas da soluo indicadora de verde de
bromocresol/vermelho de metila;
c) titular com a soluo de cido sulfrico 0,02 N at a
mudana da cor azul-esverdeada para rseo;
d) anotar o volume total de H2SO4 gasto (V) em mL.
Clculo:
Alcalinidade total em mg/L de CaCO3 = V x 20
Notas: 1. Usar 0,05 mL (1 gota) da soluo de tiossulfato de sdio
0,1 N, caso a amostra apresente cloro residual livre.

2. Utilizar essa tcnica na ausncia de alcalinidade fenolftaleina.

3. Caso haja alcalinidade fenolftaleina, adicionar, antes
da mistura indicadora de verde de bromocresol/vermelho
44

Fundao Nacional de Sade

de metila 3 gotas de fenolftaleina e titule com H2SO4 0,02N


at desaparecer a cor rsea formada. Em seguida, continuar no passo b) da tcnica.
4. A alcalinidade fenolftalena s poder ocorrer se o pH
da amostra for maior que 8,2.
5. Na impossibilidade de conseguir a mistura indicadora
de verde de bromocresol/vermelho de metila, usar o indicador de metilorange. Nesse caso o ponto de viragem no
passo 3 da tcnica ser de amarelo para alaranjado.
6. O ponto de viragem quando se usa o indicador verde
de bromocresol/vermelho de metila mais ntido do que
quando se usa metilorange.
7. A frmula acima para ser utilizada quando se usa uma
amostra de 50 mL. Quando for usado 100 mL de amostra,
o volume (V) passar a ser multiplicado por 10.
8. Fc Fator de correo da soluo titulante.

Fluxograma da anlise

Manual Prtico de Anlise de gua

45

Gs carbnico livre
O gs carbnico livre existente em guas superficiais normalmente est em concentrao menor do que 10 mg/L,
enquanto que em guas subterrneas pode existir em maior
concentrao.
O gs carbnico contido na gua pode contribuir significativamente para a corroso das estruturas metlicas e de
materiais base de cimento (tubos de fibro-cimento) de um
sistema de abastecimento de gua e por essa razo o seu teor
deve ser conhecido e controlado.

Mtodo de determinao
Titulao com Hidrxido de Sdio
Material necessrio
a) bureta de 50 mL;
b) frasco Erlenmeyer de 250 mL;
c) pipeta volumtrica de 100 mL;
d) rolha de borracha;
e) hidrxido de sdio 0,02N;
f) fenolftalena.
Tcnica
a) tomar 100 mL de amostra (sem agitar) em um Erlenmeyer;
b) adicionar 10 gotas de fenolftalena, se colorir, no
contm CO2, se no colorir, prosseguir;
46

Fundao Nacional de Sade

c) titular com a soluo de hidrxido de sdio (NaOH)


0,02 N gota a gota at o aparecimento de leve colorao rsea persistente por pelo menos 30 segundos;
d) anotar o volume (mL) de NaOH gasto ( V ).
Clculo
V x 10 x Fc = mg/L de CO2 livre
Onde:
Fc = fator de correo.
Para calcular o CO2 total aplicar a seguinte frmula: mg/l
CO2 total = A + 0,44(2B + C)
Onde:
A = mg/L CO2 livre
B = Alcalinidade devido a bicarbonato
C = Alcalinidade devido a carbonato

Manual Prtico de Anlise de gua

47

Fluxograma da anlise de CO2

Cloretos
Geralmente, os cloretos esto presentes em guas brutas e
tratadas em concentraes que podem variar de pequenos
traos at centenas de mg/L. Esto presentes na forma de cloretos de sdio, clcio e magnsio. A gua do mar possui concentrao elevada de cloretos que est em torno de 26.000
mg/L. Concentraes altas de cloretos podem restringir o uso
da gua em razo do sabor que eles conferem e pelo efeito
laxativo que eles podem provocar. A Portaria n 2.914/2011
do Ministrio da Sade estabelece o teor de 250 mg/L como
o valor mximo permitido para gua potvel. Os mtodos
convencionais de tratamento de gua no removem cloretos. A sua remoo pode ser feita por dessalizao (osmose
reversa) ou eletrodilise (troca inica).
48

Fundao Nacional de Sade

Mtodo de determinao
Titulao com Nitrato de Prata
Material necessrio
a) bureta de 50 mL;
b) becker de 250 mL;
c) frasco Erlenmeyer de 250 mL;
d) medidor de pH;
e) proveta de 100 mL;
f) soluo-padro de nitrato de prata 0,0141N;
g) soluo indicadora de cromato de potssio K2CrO4;
h) hidrxido de sdio 1N;
i) cido sulfrico 1N;
j) cloreto de sdio 0,0141 N.
Tcnica
a) colocar 100 mL de amostra no Erlenmeyer;
b) ajustar o pH entre 7 e 10, se necessrio, com NaOH
ou H2SO4;
c) adicionar 1 mL da soluo indicadora de K2CrO4;
d) titular com a soluo-padro de nitrato de prata 0,0141
N at a viragem para amarelo avermelhado que o
ponto final da titulao;
e) fazer um branco da mesma maneira que a amostra.

Manual Prtico de Anlise de gua

49

Clculo:

mg/L Cl =

(A B) x N x 35.45
mL da amostra

Onde:
A = mL do titulante gasto na amostra.
B = mL do titulante gasto no branco.
N = normalidade do titulante.

Fluxograma da anlise de cloretos

50

Fundao Nacional de Sade

Dureza total
A dureza total calculada como sendo a soma das concentraes de ons clcio e magnsio na gua, expressos como
carbonato de clcio.
A dureza de uma gua pode ser temporria ou permanente.
A dureza temporria, tambm chamada de dureza de carbonatos, causada pela presena de bicarbonatos de clcio
e magnsio. Esse tipo de dureza resiste ao dos sabes e
provoca incrustaes. denominada de temporria porque
os bicarbonatos, pela ao do calor, se decompem em gs
carbnico, gua e carbonatos insolveis que se precipitam.
A dureza permanente, tambm chamada de dureza de no
carbonatos, devida presena de sulfatos, cloretos e nitratos
de clcio e magnsio, resiste tambm ao dos sabes, mas
no produz incrustaes por serem seus sais muito solveis
na gua. No se decompe pela ao do calor.
A Portaria MS n 2.914/2011 estabelece para dureza total o
teor de 500 mg/L em termos de CaCO3 como o valor mximo
permitido para gua potvel.

Mtodo de determinao
Titulao com EDTA
Material necessrio
a) bureta de 50 mL;
b) pipeta volumtrica de 25 mL;
c) balo volumtrico de 50 mL;
d) becker de 100 mL;
Manual Prtico de Anlise de gua

51

e) frasco Erlenmeyer de 250 mL;


f) soluo-padro de EDTA 0,01 M;
g) soluo tampo;
h) indicador eriochrome black T;
i) inibidor I - cianeto de sdio P.A em p;
j) inibidor II - sulfeto de sdio.
Tcnica
a) tomar 25 mL da amostra e diluir para 50 mL com gua
destilada em balo volumtrico;
b) transferir para um becker de 100 mL e adicionar 1 a 2
mL da soluo tampo para elevar o pH a 10 0,1;
c) transferir para um frasco Erlenmeyer de 250 mL e adicionar aproximadamente 0,05 gramas do Indicador
negro de eriocromo T;
d) titular com EDTA 0,01M agitando continuamente at
o desaparecimento da cor prpura avermelhada e o
aparecimento da cor azul (final da titulao);
e) anotar o volume de EDTA gasto (mL);
f) fazer um branco com gua destilada;
g) subtrair o volume de EDTA gasto na titulao do branco
do volume de EDTA gasto na titulao da amostra. A
diferena o volume que ser aplicado no clculo.

52

Fundao Nacional de Sade

Clculo
Dureza Total em mg/l CaCO3 =

ml de EDTA x 1000 x Fc
ml de amostra

Notas: 1. A ausncia de um ponto de viragem definido, geralmente, indica a necessidade de adio de um inibidor ou que o
indicador est deteriorado.

2. No leve mais do que 5 minutos para a titulao, medido aps a adio da soluo tampo.

3. Caso a dureza da gua seja muito baixa, use amostra
maior, 50 a 250 mL adicionando proporcionalmente maior
quantidade de soluo tampo, do inibidor e indicador.

4. Se precisar usar o inibidor adicionar 20 gotas do inibidor
II.

5. Fc = Fator de correo do EDTA quando houver e for
diferente de 1.

Fluxograma da anlise

Manual Prtico de Anlise de gua

53

pH
O termo pH representa a concentrao de ons hidrognio em
uma soluo. Na gua, esse fator de excepcional importncia, principalmente nos processos de tratamento. Na rotina
dos laboratrios das estaes de tratamento ele medido e
ajustado sempre que necessrio para melhorar o processo
de coagulao/floculao da gua e tambm o controle da
desinfeco. O valor do pH varia de 0 a 14. Abaixo de 7 a
gua considerada cida e acima de 7, alcalina. gua com
pH 7 neutra.
A Portaria n 2.914/2011 do Ministrio da Sade recomenda que o pH da gua seja mantido na faixa de 6,0 a 9,5 no
sistema de distribuio.
Existem no mercado vrios aparelhos para determinao do
pH. So denominados de potencimetros ou colormetros.
Neste manual, descreve-se o funcionamento bsico de um
potencimetro, embora as instrues dos fabricantes devam
ser seguidas.
Material necessrio
a) potencimetro;
b) cubetas;
c) frasco lavador;
d) papel absorvente;
e) solues tampo de pH conhecido;
Tcnica
a) ligar o aparelho e esperar a sua estabilizao;
b) lavar os eletrodos com gua destilada e enxug-los com
papel absorvente;
54

Fundao Nacional de Sade

c) calibrar o aparelho com as solues padro (pH 4 7


ou 10);
d) lavar novamente os eletrodos com gua destilada e
enxug-los;
e) introduzir os eletrodos na amostra a ser examinada e
fazer a leitura;
f) lavar novamente e deix-los imersos em gua destilada;
g) desligar o aparelho.

Fluxograma do teste

Manual Prtico de Anlise de gua

55

Anlises colorimtricas
Cloro residual livre
O cloro um produto qumico utilizado na desinfeco da
gua. Sua medida importante e serve para controlar a dosagem que est sendo aplicada e tambm para acompanhar
sua evoluo durante o tratamento.
A Portaria n 2.914/2011 do Ministrio da Sade determina a
obrigatoriedade de se manter, no mnimo, 0,2 mg/L de cloro
residual livre ou 2 mg/L de cloro residual combinado em toda
a extenso do sistema de distribuio (reservatrio e rede).
Tambm recomenda que o teor mximo de cloro residual
livre em qualquer ponto do sistema de abastecimento seja
de 2 mg/L. Os principais produtos utilizados so: hipoclorito
de clcio, cal clorada, hipoclorito de sdio e cloro gasoso.

Mtodo de determinao
Comparao visual
Material necessrio
a) comparador colorimtrico;
b) cubetas de vidro ou de acrlico;
c) DPD para cloro livre em cpsula.

56

Fundao Nacional de Sade

Tcnica
a) encher a cubeta com gua da amostra at a marca de
5,0 mL;
b) coloc-la na abertura do lado esquerdo do aparelho;
c) encher outra cubeta at a marca de 5,0 mL com a
amostra a ser testada;
d) adicionar uma cpsula do reagente DPD na segunda
amostra e misturar;
e) colocar a cubeta com a amostra no compartimento do
lado direito do aparelho;
f) antes de 1 minuto fazer a leitura do teor de cloro.
Nota: Quando fizer a leitura posicionar o comparador (equipamento) contra uma fonte de luz como, por exemplo, uma
janela, o cu ou uma lmpada. Rotacione o disco at que
se obtenha a mesma tonalidade nos dois tubos.

Resultado
O resultado expresso em mg/L de Cloro Residual Livre.
Observao: Existem no mercado vrios tipos de comparadores
colorimtricos para medir o cloro residual, tanto
com o uso de ortotolidina quanto o DPD. Em caso
de dvida consultar, sempre, as instrues do fabricante. O uso da ortotolidina est sendo evitado
por tratar-se de substncia cancergena e no mais
recomendado pelo Standard Methods.

Cor
A cor da gua proveniente da matria orgnica como, por
exemplo, substncias hmicas, taninos e tambm por metais
como ferro e mangans e resduos industriais fortemente coloridos. A cor, em sistemas pblicos de abastecimento de gua,
Manual Prtico de Anlise de gua

57

esteticamente indesejvel. A sua medida de fundamental


importncia, visto que, gua de cor elevada provoca a sua
rejeio por parte do consumidor e o leva a procurar outras
fontes de suprimento muitas vezes inseguras.
A Portaria MS n 2.914/2011 estabelece para cor aparente
o Valor Mximo Permitido de 15 (quinze) uH como padro
organolptico para consumo humano.

Mtodo de determinao
Mtodo de Comparao visual
Material necessrio
a) tubos de Nessler forma alta de 50 mL;
b) suporte de madeira;
c) soluo-padro de Cloroplatinato de Potssio (500
Unidades de Cor).
Tcnica
a) preparar padres de cor na faixa de 5 a 50 unidades de
cor, medindo 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5;
5,0; 6,0 e 7,0 mL da soluo-padro (500 unidades de
cor) e colocar em tubos de Nessler de 50 mL;
b) diluir com gua destilada at a marca de 50 mL;
c) medir 50 mL da amostra em outro tubo de Nessler e
comparar com os padres.
Resultado
O resultado expresso em unidades de cor ou unidade
Hazen (uH).
58

Fundao Nacional de Sade

Notas: 1. A comparao dever ser feita olhando os tubos verticalmente contra um fundo branco.

2. Proteger os padres contra evaporao e poeira.

3. Quando a cor da amostra for maior do que 70 unidades,
fazer diluio at que se obtenha resultado dentro da faixa coberta pelos padres. Neste caso, o resultado deve ser
multiplicado pelo fator de diluio.

4. uH a unidade de escala de Hazen (platina-cobalto,mgPt-Co/L).

