Sunteți pe pagina 1din 8

Lucrarea de laborator Nr 4

1.Actiunea factorilor fizici si chimici asupra organismelor


Factorii fizici:
Temperatura are o mare influen asupra proceselor fiziologice ale celulei microbiene
deoarece stimuleaz sau inhib activitatea echipamentului lor enzimatic.
n funcie de temperaturile posibile ale mediului natural i ca rezultat al adaptrii, diferitele
specii de microorganisme prezint urmtoarele temperaturi:

temperatura minim temperatura la care mai poate avea loc creterea, n schimb
dac temperatura scade sub valoarea minim, creterea este oprit;
temperatura optim temperatura la care rata specific de cretere este maxim;
temperatura maxim - temperatura la care creterea este nc posibil dar prin
depirea acesteia efectul devine letal.

Umiditatea
Viaa microbian este posibil numai cnd n mediul nutritiv exist ap liber care particip
ca solvent, ca mediu de reacie pentru enzimele celulare i pentru transportul bidirecional al
produselor de metabolism. Dac coninutul de ap liber intracelular se reduce, celulele trec
n stare de preanabioz, continuat cu anabioz, n care enzimele trec n stare inactivat iar
metabolismul este mult redus
Microorganismele pot s-i refac structura iniial prin fotoreactivare cnd n prezena
luminii sunt activate enzimele care desfac dimerii timinei, sau la ntuneric cnd celula are
capacitatea de a elimina poriunea denaturat. n practic, radiaiile se pot folosi pentru
sterilizarea aerului i pentru obinerea de mutani valoroi performani prin produii lor de
biosintez.
Factorii chimici
Substanele chimice cunoscute prezint o mare diversitate de compoziie i se difereniaz n
funcie de efectul pe care l prezint asupra celulelor microbiene i anume:

efect stimulator , benefic n concentraii mici deoarece numeroase substane conin


elemente majore sau minore ce intr n componena compuilor celulari;

efect de stagnare a creterii (microbiostatic) ca rezultat al aciunii unor substane


asupra enzimelor microbiene cu rol n metabolismul celulei vii;

efect letal (microbicid) atunci cnd substana, n funcie de doz, conduce la


modificri ireversibile i dau distrugerea fizic a celulei sau inactivarea enzimelor,
asociat cu moartea fiziologic.

2.Notiunea de sterilizare,obiect steril si nesteril.Notiuni de aseptica si


antiseptica.
Sterilizarea este distrugerea completa a tuturor microbilor cu ajutorul metodelor
fizicce,chimice si mecanice.
Obiect steril obiect dezinfectat,prelucrat in urma procesului de sterilizare cu dezinfectant.
Obiect nesteril obiect care nu a fost sterilizat,nu a trecut procesul de sterilizare.
Antisepsia consta in aplicarea unor substante bactericide sau bacteriostatice in scopul
de a omori sau inhiba dezvoltarea florei patogene in plagi.
Asepsia cuprinde toate masurile care impiedica contaminarea cu agenti infectiosi a
unei plagi.

3.Metodele de sterilizare : fizica,chimica,mecanica.Notiunea de


dezinfectie.Substante chimice utilizate ca dezinfectante.Controlul
eficientei sterilizarii.
1.1. STERILIZAREA PRIN CALDURA USCATA
Caldura uscata omoara microorganismele prin oxidarea distructiva a componentelor
celulare. Cei mai rezistenti spori sunt distrusi de caldura uscata la 160 0C, timp de 60 minute.
Caldura uscata de 1000C distruge in 60 de minute bacteriile care sunt omorate prin caldura
umeda la 600C in 30 minute. Sporii fungilor sunt distrusi in 60 de minute la 115 0C, iar cei
bacterieni la temperaturi cuprinse intre 120-l60 0C. In laboratorul de microbiologie se utilizeaza
urmatoarele tehnici de sterilizare: incalzirea la rosu, flambarea, sterilizarea la pupinel si
sterilizarea cu raze infrarosii.
- Incalzirea la rosu in flacara a obiectelor se aplica anselor bacteriologice in laboratorul de
microbiologie.
- Flambarea (trecerea prin flacara pentru cateva secunde) se aplica gatului baloanelor,
eprubetelor dupa deschidere si inainte de inchiderea lor, pipetelor inainte de utilizare pentru a
preveni contaminarea cu germenii din aer. Se mai sterilizeaza prin flambare instrumente de
mica chirurgie, dupa ce se stropesc cu alcool, dar temperatura produsa nu este suficient de
inalta pentru a asigura o sterilizare optima.
- Sterilizarea la pupinel. Pupinelul sau cuptorul cu aer cald este o cutie metalica cu pereti
dubli intre care se gaseste un strat de azbest care impiedica pierderile de caldura. Mai este
prevazut cu o sursa de caldura care este energia electrica si un termoregulator. In interior
pupinelul este prevazut cu rafturi pentru obiectele de sterilizat. Temperatura de sterilizare la
pupinel este de 1600C timp de 1 ora sau de 180 0C timp de de ora. La pupinel se
sterilizeaza intreaga sticlarie de laborator, instrumentarul de stomatologie, seringi fara

