Sunteți pe pagina 1din 7

Pg 63

Msurarea digestiei i.....


Introducere
Endonucleotidele sunt enzime care recunosc secvene de nucelotide specifice din ADN dublu
catenar i sunt un instrument major al biotehnologitilor.Pentru celulele procariote, acestea
funcioneaz n natur ca sisteme de restricie i modificare i se va lipi de ADN-uri strine care
intr n celula bacterian, dar nu se va lipi de ADN-ul gazd care a fost protejat sau modificat
prin metilare. Majoritatea endonucleotidelor se vor lipi reproductiv de ADN la un anumit punct
ntr-o secven de recunoatere. n general, diferite enzime vor recunoate diferite secvene care
au lungimea de la 4 la 6 nucleotide. Aceast precizie este esenial pentru tehnicile de clonare
molecular, cum ar fi izolarea genelor din ADN-ul genomic sau inserarea unui ADN strin ntr-o
plasmid. Multe enzime produc secvene n zig-zag fa de axa de simetrie a secvenei lor de
recunoatere. Clivajele de acest tip vor aduce un beneficiu de 3 i 5 fragmente de ADNprelungiri sau capetele lipicioase care pot forma pereche cu fragmente de AND generate de
aceeai enzim i totui care s formeze molecule recombinate.

Pg 64
Alte enzime vor readuce adresa de recunatere la axa de simetrie pentru a produce
rezultate direct finisate. Acestea pot fi legate altor secvente direct finisate sau
terminate, indiferent de enzima de restricie utilizat. A dua tehnic introdus n
acest exerciiu este gelul de agarpz electroforez. Cnd agaroza este topit i
apoi rcit ntr-o soluie apoas, aceasta formeaz un gel prin legturi de
hidrogen. Populaia fragmentelor de ADN generate de restricia enzimelor va
trece printr-un mediu agarizat sub influena unui cmp electric, unde
moleculele de ADN ncrcate negativ vor fi atrase la anod. Rata lor de micare
se bazeaz aproape n ntregime pe mrime, moleculele cele mai mari avnd
mobilitatea cea mai mic. Concentraia de agaroz n gel determin mrimea
porilor iar fragmentul de ADN care are o anumie mrime va migra la rate
diferite prin geluri de concentraii variate.
Exist o relaie linear ntre registrul de mobilitate i concentraia gelului
peste un anumit interval de mrimi ale fragmentului, astfel c concentraia
gelului trebuie s fie aleas astfel nct s poat efectiv separa moleculele de
ADN din populaia de ADN. Gelul de agaroz 0,8% este potrivit pentru a separa
moleculele de ADN-ul linear, de mrime 0,5-10 kb.

Greutile moleculare ale fragmentelor cunoscute, cum ar fi phage cut, cu


restricia nucleotidei Hindill, poate s fie un punct de msurare mpotriva
mobilitii. Curba de etalonare care rezult poate fi folosit pentru a determina
greutile moleculare ale fragmentelor de ADN necunoscute. Ca o msur rapid,
greutatea molecular a unui fragment poate fi estimat prin comparaie direct
vizual la poziia de ~ fragmente pe gel. Benzile sunt vizualizate cu iluminaie
ultraviolet dup colorarea cu o vopsea fluorescent, bromur de etidiu. (Cantitatea
potrivit de ADN prezent n band poate fi estimat la fel de bine i prin
compararea intensitilor fluorescenei, la fel ca n Exerciiul 5, partea C).
Puritatea sau orice degradare a ADN-ului poate fi de asemenea determinat pe gel de agaroz.
Contaminarea cu ARN poate fi detectat ca un larg frotiu care ruleaz la o greutate molecular
mic. ARN-ul poate fi ndeprtat prin adiia de ribonucleotide la digestia restrictiv.
Contaminarea cu proteine poate rezulta prin inhibarea parial a activitii enzimelor restrictive
sau a degradrii ADN-ului. Contaminanii proteiformi pot fi eliminai prin extracia de
fenocloroform i ulterior, prin precipitaii de etanol. Excesul de sare ntr-un preparat plasmid
va inhiba de obicei activitatea enzematic

