Facultatea de Stiinta si Ingineria Alimentelor

Specializarea de licenta Biotehnologii industriale

TEHNICI DE PURIFICARE A ENZIMELOR PRIN PRECIPITARE,

DIALIZA SI ULTRAFILTRARE

Sub actiunea diferitilor factori fizici (ultrasunete, radiatii cu diferite

lungimi de unda, caldura), factori chimici (acizi, baze, diferiti solventi
organici), sau mecanici (agitare), are loc fenomenul de precipitare a
proteinelor, precipitare care poate fi reversibila sau ireversibila.

Precipitare reversibila
Precipitarea reversibila se poate produce sub actiunea solutiilor
concentrate ale sarurilor alcaline dar si in prezenta unor dizolvanti organici
miscibili cu apa in orice proportie, cum sunt de exemplu acetona si alcoolul.
Astfel, molecula proteinei sufera unele modificari fizico-chimice, dar nu are
loc afectarea structurii moleculare. Solventii de tipul alcoolului sau acetonei in
functie de concentratia lor pot forma induce precipitare reversibila sau
ireversibila. Sarurile alcaline au un comportament diferit fata de proteine, in
solutii diluate marind solubilitatea proteinelor, iar in solutii concentrate
determinand precipitarea lor reversibila. De altfel, solutiile sarurilor alcaline
de diferite concentratii se folosesc pentru precipitarea fractionata a
proteinelor din amestecuri.

Precipitare ireversibila
In cursul acestei precipitari molecula proteinei sufera modificari fizicochimice ireversibile avand loc si modificarea structurii moleculare. Aceste
modificari se produc, de regula, la adaugarea de solutii ale metalelor grele (Cu,
Pb, Hg, Fe, a acizilor minerali tari (HNO3, H2SO4), acidului tricloracetic, a
solutiilor concentrate de alcool sau acetona, sau in cazul anumitor proteine in
prezenta caldurii. Prin precipitare ireversibila, dupa cum arata si numele
proteinele isi pierd activitatea lor biologica (enzimatica, hormonala, etc.), are
loc o descrestere a solubilitatii, modificarea activitatii optice si sunt mai usor
de degradat sub actiunea unor enzime proteolitice. Prin indepartarea
factorilor care au dus la precipitare, proteinele nu revin la forma lor initiala si
nu isi pot reface structura moleculara. Proteinele precipitate isi pierd din
proprietatile hidrofile "obtinand" proprietati hidrofobe.
In extractele enzimatice brute coexista impreuna cu enzima pe care
dorim sa o separam si sa o purificam, alte enzime, proteine cu mase
moleculare si sarcini electrice diferite, acizi nucleici si nucleotide, poliglucide.
Acesti contaminanti trebuie indepartati treptat din extractul proteic folosind
diverse procedee: dializa, denaturarea termica, precipitarea la pH izoelectric,
fractionarea cu solventi organici si saruri neutre, separarea cromatografica.
In solutie, la un anumit pH, proteinele se diferentiaza intre ele prin:
solubilitate, densitate si distributie de sarcina, grad de hidratare, marime,
forma, densitate, grupari reactive specifice, stabilitate. Toate moleculele
Lucrari practice_Enzimologie aplicata 1
L2_Tehnici de purificare a enzimelor prin precipitare, dializa si ultrafiltrare

