Formare profesionala si

organizationala aangajatilor din

Laboratoarele deImunologie prin
implementarea tehnologiilor de
varf si amanagementului calitatii
IMUNOLAB

POSDRU/81/3.2/S/59497

De la genom la proteom - biomarkeri

Lectori: CSII Dr. Monica Neagu

CSIII Dr. Carolina Constantin
INCD Victor Babes, Bucuresti

Ce este proteomica?
Ce ar trebui sa fie:analiza simultana atuturor
proteinelor dintro proba biologica
Ceea ce sigur nueste:analiza structurala
detaliata aunei singure
proteine/determinarea nivelului unei singure
proteine dintro proba
Nuexista ometoda unica pentru aaborda
proteomica!

Originile proteomicii
Secventierea genomului unpasimportant
catre analiza proteomica,pornind dela
caracterizarea complexa asecventelor ADN
1984 Reovirus serotype3
1997 E.coli
1998 C.elegans
2001 H.sapiens

Dogmacentrala abiologiei moleculare

ADN ARN(ARNm) proteine
cca 25,000genelaom:ogena pentru >1
ARNm
>1,000,000proteine diferite constituie
proteomul uman
Proteomul este otinta inmiscare
modificari continue!

Incartierul Proteomicii zonesi activitati

ZONE
Proteomica structurala determinare pe scara larga a
structurilor proteice tridimensionala (cristalografie de
razeX,spectroscopie NMR)
Proteomica deinteractie analiza interactiilor lanivel
atomic,molecularsi celular;
Proteomica celulara cartarea localizarii proteice si a
interactiilor acestora intimpul evenimetelor celulare
cheie (tomografie derazeXsi microscopie optica de
fluorescenta)

ACTIVITATI
Separarea proteinelor delimitarea fiecarei porteine dintro
mixtura
Identificarea proteinelor secventiere prin spectrometrie de
masa (MS);recunoastere cuanticorpi specifici fata deun
motiv/secventa proteica;degradarea Edman pentru
confirmarea secventei cand MSeste inaccesibila
Analiza secventa proteica utilizeaza baze dedatepentru
proteine sau peptide,analiza functionala adomeniilor,
predictia functiei dinsecventa sau relatia evolutionara a
proteinelor;
Modificari proteice prin analize fosfoproteomice si
glicoproteomice (toate proteinele sufera modificari)
Cuantificare proteine metode electroforetice sau gelfree
(multiplexpe beadssau planare Proteinmicroarray)

Portretul robotalProteomicii
Identificare proteica ce fel deproteine exista intr
unorganism,organ,tesut,celula,fluidbiologicsau
mediu decultura biologic?
Cuantificare proteine ce cantitate dintro proteina
identificata segaseste intrunorganism,organ,
tesut,celula,fluidbiologicsau mediu decultura
biologic?
Descoperire debiomarkeri proteici careproteina
este alterata caabundenta si/sau structura intre 2
sau mai multe tipuri deprobe,maladii etc

Caracteristici proteine
Sintetizate calanturi liniare deAA:secventa
AAdictata desecventa ADNagenei ce
codifica pentru proteina;
AAprezinta mase,structuri si chimii diferite:
proteinele aumase,structuri si caracter
chimic diferit,infunctie denumarul si tipul AA
dincomponenta

Maimult despre proteine

Ce caracteristici aleproteinelor primeaza in
proteomica?
Masa electroforeza ingel,spectrometrie demasa
Caracterul acid,neutru sau bazic cromatografia,
electroforeza ingel,spectrometrie demasa
Antigenicitatea imunometode multianalit (array)
Modificari chimice
Formaacesteia
???

Cumabordam problema?

ELISA
Genotipare
Spectrometrie
demasa

Spectroscopie
RMN

SELDI/MALDIMS

Microarray/xMAP

Competitia
complexitate &
detectie

Careeste Intrebarea Proteomica?

Ce intrebari trebuie puse cand neindreptam
spre proteomica?
Ce secvente intrainstructura tuturor
proteinelor?SAU
Catdintro proteina anume exista intro
proba?SAU
Cumdifera nivelul tuturor proteinelor intre
grupe deprobe,timp sau interventie
experimentala?