armatura metalica, pudre, uleiuri etc. Pupinelul nu trebuie sa fie supraincarcat, pentru ca
aerul sa poata circula nestingherit printre obiectele de sterilizat.
- Sterilizare cu raze infrarosii este folosita pentru sterilizarea seringilor fara armatura
metalica la o temperatura de 1800C. Sterilizarea se poate efectua si la 200 0C in vid,
aplicandu-se instrumentelor chirurgicale.
1.2. STERILIZAREA PRIN CALDURA UMEDA
Caldura umeda este mai eficienta decat caldura uscata, distrugand bacteriile la o
temperatura mai scazuta si in timp mai scurt. Formele vegetative ale majoritatii bacteriilor,
fungilor si virusurilor animale sunt omorate de caldura umeda in 10 minute la temperaturi
cuprinse intre 500C (Neisseria gonorrhoeae) si 65 0C (Staphilococcus aureus). O
susceptibilitate deosebita fata de caldura o prezinta Treponema pallidum, care este distrusa
in 10 minute la 430C. Rezistenta maxima la caldura umeda o are, insa, Bacillus
stearothermophylus, a carui forma vegetativa se poate multiplica la 80 0C. O parte
din virusurile animale au o rezistenta crescuta fata de caldura umeda, ca, de pilda, virusul
poliomielitic care este inactivat la 600C dupa 30 de minute si virusul hepatitei B care, daca se
afla in ser, rezista 10 ore la 60 0C. Multi bacteriofagi au o rezistenta mai mare la caldura
umeda decat bacteria gazda, aceasta fiind distrusa la 60 0C in 15-30 de minute, iar
bacteriofagul la temperaturi cuprinse intre 65-80 0C.
Formele sporulate ale actinomicetelor, ciupercilor si a fungilor sunt mai rezistente
decat formele vegetative, dar nu atat de rezistente ca si sporii bacterieni.
Rezistenta sporilor bacterieni variaza la diferite specii, dar chiar si intre tulpinile
aceleiasi specii. Astfel, majoritatea sporilor de Cl. tetani sunt distrusi prin fierbere la 100 0C in
10 minute, dar s-au semnalat tulpini ai caror spori rezista la fiebere 1-3 ore, fiind cei mai
rezistenti patogeni ce pot infecta o plaga. Rezistenta lor determinastandardele minime
pentru sterilizarea chirurgicala: 10 minute la 121 0C sau 30 de minute la 115 0C fara a
socoti timpul de incalzire. Unii spori de Cl. botulinum rezista la fierbere la un pH de 7 pana la
8 ore, iar la autoclavare 10-40 minute la 1150C.
Omorarea microorganismelor prin caldura umeda se produce prin coagularea
proteinelor structurale si inactivarea enzimelor, cu participarea apei. Cei mai rezistenti
spori sunt distrusi prin expunere la caldura umeda la 121 0C timp de 30 de minute.
- Fierberea este de fapt o metoda de dezinfectie deoarece ea nu distruge toate formele
sporulate. Se efectueaza la 1000C timp de de ora si se aplica siringilor si instrumentelor de
mica chirurgie atunci cand nu este posibila alta metoda. Fierberea se mai foloseste in
epidemii la sterilizarea apei.
- Pasteurizarea a fost introdusa de Pasteur pentru conservarea vinului, fiind utilizata si acum
pentru sterilizarea unor alimente lichide care nu suporta temperaturi prea ridicate (lapte,
bere, sucuri de fructe). Metoda consta in incalzirea lichidului: la 62 0C pentru 30 de minute
(pasteurizare joasa), la 710C timp de 15 minute (pasteurizare medie), la 80-850C timp de 3-5
minute (pasteurizare inalta ) sau introducerea unor vapori filanti la o temperatura de 130l500C sub presiune pentru cateva secunde (ultrapasteurizare). Pasteurizarea este o metoda
eficienta deoarece bacteriile patogene care se pot dezvolta in lapte (Mycobacteium
tuberculosis, Salmonella, Streptococcus si Brucella) nu sunt bacterii sporulate, numarul lor

reducandu-se dupa pasteurizare cu 97-99%. Coxiella burnetii nu este distrusa prin