Facultatea de Stiinta si Ingineria Alimentelor

Specializarea de licenta Biotehnologii industriale

aceleiasi proteine vor avea proprietati identice. Aceste proprietati

caracteristice ale proteinelor in solutii pot fi utilizate pentru separarea
amestecurilor de proteine.
Dializa este un procedeu de separare bazat pe diferenta de masa
moleculara. Este una din cele mai vechi tehnici pentru indepartarea din
preparatele enzimatice lichide a substantelor solubile, cu masa moleculara
redusa, sau pentru schimbarea tamponului in care este solubilizata enzima.
Metoda se bazeaza pe proprietatea membranelor semipermeabile de a separa
solutia de proteina de tamponul de dializa si a permite trecerea libera in
tampon a moleculelor cu masa moleculara redusa, pe baza fenomenului de
difuzie sub un anumit gradient de concentratie, in timp ce macromoleculele
nu pot penetra prin porii membranei. Inlocuind de cateva ori faza apoasa din
exteriorul membranei, concentratia de molecule mici in solutia proteica poate
fi scazuta pana la valori nesemnificative.
Pentru dializa se recomanda utilizarea de membrane tip
Spectra/por 7 membrane tubing, procesul fiind condus la 4 C, cu
optimizarea timpului de dializa si a perioadei dupa care se impune schimbarea
tamponului.
Se decupeaza o bucata de membrana semipermeabila pentru dializa, cu
lungime variabila in functie de volumul de preparat enzimatic supus analizei.
Se tine cont de faptul ca in timpul dializei se mareste volumul solutiei tampon
in care este solubilizata enzima. Membrana se inmoaie si se spala cu apa pura
(apa purificata prin trecere prin coloana cu schimbatori de ioni). Dupa ce un
capat al membranei tubulare este bine inchis printr-un nod sau cu ajutorul
unei cleme, se introduce in interiorul ei preparatul enzimatic (5 cm3), prin
intermediul unei palnii mici, a unei pipete, sau a unei seringi, apoi se inchide
etans si celalalt capat al tubului.
Se aseaza tubul obtinut in pozitie verticala intr-un vas cilindric, de
capacitate mare, in care se gaseste tamponul de dializa (2 dm3
solutie 0,05M tampon fosfat pH=7,2), cu posibilitatea de agitare lenta si
continua a solutiei tampon in vas (la 4 C, timp de 20 h) cu schimbarea
tamponului de dializa de cateva ori, la diferite intervale de timp, in functie de
necesitatile dializei.
Ultrafiltrarea un alt procedeu de separare a moleculelor cu masa
moleculara mica, dintr-un extract proteic. Se aseamana in principiu cu dializa,
dar utilizeaza presiunea sau forta centrifuga pentru a filtra prin membrana
semipermeabila apa si moleculele mici dizolvate, in timp ce moleculele mari
sunt retinute.
Ultrafiltrarea poate fi utilizata in experimente de purificare partiala a
extractelor enzimatice brute sau pentru concentrarea fractiilor active dupa o
purificare prealabila prin alte procedee. Proteina concentrata poate fi apoi
rediluata cu o solutie tampon adecvata, ceea ce permite schimbarea conditiilor
de tamponare sau desalifierea proteinei. In acest scop pot fi aplicate doua
procedee clasice de ultrafiltrare, realizate la nivel de laborator:
- Ultrafiltrare prin membrane semipermeabile de tip DIAFLO se aplica
in scop de purificare partiala sau concentrare. Proteinele extractului
proteic sunt concentrate si desalifiate prin ultrafiltrare. In plus, ele sunt
separate in raport cu masa lor moleculara, in functie de membrana
semipermeabila utilizata, caracterizata prin NMWC (Normal Molecular
Lucrari practice_Enzimologie aplicata 2
L2_Tehnici de purificare a enzimelor prin precipitare, dializa si ultrafiltrare

Facultatea de Stiinta si Ingineria Alimentelor

Specializarea de licenta Biotehnologii industriale

Weight Cutoff). Aceasta caracteristica este dependenta de marimea

porilor si este specifica fiecarei membrane. Ea arata care este masa
moleculara limita, in functie de care proteinele cu masa moleculara
superioara nu trec prin membrana. Experimentele de ultrafiltrare pot fi
realizate in celula AMICON, la presiune de 2 MPa, prin membrane de
tip DIAFLO ULTRAFILTERS.
-

Ultrafiltrarea centrifugala in CENTRICON se aplica in scopul

concentrarii fractiilor active, cu volume mici, dupa cromatografie. Acest
tip de UF asigura concentrarea si desalifierea unor volume mici de
extract proteic (0,025-2 cm3), prin UF prin membrana semipermeabila,
sub actiunea fortei centrifuge (4000 x g, 1h, la 4 C). Dupa fiecare
utilizare Centriconul se spala cu apa si se mentine, 10 minute, in
Branson 3200 (sub vibratii ultrasonice), pentru o mai buna curatare.

