REFERAT

Tehnici de identificare a drojdiilor si mucegaiurilor

din alimente

Student: BORDEA
EDUARD-DANIEL
Anul: I- MASTER
1. Ce sunt mucegaiurile ?

Mucegaiurile sunt fungi filamentoi care cresc sub forma unei mese ncolcite i se
rspndesc rapid putnd acoperi o suprafa de mai muli centimetrii n numai 2-3 zile.
ntreaga structur sau numai o poriune din aceasta este denumita miceliu. Un miceliu
este format din ramuri sau filamente denumite hife. Cele mai importante se nmulesc prin
ascospori, zigospori sau conidii. Ascosporii unor genuri se remarc prin gradul lor ridicat
de rezisten la temperaturi ridicate. Un grup formeaz picnidii sau acervuli (celule mici n
form de flacon, iar corpii de fructificare sunt conidiofori). Artrosporii rezult din
fragmentarea hifelor din unele grupe.
Cele mai importante observaii din ultimii douzeci de ani referitoare la sistematica
fungilor transmisibili prin alimente sunt despre descoperirea nmulirii sexuate sau
perfecte a ctorva specii i genuri binecunoscute. n aceast privin starea de ascomicet
este considerat de micologi ca fiind starea reproductiv cea mai important a unor fungi,
stare denumit teleomorf. Numele de specie dat unei ciuperci teleomorfe are prioritate
fa de cel ce definete starea anamorf (denumire dat strii imperfecte sau conidiale).
Termenul holomorf arat c sunt cunoscute ambele stadii, dar este utilizat termenul
teleomorf.
Evoluia tehnicilor de recoltare i transformare a produselor agricole, transportul
alimentelor pe distane lungi i prezentarea consumatorilor prin stocarea prelungit
constituie condiii care dac sunt realizate necorespunztor, devin favorabile dezvoltrii
microorganismelor nedorite i n particular, a mucegaiurilor.
Micotoxinele sunt metabolii ai mucegaiurilor cu o structur chimic mai mult sau
mai puin cunoscut care au capacitatea de a modifica structuri biologice anormale, cu
efecte degradante att la om,ct i la animale. Aceste toxine pot fi coninute n sporii de
mucegai sau de cele mai multe ori eliminate n substratul de cretere (aliment).

2. Ce sunt drojdiile ?

Drojdiile reprezint un grup taxonomic complex i heterogen de

microorganime monocelulare de tip eucariot care se nmulesc prin nmugurire

(mitoz), ca form general de reproducere i n mod particular, prin ascospori formai

pe cale asexuat i sexuat (n urma proceselor de conjugare ntre celule).
Importan i rol. Avnd drept caracteristic principal capacitatea de a
produce fermentarea glucidelor simple n anaerobioz, cu formare de alcool etilic i dioxid
de carbon, drojdiile fermentative sunt utilizate industrial n biotehnologii alimentare la
fabricarea spirtului de fermentaie, a vinului, a berii i pinii. Drojdiile au o compoziie
chimic valoroas i dup cultivare n condiii de aerare i prelucrare sunt utilizate ca
surs de proteine n alimentaia uman (cu denumirea da SCP single cell protein
proteine din monocelulare) sau n alimentaia animalelor, deoarece, pe lng 45-55%
protein brut s.u., aduc n raie aminoacizi i vitamine ale grupului B.
In microbiologia industrial din biomasa de drojdie se obin: plasmolizate,
autolizate, folosite ca aditivi alimentari sau pentru mbogirea n substane azotate a
mediilor de cultur destinate fermentaiilor. Cu ajutorul drojdiilor se pot obine avantajos.
n condiii industriale, --fructofuranozidaza i vitaminele hidrosolubile (B1, B2, PP,
ergosterol), enzime ( galactozidaza), iar prin metode de inginerie genetic, din mutani ai
speciei Saccharomyces cerevisiae, s-a obinut interferonul substan cu efect antiviral i
citostatic.
Rspndire n natur. Drojdiile au o larg rspndire n mediul ambiant, fiind
ntlnite n toate habitatele naturale: sol, ape, aer, plante, animale. n sol, celulele de
drojdie se ntlnesc n straturile superficiale, pn la adncimi de aproximativ 30 cm, n
concentraii de 102 -2x105 g -1. Cantitatea crete n solurile viilor i grdinilor, ca urmare
a mbogirii solului n substane nutritive furnizate de fructele care cad la sol i sufer
lent putrezirea. Din sol, prin aciunea unor factori fizici, mecanici i biologici,
microorganismele ajung temporar n aer i se rspndesc la distane mari; din sol i aer
drojdiile pot ajunge n ape, unele specii fiind ntlnite chiar la adncimi de 4000 m.
n mod permanent, drojdiile se afl n microbiota epifit a plantelor(flori,
fructe, frunze, rdcini). Rspndirea drojdiilor este favorizat de insecte, care, o dat cu
nectarul/sucul, preiau i celule de drojdii care pot hiberna n tractul digestiv al insectelor.
n organismul animal, drojdiile sunt prezente n biocenoza intestinal i se elimin pe ci
naturale prin produsele de dejecie; n cantitpi mai reduse se ntlnesc n cavitatea