pasteurizare joasa.
- Tyndalizarea consta in incalzirea produsului de sterilizat 3 zile la rand, in baie de apa
la 56-l000C cate o ora. Temperatura se alege in functie de produsul de sterilizat. Metoda se
aplica lichidelor care nu suporta temperaturi ridicate, ca de exemplu:vaccinuri, medii de
cultura ce contin zaharuri in concentratie mare, proteine, gelatinaetc. Formele vegetative sunt
distruse in prima zi, iar sporii se transforma in forme vegetative ce vor fi distruse zilele
urmatoare. Reamintim, insa, ca sporii bacteriilor termofile nu se distrug prin aceasta metoda.
- Autoclavarea este metoda folosita pentru instrumentarul de chirurgie iar in laboratoarele
de microbiologie pentru sterilizarea mediilor de cultura si a materialului infectios. Sterilizarea
are loc intr-o atmosfera saturata de vapori de apa la 1200C, la o presiune de 1 atm, timp de
30 de minute, in aparate speciale numite autoclave.
Dezinfectia este procesul de inactivare a microorganismelor de pe suprafete.
Dezinfectantul este o substanta (agent) folosita pentru inactivarea microorganismelor de pe
unele suprafete (mese, podele), dar care, datorita toxicitatii sale marcate, nu poate fi aplicat
in tesuturi umane.

4.Metabolismul microbian.Particularitatile.Enzimele
bacterine.Clasificarea.Rolul
Particularitile metabolismului bacterian:
1. Este un metabolism necompartimentat , toate
procesele metabolice se desfoar intr-o singur
celul
2. Este foarte flexibil, realizndu-se prin diverse ci
metabolice (bacteriile se adapteaz rapid la
condiiile mediului)
3. Este foarte intens (viteza reaciilor este mare)
4. Produsele intermediare din procesele catabolice
pot fi utilizate direct n calitate de precursori
pentru reaciile anabolice (amfibolism)
n toate reaciile metabolice intervin catalizatori
proteici specifici - enzimele
Enzimele bacteriene. Caractere generale:
- Substane proteice
- Active n limite largi de temperaturi (0-65 C)
i de pH (2-9)
- Specificitate de substrat i de aciune
(reacioneaz cu un substrat cataliznd un
tip de reacie)
- Specificitatea este determinat de centrul
activ al enzimei, complementar cu
receptorul de pe substrat
- Nu se modific n cursul reaciei
Clasificarea enzimelor
I. Constitutive (permanente)
II. Inductive (adaptive), se sintetizeaz n prezena

substratului (ex.: lactaza)


III. Represive, sinteza lor este inhibat de acumularea n
exces a produsului reaciei catalizate
VI. Dup locul de aciune (exoenzime, endoenzime)
V. Dup tipul reaciei catalizate (oxido-reductaze, hidrolaze,
transferaze, liaze, izomeraze, ligaze)
VI.Dup impactul asupra macroorganismelor:
- Enzime metabolice
- Enzime de patogenitate, responsabile de modificri
patologice ale esuturilor, celulelor ma/o : hialuronidaza,
colagenaza, plasmocoagulaza, hemolizina.
Importana practic a studierii enzimelor
1. Rol n identificarea i clasificarea
bacteriilor (enzimele determin activitatea
biochimic specific a bacteriilor)
2. Unele substane chimice, antibiotice
interfereaz cu activitatea unor enzime,
inhibnd creterea bacteriilor (tratament)
3. Determinarea mecanismelor patogenezei
infeciilor (unele enzime sunt responsabile
de producerea leziunilor n esutul gazdei)
4. Aplicarea industrial a enzimelor

5.Temperatura optima de dezvoltare a


microorganismelor.Clasificarea bacteriilor in functie de
temperatura.
Temperatura de cretere
Exist temperaturi minime, maxime i optime
de dezvoltare a bacteriilor. n raport cu
temperatura optim deosebim:
1. Bacterii psichrofile t optim 10-20 C.
Cresc i la 0 C.
2. Bacterii mezofile optimum 30-37 C
(limite 15-45 C)
3. Bacterii termofile optimum 50-60 C
(pn la 95 C)
4. Bacterii hipertermofile (cresc la 70110 C)

6.Mediile de cultura si cerintele fata de ele.Clasificarea


Mediile de cultur soluii sau substrate solide
care asigur nutrienii i condiiile fizico-chimice
necesare cultivrii bacteriilor. Ele pot fi utilizate
pentru cultivarea (izolarea) bacteriilor, testarea
sensibilitii la antibiotice, stocarea sau transportul
culturilor bacteriene.