Precipitarea cu sulfat de amoniu sarurile neutre au efecte puternice

asupra solubilitatii proteinelor. In concentratii mici sarurile cresc solubilitatea
multor proteine, fenomen cunoscut in literatura americana ca salting-in.
Capacitatea sarurilor neutre de a influenta solubilitatea proteinelor este
dependenta de taria lor ionica, marime care masoara atat concentratia cat si
numarul sarcinilor eletrice ale cationilor si anionilor formati de sare. Efectele
de salting-in sunt produse de modificari ale tendintei gruparilor disociabile
ale proteinei de a ioniza. Pe masura ce taria ionica continua sa creasca,
solubilitatea proteinei incepe se scada. La o tarie ionica suficienta de mare,
proteina solubila poate fi precipitata aproape complet, efect numit salifiere
(salting-out).
Folosirea sulfatului de amoniu pentru a produce efectul de salting-out
al proteinelor este una dintre metodele cele mai cunoscute si mai utilizate la
nivel de laborator. Sulfatul de amoniu este preferat pentru salifierea
proteinelor deoarece el prezinta o solubilitate ridicata, incat poate fi realizata
o tarie ionica foarte mare; este ieftin si are efect stabilizator asupra unor
enzime; este lipsit de toxicitate pentru multe enzime. Desi solutia saturata
(3,9 M) are o densitate de 1,235 g/cm3, acesta nu interfera cu sedimentarea
multor precipitate prin centrifugare.
Utilizarea (NH4)2SO4 pe scara larga este totusi limitata, ca urmare a
efectului sau coroziv ( exceptand otelul inox), a formarii de solutii dense care
genereaza probleme de colectare a precipitatului prin centrifugare si a
posibilitatii de a degaja amoniac, in special la pH alcalin.
Metoda se bazeaza pe urmatorul principiu: proteinele in solutie
formeaza legaturi de hidrogen cu moleculele de apa prin gruparile lor polare si
ionice. Ionii de amoniu intra in competitie cu proteinele pentru locul
moleculelor de apa, are loc indepartarea apei de hidratare din molecula de
proteina, ceea ce conduce la scaderea solubilitatii proteinei si precipitarea
acesteia. Acest fenomen este reversibil. Proteinele precipitate prin salifiere isi
pastreaza conformatia lor nativa si pot fi resolubilizate cand se diminueaza
concentratia de sulfat de amoniu.
Pentru precipitare, peste un volum cunoscut de extract enzimatic, aflat
intr-o fiola de centrifuga si mentinut pe gheata, se adauga foarte lent
(picatura cu picatura), un volum determinat de solutie saturata de sulfat de
amoniu, incat sa se asigure obtinerea unei concentratii de sare in solutie, care
sa determine precipitarea proteinei. Fiola se mentine pe gheata (0C), 1h, cu
Lucrari practice_Enzimologie aplicata 3
L2_Tehnici de purificare a enzimelor prin precipitare, dializa si ultrafiltrare

Facultatea de Stiinta si Ingineria Alimentelor

Specializarea de licenta Biotehnologii industriale

agitare lenta si continua a amestecului (pentru evitarea spumarii). Fractia

precipitata se separa de restul solutiei prin centrifugare la 8000 x g, 1h, la
4C. Precipitatul, care reprezinta fractia activa, este apoi redizolvat in solutie
tampon fosfat specifica enzimei testate. Volumul de tampon utilizat pentru
solubilizarea enzimei, variaza in functie de cantitatea de precipitat separata,
astfel incat sa se asigure o solubilizare completa a acestuia.
Pentru detectarea domeniului concentratiilor de sulfat de amoniu la
care precipita selectiv enzima, se procedeaza la precipitarea succesiva a
proteinelor din extractul enzimatic brut la saturatii de 40, 65, 80, 90% sulfat
de amoniu. Aceasta metoda prezinta dezavantajul ca mareste mult dilutia
proteinei, prin cresterea volumului solutiei de sare adaugata de la o etapa la
alta. Astfel, pentru a obtine o saturatie de 80%, trebuie adaugate patru volume
de solutie 3,9M sulfat de amoniu, pentru un volum de extract enzimatic brut.
La fiecare etapa de precipitare se recomanda atat analiza precipitatului
cat si a supernatantului, dupa o dializa prealabila (pentru indepartarea
sulfatului de amoniu care poate sa interfere in unele tehnici de analiza),
tinand cont de cresterea in volum in timpul dializei.
Unele enzime se denatureaza la precipitarea cu sulfat de amoniu. Alte
saruri pot substitui aceasta substanta, dar varianta cea mai favorabila este
utilizarea solventilor organici ca metanolul, etanolul, 2-propanului si
acetona. Acestia actioneaza reducand constanta dielectrica a mediului si, in
consecinta, reducand solubilitatea proteinelor, favorizand interactiunile
proteina-proteina si nu cele proteina-solvent.
Solventii organici nu sunt utilizati pe scara larga deoarece sunt
scumpi, inflamabili si tind sa denatureze proteinele, daca temperatura creste
de 0C.