pg 65
de asemenea. Sarea poate fi eliminat prin precipitaii de etanol urmat de
splarea ADN-ului cu 70% etanol. Gelul de agaroz va arta dac plasmida digerat
d randamentul ateptat de la cunoscutele adrese de restricie din harta plasmidei.
Dac ADN-ul a fost degradat, de exemplu, prin contaminarea DN-ului, Adn-ul
va aprea ca un frotiu n gelul colorat.
n acest exerciiu vom folosi enzime restrictive i mini-geluri de agaroz ca un
instrument de diagnostic rapid pentru a determina mrimea i puritatea att a maxi
prep(aratelor) ct i a mini-prep(aratelor). n plus, cantitatea aproximativ de plasmid
ADN din mostre poate fi determinat prin compararea cu bandele luminoase (vezi
exerciiul 5, partea C).
Succesul de amplificare PCR a unei gene fragment lacZ, aa cum s-a ncercat n
exerciiul 7, va fi de asemenea evaluat n acest exerciiu.

Reactivi/materiale necesare:

Agaroz (Seakem, FMC Corporation)


Albumina seric bovin (BSA, 10mg/ml)
Ditiothreitol, 20x (DTD, 20mm)
Baloane Erlenmezer (250ml)
Bromur de etidiu (10mg/ml, vezi exerciiul 5)
Mnui
Ghea
Laboratorul de band
Marcatori de mrime Hindill, de concerntrare furnizate de fabricant
(~0,5/~g/ml)
Tuburi de microcentrifug (0,5ml)
Micropipetor i sfaturi
Pipeta pasteur
Probe de reacie PCR (de la exerciiul 7)
Folie de plastic
Film polaroid (tip 667)
pRY121 plasmid de ADN de la maxi-prep (de la Exerciiul 6)
pRY121 plasmid de ADN de la mini-prep (de la Exerciiul 4).

Pg 66
Restricie tampoane reacie enzim, 10x (a se vedea nota instructorului de
mai jos)

Restricii ale enzimelor: Hindill, Pstl, BamHI, EcoRI (n glicerol, disponibile


de la diveri productori, a se vedea apendicele 20)
Tampon stop: 200 mM EDTA (pH 8,0)
TEA tampon, 25x: Tris 1M, 15 mM EDTA, 125 mm acetat de sodiu, pH 7,8
La 750 ml de H2O distilat de adaug 121 g de baz Tris, 10,2 g de acetat de
sodiu, 18,6 g de EDTA. Ajusteaz PH-ul la 7,8 cu acid acetic glacial i adu
volumul la 1 litru. Pstreaz la 4 grade.
Urmrire vopsea, 6x (a se vedea nota instructorului, mai jos)
Containere Tupperware (sau echivalent) pentru colorare.

Echipament
Bloc de cldur la 65 de grade
Aparate orizontale de electroforare n-cu gel (a se vedea nota instructorului
de mai jos)
Filtru Wratten KodaK 22A

Microcentrifug
Cuptor cu microunde sau arztor Bunsen
Camer Polaroid MP-4
Putere capabil s transporte cel puin 100 de voli de aprovizionare
Transiluminator ultraviolete (UV)
Baie de ap la 37 de grade
Baie de ap la 45 de grade.

Notele instructorului
1. 1. Pregtirea de urmrire a soluiei colorate: Pentru 100 ml de stoc 6x soluie,
se adaug 40 g de zaharoz la 60 ml ap distilat. Adaug 250mg de albastru de
bromfenol. Se amestec prin agitare pentru 15+20 de minute. A se pstra la 4 grade
C. Aceast soluie colorat 6x se adaug la esime din volumul final al soluiei de
ADN pentru a fi supus electroporezei.
2.
2. Atunci cnd achiziionai un aparat de electroforez orizontal gel,
instructorul ar trebui s ia n considerare numrul de probe sau mostre care
urmeaz s fie prelucrate.