Saneferim dereductionismul
traditional!
Deregula,osingura intrebare conducelao
unica ipoteza stiinta reductionala
traditionala
Cunoastere sigura dar restrictiva deex.,
activitatea enzimei Xnuva fi influentata de
stimularea cufactori decrestere aunei celule
particulare

Cuosingura momeala (ipoteza)sepoate prinde un

singur peste (testarea ipotezei)!
Urmeaza onoua momeala pentru unaltpeste s.a.m.d

Stiinta Omicii
Cuosingura plasa
Omica,sunt capturate
milioane poate de
modificari diferite!
Exemplu patternul
ARNm intre tesutul
normalsi patologic

Biomarkerii proteomici
Markeri Glucoza dinsange,proteine serice,
presiune sange,temperatura etc
Biomarker ocaracteristica masurata
obiectiv,si evaluata caunindicatoralunui
proces biologicnormalsau patologic,sau al
unui raspuns farmacologic inurma unei
interventii terapeutice

Cuvinte cheie
Specificitate
Proportia deindivizi normali (control)negativi
pentru biomarkerul respectiv
Sensibilitate
Proportia deindivizi cumaladia confirmata
(corect diagnosticati)pozitivi pentru
biomarkerul respectiv
Curba ROC

Curba ROC=ReceiverOperatingCharacteristic

Kulasingam V, 2008, Nature Clinical Practice ONCOLOGY, vol 5 no 10

Tipuri debiomarkeri
Biomarkerdediagnostic (screening) unmarkerpentru
detectia si identificarea unui tipdecancerlaunindivid.Se
presupune caauspecificitate si sensibilitate inalta;deex,
prezenta proteinelor BenceJonesinurina ramane unul dintre
cei mai siguri indicatori dediagnosticpentru mielom multiplu.
Biomarkerdeprognostic utilizat dinmomentul incare
statusul maladiei afost stabilit.Sepresupune cavor
previziona (predictie)cursul maladiei,inclusiv recurenta
acesteia,auoinfluenta importanta inagresivitatea terapiei;
deex,interatomul testicular,nivelele degonadotropina
corionica umana si alfafetoporteina potdiscrimina intre doua
grupe curatedesupravietuire diferite

 Biomarkerdestratificare (predictivi)
serveste pentru predictia raspunsului lao
medicatie/agentterapeutic ,inainte ca
tratamentul sa fieinstituit.Acest marker
clasifica indivizii caresponsivi sau non
responsivi launtratament particular.Sunt
explotati inexperimente detiparraycarefac
posibila predictia evolutiei clinice,pornind de
lacaracteristicile moleculare aletumorii
pacientului.
Strategiesfordiscoveringnovelcancerbiomarkersthroughutilizationofemerging
technologies
http://www.nature.com/nrclinonc/journal/v5/n10/full/ncponc1187.html

Conduita biomarkeri

Strategii indescoperirea biomarkerilor

Kulasingam VandDiamandis
EP(2008)Strategiesfor
discoveringnovelcancer
biomarkersthrough
utilizationofemerging
technologies
NatClin Pract Oncol
doi:10.1038/ncponc1187

Phases of biomarker development.

Pepe M S et al. JNCI J Natl Cancer Inst 2001;93:1054-1061

Oxford University Press

Etape indezvoltarea debiomarkeri

1.Studii exploratorii preclinice
Specimene tumorale si nontumorale sunt comparate,pentru
generarea ipotezelor privind testele clinice indetectia
cancerului.Strategiile tehnologice implicate:profil de
expresie genica sau spectrometrie demasa.
2.Dezvoltarea demetoda si validare
Inaceasta etapa este dezvoltata ometoda clinica careva
operacuunanumit specimen(obtinut noninvaziv).Metoda
va trebui sa discrimineze indivizii cucancerfata decei
sanatosi.Pacientii investigati inaceasta faza prezinta maladia
diagnosticata,stabilita.Nueste demonstrata inaceasta etapa,
utilitatea metodei indetectia timpurie amaladiei.