Alumnio
O teste de alumnio indicado para estaes de tratamento
onde o sulfato de alumnio usado como coagulante.
A dosagem incorreta desse coagulante denotada pela quantidade significativa de alumnio que persiste na gua tratada.
O hidrxido de alumnio Al(OH)3 - formado na reao
anftero. Sua ionizao se processa em pH cido ou bsico,
segundo as equaes:
Em pH cido:
Al(OH)3

[ H+]

Al3 + nH2O
+

Em pH bsico:
Al(OH)3

[OH-]

AlO33 + nH2O

Nas duas formas ele pode se solubilizar e atravessar os decantadores e filtros. A solubilizao acontece com a correo
do pH.
Quando o pH timo de floculao no est correto, o teor
de alumnio da gua tratada aumenta.

Manual Prtico de Anlise de gua

59

A Portaria n 2.914/2011 do Ministrio da Sade estabelece


que o padro organolptico para consumo humano de
0,2 mg/L.

Mtodo de determinao
A determinao do alumnio pode ser feita atravs dos
mtodos de Absoro Atmica, Eriocromo Cianina R
utilizando um fotmetro de filtro ou espectrofotmetro e
tambm pelo mtodo de Comparao Visual, utilizando-se
tubos de Nessler.
Neste manual, descreve-se o mtodo de Comparao Visual,
considerando que a maioria dos laboratrios dos servios de
abastecimento de gua nem sempre possui equipamentos
como Espectrofotmetro de Absoro Atmica ou outro.

Mtodo de Comparao Visual


Material necessrio
a) tubo de Nessler forma alta, de 50 mL;
b) pipeta graduada de 1 mL;
c) pipeta graduada de 5 mL;
d) pipeta graduada de 10 mL;
e) suporte para tubos de Nessler.
Reagentes
a) cido sulfrico 0,02N;
b) reagente tampo de acetato de sdio;
c) eriocromo cianina-R - (corante);
d) soluo de trabalho do corante.
60

Fundao Nacional de Sade

Tcnica
a) medir 25 mL de amostra ou uma poro diluda para
25 mL em um frasco Erlenmeyer de 125 mL;
b) adicionar 3 gotas de metilorange e titular com cido
sulfrico (H2SO4) 0,02N at ligeira colorao rosa
plido;
c) anotar o volume gasto de cido e descartar a amostra;
d) medir novamente 25 mL de amostra ou uma alquota
diluda a 25 mL e transferir para um tubo de Nessler de 50
mL;
e) adicionar amostra o mesmo volume de cido sulfrico
gasto no passo 2, acrescentando 1 mL em excesso;
f) adicionar 1,0 mL de cido ascrbico e misturar;
g) adicionar 10,0 mL do reagente tampo e misturar;
h) adicionar 5,0 mL da soluo de trabalho do corante e
misturar;
i) imediatamente, diluir at a marca de 50 mL, com gua
destilada;
j) misturar e deixar em repouso por 5 a 10 minutos e comparar a cor desenvolvida pela amostra com os padres
preparados da mesma maneira e na mesma hora.
Resultado
O resultado expresso em mg/L de alumnio.
Observao: Nesse mtodo no necessrio preparar o branco
da amostra e ele tambm no recomendado para
amostras que contm cor e turbidez porque pode
levar a erros considerveis.

Manual Prtico de Anlise de gua

61

Preparo dos Padres


Material necessrio
a) tubo de Nessler forma alta, de 50 mL;
b) pipeta graduada de 1 mL;
c) pipeta graduada de 5 mL;
d) pipeta graduada de 10 mL;
e) suporte para tubos de Nessler.
Reagentes
a) cido sulfrico 0,02N;
b) reagente tampo de acetato de sdio;
c) eriocromo cianina-R - (corante);
d) soluo de trabalho do corante;
e) soluo-padro de alumnio (1 mL = 5 g Al).
Tcnica
Preparar os padres na faixa de 0 a 0,5 mg/L, pipetando:
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 e 2,5 mL da soluo-padro (1
mL = 5 g) e diluindo para 25 mL com gua destilada em
tubos de Nessler (ver quadro a seguir).
Tratar esses padres do seguinte modo:
a)
b)
c)
d)

62

adicionar 1,0 mL de cido sulfrico 0,02N e misturar;


adicionar 1,0 ml de cido ascrbico e misturar;
adicionar 10 mL do reagente tampo e misturar;
adicionar 5 mL da soluo de trabalho do corante e
misturar;

Fundao Nacional de Sade

e) levar o volume para 50 mL com gua destilada e misturar;


f) deixar em repouso por 5 a 10 minutos.
mL da soluo-padro
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5

g Al/mL
0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5

Volume de
amostra
25
25
25
25
25
25

mg/L Al
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5

Notas: 1. Para o padro 0,0 mg/L, tomar 25 mL de gua destilada


e proceder igual aos outros.

2. Preparar os padres toda vez que for examinar a amostra.

3.Caso o laboratrio possua espectrofotmetro, fazer a leitura
dos padres a 535 nm e traar a curva de calibrao em papel semilogaritmo (% de transmitncia x concentrao). Nesse caso, no necessria a preparao de todos os padres
quando examinar a amostra. Fazer apenas um ou dois para
checar a curva de calibrao do aparelho.

Turbidez
A turbidez da gua devido presena de materiais slidos
em suspenso, que reduzem a sua transparncia. Pode ser
provocada tambm pela presena de algas, plncton, matria
orgnica e muitas outras substncias como o zinco, ferro,
mangans e areia, resultantes do processo natural de eroso
ou de despejos domsticos e industriais.
A turbidez tem sua importncia no processo de tratamento
da gua. gua com turbidez elevada, e dependendo de sua
natureza, forma flocos pesados que decantam mais rapidamente do que gua com baixa turbidez. Tambm tem suas
Manual Prtico de Anlise de gua

63

desvantagens como no caso da desinfeco que pode ser


dificultada pela proteo que pode dar aos micro-organismos
no contato direto com os desinfetantes. um indicador sanitrio e padro organolptico da gua de consumo humano.
No Brasil, a recentemente revisada norma de potabilidade da
gua, Portaria MS n 2.914/2011, incorpora as preocupaes
internacionais relacionadas transmisso de protozorios
via abastecimento de gua. O padro de turbidez da gua
resultante de filtrao rpida (tratamento completo ou filtrao direta) foi reduzido para 0,5 UT e para gua resultante
de filtrao lenta reduzido para 1,0 UT. Entretanto, o atendimento ao valor mximo permitido de 0,5 e 1,0 UT dever
ser cumprido em metas progressivas ao longo de quatro anos:
em 25% das amostras analisadas mensalmente no primeiro
ano, at em 95% no quarto ano (sempre com VMP de 1 UT
no restante das amostras mensais).
A Portaria n 2.914/2011 do Ministrio da Sade estabelece
ainda o Valor Mximo Permitido de 1,0 UT para gua subterrnea ps-filtrao ou pr-desinfeco. E em qualquer ponto
da rede de distribuio 5,0 UT como padro organolptico
de potabilidade.
Existem equipamentos especficos para determinao da
turbidez na gua. Neste manual, apresenta-se a tcnica de
determinao da turbidez utilizando a metodologia nefelomtrica.

Mtodo Nefelomtrico
Material necessrio
a) turbidmetro com nefelmetro;
b) clulas de amostras de vidro incolor (quartzo),
64

Fundao Nacional de Sade

c) balo volumtrico de 100 mL;


d) pipeta volumtrica de 5 mL;
e) conjunto de filtrao;
f) filtros de membrana de 0,2 m.
Reagentes
gua isenta de turbidez:
a) passar gua destilada atravs de um filtro de membrana
de 0,02 m de porosidade. Enxaguar o frasco de coleta
pelo menos duas vezes com gua filtrada e desprezar
os primeiros 200 mL.
Suspenso estoque de turbidez padro primrio:
Soluo I
-

Dissolver 1,0 g de sulfato de hidrazina (NH2). H2SO4 em


gua destilada e diluir a 100 mL em balo volumtrico.

Advertncia: sulfato de hidrazina carcinognico. Evitar inalao, ingesto e contato com a pele.

Soluo II
- dissolver 10,0g de hexametilenotetramina (CH2)6N4 em
gua destilada e diluir a 100 mL em balo volumtrico;
-

misturar 5,0 mL da soluo I e 5,0 mL da soluo II.


Deixar em repouso por 24 horas a 25 3oC. A turbidez
dessa suspenso de 4000 UT.

- transferir a soluo-estoque para um frasco de cor


mbar ou outro frasco protegido da luz ultravioleta,
para armazenagem. Fazer diluio dessa suspenso-estoque. A suspenso-estoque estvel por um ano
quando corretamente armazenada.
Manual Prtico de Anlise de gua

65

Suspenso-padro de turbidez:
a) diluir 1,0 mL da soluo-estoque para 100 mL com
gua isenta de turbidez. A turbidez desta suspenso
de 40 UT. Preparar diariamente.
Padres de turbidez diludos:
a) diluir pores da suspenso-padro de turbidez com
gua livre de turbidez de acordo com a faixa de interesse. Preparar diariamente.
Procedimento:
a) calibrar o turbidmetro de acordo com as instrues do
fabricante;
b) medida de turbidez menor que 40 UT: agitar a amostra
suavemente e esperar at que as bolhas de ar desapaream e coloc-la na clula de amostra do turbidmetro;
fazer a leitura da turbidez diretamente na escala do
instrumento ou na curva de calibrao apropriada.
c) medida de turbidez acima de 40 UT: diluir a amostra
com um ou mais volumes de gua isenta de turbidez
at que a turbidez da amostra diluda fique entre 30
e 40 UT. Fazer a leitura e multiplicar o resultado pelo
fator de diluio.
Clculo:
uT =

66

A x (B + C)
C

Fundao Nacional de Sade

Onde:
UT = UTN = Unidade de Turbidez Nefelomtrica.
A = Turbidez da amostra diluda.
B = Volume da diluio (mL).
C = Volume da amostra tomado para a diluio.
Exemplo: Uma poro de 10 mL da amostra foi diluda para 50
mL com gua isenta de turbidez. Feita a leitura dessa
amostra diluda obteve-se 20.

UT =

20 x (40 + 10)
10

UT = 100

Temperatura
A temperatura est relacionada com o aumento do consumo
de gua, com a fluoretao, com a solubilidade e ionizao
das substncias coagulantes, com a mudana do pH, com
a desinfeco, etc.

Procedimento para determinao na gua


Material necessrio
a) termmetro;
b) becker de 250 mL.
Tcnica
a) coletar um pouco de gua em um becker de 250 mL;
b) mergulhar o termmetro na gua;
c) esperar at que o material dilatante (mercrio) se estabilize;
Manual Prtico de Anlise de gua

67

d) fazer a leitura com o bulbo do termmetro ainda dentro


da gua.

Fluoretos
A aplicao de flor na gua para consumo humano tem a
finalidade de prevenir a crie dental. Hoje, esse procedimento
considerado um processo normal de tratamento de gua
e o teor timo de flor parte essencial de sua qualidade.
Em razo disso e outros fatores, que o seu controle se faz
necessrio na estao de tratamento de gua (ETA).
Existem vrios mtodos para determinao de flor na
gua. Os trs mais conhecidos so: o mtodo Spadns, o
Scott-Sanchis e o mtodo do eletrodo especfico para ons
fluoretos.
Neste manual, descreve-se apenas o mtodo Scott-Sanchis,
que embora no seja o que d maior grau de exatido, atende
s expectativas e o de custo mais barato. um mtodo de
comparao visual de cor feito em tubos de Nessler.

Procedimentos para anlise de fluoretos


Mtodo Scott-Sanchis
Material necessrio
a) tubo de Nessler de 100 mL;
b) suporte para tubo de Nessler;
c) termmetro;
d) pipeta volumtrica de 5 mL;
e) pipeta graduada de 10 mL.
Reagentes
-

a) soluo-padro de fluoretos (1mL = 10 gF );


68

Fundao Nacional de Sade

b) reagente Scott-Sanchis;
c) arsenito de sdio (0,5%).
Preparo dos padres e da amostra:
a) tomar 7 tubos de Nessler de 100 mL;
b) encher o 1 tubo com gua destilada (branco);
c) pipetar no 2 tubo 2 mL da soluo-padro;
d) pipetar no 3 tubo 4 mL da soluo-padro;
e) pipetar no 4 tubo 6 mL da soluo-padro;
f) pipetar no 5 tubo 8 mL da soluo-padro;
g) pipetar no 6 tubo 10 mL da soluo-padro;
h) encher o 7 tubo com 100 mL de amostra ou uma alquota diluda a 100 mL. Caso haja cloro na amostra,
remov-lo pela adio de 0,1mL (2 gotas) da soluo
de arsenito de sdio para cada mg/L de cloro;
i) diluir os padres de 2 a 6 a 100 mL com gua destilada;
j) ajustar a temperatura dos padres e da amostra;
k) adicionar a cada tubo, inclusive no branco (1o tubo) 5
mL do reagente Scott-Sanchis;
l) misturar e deixar em repouso por uma hora;
m) decorrido uma hora da adio do reagente Scott-Sanchis, comparar a amostra com os padres e expressar
o resultado em mg F /L.
Exemplo: Se a colorao desenvolvida pela amostra for semelhante ao padro do tubo n 5 essa amostra ter 0,8
mg/L de on fluoreto. Caso a amostra desenvolva uma
colorao que se situe entre dois padres poder ser
feita a interpolao dos resultados. Ex.: leitura entre 0,6
e 0,8 expressar como 0,7 mg/L.
Manual Prtico de Anlise de gua

69

Fluxograma do teste

Notas: 1. A concentrao dos padres preparados (tubos de 2 a


6) correspondem a 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 mg/L de on
fluoreto, respectivamente.