Pagina 67

n acest exerciiu. Muli productori vnd aparate sufie (a se vedea Appendix 20)
Procedura:
1.
Urmtoarele orientri sunt folosite pentru a pregti ADN-ul
plasmidic pentru restricia digestiei:
a.
Determin cantitatea de ADN pentru a fi digerat (de exemplu,
1~g).
b.
Pe baza de concentrare a stocului (uniti pe microlitri) de
endonucleaze de restricie, calculeaz micrilotrii de enzim necesari
pentru a atinge digestia din cantitatea dorit de ADN. Pentru acest
experiment, 2 uniti de enzim sunt suficiente pentru a digera 1/.~g
de plasmid ADN. (Not: 6 uniti // g~ este regula degetului
mare pentru digestia de AND cromozomial). Pentru ca folosirea
excesului de enzyme s asigure digestia complet, stocul de producie
este adugat ca furnizor i fr diluare.
c.
Determinai volumul total de reacie de digestiv pentru a atinge
un volum adecvat, n care coninutul de glicerol n reacie va fi mai
mic sau egal cu 50% (v/v)glicerol, astfel nct A1:10 diluarea enzimei
din amestecul reaciei finale s fie suficient.

d.
Pe baza acestui volum total de reacie, calculeaz ct de mult
tampon 10x i 20x DDT (dac este necesar) este necesar pentru a
obine 1x o concentraie final a acestor reactivi n amestecul reaciei.
Tamponul folosit este dependent de concentraia de sare la care
enzima este activ optim. Tamponul corespunztor (sczut, mediu sau
ridicat) este furnizat de ctre productor.
e.
Pentru unele enzyme de albumin seric bovin (BSA) este
necesar ca un stabilizator pentru o digestive optim. BSA este
deseori furnizat ca o soluie 100x stoc la 10mg/ ml i ar trebui s fie
adugate reaciilor pentru o concentraie final de 0,1mg/ml. Este
convenabil s fie pregtit o soluie de lucru 10x pentru acest PUR
(din pagia anterioara-ultima propozitie)
a.
Este convenabil s fie pregtita o soluie de lucru 10x pentru
acest scop.
Este prudent s se verifice dac o enzim necesit BSA sau nu nainte de digestie.
n cazul n care se adaug BSA, o cantitate comparabil de H2O distilat trebuie s
fie reinut de reacia amestecului.
Calculai volumul de H2O distilat necesar pentru adaptarea volumului de reacie la
volumul final dorit. A se vedea eantionul ntabulat (Tabelul 8.1) pentru un
exemplu de cum o astfel de reacie poate fi pregtit i corespunztor ntregistrat
ntr-un caiet.
Tub-1
Concentraia de ADN- 0,5 ug/ul
Solutie de ADN pentru a da 1 ug deADN: 2 ul 00
Enzime si concentratie de enzime

Enzime si concentratie de enzime: ECO RI #61121: 10U/ul


Solutie enzime dau 2u de ADN per microgram: 1 ul din 1:5 diluare
10x tampoane (concentratia sarii): 2ul (mediu)
10 xBSA: 2 ul
Apa distilata: 13 ul
Volum total: 20ul.

(!!! Nota de la mine, Delia: u= miu, stii tu semnul acela! in


loc de u-urile puse de mine in bold, pune tu acel simbol!
Plus ca eu nu am mai facut tabel, asa cum era in text, ci am
enumerat, asa cum vezi mai sus!)
2. Calculeaza sumele de ingrediente pentru a fi utilizate in fiecare dintre
urmatoarele restrictii digestive:
(1)pRY121 (mini-prep0 t[iat cu BamHI, (2)pRY121 (maxi-prep) taiat cu Hindill,
(3)pRY121 (maxi-prep) taiat cu EcoRI, (4)pRY121 (maxi-prep) taiat cu Pstl si
(5)pRY121 (maxi-prep), taiat cu BamHI.

Nota instructorului:
Producatorii vor furniza un tampon recomandat cu enzima. Alternativ, acestea
tampoane 10x (denumit in cintinuare sare scazuta, medie sau mare) pot fi pregatite
in conformitate cu specificatiile producatorului si stocate in parti alicote de 1,5ml
la 20 de grade. Untampon universal potrivit pentru.. (pana aici am tradus!
Adica pana la sfarsitul paginii 68)