Lucrari practice_Enzimologie aplicata 4

L2_Tehnici de purificare a enzimelor prin precipitare, dializa si ultrafiltrare

Facultatea de Stiinta si Ingineria Alimentelor

Specializarea de licenta Biotehnologii industriale

PROTOCOL DE LUCRU
1. Obtinere extractului enzimatic brut utilizand un trament
combinat de rupere a peretilor celulari: tratament mecanic (mojarare biomasa
cu nisip de cuart) combinat cu tratament cu ultrasunete (vezi lucrarea de
laborator 1).
Solutie 0,02 M tampon Drojdie comprimata
pH=4,6
(5g)

Nisip
(5 g)

Mojarare energica

(50 cm3 )
Omogenizare

Extractie

10 minute
10 minute

Completare volum
pana la 200 ml

Ultrasonare

15 minute

Centrifugare

Biomasa reziduala

6000 rot/min, 10 min

EXTRACT ENZIMATIC

Determinare continut de proteine in extract,

spectrofotometrie, =280 nm

Lucrari practice_Enzimologie aplicata 5

L2_Tehnici de purificare a enzimelor prin precipitare, dializa si ultrafiltrare

Facultatea de Stiinta si Ingineria Alimentelor

Specializarea de licenta Biotehnologii industriale

Etape de investigare:
-

Se caracterizeaza extractul brut din punct de vedere al continutului de

proteine si al activitatii enzimatice

Se plaseaza un volum cunoscut de extract enzimatic brut intr-un vas

Berzelius, la temperatura de 0-4C, pe o baie de gheata

Se calculeaza necesarul de agent de precipitare: solutie suprasaturata

de sulfat de amoniu (40%, 60% , 80% , pH=7,0) sau sare: acetona

Se adauga, in extractul brut, volume foarte mici (picaturi) din agentul

de precipitare solutie sau cantitati foarte mici de sare (cristale), cu
amestecare continua, mentinand amestecul pe gheata la temperatura
de 0-4C

Se centrifugheaza amestecul la 12000 rot/minut, timp de 30 minute

Se recupereaza supernatantul

Se solubilizeaza precipitatul in solutie tampon, cu pH si tarie ionica

controlate (de obicei o,02M)

Precipitatul si supernatantul se supun dializei, 24 de ore, cu

schimbarea tamponului la interval de 12 h

Se determina:
o Volumele de subproduse (supernatant, precipitat dizolvat si
dializat)
o Continutul de proteine
o Activitatea enzimatica

Lucrari practice_Enzimologie aplicata 6

L2_Tehnici de purificare a enzimelor prin precipitare, dializa si ultrafiltrare

Facultatea de Stiinta si Ingineria Alimentelor

Specializarea de licenta Biotehnologii industriale

Protocol de lucru
30 ml extract enzimatic brut
Mentinere la 0-4C

Precipitare cu
acetona, adaos
solvent in picatura si
amestecare continua

Centrifugare
1200

Precipitat P

1 12000-15000 rpm, 30 minute

Supernatant S

Solubilizare cu 5 ml solutie
0,2 % NaCl

Determinare continut de proteine,

=280 nm

Determinare continut de proteine,

=280 nm

Observatii: Fiecare grup de lucru va investiga efectul unei concentratii diferite de

agent se precipitare: sulfat de amoniu: 40%, 60%, 80%;
acetona: 20%, 50%, 80%.

Lucrari practice_Enzimologie aplicata 7

L2_Tehnici de purificare a enzimelor prin precipitare, dializa si ultrafiltrare

Facultatea de Stiinta si Ingineria Alimentelor

Specializarea de licenta Biotehnologii industriale

Centralizare rezultate
Saturatie

Subprodus

Volum

DO 280 nm

DO280 nm/ml

Grad de
purificare*

Volum

DO 280 nm

DO280 nm/ml

Grad de
purificare

(NH4)2SO4, %

40

Extract brut
Supernatant S1
Precipitat P1

60

Supernatant S2
Precipitat P2

80

Supernatant S3
Precipitat P3

Saturatie

Subprodus

Acetona, %

20

Extract brut
Supernatant S1
Precipitat P1

50

Supernatant S2
Precipitat P2

80

Supernatant S3
Precipitat P3

* Gradul de purificare sa va stabili in corelatie cu activitatea enzimatica in functie

de activitatea specifica (unitati de activitate/mg proteine)

Lucrari practice_Enzimologie aplicata 8

L2_Tehnici de purificare a enzimelor prin precipitare, dializa si ultrafiltrare