2. Podero ser analisadas vrias amostras simultaneamente
com os padres.

3. Caso haja interferentes nas amostras em concentraes
que possam alterar os resultados, essas amostras devero
ser destiladas.
70

Fundao Nacional de Sade

Tabela de interferentes
Substncias interferentes

Mtodo Scott-anchis

Tipo de erro

Alcalinidade (CaCO3)

400 mg/L

Alumnio (AL3+)

0,25 mg/L

--

Cloreto (Cl-)

2000 mg/L

Ferro (Fe3+)

2,0 mg/L

Hexametafosfato (NaPO3)6

1,0 mg/L

Fosfato (PO4-3)

5,0 mg/L

Sulfato (SO4-2)

300 mg/L

Fonte: Adaptado de Mayer, 1971

Equipamentos para destilao:

Manual Prtico de Anlise de gua

71

Fazer primeiro uma destilao preliminar para remover


qualquer contaminao de fluoreto e ajustar a reao cido/
gua para as destilaes subsequentes, do seguinte modo:
a) colocar 400 mL de gua destilada no balo de destilao;
b) adicionar lentamente e com agitao 200 mL de cido
sulfrico concentrado (H2SO4);
c) adicionar algumas prolas de vidro;
d) conectar o balo ao condensador e comear a destilao;
e) quando a temperatura atingir 180oC, parar a destilao
e eliminar o destilado. O conjunto est pronto para a
destilao da amostra.
Destilao da amostra
Adicionar mistura de cido que sobrou da destilao preliminar 300 ml de amostra, misturar cuidadosamente e destilar
como anteriormente, at que a temperatura atinja 180oC.
Nesse momento o destilado ser igual a 300 ml.
Notas: 1. No deixar que a temperatura ultrapasse 180oC, assim se
evita que haja arraste de sulfato para o destilado.

2. Quando amostras de alto contedo de cloretos so analisadas, adicionar ao balo de destilao 5 mg de sulfato de
prata para cada mg de cloreto presente na amostra.

3. Usar a soluo de cido sulfrico vrias vezes at que os
contaminantes das amostras de gua acumulados no frasco
de destilao comecem a interferir no destilado. Quando
isso acontecer, o melhor desprezar o cido e comear
tudo novamente.
Importante: A dosagem de flor na gua para consumo humano
estabelecida em funo da mdia das temperaturas mximas dirias
da localidade observadas durante um determinado perodo.

72

Fundao Nacional de Sade

Coleta e preservao de amostras para anlise fsicoqumicas


Parmetros

Recipientes

Volume
mnimo (mL)

Preservao

Tempo
mximo

Alcalinidade

Vidro ou
polietileno

200

Refrigerar

24h/14d

CO2

100

Anlise
imediata

Dureza

100

HNO3 pH < 2

Cloretos

100

No requer

Alumnio

Fluoretos

Polietileno

300

Anlise
imediata

Turbidez

Vidro ou
Polietileno

200

Proteger
da luz

24h

Cloro
Residual

Vidro ou
polietileno

500

Anlise
imediata

30min/2h

pH

200

Anlise
imediata

Cor

500

Refrigerar

24h

Temperatura

6 meses
7 dias

HNO3 pH < 2

6 meses

No requer

28 dias

Fonte: Adaptado de APHA, 1985

Notas: 1. Os volumes aqui descritos so estimados. Na prtica,


deve-se coletar o volume necessrio para realizao das
anlises, at porque existem repeties de anlises muitas
vezes necessrias.

2. Quando preservar com cido ntrico, usar 2 mL do cido
para cada litro de amostra.

3. Normalmente, nas Estaes de Tratamento de gua ETAs, as anlises devem ser efetuadas imediatamente aps
a coleta. No de boa prtica deixar as amostras por muito
tempo para serem analisadas.

Manual Prtico de Anlise de gua

73

Ensaio de coagulao (Jar-test)


O ensaio de coagulao um procedimento de rotina em
estaes de tratamento de gua para determinar a dosagem
dos produtos qumicos utilizados no tratamento.
Podemos dizer que uma simulao do que ocorre na ETA.
Para realizar esse ensaio necessrio que se conhea previamente as seguintes caractersticas da gua bruta: cor, turbidez,
alcalinidade, pH e temperatura; alm de parmetros hidrulicos da estao de tratamento, tais como: vazo, tempo de
deteno no floculador, velocidade de sedimentao no
decantador, etc.
O ensaio de coagulao no uma operao muito simples,
pois devem ser consideradas algumas variveis do processo,
como a cor e turbidez da gua bruta; se a alcalinidade natural
da gua suficiente, se o pH est dentro da faixa tima de
floculao, o tipo de coagulante empregado, etc.
Nesse exemplo prtico, consideram-se apenas os parmetros: cor, turbidez, pH e alcalinidade total, j que o objetivo
principal do teste a remoo da cor e turbidez da gua,
aplicando-se uma menor quantidade de coagulante.
O produto qumico utilizado o sulfato de alumnio, sendo
o mais comum.

74

Fundao Nacional de Sade

Etapas do teste de coagulao que devem ser


observadas
a) fazer anlise da amostra bruta cor, pH, turbidez e alcalinidade total, temperatura;
b) descobrir o pH timo de floculao;
c) verificar a menor dosagem do coagulante no pH timo;
d) observar a velocidade de sedimentao dos flocos;
e) analisar o sobrenadante, verificando, principalmente, a
remoo de cor e turbidez.
Material necessrio
a) aparelho de Jar-test conforme o da figura;
b) becker forma baixa de 1000 mL;
c) soluo de sulfato de alumnio a 1%;
d) soluo de cal a 0,5%;
e) pipetas graduadas de 5 e 10 mL.

Fonte: Adaptado de Cetesb, 1973

Manual Prtico de Anlise de gua

75

Procedimento 1 (Considerando que a gua bruta tenha


alcalinidade natural suficiente e tenha, tambm, um pH
timo de floculao).

a) colocar 6 beckers de 1 litro na plataforma do aparelho


de Jar-Test;
b) ench-los com gua bruta at a marca de 1000 mL;
c) ligar o aparelho na velocidade mxima 100 r.p.m;
d) adicionar simultaneamente nos beckers a quantidade de
coagulante (sulfato de alumnio) que foi calculada para
cada becker;
e) deixar agitar nessa velocidade por 2 a 3 minutos (tempo
de deteno na cmara de mistura rpida);
f) reduzir a velocidade de agitao para 50 r.p.m durante
10 a 30 minutos (tempo de deteno nos floculadores);
g) deixar as amostras decantar por algum tempo (esse tempo
seria o correspondente velocidade de sedimentao no
decantador 10 a 30 minutos);
h) coletar o sobrenadante de todos os beckers e analisar os
parmetros necessrios para verificar qual deles apresentou melhor resultado;
i) normalmente o melhor resultado aquele que apresentou
maior reduo de cor e turbidez e essa dosagem dever
ser a escolhida.

Procedimento 2 (Quando a gua no tem alcalinidade natural suficiente e desconhece-se o pH timo de floculao.)

a) colocar 6 beckers de 1 litro na plataforma do aparelho


de Jar-Test;
b) ench-los com gua bruta at a marca de 1000 mL;
76

Fundao Nacional de Sade

c) ligar o aparelho na velocidade mxima 100 r.p.m;


d) estabelecer diferentes pH nos beckers usando lcali (cal
hidratada);
e) aplicar uma quantidade fixa de sulfato de alumnio em
todos os beckers e proceder de acordo com os passos e)
a i) do procedimento 1;
f) medir o pH do frasco que apresentou melhor resultado;
g) executar novo ensaio, fixando em todos os beckers o pH
timo encontrado no item anterior;
h) adicionar sulfato de alumnio em cada becker, variando
a concentrao em valores prximos (menor e maior) da
dosagem utilizada na letra e);
i) proceder de acordo com os passos de e) a i) do procedimento 1.
Notas: 1. Dependendo das alteraes que a gua bruta possa
sofrer, consequncia de enchentes, estiagens, alteraes
climticas, etc., recomendado sempre fazer novos testes
para ajustar as dosagens dos coagulantes.

2. Quando a gua bruta no tiver alcalinidade natural suficiente para reagir com o sulfato de alumnio, usar cal hidratada ou outro lcali para promover uma alcalinidade
artificial.

3. Quando a gua bruta no tiver um pH timo de floculao, criar essa condio, utilizando cidos ou bases
(lcalis).

4. O lcali mais usado a cal hidratada.

5. Normalmente se usa sulfato de alumnio a 1% e cal a
0,5% para fazer os ensaios, pois facilita a medio de volumes utilizados no processo.

6. Para dosagens de sulfato de alumnio de 10 15 20
25 30 e 35 mg/L de uma soluo a 1% so necessrios
os seguintes volumes: 1,0 mL, 1,5 mL, 2,0 mL, 2,5 mL, 3,0
mL e 3,5 mL, respectivamente. Para dosagem de cal, usa-se
metade desses volumes em mL.
Manual Prtico de Anlise de gua

77

7. As velocidades de agitao, os tempos de agitao e o


tempo de decantao dependem das dimenes das unidades de tratamento e da vazo de operao.
8. Consultar a tabela abaixo para estabelecer a quantidade
de cal necessria em funo do consumo de sulfato de alumnio.

Consumo de
Sulfato de
Alumnio
mg/L
Al2(SO4)3

Alcalinidade
teoricamente
necessria
mg/L (CaCO3)

Alcalinidade
natural
desejada
(CaCO3)

Quantidade
terica de cal
mg/L *

Quantidade de
cal desejvel
mg/L *

10
15
20
25
30
40
50

5
7
9
12
14
18
25

7
10
14
17
20
27
34

3
4
5
7
8
10
13

4
6
8
10
12
15
19

Fonte: Tcnicas de Abastecimento e Tratamento de gua - vol. II/Cetesb SP


* se no houver alcalinidade natural.

Teoricamente, cada mg/L de sulfato de alumnio requer:


0,45 mg/L de alcalinidade natural;
0,25 mg/L de cal (CaO);
0,33 mg/L de cal como Ca(OH)2;
0,48 mg/L de carbonato de sdio Na2CO3 (barrilha).

Correo do pH da gua tratada


A correo do pH da gua tratada um procedimento utilizado nas ETAs com a finalidade de prevenir o processo de
corroso das estruturas metlicas do sistema de distribuio
que provocado pela acidez da gua, consequncia da
presena de gs carbnico dissolvido.

78

Fundao Nacional de Sade

As guas superficiais possuem gs carbnico dissolvido. Esse


gs carbnico pode ser proveniente da atmosfera, da respirao dos seres aquticos e at da reao do sulfato de alumnio
quando esse reage com a alcalinidade natural da gua.
A correo do pH significa elevar o pH da gua tratada at
o pH de saturao que o ponto onde no acontece mais o
processo de corroso. Esse pH no igual para todas as guas
e sua determinao pode ser feita no laboratrio.

Mtodo de determinao
Ensaio do mrmore
Material necessrio
a) balo volumtrico de 1000 mL;
b) medidor de pH;
c) balana.
Reagente
Carbonato de clcio
Tcnica
a) colocar 750 mL de gua filtrada em um balo volumtrico de 1000 mL;
b) determinar o pH e a alcalinidade (I) dessa gua;
c) adicionar 10 gramas de carbonato de clcio ao balo;
d) agitar por 1/2 hora e deixar decantar e filtrar;
e) determinar o pH;
Manual Prtico de Anlise de gua

79

f) agitar novamente o balo por mais 1/2 hora;


g) deixar decantar e filtrar;
h) determinar novamente o pH.
Repetir os procedimentos "e","f" e "g" at pH constante.
O pH de saturao ser o pH constante encontrado.
Determinar na ltima operao a alcalinidade (II).

Concluso
Se a alcalinidade II > alcalinidade I => gua corrosiva.
Se a alcalinidade II = alcalinidade I => gua no corrosiva.
Se a alcalinidade II < alcalinidade I => gua incrustante.

Determinao do teor de cloro ativo em


uma soluo de cloro (hipoclorito de sdio e
hipoclorito de clcio)
Material necessrio
a) frasco Erlenmeyer de 250 ou 500 mL;
b) bureta de 50 mL;
c) pipeta volumtrica de 1; 5 e 10 mL;
d) balana de preciso.

80

Fundao Nacional de Sade

Reagentes
a) tiossulfato de sdio 0,1N (Na2S2O3. 5H2O);
b) iodeto de potssio (KI);
c) cido actico P.A;
d) indicador de amido.
Tcnica
a) medir 1,0 mL da soluo;
b) dissolver em 50 mL de gua destilada;
c) adicionar 5,0 mL de cido actico concentrado (glacial);
d) adicionar 1,0 g de iodeto de potssio;
e) titular com a soluo de tiossulfato de sdio 0,1 N;
f) anotar os mL de tiossulfato gastos.
Clculo
% de cloro =

(A-B) x N x 35,45
P x 10

onde:
A = mL de tiossulfato gasto na titulao da amostra
B = mL de tiossulfato gasto no branco
N = Normalidade do tiossulfato
P = Peso ou volume do produto
Observao: Dependendo da concentrao da soluo a ser analisada usar um peso ou volume que no gaste mais do
que a capacidade da bureta utilizada, de tiossulfato
de sdio 0,1 N.Fazer um branco com gua destilada.
Manual Prtico de Anlise de gua

81

Preparao dos reagentes


utilizados nas anlises
constantes nesse manual

Reagentes para alcalinidade


Soluo de cido sulfrico 0,02 N
Para preparar essa soluo, faz-se primeiro uma soluo
0,1N do seguinte modo:
a) transferir, com pipeta, lentamente, 2,8 mL de cido sulfrico concentrado (96% d=1,84) para um balo volumtrico
de 1000 mL contendo cerca de 500 mL de gua destilada;
b) completar o volume, at a marca, com gua destilada e
agitar;
b) desta soluo, medir, com pipeta volumtrica, 200 mL
e transferir para um balo volumtrico de 1000 mL e
completar o volume com gua destilada. Essa soluo
aproximadamente 0,02 N.

Soluo de carbonato de sdio 0,02 N


Para preparar a soluo de carbonato de sdio 0,02 N secar
1,5 a 2,0 gramas de Na2CO3 grau padro primrio, a 250 C
por quatro horas. Esfriar em dessecador. Em seguida, pesar
1,060 gramas e dissolver em 250 mL de gua destilada e
completar o volume para 1000 mL com gua destilada em
balo volumtrico.
0

Padronizao da soluo
Colocar 50 mL de uma soluo de carbonato de sdio 0,02
N em um frasco Erlenmeyer de 250 mL e adicionar 4 gotas
do indicador metilorange. Titular com H2SO4 0,02N at a
viragem do indicador para leve colorao avermelhada.
Anotar o volume do cido gasto.