3.Studii clinice retrospectivelongitudinale

Sunt utilizate specimene colectate si stocate delao
cohorta deindivizi sanatosi careaufost monitorizati
pentru dezvoltarea decancer.Inaceasta etapa este
demonstrata capacitatea biomarkerului deadetecta
boala lanivel preclinic.
4.Studii prospectivedescreening
Indivizii sunt monitorizati cumetoda si procedurile
dediagnosticaplicate indivizilor declarati pozitivi.Se
stabileste stadiul tumorii sau natura maladiei la
momentul detectiei.
5.Trialuri clinice randomizate controlalbolii
Obiectivul acestei fazeeste deadetermina daca
screeningul reduceincarcarea tumorala in
populatie.
Pepe MS et al. (2001) Phases of biomarker development
for early detection of cancer. J Natl Cancer Inst 93:10541061

Unmarkertumoral ideal
Produs decelule tumorale si regasit incirculatie
Prezent incantitati scazute inserul indivizilor sanatosi si ai
acelora cuforme benigne,dar crescut semnificativ in
formele decancer(depreferat intrunsingur tipdecancer)
Usor decuantificat printro metoda necostisitoare
Prezent incantitati detectabile (sau mai mari decat limitele
normale)instadii timpurii sau preclinice
Nivelul cantitativ sa reflecte incarcarea tumorala
Sensibilitate (cativa falsi negativi)si specificitate (cativa falsi
pozitivi)crescute

Aplicatii alemarkerilor tumorali actuali

Kulasingam V and Diamandis EP (2008) Strategies for discovering novel cancer biomarkers through utilization of
emerging technologies Nat Clin Pract Oncol doi:10.1038/ncponc1187

Biomarkeri tumorali actuali inclinica

Kulasingam V and Diamandis EP (2008) Strategies for discovering novel cancer biomarkers through utilization of
emerging technologies Nat Clin Pract Oncol doi:10.1038/ncponc1187

Fluide biologice casursa debiomarkeri

Kulasingam V and Diamandis EP (2008) Strategies for discovering novel cancer biomarkers through utilization of
emerging technologies Nat Clin Pract Oncol doi:10.1038/ncponc1187

Probele biologice
Cercetare versusrealitate
Cercetare toate conditiile experimentale sunt mentinute
identic inscopul cresterii probabilitatii statistice de
identificare abiomarkerilor
Potfi generati numerosi biomarkeri delaunnumar mic de
probe,dar carenuvor facefata realitatii!
Realitate oricare biomarkertrebuie sa supravietuiasca
indiferent demodalitatea diferita decolectie aprobei,
manevrarea si stocarea acesteia
Sunt generati putini biomarkeri dar robusti,insa enecesar un
numar mult mai maredeprobe!
http://chromatographyonline.findanalytichem.com/lcgc/Misc/Top-Down-versus-Bottom-Up-Approaches-inProteomics/ArticleStandard/Article/detail/374600

Strategii deanaliza aprobei:Topdown &Bottomup

Doua strategii majore deanaliza aproteinelor dinproba:
informaintacta (Topdown)
digerate proteolitic experimental(Bottomup)

Abordarea Topdown:proteiele sunt analizate informa

intacta.Biomarkerii sunt ulteriordelimitati prin tehnologii
variate (ex.gelurile 2D),cuantificati si ulteriordigerati
enzimatic,analizati prin spectrometrie demasa si identificati
oficial.
Abordarea Bottomup:toate proteinele dintro proba sunt
digerate initialcutripsina,peptidele derivatesunt identificate
prin spectrometrie demasa si cuantificate pentru generarea
unei baze dedateutila inanaliza statistica abiomarkerilor.
http://chromatographyonline.findanalytichem.com/lcgc/Misc/Top-Down-versus-Bottom-UpApproaches-in-Proteomics/ArticleStandard/Article/detail/374600

Metode proteomice uzuale

Topdown(formaintacta)
Electroforeza 2Dgel
Spectrometrie demasa,MALDI,SELDITOFMS
Imunometode multiplexate