Cerinele fa de mediile de cultur


- S asigure necesitile nutritive i energetice ale
bacteriilor
- Umiditate optimal
- pH optimal (7,2-7,4) i constant (caracter de
tampon)
- Potenial de oxido-reducere optimal (anaerobi rH2<5, aerobi rH2>10)
- S fie izotonice (0,5% NaCl)
- S fie sterile i transparente
CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTUR
Dup provenien
1. Empirice, naturale. Au la baz produse de
origine animal sau vegetal (snge, ser,
lapte, ou, cartof, extracte din carne, cord,
creier, ficat, pete, levuri, etc). Compoziia
lor chimic precis nu poate fi controlat
2. Sintetice includ ingrediente chimice pure,
compoziia chimic este cunoscut cu
exactitate
3. Semisintetice
Dup consisten
1. Medii lichide (bulion) utilizate pentru
obinerea biomasei bacteriene i a
produselor lor (antibiotice, enzime, toxine)
2. Medii solide conin 10-15% gelatin sau 2-3%
agar-agar (polizaharid extras din alge roii, t
topire 80-100 C, solidificare 42 C). Placa de
geloz n cutii Petri este utilizat pentru
izolarea culturilor pure, geloza nclinat (n
pant) pentru acumularea culturilor pure
3. Medii semisolide 0,2 0,5 % agar-agar. Se
utilizeaz pentru studierea activitii
biochimice sau a mobilitii bacteriilor.
Dup compoziia chimic (complexitate) i
destinaie
A. Medii uzuale (universale, simple)
1. Ap peptonat (ap+1% pepton+0,5%
NaCl)
2. Bulion peptonat BP (extract apos din carne
+ 1% pepton+0,5% NaCl)
3. Geloza nutritiv (BP + 2-3% agar-agar)
4. Gelatina nutritiv (BP + 10-15% gelatin)
Sunt utilizate pentru creterea bacteriilor
nepretenioase la cultivare
Sterilizarea prin autoclavare: 120 C, 20 min

7.Cultivarea bacteriilor.Tehnici de insamintare.


Pentru cultivarea bacteriilor o cantitate mic
de material ce conine bacterii (inoculum) se
ntroduce ntr-un mediu de cultur
(nsmnare, inoculare), care ulterior va fi
incubat n termostat (pentru asigurarea
temperaturii optime).
n timpul incubrii (18-24-48 ore..) bacteriile
cresc i se divid, formnd o cultur
bacterian (totalitatea bacteriilor acumulate
prin multiplicare intr-un mediu).
M.tuberculosis 3-5 sptmni
V.cholerae 6-12 ore

8.Studiul caracterelor biochimice ale bacteriilor


STUDIEREA ACTIVITII
BIOCHIMICE A BACTERIILOR
1. Activitatea zaharolitic (irul Hiss, coagularea
laptelui, etc)
2. Activitatea proteolitic
- Degradarea proteinelor native (lichefierea
gelatinei sau a serului coagulat, peptonizarea
laptelui, etc)
- Evidenierea enzimelor ce intervin n
degradarea AA (decarboxilaze, dezaminaze,
desulfhidraze, etc) cu detectarea produsele
finale ale descompunerii AA: H2S, NH3
, indol,
Depistarea producerii H2S: formarea sulfurii
de fer de culoare neagr n mediile
multitest Kligler, Olkeniki, etc; plasarea
unei benzi de hrtie de filtru mbibat cu
acetat de Pb deasupra BP n care crete
cultura studiat (formarea sulfurii de Pb
nnegrete hrtia)
Depistarea indolului (produs al hidrolizei
triptofanului) benzi de hrtie mbibate cu
acid oxalic. n prezena indolului indicatorul
vireaz n roz.
Depistarea amoniacului (ureaza) hrtia de
turnesol se coloreaz n albastru.
Depistarea catalazei (H2O2
.... H2O + O2
)
(cultura se amestec cu o pictur de ap oxigenat
apariia bulelor de gaz)
Depistarea oxidazei (detectarea prezenei citocromoxidazei
din lanul respirator)

Reactiv di (tetra)metil-parafenilen-diamin (benzi sau


rondele de hrtie mbibate cu reactiv, creioane, etc)
Oxidarea reactivului culoare violet-neagr
Oxidazo+ : Neisseria, Vibrio, Pseudomonas
Oxidazo- : Enterobacteriaceae
Depistarea lecitinazei mediu cu glbenu de ou 10% formarea unui halou opac n jurul coloniilor
Depistarea lipazei mediu cu Twin 80 1% halou opac n
jurul coloniilor (precipitarea acizilor grai)
Depistarea hemolizinei geloz-snge 5-10% - zon clar n
jurul coloniei
Depistarea ADNazei, fosfatazei, etc
Probele sunt incubate la 37 C, 18-24 h