Manual Prtico de Anlise de gua

85

Para calcular a normalidade correta, use a seguinte frmula:


N=

N X V
V

onde:
N = normalidade do H2SO4 desejada
V = volume do cido gasto na titulao
N = normalidade do carbonato de sdio
V = volume do carbonato de sdio usado
1 ml de H2SO4 0,02 N = 1,0 mg de CaCO3

Soluo de tiossulfato de sdio 0,1 N


Pesar exatamente 25,0 gramas de Na2S2O3.5H2O e dissolver
em um pouco de gua destilada e completar o volume para
1000 mL em balo volumtrico.

Indicador metilorange
Pesar 0,100 gramas de metilorange e dissolver em 200 mL
de gua destilada.

Fenolftalena
a) dissolver 1 grama de fenolftalena em um pouco de gua
destilada e diluir a 200 mL.
b) adicionar gotas de NaOH 0,02 N at o aparecimento de
leve colorao cor-de-rosa.

86

Fundao Nacional de Sade

Mistura indicadora de verde de bromocresol/


vermelho de metila
Pesar 20 mg de vermelho de metila e 100 mg de verde de
bromocresol e dissolver em 100 mL de gua destilada ou
lcool etlico a 95%.

Reagentes para CO2


Hidrxido de sdio 0,02 N
Para preparar essa soluo, faz-se primeiro uma soluo
0,1N do seguinte modo:
a) pesar rapidamente 4,2 gramas de hidrxido de sdio
em lentilhas e transferir para um becker de 500 mL e
dissolver em gua destilada isenta de gs carbnico;
b) transferir essa soluo para um balo volumtrico de
1 litro e completar o volume at a marca. Essa soluo
aproximadamente 0,1 Normal.
Padronizar com uma soluo de cido Sulfrico 0,1 normal
do seguinte modo:
a) tomar 100 mL de gua destilada em um frasco Erlenmeyer
de 250 mL;
b) medir, com pipeta volumtrica ou bureta 10 mL da Soluo de NaOH 0,1 Normal e transferir para o Erlenmeyer
acima;
c) juntar 3 a 4 gotas do Indicador de metilorange;
d) titular com a soluo de cido sulfrico 0,1 Normal;
e) anotar os mL de H2SO4 gastos que devem ser 10 ou prximo de 10.
Manual Prtico de Anlise de gua

87

Se o volume de H2SO4 0,1 N gasto na titulao for maior


ou menor que 10 mL, calcular o Fator de correo (Fc) da
soluo de NaOH utilizando a seguinte frmula:
Fc (NaOH) =

ml H2SO4 x Fc (H2SO4)
mL de NaOH

Anotar o Fc no rtulo do frasco.


Preparao da soluo de hidrxido de sdio N/50:
a) transferir 200 mL da soluo-estoque de NaOH 0,1 N
para um balo volumtrico de 1 litro e completar com
gua destilada. Essa nova soluo aproximadamente
N/50 (0,02 N).
Padronizao da soluo de NaOH 0,02 N:
a) tomar 100 mL de gua destilada em um frasco Erlenmeyer
de 250 mL;
b) medir, com pipeta volumtrica ou bureta 10 mL da soluo de NaOH 0,02 N, e transferir para o Erlenmeyer
acima;
c) juntar 3 a 4 gotas do Indicador de metilorange;
d) titular com a soluo de cido sulfrico 0,02 N at a
viragem do indicador;
e) anotar o volume de H2SO4 gastos que devem ser em torno
de 10 mL.
Clculo do fator de correo do NaOH
Fc (NaOH) 0,02N =

88

mL de H2SO4 de 0,02 N x Fc (H2SO4)


mL de NaOH

Fundao Nacional de Sade

Notas: 1. A viragem do indicador no muito fcil de visualizar.


Fazer um branco com 100 mL de gua destilada para a
comparao de cor no momento da viragem do indicador.

2. Ao adicionar o indicador, a soluo fica amarelada e no
final da titulao a soluo fica levemente avermelhada.

3. gua isenta de CO2 pode ser obtida pela fervura da gua
destilada durante 15 minutos e resfriada rapidamente at a
temperatura ambiente.

Fenolftalena
a) dissolver 1 grama de fenolftalena em um pouco de gua
destilada e diluir a 200 mL;
b) adicionar gotas de NaOH 0,02N at o aparecimento de
leve colorao cor-de-rosa.

Reagentes para anlise de cloretos


Soluo-Padro de Nitrato de Prata 0,0141 N
a) pesar 2,395 gramas de AgNO3 e dissolver em um pouco de gua destilada. Completar para 1 litro em balo
volumtrico;
b) padronizar contra uma soluo de cloreto de sdio
0,0141N; 1,00 mL = 500 g Cl-;
c) guardar a soluo em frasco escuro.
Cloreto de sdio 0,0141 N
a) dissolver 824,1 mg de cloreto de sdio seco a 140oC

em gua livre de cloretos e diluir para 1000 mL. 1,00


mL = 500 g Cl-.

Manual Prtico de Anlise de gua

89

Padronizao da soluo de nitrato de prata 0,0141 N


a) usar 100 mL de amostra (NaCl 0,0141 N) ou uma
poro diluda a 100 mL;
b) ajustar o pH entre 7 e 10 com NaOH ou H2SO4 1 N;
c) adicionar 1 mL de K2CrO4 (cromato de potssio);
d) titular com a soluo de nitrato de prata 0,0141 N at
o aparecimento da cor amarelo avermelhado;
e) anotar o volume de nitrato de prata gasto na titulao;
f) calcular o fator de correo do AgNO3 0,0141 N usando
a seguinte frmula:
Fc =

100
Vp

onde:
Fc = Fator de correo
Vp = Volume de AgNO3 gasto na titulao
Soluo indicadora de cromato de potssio (K2CrO4)
a) pesar 50 gramas de K2CrO4 e dissolver em um pouco
de gua destilada;
b) adicionar soluo de AgNO3 0,0141 N at formar um
precipitado vermelho;
c) deixar em repouso por 12 horas;
d) filtrar e completar o volume para 1000 mL com gua
destilada.

90

Fundao Nacional de Sade

Hidrxido de sdio (NaOH) 1N


a) pesar 40 gramas de hidrxido de sdio e dissolver em
um pouco de gua destilada e diluir a 1 litro;
b) guardar em frasco de polietileno ou vidro-pirex.
cido sulfrico (H2SO4) 1N
a) em um becker de 1000 mL colocar cerca de 500 ml
de gua destilada;
b) em seguida medir 28 mL de cido sulfrico concentrado
e adicionar lentamente no becker acima, com agitao
constante;
c) deixar esfriar;
d) transferir para um balo volumtrico de 1000 mL e
completar o volume com gua destilada, homogeneizando a seguir;
e) armazenar em frasco de polietileno ou vidro pirex.
Notas: 1. Agitar com basto de vidro.

2. Nunca adicionar gua no cido, e sim cido na gua.

Reagentes para anlise de dureza


Soluo-padro de EDTA 0,01 M
a) pesar 3,723 gramas de EDTA (sal di-sdio do cido etilenodiamino tetraactico), dissolver em gua destilada
e diluir a 1000 mL;
b) padronizar contra uma soluo-padro de carbonato
de clcio;
c) guardar essa soluo em frasco de polietileno.
Manual Prtico de Anlise de gua

91

Soluo-padro de clcio
a) pesar 1,0 grama de carbonato de clcio anidro (CaCO3)
padro primrio e colocar em um frasco Erlenmeyer
de 250 mL;
b) adicionar aos poucos, com auxlio de um funil, HCl
1:1 at dissolver todo CaCO3;
c) adicionar 200 mL de gua destilada e ferver por alguns
minutos para eliminar o CO2;
d) esfriar e adicionar algumas gotas de vermelho de metila
e ajustar para a cor laranja intermediria por adio de
NH4OH 3N ou HCl 1:1;
e) transferir toda a mistura para um balo volumtrico de
1000 mL e completar o volume com gua destilada (1
mL desta soluo = 1,0 mg de CaCO3).
Padronizao da soluo de EDTA 0,01 M
a) medir 25 mL da soluo-padro de clcio e diluir para
50 mL com gua destilada em frasco Erlenmeyer de
125 mL;
b) adicionar 1 a 2 mL da soluo tampo para obter o pH
em torno de 10 0,1;
c) adicionar 0,05 gramas do indicador eriochrome black
T;
d) titular com EDTA 0,01 M gota a gota at desaparecer
a ltima colorao violcea e aparecer a cor azul indicadora do ponto final da titulao.
Clculo:
Fc =
92

25
Vp

Fundao Nacional de Sade

onde:
Fc = Fator de Correo
Vp = Volume de EDTA gasto na titulao
Soluo tampo para dureza
a) pesar 16,9 gramas de cloreto de amnia (NH4Cl) e dissolver em 143 mL de hidrxido de amnia concentrado
(NH4OH);
b) adicionar 1,25 gramas do sal de magnsio do EDTA e
diluir a 250 mL com gua destilada.
Observao: Caso no disponha do sal de magnsio do EDTA,
dissolver 1,179 gramas do sal sdico do EDTA e 780
mg do MgSO4.7H2O ou 644 mg do MgCl2.6H2O em
50 mL de gua destilada e juntar soluo do item
1, completando o volume para 250 mL com gua
destilada.

Indicador negro Eriocromo T


a) pesar 0,5 gramas de negro eriocromo T em um vidro
de relgio;
b) pesar 100 gramas de cloreto de sdio P. A. em um
Becker;
c) transferir os dois reagentes para um almofariz e triturar
a mistura at se transformar em p;
d) armazenar em frasco de boca larga, bem fechado.
Inibidor I cianeto de sdio P.A.
Usar 250 mg na soluo a ser titulada.

Manual Prtico de Anlise de gua

93

Inibidor II sulfeto de sdio


a) pesar 5 gramas de sulfeto de sdio ( Na2S.9H2O) ou
3,7 gramas de Na2S.5H2O;
b) dissolver em 100 mL de gua destilada;
c) guardar em frasco de vidro bem fechado a fim de evitar
sua deteriorao por contato com o ar.
Soluo padro de cor
a) pesar 1,246 gramas de cloroplatinato de potssio
(K2PtCl6) e 1,0 grama de cloreto cobaltoso cristalizado
(CoCl2.6H2O);
b) dissolver em gua destilada;
c) acrescentar 100 mL de cido clordrico concentrado e
diluir para 1000 mL com gua destilada. (Essa soluo
equivale a 500 Unidades de Cor).

Reagentes para anlise de alumnio


cido sulfrico (H2SO4) 0,02N
a) preparar igual ao utilizado para alcalinidade total.
cido ascrbico
a) pesar 0,1g de cido ascrbico e dissolver em um pouco
de gua destilada e completar o volume para 100 mL.
Essa soluo dever ser preparada diariamente.
Reagente tampo
a) pesar 136 g de acetato de sdio (NaC2H3O2.3H2O )
e dissolver em gua destilada. Adicionar 40 mL de
soluo de cido actico 1N e diluir para 1000 mL
com gua destilada.
94

Fundao Nacional de Sade

Soluo de cido actico 1N


a) medir 58 mL de cido actico concentrado e diluir
para 1000 mL com gua destilada.
Soluo de eriocromo cianina-R (estoque)
a) pesar e dissolver 150 mg do corante em cerca de 50
mL de gua destilada. Ajustar o pH para 2,9 com cido
actico 1:1 (so requeridos aproximadamente 2 ml de
cido). Diluir para 100 mL com gua destilada.
Soluo de trabalho (eriocromo cianina-R)
a) medir 10 mL da soluo-estoque e diluir para 100
mL com gua destilada. Essa soluo estvel por 6
meses.
Soluo indicadora de metilorange.
a) pesar e dissolver 100 mg de metilorange em 200 mL
de gua destilada.
Soluo Estoque de Alumnio (1mL = 500 g Al)
a) pesar 8,791 g de sulfato duplo de alumnio e potssio

(AlK(SO4)2.12H2O) e dissolver em um pouco de gua


destilada. Completar o volume para 1000 mL em balo
volumtrico.
Soluo-Padro de Alumnio (1mL = 5 g)
a) diluir 10 mL da soluo-estoque de alumnio para
1000 mL com gua destilada, em balo volumtrico.

Preparar diariamente.

Observao: 1) Todos os reagentes devem ser preparados com


gua destilada isenta de alumnio.

2) Todos os procedimentos que determinam diluir
ou completar para x mL, fazer em balo volumtrico.
Manual Prtico de Anlise de gua

95

Soluo de EDTA 0,01M


a) pesar e dissolver 3,7 gramas de EDTA em 1000 mL de
gua destilada.

Reagentes para anlise de fluoretos


Soluo-padro de fluoretos
a) preparar uma soluo-estoque, dissolvendo 221,0 mg
de fluoreto de sdio anidro (NaF) em gua destilada e
diluir a 1000 mL (1 mL desta soluo equivale a 100
gF );
b) diluir 100 mL da soluo-estoque acima, para 1000
mL com gua destilada (1 mL = 10 gF ).
Reagente zircnio-alizarina
a) pesar e dissolver 300 mg de oxicloreto de zircnio
(ZrOCl2.8H2O), em 50 mL de gua destilada e transferir
para um frasco volumtrico de 1000 mL com tampa;
b) pesar e dissolver 70 mg de monosulfato de alizarina
em 50 mL de gua destilada;
c) colocar a soluo 2 na soluo 1, lentamente e com
agitao;
d) a soluo resultante dever ficar em repouso por alguns
minutos.
Mistura cida
a) medir 101 mL de cido clordrico concentrado (HCl)
e diluir para aproximadamente 400 mL com gua
destilada;

96

Fundao Nacional de Sade

b) adicionar cuidadosamente 33,3 mL de cido sulfrico


concentrado (H2SO4) em aproximadamente 400 mL de
gua destilada;
c) aps esfriar, misturar as duas solues cidas.
Reagentes Scott-Sanchis
a) adicionar a mistura cida soluo reagente Zirconil-alizarina;
b) completar o volume para 1000 mL com gua destilada
e misturar;
c) guardar em frasco mbar e em lugar protegido da
incidncia de luz direta. Esse reagente estvel por 6
meses.
Arsenito de sdio
a) pesar 5 g de arsenito de sdio (NaAsO3) e dissolver em
um pouco de gua, diluir para 1 litro com gua destilada (usar 1 gota para cada 0,1mg de cloro existente
na amostra).
Observao: essa soluo txica evitar ingesto e contato com
a pele.