bucal i pe piele. Un grup restrns de drojdii sunt patogene (Candida albicans,

Cryptococcus neoformans) i dau mbolnviri la om i la animale.

3. Tehnici de identificare a mucegaiurilor

Pentru manipularea eantioanelor se recomand s se lucreze n cabine

securizate biologic. Pentru protecie, personalul trebuie s poarte n permanen sor,
mnui i masc.

Manipularea produselor mucegite

Produsele mucegite nu trebuie s fie manipulate niciodat fr mnui i
analizele se vor face n aa fel nct s se evite pe ct posibil inhalarea particulelor
toxice.
Analiza eantioanelor test
Securitatea manipulrii este foarte important n timpul acestei operaii. Este
primordial minimizarea contaminrii atmosferice cu vapori toxici si particule de praf.
Contactul direct cu toxinele pure sau n soluie trebuie s fie evitat prin folosirea
echipamentului de pipetare mecanic. Toate suprafeele de lucru ca i echipamentele
folosite n timpul extraciei trebuie s fie obligatoriu decontaminate dup utilizare.
Decontaminarea laboratorului
Sticlria de laborator i suprafeele care au intrat n contact cu toxinele sunt
splate cu NaClO 0,5%. Carcasele n care au fost inute animalele de laborator sunt
incinerate.
Eantionarea

Studii au artat c peste 90% din erorile de cuantificare a micotoxinelor se

datoreaz eantionrii necorespunztoare; trebuie deci s ne asigurm c eantioanele
prelevate pentru a fi analizate sunt reprezentative.
Este important deci s se prezinte un plan de eantionare care s fac parte din
reglementrile privind controlul contaminrii cu micotoxine. n ultimii ani, o atenie
deosebit a fost acordat ameliorrii i asigurrii calitii analizelor fcute pentru
identificarea contaminanilor din produsele din alimentaia uman i animal. Pentru
stabilirea normelor comerciale, contaminanii trebuie s fie corect identificai si cantitile
determinate s fie sczute. Micotoxinele nu fac excepie de la aceste reguli i analiza lor
prezint dificulti particulare n ceea ce privete obinerea eantioanelor reprezentative
iar analiza trebuie s permit identificarea nivelurilor sczute de micotoxine (sub 500
ppm).
Eantionarea constitue o etap crucial n determinarea coninutului de micotoxine
dintr-un lot de produse alimentare. Deoarece cantitatea de micotoxin nu este
proporional cu cantitatea de mucegaiuri prezent, sunt foarte rar distribuite uniform n
eantion. Contrar metodelor analitice, sistemele de eantionare nu pot face obiectul
ncercrilor interlaboratoriale i n general, un plan de eantionare este propus pe baza
unui studiu statistic al repartiiei toxinelor msurate, apoi el este adoptat n mod oficial.
Determinarea numarului de mucegaiuri
Materiale necesare:
1. Cutii necesare pentru operatia de pregatire si omogenizare a probei
2. Cutii Petri, eprubete si pipete
3. Solutii diluate: solutie fiziologica peptonata 0.1 %; apa de robinet sterila; citrat de
sodiu 2%.
4. Solutii: acid tartric solutie 10%, acid lactic solutie 10%
5. Inhibitori
6. Medii de cultura (Czapek Dox, extract de drojdie, agar-malt, etc)

Efectuarea dilutilor decimale: din alimentele lichide, omogenizate prin agitare se ia 1 ml si