Bottomup(formadigerata)
MudPit Themultiproteinidentificationtechnology
MudPIT combinatie intre analiza proteomului si detectia
debiomarkeri.Primul paseste ocromatografie
multidimensonala urmata despectrometrie demasa,iar
datele analizate cuprograme dedicate SEQUEST

Tacu Cetal.,Roum ArchMicrobiol Immunol,vol 69(1),2010,4855

Dincolo degranite:Imunoproteomica
Immunoproteomica
Capacitatea sistemului imun deavizualiza si
recunoaste patternul deanticorpi generati incursul
bolii (autoimunitate,cancersau infectii);
Anticorpi circulanti
Regiunea constanta (Fc)rol importantintehnicile
imunoproteomice marcare secundara directa in
vizualizare areactiei;anticorpi decaptura instrategii
cuproteina A/G;

Dece anticorpi?

Clinic markeri moleculari importanti carereflecta informatia globala a

organismului,referitoare lapatternul molecularalantigenelor asociate
agentilor infectiosi,maladii autoimune sau cancer.

Purcell,A.W.,Gorman,J.J.,Mol.Cell.Proteomics2004,3,193208

Aplicatii indiagnostic trasaturi ideale cabiomarkeri:

Biodisponibilitate: surplusdeanticorpi generati inurma activarii sistemului
imun umoral laaparitia antigenului inorganism;
Durata raspunsului: desi prezenta antigenului este tranzitorie,raspunsul
generat este persistent;
Timpul deviata: suficient delung,intre 720zile infunctie deizotip;
Stabilitate: comparativ cualte proteine serice,stabilitatea Acfaceca
protocoalele deanaliza pe sersa fieflexibile.

Full Option molecule ideale in diagnosticul maladiilor imune si in

abordarile tehnologiilor proteomice!
Anderson, K. S., LaBaer, J., J. Proteome Res. 2005, 4, 11231133

Ghici cine vine la cina: tehnologii imunoproteomice in

descoperirea debiomarkeri
Demersurile indomeniul biomarkerilor abordari pentru
dezvoltare si nuformularea deipoteze!
Secventierea genomului uman,tehnologii deinalta rezolutie
pentru separarea si detectia proteinelor/peptidelor,
bioinformatica
Investigarea tuturor proteinelor,normalsi patologic
Identificarea antigenelor relevante asociate bolii in
maniera proteomica

I.Imunoproteomica ingel(electroforeza)
2DPAGE
Pro(+): comparare probe
patologic versusnormal.
Contra(): rezolutie slaba a
proteinelor cuMMjoasa
(<10kD);serecomanda o
fractionare prealabila

Immunoblotting =Westernblot
(analiza postelectroforetica)

Proteinele separateingelde
poliacrilamida SDSsunt transferate
pe omembrana (NC/PVDF)incamp
electric;
Incubare aproteinelor imobilizate
cuanticorpi primari (captura);
Detectia cuanticorp secundar
antiFc aanticorpului primar,cuplat
laoenzima,urmata deaditia
substratului corespunzator;
Conversia substratului vizualizata
pe membrana directsau prin
expunerea membranei incamera
fluorescenta (chemisluminiscenta);
Intensitatea semnalului este
corelata cuabundenta proteinei
(antigenulu)imobilizat pe
membrana.

Spectrometrie MALDITOFMS

Detectia ulterioara aproteinelor

imunogene dinexperimentele de
imunobloting,poate fi urmata deo
excizie aproteinelor dingel;

Piesele excizate sunt supuse unei

digestii proteazice;

Digestul rezultat este analizat prin

MALDITOFMS;

Amprenta peptidica rezultata este

comparata cuobaza dedate;

Identificarea proteinei deinteres cu

programe dedicatedeanaliza.