Reagentes para anlise do teor de cloro ativo


Tiossulfato de sdio 0,1 N Dissolver 25 gramas de tiossulfato de sdio Na2S2O3.5H2O em 1 litro de gua destilada
fervida recentemente. Armazenar durante duas semanas e
padronizar com dicromato de potssio K2Cr2O7 0,1 N.

Manual Prtico de Anlise de gua

97

Notas: 1. Usar gua destilada fervida na preparao do tiossulfato.



2. Adicionar alguns mililitros de clorofrmio ( 5 mL) para
minimizar a decomposio bacteriana da soluo de tiossulfato.

Dicromato de potssio 0,1 N Pesar 4,904 gramas de dicromato de potssio (K2Cr2O7), dissolver em um pouco de
gua destilada e em seguida diluir para 1 litro. Armazenar
em frasco de vidro com tampa de vidro.
Soluo indicadora de amido Pesar 5,0 gramas de amido.
Adicionar um pouco de gua destilada at formar uma pasta.
Em seguida dissolver essa pasta em um litro de gua destilada fervente. Deixar em repouso durante uma noite. Usar
o lquido sobrenadante preservando-o pela adio de 1,25
gramas de cido saliclico.

Padronizao da soluo de tiossulfato de sdio


0,1N.
Material necessrio
a) bureta de 50 mL;
b) frasco Erlenmeyer de 250 mL;
c) pipeta graduada de 1 mL;
d) pipeta volumtrica de 10 mL.
Procedimento:
a) colocar 80 mL de gua destilada no Erlenmeyer;
b) adicionar, com agitao constante, 1 mL de H2SO4
concentrado e 10 mL de dicromato de potssio 0,1 N;
c) adicionar 1,0 grama de Iodeto de potssio;
d) deixar a mistura reagir durante 6 minutos no escuro;
98

Fundao Nacional de Sade

e) titular com a soluo de tiossulfato de sdio at o


e
aparecimento da colorao amarela claro;
f) adicione 1,0 mL da soluo de amido e continue a
titulao at o desaparecimento da cor azul formada.
Clculo

Normalidade =

1
ml de tiossulfato consumido

Regras gerais para corrigir as solues tituladas


A correo das solues tituladas um procedimento muito
utilizado em laboratrio. Serve para aferir o grau de exatido
das solues padronizadas. Periodicamente, o tcnico deve
verificar a exatido dessas solues para que os resultados
das anlises sejam os mais corretos possveis.

Regra 1
Quando o volume consumido de soluo a titular for igual ao
volume da soluo-padro tomado para a titulao, significa
que aquela est exata.
Exemplo: 10 mL de HCl 0,1N foram consumidos para titular 10
mL de Na2CO3 0,1N.

Regra 2
Quando o volume consumido da soluo a titular for menor
que o volume do padro tomado, significa que a soluo a
titular encontra-se mais concentrada. Nesse caso, faz-se a
correo do seguinte modo:

Manual Prtico de Anlise de gua

99

Exemplo: Foram gastos na titulao de 10 mL de Na2CO3 0,1N;


8,3 mL de HCl 0,1 N. Aplicando-se a seguinte equao,
temos: 8,3 : 10 :: x : 1000.

Efetuando-se os clculos, tem-se:


10x = 8,3 x 1000
x = 8300/10 x = 830 mL
Logo, mede-se 830 mL da soluo a titular e completa-se
a 1000 mL com gua destilada. Fazer nova titulao para
verificar o rigor da dosagem, que no deve ficar abaixo de
9,9 e acima de 10,1 mL.

Regra 3
No caso em que o volume da soluo a titular for maior do
que o da soluo-padro, significa que a soluo a titular
encontra-se mais diluda. Nesse caso, calcula-se o fator de
correo da seguinte forma:
Exemplo: 10,5 mL de uma soluo de HCl 0,1N foram consumidos para titular 10 mL de uma soluo-padro de
Carbonato de Sdio.

Aplicando-se a seguinte equao, temos:

10,5 : 10 :: 1 : x

Efetuando-se os clculos temos:

10 = 10,5x
x = 10/10,5

x = 0,9524

Logo o Fator de correo da soluo 0,9524.

Limpeza de material de vidro no laboratrio


A preciso e exatido das anlises esto, alm de outros
fatores, tambm, ligadas ao uso do material de vidro no
laboratrio.
Faz-se, portanto, necessrio que toda a vidraria esteja perfeitamente limpa, livre de impurezas, tais como sabes,
100

Fundao Nacional de Sade

detergentes e outros produtos que podem ficar aderidos s


paredes dos recipientes.
A vidraria em geral pode ser lavada simplesmente com gua,
gua e sabo neutro ou por meio de solues especiais, como
a soluo sulfo-crmica, por exemplo.

Procedimento de lavagem
Para vidraria nova:
a) a maioria dos materiais de vidros novos levemente

alcalina, portanto esses materiais devem ser colocados


de molho por algumas horas em soluo de cido
clordrico ou ntrico a 1% antes de serem lavadas.
Para vidraria usada:
a) os materiais de vidro j utilizados com meio de cultura
(placas de Petri, tubos de cultura), devem ser esterilizados antes de serem lavados. Depois devem ser colocados em um recipiente grande, com gua contendo
1 a 2 % de sabo ou detergente, deixando ferver por
30 minutos. Em seguida devem ser enxaguados com
gua corrente, esfregados com detergentes neutros e
enxaguados novamente;
b) em determinadas situaes em que os materiais de vidro
no puderem ser limpos com os detergentes comuns ou
outros produtos de limpeza, faz-se necessrio o uso de
uma mistura constituda de cido sulfrico e soluo
saturada de dicromato de sdio, preparada do seguinte
modo: misturar 1 litro de cido sulfrico concentrado
com 35 mL da soluo saturada de dicromato de sdio. Essa soluo no deve ser usada para lavagem de
vidrarias utilizadas para anlise de cromo.
Manual Prtico de Anlise de gua

101

Notas: 1. a soluo acima cida e ataca a pele;



2. no permitir contato da mo com a soluo;

3. a soluo ataca os tecidos. Evitar contato com a roupa;

4. no lavar com essa soluo vidros colados como cubetas utilizadas em espectrofotmetros, cubetas de turbidez,
etc.;

5. depois de passar essa soluo na vidraria, enxagu-la
com bastante gua e em seguida com gua destilada.

Relao de materiais de laboratrio de anlise


de gua
Equipamentos
a) autoclave vertical, capacidade para 18, 24, 48 ou 72
litros, 110/220 volts;
b) estufa para cultura bacteriolgica, com termostato regulvel na faixa de 30 a 65oC, tamanho 45x45x40 cm de
largura, profundidade e altura, respectivamente, equipada
com bandeja regulvel para trs posies;
c) balana analtica, eltrica, capacidade para 160 g, sensibilidade de 1/100 mg, cinco casas decimais, 110/220 volts;
d) balana de preciso, com dupla escala, pesagem mxima
200 gramas, sensibilidade de 0,1 g;
e) destilador de gua, capacidade para 2 litros/hora, 110/220
volts;
f) banho-maria capacidade para 50 tubos de ensaio, com
termostato regulvel na faixa de 35 a 65oC, 110/220 volts;
g) banho de vapor, para 6 provas simultneas, construdo
em chapa metlica, com termostato regulvel em at 6
posies, 110/220 volts;
102

Fundao Nacional de Sade

h) capela para exausto forada de gases, com motor eltrico


de 1/3 de HP, 110/220 volts;
i) chapa aquecedora com termostato regulvel, tamanho x,
110/220 volts;
j) estufa para esterilizao e secagem, tamanho 50x40x50
cm de largura, profundidade e altura, respectivamente,
com termostato regulvel at 300oC, e bandeja regulvel
para 3 posies, 110/220 volts;
k) aparelho de Jar-Test para 6 provas simultneas, com regulador de velocidade de 0 a 100 rpm, com base de vidro
ou acrlico iluminada, 110/220 volts;
l) medidor de cloro residual, porttil, com disco de cor,
escala de 0 a 3,5 mg/L, para uso com reagente DPD;
m) termmetro bacteriolgico, com escala de 0 a 60oC, com
divises de 1oC;
o
n) termmetro qumico com escala de 0 a 300 C, com diviso de 1oC;
o) turbidmetro, completo;
p) medidor de pH digital, de bancada, faixa de medio de
0 a 14, com eletrodo, 110/220 volts;
q) medidor de pH, digital, porttil, faixa de medio de 0 a
14, com eletrodo, funcionamento bateria de 9 volts;
r) lanterna para identificao de E. Coli, com lmpada
fluorescente ultravioleta, 6 watts, 365 nm, recarregvel,
porttil, 110 volts;
s) bico de Bunsen;
t) deionizador capacidade para 50 litros/hora 110/220
volts.

Manual Prtico de Anlise de gua

103

Vidraria
a) tubo para cultura, sem borda, tamanho 150 x 16 mm;
b) tubo para cultura, sem borda, tamanho 180 x 18 mm;
c) tubo para cultura, sem borda, tamanho 125 x 15 mm;
d) tubo de Nessler, forma alta, capacidade de 50 e 100 mL;
e) tubo de Durhan, tamanho 40 x 5 mm;
f) balo volumtrico, fundo chato, com tampa de teflon
ou vidro esmerilhado, classe "A" capacidade de 50, 100,
250, 500 e 1000 mL;
g) becker forma baixa, graduado, capacidade de 50, 100,
250, 500 e 1000 mL;
h) bureta com torneira de vidro ou teflon, gravao permanente, classe "A" capacidade de 10, 25, e 50 mL;
i) pipeta sorolgica, codificada por cores, com bocal para algodo, gravao permanente, capacidade de 1, 2, 5 e 10 mL;
j) pipeta de MOHR, codificada por cores, bocal e bico temperados, gravao permanente, capacidade de 1, 2, 5 e 10 mL;
k) pipeta volumtrica, codificada por cores, bocal e bicos
temperados, gravao permanente, classe A, capacidade
de 10, 25, 50 e 100 mL;
l) frasco de vidro para reagentes, boca larga, cor branca,
com rolha de vidro esmerilhada intercambivel, capacidade de 125 mL;
m) proveta graduada a conter, com base hexagonal de vidro,
gravao permanente, classe "A", capacidade de 10, 25,
50, 100, 250, 500 e 1000 mL;
n) frasco Erlenmeyer, boca larga reforada, graduado, capacidade de 125, 250 e 500 mL;
104

Fundao Nacional de Sade

o) funil analtico, ngulo de 60o, liso, haste curta, com dimetro de 50, 75 e 100 mm;
p) funil analtico, ngulo de 60o, raiado, haste longa, com
dimetro de 50, 75 e 100 mm;
q) funil analtico, ngulo de 60o, raiado, haste curta, com
dimetro de 50, 75 e 100 mm;
r) Placa de Petri de vidro, transparente, tamanho 100 x 15
mm;
s) conjunto de destilao para fluoretos, constitudo de
balo de fundo chato de 1000 mL com sada lateral para
condensador Grahan, com juntas esmerilhadas;
t) basto de vidro de 30 cm de comprimento x 5 mm de
dimetro.

Materiais diversos
a) ala de platina calibrada com 3 mm de dimetro;
b) cabo de Kolle para ala de platina;
c) algodo em rama para bacteriologia;
d) lpis dermogrfico;
e) caldo lactosado, desidratado, embalagem de 100 ou 500
gramas;
f) caldo lactosado, verde brilhante bile a 2%, desidratado,
embalagem de 100 ou 500 gramas;
g) meio ENDO MF, para coli total, embalagem de 100 ou
500 gramas;
h) meio EC MF, para coli fecal, embalagem de 100 ou 500
gramas;
i) prpura de bromocresol, embalagem de 5 gramas;
Manual Prtico de Anlise de gua

105

j) estante para tubo de ensaio, com capacidade para 15


tubos de 180 x 18 mm, de madeira ou plstico resistente;
k) estante para tubo de ensaio com capacidade para 40 tubos
de 180 x 18 mm, em arame resistente autoclavao;
l) caldo lauril triptose, desidratado, embalagem de 100 ou
500 gramas;
m) meio EC, desidratado, embalagem de 100 ou 500 gramas;
n) Plate count agar, desidratado, embalagem de 100 ou 500
gramas;
o) substrato cromognico para determinao enzimtica
qualitativa de coliformes totais e E. Coli em amostras
de100 ml de gua, caixa com 20 ampolas;
p) cesto de arame com capacidade para 50 tubos de ensaio
de 180 x 18 mm, resistente autoclavao;
q) suporte para tubo de Nessler de 50 e 100 mL, em madeira
ou alumnio, capacidade para 8 tubos;
r) papel de alumnio, medindo 7,5 m de comprimento x 30
cm de largura;
s) algodo hidrfilo, pacote de 500 gramas;
t) Placa de Petri, de plstico, esterilizada, de 47 mm de
dimetro;
u) filtros estries de 47 mm de dimetro, 0,45m de porosidade, com carto absorvente, embalagem com 100
unidades;
v) conjunto porta-filtro de membrana, construdo em ao
inoxidvel, com dispositivo para esterilizao no campo;
w) pina de ao inoxidvel, de 10 cm de comprimento.

106

Fundao Nacional de Sade

Biossegurana em laboratrio
Neste manual, constam apenas os principais procedimentos
relacionados biossegurana em laboratrio que devero ser
observados pelos tcnicos que atuam na rea.

Procedimentos de ordem pessoal:


a) no pipetar nenhum tipo de lquido com a boca;
b) usar culos de proteo nos ambientes do laboratrio
onde o uso obrigatrio;
c) no levar as mos boca ou aos olhos quando estiver
manuseando produtos qumicos;
d) no guardar alimentos na geladeira do laboratrio;
e) no fazer refeies dentro do laboratrio;
f) no fumar no interior do laboratrio;
g) usar avental/jaleco de manga comprida com elstico no
punho, sempre. E retir-lo ao sair do laboratrio;
h) lavar cuidadosamente as mos com bastante gua e sabo,
antes de fazer qualquer refeio;
i) no manipular produtos txicos sem antes se certificar de
sua toxicidade.