se introduce intr-o eprubeta de 9 ml cu ser fiziologic peptonat. Se continua dilutiile
decimale succesive
Insamantarea: din fiecare dilutie se introduce cate 1 ml in doua cutii Petri. Se toarna cate
15 ml mediu topic si racit si se omogenizeaza.
Incubarea: cutiile Petri se tin la o temperatura de 22-24 grade timp de 5 zile pentru
mucegaiuri.
Numararea coloniilor: cu ochiul liber sau cu lupa. Se efectueaza de obicei in cutiile Petri
in care s-au dezvoltat intre 10 si 100 colonii.
4. Identificarea morfologica a coloniilor de mucegaiuri:
Examenul macroscopic: se efectueaza pe colonii de o saptamana in placa initiala. Se
urmareste aspectul general al coloniei, textura, ritmul de crestere si pigmentarea.
1. Examinarea la lupa binocular: prin observarea in detaliu a aparatului vegetativ.
2. Examinarea microscopica: se racleaza cu ansa o mica portiune de colonie, se
pune o picatura de Lugil si se examineaza cu obiectivele de 10x, 20x si 40x pentru
a observa spori sau alte structuri de diagnostic.
Tehnici de identificare a mucegaiurilor
Examenul microscopic direct este dificil, prin caracterul sau interpretabil. El poate
creea confuzii deoarece filamentele fungice pot fi u or confundate cu fibrele vegetale, iar
sporii pot fi confundai cu diferite artefacte. Fungii levuriformi sau filamento i primari,
rspunzatori cu declanarea bolii, pot fi deseori masca i de specii care se dezvolt
secundar, aa cum ar fi Penicillium, Rhizopus sau Scopulariopsis.
Prin colorarea frotiurilor obinute din materiale patologice se ating doua obiective:
vizualizarea mai bun a elementelor fungice i conservabilitatea preparatelor. De
asemenea, se pot colora i fragmente de mice i recoltate din coloniile ce au crescut pe

mediile de cultur. Frotiurile se realizeaza prin suspendarea mice ilor n ap distilat, pe

lama degresat, i uscate la temperatura camerei.
1. Metoda de colorare rapida (dupa Schwartz si Lamkins).
2. Metoda Hotckiss McManus

5. DETERMINAREA NUMRULUI TOTAL DE DROJDII SI MUCEGAIURI

PRINCIPIUL METODEI
Prin aceast metod, numrul de drojdii si mucegaiuri se apreciaz indirect, pe baza
coloniilor generate de celulele acestor microorganisme prezente n proba de analizat,
care se formeaz cnd proba sau o dilu_ie a acesteia vine n contact cu un mediu nutritiv gelozat,
dup termostatare la 25C timp de 72 de ore.
ECHIPAMENTE
_ Omogenizator;
_ Balan_ analitic;
_ Termostat reglat la 25C;
_ Baie de ap pentru fluidificarea mediului de cultur reglat la 45C.
MATERIALE SI STICLRIE
_ 25g produs alimentar;
_ 225 ml 0.1% apa peptonat;
_ Plci Petri =10 cm sterile;
_ Pipete de 1 cm3 si 10 cm3 sterile;
_ Eprubete cu ser fiziologic steril, cte 9 cm3 per eprubet;
_ Baloane cu ser fiziologic steril;
_ Pungi sterile pentru omogenizarea probelor solide sau semisolide;
_ Numrtor de colonii.
Reactivi pentru determinare
Mediu de diluare: Solu_ie ser fiziologic;
Mediu de cultur: Anexa 2.
DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU

Se cntresc 25 g proba produs alimentar, peste care se adaug 225 ml apa

peptonat. Se omogenizeaz timp de 1 min.
Pentru diluarea probei se aplic schema de dilutie din figura 1.

Figura 1 Schema de lucru pentru realizarea dilu_iilor si inocularea probelor

*Toate probele se realizeaz in duplicat.

Cu o pipet steril se transfer n fiecare plac Petri steril, cte 1 cm2 prob de
analizat, dac produsul este lichid sau cte 1 cm2 dilu_ie ini_ial, n cazul altor produse.
Se realizeaz apoi prima dilu_ie decimal a probei de analizat (10-1). Se repet aceste
opera_ii cu dilu_iile urmtoare, folosind cte o nou pipet steril pentru fiecare dilu_ie
decimal (Fig.1).
Se toarn n fiecare plac Petri cte cca. 15 cm2 mediu MEA (Malt Extract Agar) cu
temperatura de 455C.
Mediile se uniformizeaz rapid n plci, prin rotirea plcilor n plan orizontal, apoi sunt
lsate n repaus pn se produce solidificarea lor.

Se noteaz pe capacul plcilor numele probei, mediul utilizat, dilu_ia inoculat,

temperatura la care se va face termostatarea .