MALDI:MatrixAssistedLaserDesorptionIonization
Laser

Suport proba
h

AH+

Proba

1.Proba (A)este mixata cuun

matrixspecial(M),deshidrata
ta si depusa pe unsuport
MALDI
2.Moleculele dinmixul cumatrix
sunt ionizate deunfasicul laser
3.Moleculele probei sunt ionizate
prin transferul protonilor din
matrix:
MH+ +A M+AH+

Ionii sunt generati inpulsuri ionii de

masa micaajung primii ladetector;
Semasoara timpul necesar ionilor
pentru aajunge ladetector;
Raportul masa/sarcina pentru union
VariableGround dat,este proportionalcupatratul
GridGrid
timpului dedetectie.

Sandler Mass Spectrometry Users Group, University of California San

Francisco May 20, 2003

II.Imunoproteomica nonelectroforetica
Proteinmicroarray

1. Pe un suport solid pot

fi spotate, proteine
integrale sau in forma
semi-nativa;
2. Proba de analizat
recunoaste proteinele
imobilizate (reactie
Ag-Ac);
3. Reactia este
vizualizata cu un
anticorp secundar
marcat (cromofor,
fluorofor, enzimatic)
recunoasterea
spoturilor care au
reactionat cu IgG de la
pacient.

xMAP array

Echivalentul insolutie a
platformei solide deprotein
microarray;
Marcarea este diferita,
fiecare sfera areuncolorant
intern;
Sferele sunt imbracate cu
moleculedeinteres pentru
orecunoastere specifica
Multiplexare,flexibilitate

Platforme deexpresie Expressionarray

Sisteme deexpresie alibrariilor deADNc strategie importanta de

identificare denoi antigene

Startul: ARNm izolat dincelule/tesuturi pentru generare ADNc,clonat

apoi intrunvectordeexpresie adecvat

Constructie librarie cloneindividuale careacopera profilul deexpresie al

sistemului biologiccaintreg;

Clonele individuale lizate sunt spotate pe osuprafata solida urmat de

identificarea antigenelor specifice (rememberProteinmicroarray!)

() Pierderea PTM,modificari curol dedeterminanti antigenici

(+) Identitatea antigenului decelata prin secventierea genei

corespunzatoare,dintro clona gataobtinuta

Cekaite,L.,Hovig,E.,Sioud,M..MethodsMol.Biol.2007,360,335348.

III.Imunoproteomica inversa:Profilare antigen

Abordare recenta aimunoproteomicii nongel!
Principiu intro primaetapa anticorpii pacientului
sunt imobilizati,iar antigenele corespunzatoare sunt
detectate inetapa ulterioara (similarProtein
Microarrayinfaza inversa!)

Seria noua MS: Imunocaptura MS

1. Imobilizare anticorpi serici ai pacientului legarea via
Proteine A/Gcuafinitate specifica pentru Fc;
2. Unde? suprafata plana,coloana,sfere,infaza lichida;
3. Aplicare mixtura proteica (lizat celular)laAcimobilizati,fiind
captate doar proteinele pentru careexista anticorpi inproba
deser;
4. Antigenele (proteinele)eluate depe Acsunt depuse pe o
suprafata solida si puse incontactcuunmatrixdeionizare;
5. Desorbtia antigenelor prin ionizare si migrarea incamp
electricspre detector;
6. (+) Automatizare,testare pe scara larga,multe probein
paralel,posibilitatea demanevrare antigene nativeinsolutie

Villar-Garea, A., Griese, M., Imhof, A. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2007, 1-2, 105114.

Cancercolon

Ocurenta infectiei cuS.bovis in

cancerul decolon ometodologie de
imunocaptura cuplata cuMS.
Proteine dinperetele celular
bacterian (pool)incontactcuserul
delapacient (IgG seric)(A), urmata
deprofilare antigenprin MS(B).
Rezultatele infectiile cuS.bovis
sunt timpurii intimpul dezvoltarii
cancerului decolonsi silentioase
clinic
Inplus,3antigene S.bovis sunt
asociate cutumora (C).
Profilarea serologica aanticorpilor
antiS.bovis sustine dezvoltarea
cancerului decolon,acarui detectie
timpurie este critica indecizia
terapeutica.