Procedimentos relacionados ao laboratrio


a) manter as bancadas do laboratrio sempre limpas e livres
de materiais estranhos ao trabalho;
b) retirar da bancada os materiais, amostras e reagentes
empregados no trabalho, logo aps utiliz-los;
c) limpar imediatamente qualquer derramamento de produtos e reagentes com os cuidados necessrios;
Manual Prtico de Anlise de gua

107

d) ao esvaziar um frasco de reagente, fazer a limpeza prvia


com gua, antes de coloc-lo para lavagem;
e) rotular imediatamente qualquer reagente ou soluo
preparada e as amostras coletadas;
f) no jogar produtos corrosivos concentrados na pia;
descart-los somente aps serem diludos;
g) na preparao de solues cidas nunca adicionar gua
no cido e sim cido na gua;
h) no jogar na pia lquidos inflamveis e/ou volteis; estoc-los em recipientes adequados;
i) dispor os cilindros com gases em ambiente externo ao
laboratrio, devidamente acondicionados;
j) usar cmara de fluxo laminar (cabine de segurana biolgica) para manipulao de meios de cultura e pesquisa
microbiolgica;
k) usar cmara de exausto (cabine de segurana qumica)
com lavador de gases quando manusear lquidos inflamveis e/ou volteis.

Procedimentos para o uso de vidrarias


a) no utilizar materiais de vidro trincados;
b) usar luvas de amianto para manusear peas de vidro que
estejam quentes;
c) no deixar frascos quentes sem proteo sobre as bancadas
do laboratrio, coloc-los sobre placas de amianto;
d) no aquecer recipiente de vidro em chama direta, usar
tela de amianto;
e) no pressurizar recipientes de vidro;

108

Fundao Nacional de Sade

f) no esquecer vidraria em aquecimento usar despertador,


sempre;
g) no usar frascos para amostras que no estejam perfeitamente limpos e sem certificar-se de sua adequao aos
servios a serem executados;
h) usar luvas de pelica e culos de segurana, sempre que
atravessar ou remover rolhas de borracha ou cortia, de
tubos de vidro ou termmetros;
i) remover tampas de vidro emperradas;
j) remover cacos de vidro usar p de lixo e escova;
k) usar protetor facial e luvas de pelica quando agitar solventes volteis em frascos fechados.

Procedimento para uso de equipamentos em geral


a) antes de utilizar qualquer equipamento ler as instrues
de operao fornecidas pelo fabricante;
b) nunca ligar equipamentos eltricos sem antes verificar a
voltagem;
c) no instalar nem operar equipamentos eltricos sobre
superfcies midas;
d) no deixar equipamentos eltricos ligados no laboratrio
fora do expediente, exceto os de energia constante como
geladeiras, estufas, etc.;
e) combater fogo em equipamentos eltricos somente com
extintor de CO2;
f) manter os equipamentos de segurana em locais de fcil
acesso e ao alcance de todos os funcionrios do laboratrio, tais como:
extintor de incndio;
Manual Prtico de Anlise de gua

109

chuveiro de emergncia;
lavador de olhos;
cobertor de segurana;
mscara contra gases;
mscaras e culos de segurana, etc.

110

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Apndice A

Coleta e preservao de amostras para


contagem de clulas de cianobactrias
e cianotoxinas

Indroduo
No final da elaborao deste manual, j revisado e adaptado
para a atual legislao sobre qualidade de gua para consumo humano, foram includos os procedimentos bsicos de
coleta de amostras de gua para a identificao e contagem
de cianobactrias em mananciais de abastecimento.
Tal iniciativa deve-se crescente eutrofizao dos ambientes
aquticos que tem sido produzida principalmente por atividades humanas, causando um enriquecimento artificial desses
ecossistemas. As principais fontes desse enriquecimento tm
sido identificadas como as descargas de esgotos domsticos e
industriais dos centros urbanos e a poluio difusa originada
nas regies agricultveis. Essa eutrofizao artificial produz
mudanas na qualidade da gua, incluindo: a reduo de
oxignio dissolvido, a perda das qualidades cnicas, ou seja,
das caractersticas estticas do ambiente e seu potencial para
lazer, a morte extensiva de peixes e o aumento da incidncia
de floraes de microalgas e cianobactrias, com conse
quncias negativas sobre a eficincia e custo de tratamento
da gua, quando se trata de manancial de abastecimento
pblico. Essas floraes ou blooms se caracterizam pelo
intenso crescimento desses micro-organismos na superfcie
da gua, formando uma densa camada de clulas com vrios
centmetros de profundidade, com consequncias relacionadas sade pblica.

Coleta e preservao de amostras para


contagem de clulas de cianobactrias
Material necessrio
a) frasco de polietileno ou vidro mbar, com capacidade para 1000 mL;
Manual Prtico de Anlise de gua

113

b) garrafa de Van Dorn ou similar;


c) soluo de lugol;
d) soluo de Formaldeido a 40%;
e) equipamentos de proteo individual (luvas,
botas e mscara).

Definio do ponto de coleta da amostra


a) quando houver florao de Cianobactrias, a
amostra dever ser coletada no ponto de maior
concentrao da mesma;
b) quando no houver florao de Cianobactrias,
a amostra dever ser coletada no ponto de captao da ETA, no manancial.
Identificao das amostras
a) todas as amostras devero ser identificadas por
uma numerao no prprio frasco de coleta,
referente s fichas de coleta;
b) as fichas de coleta acompanharo as amostras
e devero conter os seguintes dados: nome e
endereo do interessado, nome do manancial,
tipo de manancial, data e hora da coleta, descrio do local de coleta GPS, nome do coletor,
ocorrncia de fenmenos.

114

Fundao Nacional de Sade

Procedimento de coleta - amostra de superfcie


a) fazer ambiente no frasco de coleta por pelo menos trs vezes;
b) encher o vasilhame com a amostra coletada,
deixando um volume de ar na parte superior do
frasco;
c) coletar no mnimo 1000 mL da amostra para gua
bruta;
d) coletar 4.000 mL da amostra para gua tratada.
Observao: Coletar somente em frasco mbar.

Preservao, acondicionamento e transporte da


amostra
a) ambientes oligotrficos: preservar as amostras
em soluo Lugol (adicionar 1mL/L);
b) ambientes eutrofizados: preservar as amostras em
soluo Formaldedo 40%: (adicionar 2mL/L);
c) refrigerar a amostra a 4C;
d) acondicionar em caixas trmicas e encaminhar
ao laboratrio em no mximo 08 horas.

Coleta e preservao de amostras para


determinao de cianotoxinas
Material utilizado
a) frasco de polietileno ou vidro mbar, com capacidade para 1000 mL;
b) equipamentos de proteo individual (luvas,
botas e mscara).
Manual Prtico de Anlise de gua

115

Definio do ponto de coleta da amostra


a) quando houver florao de Cianobactrias, a
amostra dever ser coletada no ponto de maior
concentrao da mesma;
b) quando houver florao de Cianobactrias e a
contagem de clulas ultrapassar a 20.000 clulas/
mL, devero ser coletadas amostras no manancial
e na sada da ETA, segundo determinao da
Portaria MS n 2.914/2011;
c) quando no houver florao de Cianobactrias,
a amostra dever ser coletada no ponto de captao da ETA, no manancial.

Identificao das amostras


a) todas as amostras devero ser identificadas por
uma numerao no prprio frasco de coleta,
referente s fichas de coleta;
b) as fichas de coleta acompanharo as amostras e
devero conter os seguintes dados: nome e endereo do interessado, nome do manancial, tipo
de manancial, data e hora da coleta, descrio
do local de coleta GPS, nome do coletor e
ocorrncia de fenmenos.

Procedimentos de coleta Frao Particulada


Material necessrio
a) fazer ambiente no frasco de coleta por pelo menos trs vezes;

116

Fundao Nacional de Sade

b) encher o vasilhame com a amostra coletada,


deixando um volume de ar na parte superior do
frasco;
c) coletar no mnimo 1000 mL da amostra de gua
bruta;
d) coletar 4000 mL da amostra de gua tratada;

Preservao, acondicionamento e transporte da


amostra
a) refrigerar a amostra a 4oC;
b) acondicionar em caixas trmicas e encaminhar
ao laboratrio em no mximo 08 horas.
Observao: Caso a amostra no possa ser enviada ao Laboratrio no mesmo dia da coleta, a mesma dever ser
congelada e enviada ao laboratrio no prazo mximo de 15 dias.

Lavagem dos frascos


Sugere-se para lavar os frascos de coleta e acondicionamento
de amostras para anlise de cianotoxinas o seguinte procedimento: deix-los previamente imersos em sabo neutro por
12 horas, depois lavar exaustivamente com gua e colocar
em soluo de HCl a 5% durante 12 horas, lavar novamente
e exaustivamente com gua destilada e secar. Caso o frasco
j tenha sido utilizado anteriormente para coleta de amostras
contendo cianobactrias, deix-lo em uma soluo de gua
sanitria por 30 minutos antes de passar pelo sabo neutro.

Manual Prtico de Anlise de gua

117

Garrafa de van Dorn


A garrafa de van Dorn (fig.) consiste de um tubo de PVC com volume
de 2; 5 e 7 litros ou mais. O funcionamento consiste em mergulhar a
garrafa aberta em ambas as extremidades e aps atingir o ponto desejado, deixa-se cair o mensageiro que
fecha hermeticamente as duas extremidades. A amostra retirada pela
mangueira que fica na parte lateral
da garrafa desconectando a parte superior.

118

Fundao Nacional de Sade

Apndice B

Determinao de Giardia sp e
Cryptosporidium sp em gua pela tcnica
de filtrao, separao imunomagntica e
microscopia de imunofluorescncia

Introduo
A transmisso de protozoonoses via abastecimento de gua,
em particular giardiose e criptosporidiose, um tema que tem
despertado crescente preocupao no que tange questo
de sade pblica.
Protozorios so micro-organismos eucariticos, unicelulares, sem paredes celulares que se alimentam de bactrias e
outros organismos. A maior parte dos protozorios de vida
livre e so frequentemente encontrados em guas superficiais,
no entanto vrias espcies so parasitas. Os efeitos sobre a
sade em decorrncia da exposio a protozorios presentes
na gua de consumo so variados. A manifestao mais comum so distrbios gastrointestinais, normalmente, de curta
durao. No entanto, em indivduos sensveis, tais como
crianas, idosos e imunocomprometidos, os efeitos podem
ser mais graves, crnicos ou at mesmo fatais.
Giardia e Cryptosporidium so micro-organismos de ampla
distribuio, e relevante patogenicidade, que se multiplicam
apenas no trato gastrointestinal de seres humanos e outros
animais. Apesar de no poderem se reproduzir no ambiente,
podem sobreviver por longos perodos de tempo em meio
aqutico. Cistos de Giardia e, principalmente, oocistos de
Cryptosporidium, so reconhecidamente resistentes aos
agentes desinfetantes utilizados no tratamento de gua para
consumo humano, particularmente quando o cloro o
agente utilizado.
Ante esse cenrio, a Portaria MS n 2.914/2011 impe o
monitoramento de Giardia e Cryptosporidium no ponto
de captao de gua quando a mdia geomtrica anual de
E. coli nesse ponto for maior ou igual a 1.000 org/100mL.
Adicionalmente, quando a mdia aritmtica da concentrao
de oocistos de Cryptosporidium spp. for maior ou igual a 3,0
Manual Prtico de Anlise de gua

121

oocistos/L no(s) pontos(s) de captao de gua, a portaria recomenda que a turbidez do efluente filtrado (filtrao rpida)
seja menor ou igual a 0,3 UT, ou que, alternativamente, se
empregue processo de desinfeco que comprovadamente
alcance a mesma eficincia de remoo de oocistos de
Cryptosporidium spp.
As metodologias utilizadas para deteco de (oo)cistos
baseiam-se na concentrao das amostras e na deteco. Em
todos os mtodos utilizados no monitoramento de oocistos, as
etapas de concentrao, purificao (que incorporada para
separar (oo)cistos dos resduos remanescentes) e deteco
so consideradas muito importantes. No entanto, destaca-se
que essas metodologias foram delineadas e padronizadas
em pases como EUA, Austrlia e Canad, cujos programas
e legislaes de controle da poluio e da degradao dos
mananciais so priorizados.
As diferentes metodologias empregadas para a pesquisa de
protozorios patognicos em gua esto sujeitas a vrias
limitaes, dentre elas, custos elevados, necessidade de importao de insumos e exigncia de recursos humanos especializados. Tambm grande a variabilidade dos resultados e
baixa a taxa de recuperao dos mtodos analticos, mesmo
quando empregado o mtodo de referncia Mtodo 1623/
USEPA. H ainda de se considerar que essas metodologias
no permitem a identificao da espcie de protozorio (que
pode ser til indicador da fonte da contaminao) tampouco
fornecem informaes sobre a infectividade dos organismos.
A seguir descrito uma metodologia de determinao de
Giardia sp e Cryptosporidium sp em amostras de gua.

122

Fundao Nacional de Sade

Determinao de Giardia sp e Cryptosporidium sp em gua


pela tcnica de filtrao, separao imunomagntica e microscopia de imunofluorescncia
Mtodo 1623 da USEPA: Determinao de Giardia sp. e
Cryptosporidium sp. em gua pela tcnica de filtrao, separao imunomagntica e microscopia de imunofluorescncia
(USEPA, 2005).

1. Princpio do mtodo
A tcnica de deteco de Cryptosporidium e Giardia descrita
nesse procedimento baseada nas etapas: concentrao da
amostra por filtrao e centrifugao, purificao por separao imunomagntica (IMS), colorao e leitura de lminas
(microscopia de imunofluorescncia - FA). Cryptosporidium
e Giardia so identificados por meio do corante DAPI (do
ingls 4-6-Diamidino-2-phenylindole) e microscopia de
Contraste por Interferncia Diferencial. Esse mtodo identifica os gneros, Cryptosporidium ou Giardia, mas no em
nvel de espcie. Sua aplicao exige o emprego de pessoal
capacitado com treinamento e experincia na determinao
de Cryptosporidium e Giardia por filtrao, IMS, e FA.