Dup solidificarea mediului plcile se termostateaz cu capacul n jos, pentru 3-5 zile la
temperatura de 25-28C.
REZULTATE
Se re_in plcile care con_in 25-250 de colonii. Numrul de ufc de drojdii si mucegaiuri

per ml sau gram de produs se calculeaz ca medie ponderat, cu formula urmtoare:

C
ufc/ g(ml)=
(n +0,1 n2)d
1

unde
C suma coloniilor numrate n toate plcile re_inute;
n1 numrul de placi re_inute dintr-o dilu_ie
n2 numrul de placi re_inute din dilu_ia succesiv
d factorul de dilu_ie corespunztor primei dilu_ii din care s-a realizat re_inerea
plcilor.
Rezultatele calculate se rotunjesc la dou cifre semnificative.
Se exprima gradul de contaminare printr-un numr cuprins ntre 1,0 si 9,9 multiplicat cu
10x, unde x este puterea atribuit lui 10.
Dac cele dou placi Petri, la nivelul probei de analizat (produse lichide) sau al dilu_iei
ini_iale (alte produse) con_in mai pu_in de 15 colonii, se face media aritmetic, m, a
coloniilor numrate n cele dou placi.
Rezultatul se exprima sub forma:
- numr de ufc de drojdii si mucegaiuri estimat per ml:
NE=m (produse lichide)
- numr de ufc de drojdii si mucegaiuri estimat per gram
NE=md-1 (alte produse), n care d este factorul de dilu_ie al dilu_iei ini_iale (alte produse).
Dac cele dou plci Petri , la nivelul probei de analizat (produse lichide) sau al dilu_iei
ini_iale (alte produse) nu con_in nicio colonie, rezultatul se exprima sub forma:
- mai pu_in de o ufc de drojdii sau mucegaiuri per ml (produse lichide);
- mai pu_in de 1d-1 ufc de drojdii sau mucegaiuri pe gram (alte produse)

ANEXA 1
GRUPELE PRINCIPALE DE PRODUSE PENTRU CARE SE RECOMANDA ANALIZA
Nr.crt. Grupe de produse

1. Pine si produse de panifica_ie

2. Produse lactate acide si brnzeturi
3. Carne si produse din carne
4. Uleiuri, grsimi si semin_e oleaginoase
5. Fructe. Legume si produse prelucrate
6. Buturi alcoolice
7. Buturi nealcoolice
8. Finuri proteice, furaje , sroturi
9. Zahr si produse zaharoase
10. Cereale si produse din cereale
11. Produse de cofetrie si patiserie
12. Condimente, supe, sosuri, salate

ANEXA 2
CONDITII DE CULTIVARE SI COMPOZITIA MEDIILOR DE CULTUR PENTRU
NUMRAREA MICROORGANISMELOR
Conditiile particulare de lucru conform prevederilor din normativele romnesti adaptate
la conditiile ISO (SR ISO) sunt prezentate n tabelul 1.
Tabelul 1. Conditii de cultivare pentru numrarea microorganismelor impuse de
normativele ISO
Grup de microorganisme

Medii de cultur

Condi_ii de termostatare
Temperatur/timp

_ Drojdii si mucegaiuri

- YGC
-

25C/5 zile

OGA (OGYE)

Compozitia mediilor de cultur recomandate pentru evaluarea diferitelor categorii de

microorganisme este prezentat n tabelul 2.
Tabelul 2. Compozitia mediilor de cultur recomandate pentru determinarea si
confirmarea numrului de unitti formatoare de colonii
Indicator microbiologic

Compozi_ie medii de cultur, gl-1

Drojdii si mucegaiuri

YGC

(Extract de drojdie, glucoz, cloramfenicol agar )

Extract de drojdie ......... 5g
Glucoz ...................... 20g
Cloramfenicol ............ 0,1g
Agar-agar ................... 15g
Ap pn la .......... 1000 ml
pH=6,6
OGA (OGYE)
(Oxitetraciclina glucoz agar)
Extract de drojdie ......... 5g
Glucoz ...................... 20g
Agar-agar ................... 16g
Ap pn la ........... 1000ml
pH=7,2
n momentul utilizrii, n mediul fluidificat se adaug
100 ml solu_ie 1mg/ml oxitetraciclin.
Geloz nutritiv (geloz alba)
Agar-agar ........................... 12-18g
Ap pn la ...................... 1000 ml
MEA (Malt Extract Agar)
Extract de malt ........................ 30g
Pepton .................................... 5g
Agar-agar ................................ 15g
Apa pn la ....................... 1000ml
pH=7,6

CUPRINS
1.Ce sunt mucegaiurile ?
2.Ce sunt drojdiile ?
3. Tehnici de identificare a mucegaiurilor
4.Identificarea morfologica a coloniilor de mucegaiuri
5. Determinarea numarului total de drojdii si mucegaiuri

BIBLIOGRAFIE

http://bibliotecafmvb.ro/doc-site/ma1bib.pdf
https://www.scribd.com/doc/112686525/LaboratorMicrobiologie-Speciala-2012-2013