IV.Imunoproteomica inaplicatii dediagnostic

1.Productia deantigene pe scara larga aAgdeinteres curol indiagnostic
pentru untipdemaladie;
2.Platforme deanaliza pe scara larga metode dediagnosticmultimarker
ELISA primaalegere cand seanalizeaza unmarkersau paneluri reduse de
markeri;instrumentatie si protocolaccesibile
Directa Acimobilizati pentru recunoasterea selectiva aAgdintro proba
biologica.UnAcsecundar conjugat enzimatic este utilizat pentru detectia si
cuantificarea reactiei.
Indirecta Agimobilizat pe suport legat laanticorpii dinproba/ser(monitorizarea
eficientei vaccinarii)

Arraydeantigene (xMAP,Proteinmicroarray)
Platforma deproteinmicroarray metodologie complexa,instrumentatie si
protocoale mai putin accesibile,fara aplicabilitate clinica deocamdata.
Alternativa pentru clinica sisteme infaza fluida,pe sfere,mai accesibile (xMAP)

Exemple deutilitate clinica

Monitorizare eficienta vaccinare
Arraydepeptidepentru monitorizarea raspunsului imun
umoral fata demoleculedeadeziune delanivelul celulelor
epiteliale (EpCam),inseroterapia pacientilor cucancer
Monitorizare antigenicitate agenti terapeutici
Definirea raspunsului imun fata deunpaneldeagenti
terapeutici inruditi (deorigine proteica)pentru selectia si
individualizarea tratamentului
Diagnosticsi prognosticmaladii autoimune
Pentrul serodiagnosticul SLEafost definita oplatforma
microarraycu30deantigene asociate bolii (colagen,
fibrinogen,heparan sulfate,miozina,proteoglicani,histone
etc).Aufost identificate clustere autoreactive deanticorpi
IgG/IgM careauputut fi asociate cuactivitatea bolii.Permite
diagnosticarea pacientilor curisc crescut inleziunea severa de
organsi orientarea tratamentului.

Diagnosticinfectii
Infectia cuBorrelia burgdorferi (boala Lyme)
Studiu careaimplicat 2DPAGEsi
imunobloting,pentru relevarea raspunsului
umoral la21proteine demembrana dela
Borrelia sp.
Informatii asupra progresiei bolii,stadiilor
timpurii si tardive aleacesteia.

Diagnosticcancercuinfectii asociate
Cancergastric

Metode imunoproteomice gelelectroforetice auidentificat antigene inalt

specifice delaH.pylori,utileinimbunatatirea testarilor serologice pentru
diagnosticul si monitorizarea infectiei,identificarea indivizilor curisc de
cancergastric;
Leucemii

Pacienti imunocompromisi,curisc deinfectii oportuniste,deex.,cu

Candidaalbicans. Inserul pacientuilor cuinfectii,sagasit caocrestere a
anticorpilor antienolaza asociata curecuperarea dupa candidioza
sistemica =markeri deevolutie.Indirectdintestarea infectiilor fungice,se
potobtine informatii dediagnosticsi deprogresie amalignitatii debaza;

Cancercolon

Sarecapitulam strategia biomarkerilor.

PHASE I

Biomarker
discovery

PHASE II

Targeted
Biomarker
Candidate
Validation

PHASE III

Targeted
Clinical
Validation

10s of samples

100s of samples

1000s of samples

1000s of analytes

10s of
100s
of analytes
samples

1-2 analytes

SELDI
LC/MS Profiling
2D Gels with MS
Isotopic labeling
reagents (iTRAQ)

Labeled
quantification
Western Blot
Multiple Reaction
Monitoring

Mass
Spectrometry
AntibodyMicroarrays

Neagu et al., Recent Patents on Biomarkers 2011

PHASE IV

Clinical
Application

ELISA based tests

Multiplex
Protein microarray

Perspective(optimiste)
Tehnologiile detiparraypentru detectia antigenului
vor inlocui traditionala ELISA,lasand locmultiplexarii
inclinica;
Tehnologiile pentru profilarea antigenului vor deveni
instrumente clinice valoroase inmonitorizarea
terapiei,diagnostic,prognosticsi orientarea
interventiei terapeutice incancer,maladii
autoimune,infectii Medicina Personalizata!

Va multumesc pentru atentie si

rabdare!