2. Interferentes
Influncia

nas

etapas

de

concentrao e separao, em
virtude
Turbidez

da

concentrao

de

material particulado e da anlise


da amostra em microscpio,
dificultando a identificao de
oocistos de Cryptosporidium e
cistos de Giardia.
Manual Prtico de Anlise de gua

123

continuao
Organismos ou detritos

Interferncia

com autofluorescncia ou

de (oo)cistos, originando falsos

imunofluorescncia

positivos
Solventes,
de

na

identificao

reagentes,

laboratrio

material
quaisquer

hardwares de processamento de
amostras podem ser responsveis
por introduzir interferentes e
originar erros de interpretao
dos
Contaminao

exames

microscpicos

de oocistos e cistos. Todos os


materiais

utilizados

devem

ter constatada a ausncia de


interferentes sob as condies
de anlise por meio da execuo
de branco (controle negativo).
Material descartvel deve ser
usado sempre que possvel.
A identificao de (oo)cistos em
microscpio exige capacidade
do laboratorista para identificar
Inexperincia do
laboratorista

ambos os gneros em meio a


amostra

ambiental

(composta

por componentes diversos) e


treinamento nas diversas etapas
dos mtodos e manuseio dos
equipamentos.

124

Fundao Nacional de Sade

3. Segurana
O perigo de contaminao biolgica associada e o risco de
infeco por cistos e oocistos so elevados nesse mtodo,
uma vez que envolve a manipulao de amostras concentradas de organismos patognicos vivos (ativos), portanto,
devem ser manuseadas com luvas.
O laboratrio deve estabelecer medidas de segurana e prticas de sade apropriadas, observando os procedimentos de
segurana tpicos de laboratrios de microbiologia que lidam
com organismos patognicos, durante a preparao, uso e
descarte da amostra concentradas, reagentes e materiais, na
operao e esterilizao de equipamentos.
O conhecimento sobre toxicidade ou carcinogenicidade dos
compostos ou reagentes utilizados no so bem consolidados, assim, cada composto deve ser tratado como potencial
perigo sade, devendo, a exposio, ser reduzida ao nvel
mais baixo possvel.
O transporte de amostras, contendo agentes infecciosos, deve
ser realizado de forma criteriosa, procedendo-se, preferencialmente, a inativao dos agentes. No entanto, devem ser
observadas normas e legislaes pertinentes ao transporte de
agentes biolgicos inativados ou no.

4. Equipamentos e materiais
Nota: Marcas ou fornecedores citados so apenas para referenciais. Desempenho equivalente pode ser conseguido utilizando marcas alternativas, entretanto, deve-se observar a
adequabilidade dos insumos utilizados.

Manual Prtico de Anlise de gua

125

4.1 Gales ou recipientes plsticos (polietileno) para coleta


de amostras com volume entre 10 e 50 litros. O material de coleta deve ser, preferencialmente, descartvel
(reciclvel).
Nota: Opcionalmente, pode-se optar pela esterilizao dos gales
de coleta pela lavagem com 200 mL de soluo de hipoclorito de clcio 12,5% (agitar bastante para espalhar a soluo), aguardar de 8 a 12h (overnight), descartar a soluo
de hipoclorito de clcio e lavar, primeiramente, com 200
mL de soluo de tiossufalto de sdio (52%) e em seguida
enxaguar com gua destilada (gua reagente).

4.2 A
 gitador de tubos (tipo Vortex).
4.3 A
 gitador magntico.
4.4 B
 arras magnticas.
4.5 A
 gitador rotatrio com capacidade de 18 rpm/min.
4.6 Bomba de vcuo/presso ou linha de presso com capacidade mnima de 5 bar.
4.7 Centrfuga capaz de proporcionar fora de 1500g equipada com rotores swinging-bucket que acomodem tubos
cnicos de 250 mL e 50 mL.
4.8 Concentrador de partculas magnticas para tubos de 10
mL (MPC1 ou MPC6).
4.9 Concentrador de partculas magnticas para tubos de
microcentrfuga (MPC-M ou MPC-S).
4.10 Homogeneizador (tipo Stomacher) com capacidade de
300-350 golpes/minuto.
4.11 Sacos plsticos compatveis com o homogeneizador.
126

Fundao Nacional de Sade

4.12 Micropipetadores com volume varivel de 100-1000


L e 10-100 ou 20-200 L.
4.13 Microscpio ptico equipado com contraste interferencial diferencial (DIC) e epifluorescncia com capacidade de fornecer aumentos de 200x, 400x e 1000x.
4.14 P
 orta filtro de espuma.
4.15 B
 queres de 1000 ou 2000 mL.
4.16 F iltros de espuma (Filta-Max).
4.17 E stao de lavagem e concentrao (Filta-Max).
4.18 Membrana de policarbonato de 25 mm de dimetro e
reteno de 1m.
4.19 L minas para microscopia de fluorescncia.
4.20 L amnulas (mnimo 24x32 mm).
4.21 P
 ipetas Pasteur.
4.22 P
 ipetas sorolgicas de 5 e 10 mL.
4.23 Ponteiras de polipropileno com capacidade para 200300 L e 1000 L.
4.24 P
 roveta de 500 mL.
4.25 T
 ubos de polipropileno de 1,5 mL (tipo eppendorf).
4.26 Tubos cnicos de centrfuga com capacidade de 250
mL e 50 mL.
Manual Prtico de Anlise de gua

127

4.27 T
 ubos de Leighton (lado plano).

5. Reagentes
5.1 H
 idrxido de sdio.
5.2
 cido clordrico.
5.3 Acetona.
5.4 Glicerol.
5.5 Etanol.
5.6 Metanol.
5.7
 gua reagente (gua ultrapura).
5.8 T
 ween 20 (Sigma Chemical).
5.8.1 Tampo fosfato salino - PBS pH 7.4 (Sigma Chemical):
8 g NaCl; 0.2 g KCl; 1.15 g Na2HPO4 anidro; 0.2 g
KH2PO4; 1,0 L gua reagente.
5.8.2 DAPI - 4',6-diamidino-2-phenylindole (Sigma Chemical).
5.9 S olues para eluio dos filtros.
5.9.1 Tampo fosfato salino/ Tween 20 (PBST): Adicionar
0,10mL (100L) de Tween 20 a 1,0 L a soluo Tampo fosfato salino (PBS).
5.9.2 Soluo estoque: dissolver 2 mg DAPI em 1,0 mL de
metanol absoluto.

128

Fundao Nacional de Sade

Nota: Preparar volumes mnimos para o uso e colocar em frasco ou tubo estril protegido da luz com tampa rosqueada.
Armazenar entre 1oC e 10oC. No permitir congelamento.
Descartar a soluo aps 2 semanas ou quando o controle
positivo der negativo.

5.9.3 DAPI (soluo de uso - seguir instrues do fabricante do kit de anticorpos): adicionar 0,01 mL de DAPI
(soluo-estoque) a 50 mL de PBS.
Nota: Preparar volumes mnimos para o uso e colocar em frasco
ou tubo estril protegido da luz com tampa rosqueada. Armazenar entre 1oC e 10oC. Preparar a soluo diariamente.

5.10 S olues para montagem das lminas.


5.10.1 Glicerol/PBS: Misturar 60 mL de Glicerol e 40 mL
de PBS.
Nota: Preparar no momento do uso.

5.10.2 Meio de montagem DABCO/Glicerol: pesar 2,0g de


DABCO (Sigma Chemical) e colocar em um balo
volumtrico. Acrescentar 95 mL de soluo de glicerol/PBS morna (aquecida) e misturar at a completa
dissoluo do reagente. Completar o volume para 100
mL e colocar em frasco estril com tampa rosqueada
de capacidade de 100 mL. Manter refrigerado de 2 a
8oC (validade: 3 meses).

Manual Prtico de Anlise de gua

129

6. Coleta de amostra
6.1 Encher completamente o vasilhame, assegurando a coleta
de 10 L (A verso do mtodo utilizando filtro de espuma
Filta Max foi validada para um volume de 50 L, no entanto volumes de amostra alternativos podem ser usados).
6.2 As amostras devero ser coletadas em volume nico e
mantidas refrigeradas entre 1oC e 10oC, sem congelamento, at o processamento.

7. Identificao da amostra
7.1 Identificar adequadamente a amostra.
7.1.1 Registrar informaes da procedncia da amostra, data
e hora da coleta.
7.1.2 Registrar dados da anlise: data do incio da anlise,
volume analisado e volume do centrifugado.
7.1.3 R
 egistrar lotes dos reagentes e solues utilizados

8. Filtrao
8.1 C
 olocar o filtro de espuma no porta-filtro.
8.2 Conectar com auxlio de mangueiras de silicone o porta-filtro ao recipiente contendo a amostra e bomba ou
linha de presso.
8.3 O efluente ao processo de filtrao deve ser armazenado
em recipiente graduado para medio do volume.

130

Fundao Nacional de Sade

8.4 Aps o trmino da filtrao da amostra, desligar a presso. Desconectar o porta-filtro da mangueira e tampar
o porta-filtro com uma rolha de borracha nos pontos de
entrada e sada.
8.5 Se a eluio no for ser feita imediatamente, armazenar
o porta-filtro com a espuma sob refrigerao (1 a 10oC).
A eluio pode ser iniciada em 96 horas aps a coleta da
amostra ou sua filtrao em campo.

9. Eluio
Nota: O processo de eluio, aqui descrito, utiliza estao de
lavagem Filta-Max. Devem ser consultadas as instrues
do fabricante para domnio da montagem e operao do
aparelho. Opcionalmente pode-se utilizar um Stomacher.

9.1 P
 rocedimento de eluio na estao Filta-Max.
9.1.1 P
 rimeira lavagem.
9.1.1.1 Colocar a membrana filtrante plana na base do concentrador, com a parte rugosa para cima.
9.1.1.2 Usar as travas da estao de lavagem para parafusar o tubo concentrador (criando uma vedao na
membrana).
9.1.1.3 Retirar o tubo concentrador da estao de lavagem.
9.1.1.4 R
 emover o filtro de espuma do porta-filtro.
9.1.1.5 C
 onectar o filtro de espuma estao de lavagem.

Manual Prtico de Anlise de gua

131

9.1.1.6 Verter o excesso de lquido recuperado a partir do


mdulo de filtrao para o tubo concentrador, em
seguida, lav-lo com PBST e verter o lquido no tubo
concentrador.
9.1.1.7 Adicionar 600 mL de PBST para o tubo concentrador
e conect-lo na base abaixo do tubo de eluio.
Nota: Se mais do que 50 mL de lquido foi recuperado a partir do
mdulo de filtrao, reduzir o volume de PBST em conformidade.

9.1.1.8 Lavar o filtro de espuma, movendo o mbolo para


cima e para baixo 20 vezes. Movimentos suaves do
mbolo so recomendados para evitar a produo
excessiva de espuma.
9.1.1.9 Separe o concentrador e purgar o lquido restante
no tubo de eluio, movendo o mbolo para cima
e para baixo 5 vezes, em seguida, para evitar que
escorra, colocar o tampo fornecido na extremidade
do tubo de ao.
9.1.1.10 Concentrar a soluo eluda da primeira lavagem
utilizando o aparelho Filta-Max. Colocar o tubo
concentrador sobre uma placa de agitao magntica e colocar a tampa, com barra agitadora
magntica.
9.1.1.11 Conecte o aparelho de drenagem vlvula na base
do concentrador. Ligue o agitador e abra a vlvula.
9.1.1.12 L igue a bomba a vcuo.
9.1.1.13 Permitir que o lquido escoe at a uma altura aproximadamente igual ao meio da barra agitadora, em
seguida, fechar a vlvula.
132

Fundao Nacional de Sade

9.1.1.14 Remover o agitador magntico, e lav-lo com PBST


ou gua reagente para recuperar todos os oocistos.
9.1.1.15 Transferir o concentrado para um tubo de 50 mL,
em seguida, lavar os lados do tubo de concentrao
e transferir o produto do enxgue para o tubo de
50 mL.
9.1.2 S egunda lavagem
9.1.2.1 Adicionar um volume adicional de 600 mL de PBST
para o mdulo concentrador.
9.1.2.2 Repetir a lavagem dos filtros de espuma, movendo o
mbolo para cima e para baixo 10 vezes. Movimentos
suaves do mbolo so recomendados para evitar a
produo excessiva de espuma.
9.1.2.3 Adicionar o concentrado da primeira lavagem, armazenado no tubo de 50 mL, para o eluato (mistura
de eluente e soluto) da segunda lavagem e repetir o
processo de concentrao da amostra com aparato
Filta-Max .
Nota: No caso de obstruo dos poros da membrana e interrupo do escoamento antes de finalizar a concentrao,
pode-se substituir a membrana filtrante. Desmonte o tubo
concentrador e armazene o eluato remanescente em um
recipiente. Retire a membrana com auxlio de uma pina,
colocando-a no saco fornecido. Coloque uma nova membrana e remonte o tubo concentrador. Retorne o eluato
armazenado ao tubo concentrador, lave o recipiente com
gua reagente e adicione o lquido ao eluato, prossiga a
concentrao. A membrana pode ser substituda quantas
vezes forem necessrias. Pode-se tambm realizar a concentrao por centrifugao a 1500G por 15 minutos.

9.1.2.4 R
 emover o agitador magntico.
Manual Prtico de Anlise de gua

133

9.1.2.5 A amostra final pode ser vertida para dentro do mesmo


tubo de 50 mL. Lavar os lados do tubo concentrador
com PBST e verter a soluo para o tubo de 50 mL.
9.1.2.6 Inserir o tubo concentrador vazio na estao de
lavagem.
9.1.2.7 Retirar a membrana e transferi-la para o saco fornecido com o auxlio de uma pina.
9.1.2.8 L avar a membrana:
9.1.2.8.1 Manualmente - Adicionar 5 mL de PBST para o
saco contendo a membrana. Esfregar a superfcie da
membrana atravs do saco at que a membrana parea limpa. Usando uma pipeta, transferir o produto
de eluio a um tubo de 50 mL. Repita a lavagem
da membrana com mais 5 mL de PBST e transferir
o produto de eluio para o tubo de 50 mL.
9.1.2.8.2 Lavagem com Stomacher - Adicionar 5 mL de PBST
para o saco contendo a membrana. Coloque o saco
contendo a membrana em um Stomacher e agitar
durante 3 minutos. Usando uma pipeta transfira o
eluato para um tubo de 50 mL. Repita a lavagem
duas vezes utilizando o Stomacher e 5 mL de alquotas de PBST.

10. Centrifugao
10.1 Centrifugar o tubo de 50 mL a 1500g durante 15 minutos.
10.2 Com o auxlio de uma pipeta de Pasteur, aspirar cuidadosamente o sobrenadante at 5 mL acima do sedimento.
134

Fundao Nacional de Sade

10.3 R
 egistrar o volume do sedimento.
Nota: O volume do sedimento no deve ser superior a 0,5 mL,
quantidade mxima recomendada de material particulado
para purificao pelo mtodo.

11. Separao imunomagntica


11.1 Agitar vigorosamente o tubo em vrtex para ressuspenso do sedimento:
11.1.1 Se o volume de sedimento for inferior a 0,5 mL, agite
o tubo vigorosamente em vrtex at o sedimento ser
completamente ressuspendido. Girar o tubo de centrfuga suavemente para reduzir a espuma formada
aps homogeneizao.
11.1.2 Se o volume de sedimento for superior a 0,5 mL, o
concentrado deve ser separado em vrias subamostras
(uma subamostra no deve ter volume de sedimento
superior a 0,5 mL).
11.1.2.1 Estimar o volume total requerido usando o volume
do sedimento pela frmula:
Volume total requerido (mL) =

Volume de sedimento (mL)


0,5 mL

x 5,0 mL

Por exemplo, se o volume do precipitado for 1,2 mL, o volume total necessrio 12 mL. Adicionar gua purificada
ao tubo de centrfuga para completar o volume para 12 mL.
11.1.3 Se todo o volume obtido for submetido ao IMS, dividi-lo por 5 mL e calcular o nmero de subamostras a
serem analisadas (arredondando para o nmero inteiro
Manual Prtico de Anlise de gua

135

superior mais prximo). No exemplo citado, 12/5 mL


= 2,4, arredondando portanto 3 subamostras.
11.1.4 Se o volume a ser analisado for parcial, agitar vigorosamente o volume total em vrtex para ressuspender
completamente o precipitado.
11.2 Preparar, para cada concentrado, 1,5mL de uma diluio
1X do tampo SL-A 10X. Para cada 1,0 mL requerido da
soluo diluda, misture 100L (0,1mL) e 900L (0,9mL)
de gua reagente.
11.3 Transferir, com o auxlio de uma pipeta de 10mL, 5mL
da amostra concentrada (ou subamostra) para o tubo de
Leighton (lado plano) contendo 1,0 mL de cada tampo,
SL-A 10X e SL-B 10X (Dynabeads GC-Combo).
11.4 Enxaguar, duas vezes com gua reagente, o tubo contendo o concentrado (ou subamostra), de modo que o
volume final no tubo de Leighton seja de 12 mL.
11.5 Adicionar a cada tubo de Leighton (contendo amostra
e tampes), 100 mL de DynabeadsCrypto-Combo e
100mL de DynabeadsGiardia-Combo, previamente
homogeneizados no vrtex por 10 segundos. Colocar
os tubos no agitador rotatrio por no mnimo 1 hora,
a 18rpm.
11.6 Transferir o tubo de Leighton para o concentrador
magntico de partculas (MPC1 ou MPC6), homogeneizar, manual e suavemente, em um ngulo de
aproximadamente 90o por 2 minutos.
11.7 Descartar o sobrenadante, sem retirar o tubo do concentrador magntico de partculas e sem agitar o material.
136

Fundao Nacional de Sade

11.8 Se a amostra estiver turva, descartar o sobrenadante e


ressuspender o sedimento em 10 mL de PBS e repetir o
procedimento no concentrador magntico de partculas.
11.9 Remover o concentrador magntico de partculas e
ressuspender a amostra em 500L (0,50mL) de tampo
SL-A 1X utilizando pipeta Pasteur e transferir para um
tubo eppendorf. Adicionar mais 500L de tampo SL-A
1X ao tubo de Leighton, lavar bem e transferir para o
tubo eppendorf. Colocar o eppendorf no concentrador
magntico, MPC-M ou MPC-S, e homogeneizar manualmente em um ngulo de 180oC durante 1 minuto.
11.10 Para transferir, quantitativamente, todo o volume
aguardar, aps a segunda transferncia, cerca de um
minuto e recolher qualquer volume residual que tenha
escorrido para a parte inferior do tubo.
11.11 Descartar o sobrenadante, sem retirar concentrador
magntico.
11.12 Dissociao do complexo beads/(oo)cisto.
11.13 Remover o concentrador magntico.
11.14 Adicionar 50L da soluo de HCl 0,1N ento agite
no vrtice a alta velocidade por cerca de 50 segundos.
11.15 Colocar o tubo no concentrador magntico (MPC-M
ou MPC-S) sem a tira magntica no lugar e deixar
repousar numa posio vertical, por pelo menos 10
minutos, a temperatura ambiente.
11.16 Agite no Vrtex durante aproximadamente 30 segundos.
Manual Prtico de Anlise de gua

137

11.17 Assegurar que toda a amostra est na base do tubo.


Colocar o tubo de microcentrfuga (eppendorf) no
concentrador magntico (MPC-M ou MPC-S).
11.18 Coloque a tira magntica no concentrador magntico
(MPC-M ou MPC-S) e deixar em repouso durante
um mnimo de 10 segundos.
11.19 Preparar uma lmina e identific-la, adicionar 5 L de
NaOH 1,0 N ao poo da lmina.
11.20 O procedimento envolve duas dissociaes cidas,
no entanto pode-se optar por montar duas lminas,
cada uma com o volume de cada dissociao, ou uma
nica lmina. Caso opte-se por montar uma nica lmina, adiciona-se 10 L de NaOH 1,0 N ao poo da
lmina. Deve ser medido o volume do concentrado
adicionado lmina.
11.21 O volume obtido da dissociao pode ser armazenado
em outro eppendorf contendo 10 L de NaOH 1,0 N.
Desse modo, pode-se realizar a leitura de uma menor
alquota do concentrado, deve-se portanto registrar o
volume concentrado e o volume da alquota.
11.22 Sem remover o eppendorf do concentrador magntico
(MPC-M ou MPC-S) transferir toda a amostra para o
poo da lmina com o NaOH. Evitar tocar as partculas
presas a parede do tubo. Assegurar que todo o fluido
seja transferido.
11.23 Remover o eppendorf do concentrador magntico e
repetir o procedimento de lavagem com cido.

138

Fundao Nacional de Sade

11.24 O volume da segunda dissociao cida pode ser


adicionado lmina contendo o volume da primeira
dissociao ou pode ser montada uma segunda lmina.
Nota 1: O
 s poos da lmina podem ser pequenos para acomodar
os volumes de ambas as dissociaes.
Nota 2: As estapas de eluio, concentrao e purificao (separao imonomagntica) devem ser concludas no mesmo
dia de trabalho.

12. Colorao
12.1 Deixar as lminas secarem a temperatura ambiente
pernoite (ou at que a lmina seque completamente).
Seguir as instrues do fabricante para efetuar a colorao imunofluorescente.
Nota: A colorao deve ser iniciada em at 72 horas aps o preparo da lmina.

12.2 Colocar a lmina numa cmara mida, no escuro e


temperatura ambiente durante aproximadamente 30
minutos. (A cmara mida consiste de um recipiente
de plstico contendo toalhas de papel midas sobre as
quais as lminas so colocadas).
12.3 Lavar os poos, adicionando PBS em quantidade suficiente (aproximadamente 100L). Aspirar cuidadosamente o lquido, sem tocar a rea contendo o material.
12.4 Adicionar 50L de DAPI e deixar em repouso durante
5 minutos na cmara mida (A cmara mida consiste
de um recipiente de plstico contendo toalhas de papel
midas no topo do qual as lminas so colocadas).
12.5 Lavar os poos, adicionando PBS em quantidade suficiente (aproximadamente 100L). Aspirar cuidadosamente o lquido, sem tocar a rea contendo o material.
Manual Prtico de Anlise de gua

139

12.6 Colocar uma gota do meio de montagem DABCO/glicerol e cobrir com uma lamnula, evitando a formao
de bolhas entre a lmina e a lamnula.
12.7 Cuidadosamente, selar as bordas da lamnula com
esmalte transparente.
12.8 Preparar lminas de controles positivo e negativo, de
acordo com as especificaes do fabricante.
Nota: O exame microscpico deve ser iniciado to logo a colorao tenha sido finalizada, mas se os corantes no perderem
a fluorescncia, pode ser realizado em at 168 horas (7
dias) com as lminas armazenadas ao abrigo da luz.

13. Leitura microscpica


13.1 Examinar cada poo de maneira sistemtica, estabelecendo um padro de leitura, de cima para baixo ou
de um lado para outro, garantindo que toda a rea seja
avaliada.
13.2 Examinar usando imunofluorescncia (FA), DAPI e
microscopia de Contraste por Interferencia Diferencial
(DIC).

14. Controles positivo e negativo


14.1 Iniciar o exame pelos controles positivo e negativo,
identificando no controle positivo pelo menos trs
oocistos de Cryptosporidium e trs cistos de Giardia.
Examinar o controle negativo, confirmando a ausncia
de cistos e oocistos.
14.2 Registrar os resultados e iniciar a leitura das amostras
somente se os controles positivo e negativo apresentarem resultados satisfatrios.
140

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14.3 O
 ocistos de Cryptosporidium
14.3.1 Examinar em FITC em aumento de 200X. So oocistos caractersticos, formas fluorescentes ovides ou
esfricas de 4 a 6 m de dimetro.
14.3.2 Ao visualizar os oocistos, ampliar para 400X e mudar o
microscpio para filtro bloqueador de UV para DAPI.
Os oocistos caractersticos apresentam colorao
interna azul brilhante ou presena de at 4 ncleos
de colorao azul cu.
14.3.3 Em seguida, examinar em contraste interferencial
diferencial e observar a presena de caractersticas
morfolgicas internas e externas tpicas de oocistos
de Cryptosporidium, em aumento de 1000x.
14.3.4 Um resultado positivo de oocisto Cryptosporidium
exibe fluorescncia, tamanho e formas tpicas e
positivo para Fluorescncia-FITC, DAPI; Contraste
interferencial diferencial-DIC
14.4 C
 istos de Giardia
14.4.1 Examinar em FITC em aumento de 200X. So cistos
caractersticos, formas fluorescentes ovides ou esfricas de 8 a 18 m de dimetro e 5 a 15 m de largura.
14.4.2 Ao visualizar os cistos, ampliar para 400X e mudar o
microscpio para filtro bloqueador de UV para DAPI.
Os cistos caractersticos apresentam colorao interna
azul brilhante ou presena de dois a 4 ncleos de
colorao azul cu.

Manual Prtico de Anlise de gua

141

14.4.3 Em seguida, examinar em contraste interferencial


diferencial e observar as caractersticas morfolgicas
internas e externas tpicas de cistos de Giardia.
14.4.4 Um resultado positivo para cisto de Giardia fluorescncia tpica, tamanho e forma tpica e no exibe
caractersticas atpicas em FA, DAPI ou DIC.
14.5 C
 lculo dos resultados
Caso todo o volume concentrado (final dissociao cida)
seja levado ao microscpio
N de (oo) cistos. L-1=

N de (oo)cistos identificados
Volume da amostra coletada

Caso seja realizada a leitura em microscpio de uma alquota


do volume concentrado obtido ao final da dissociao cida.
Volume do concentrado (uL)
-1 N de (oo) cistos identificados x
Alquota do concentrado analisada (uL)
N de (oo) cistos. L =
Volume da amostra coletada

142

Fundao Nacional de Sade

Bibliografia

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146

Fundao Nacional de Sade

Elaborao

Elaborao
Elaborao
Marinaldo da Silva Valente/Suest/AM/Funasa
Colaboradores
Osman de Oliveira Lira/Suest/PE/Funasa
Nilce Bazzoli/Suest/MG/Funasa
Jlio Csar Reis da Silva/Suest/MA/Funasa
Raimundo Rodrigues dos Santos Filho/Suest/MA/Funasa
Miguel Crisstomo Leite Brito/Densp/Funasa
Coordenao
Maria Fernanda Bittencourt/Densp/Funasa
Reviso tcnica
Felizana M.M. da S. Palhano
Girlene Rodrigues Leite
Vilma Ramos Feitosa/Densp/Funasa
Marinaldo da Silva Valente/Suest-Am/Funasa
Reviso da 3 Edio
Ana Maria Moreira Dias - Cocag/Desam/Funasa
Aristeu de Oliveira Junior - Cocag/Desam/Funasa
Antonio Carlo B. Brando - Cocag/Desam/Funasa
Demtrius Brito Viana - Consultor OPAS/Funasa
Osman de Oliveira Lira - URCQA/Sesam/Suest-PE/Funasa
Reviso Ortogrfica e Gramatical da 3 Edio
Leila Santos Coesc/Gab/Presi/Funasa/MS
Reviso da 4 Edio e atualizao
Ana Maria Moreira Dias - Cocag/Desam/Funasa
Aristeu de Oliveira Junior - Cocag/Desam/Funasa

Manual Prtico de Anlise de gua

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Antonio Carlo B. Brando - Cocag/Desam/Funasa


Demtrius Brito Viana - Consultor OPAS/Funasa
Osman de Oliveira Lira - URCQA/Sesam/Suest-PE/Funasa
Ilustrao
Leonardo Ribeiro da Silva Terra /Coesc/Gab / Presi /Funasa
Projeto grfico do miolo
Glacia Elizabeth de Oliveira - Diedi/Coesc/Gab/Funasa
Capa e diagramao
Eduardo dos Santos - Diedi/Coesc/Gab/Funasa
Reviso Ortogrfica e Gramatical da 1 e 2 Edio
Olinda Myrtes Bayma S. Melo Coesc/Gab/Presi/Funasa/
MS
Reviso bibliogrfica
Raquel Machado Santos - /Coesc/Gab/Presi/Funasa
Solange de Oliveira Jacinto - /Coesc/Gab/Presi/Funasa

A publicao deste Manual foi financiada pelo Termo de


Cooperao n 38, firmando entre a FUNASA e a OPAS/OMS.

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Fundao Nacional de Sade