Tehnica PCR

PCR (polymerase chain reaction - reacia n lan a polimerazei) este o tehnic de

biologie molecular ce permite amplificarea (clonarea) in vitro a unui fragment specific de
ADN. Prin aceast metod se poate amplifica de pn la 109 ori orice fragment de ADN dorit
i nu este necesar separarea prealabil a acestuia de restul ADN-ului din prob. Tehnica PCR
este foarte sensibil: poate s detecteze i s amplifice chiar i o singur molecul de ADN
din orice tip de prob biologic. Tehnica a fost a fost inventat de ctre Kary Mullis n 1984,
cruia i s-a acordat premiul Nobel pentru chimie n anul 1993.
Pentru ca un fragment de ADN s poat fi amplificat, nu este necesar cunoa terea
ntregii sale secvene, ci doar a secvenelor de 20-30 nucleotide de la extremit ile sale.
Aceste secvene cunoscute sunt folosite pentru a proiecta dou oligo-dezoxinucleotide
sintetice, fiecare fiind complementar cte uneia din cele dou catene ale dublului helix
ADN, la nivelul celor dou extremiti ale fragmentului care urmeaz a fi amplificat. Aceste
dou oligonucleotide servesc ca primeri (amorse) pentru sinteza de ADN in vitro i ele
determin extremitile fragmentului de ADN care va fi obinut n urma amplificrii.
Etapele amplificrii prin PCR
Tehnica PCR presupune parcurgerea a trei etape succesive, care se repet ciclic de 2535 de ori. Acestea au loc ntr-un termociclor automat, care poate nclzi i rci tuburile
coninnd amestecul de reacie ntr-un timp foarte scurt. Amestecul de reacie cuprinde proba
biologic ce conine ADN-ul de interes, perechea de primeri, cei patru dezoxiribonucleozid
trifosfai (dNTP), ioni de Mg2+ (MgSO4 sau MgCl2) i o ADN polimeraz termostabil.
Etapele amplificrii PCR sunt:
1. Denaturarea
Are loc la temperatura de 940C i const n separarea celor dou catene ale ADN
dublu helicoidal, datorit ruperii legturilor de hidrogen dintre bazele azotate complementare.
2. Hibridizarea (annealing)
Aceast etap are loc la o temperatur cuprins ntre 50-60 0C. Scderea temperaturii
permite celor doi primeri s hibridizeze la nivelul secvenelor complementare din cadrul
ADN genomic: ei scaneaz toat lungimea acestuia, iar acolo unde gsesc o secven de
ADN complementar se fixeaz prin legturi de hidrogen. Unul din primeri hibridizeaz la
captul 3 al uneia din cele dou catene ale ADN-ului int, iar cellalt primer la captul 3 al
catenei complementare. Primerii conin, n general, 20-30 nucleotide.
3. Extensia (elongarea, sinteza ADN)
Are loc la o temperatur cuprins ntre 68-720C. n prezena celor patru dNTP i a
unei ADN polimeraze termostabile, are loc sinteza selectiv a regiunilor de ADN situate ntre
secvenele de ADN la care au hibridizat primerii. Fiecare primer este elongat n direcia
53, pe baza complementaritii cu catena matri.
Principala ADN polimeraz termostabil utilizat pentru amplificarea PCR este Taq
polimeraza, extras din bacteria termofil Thermus aquaticus.
Cnd succesiunea celor trei etape este repetat, fragmentele nou sintetizate servesc ca
matrie la rndul lor, iar dup cteva cicluri produsul predominant este o specie unic de
fragmente de ADN a cror lungime corespunde distanei dintre cei doi primeri utilizai. n
practic, pentru amplificarea eficient a ADN, sunt necesare 25-35 cicluri de reacie, fiecare
cuprinznd cele trei etape de denaturare, hibridizare i sintez a ADN. Fiecare ciclu dubleaz
cantitatea de ADN sintetizat n ciclul anterior, deci are loc o cretere exponenial a
numrului de copii ale fragmentului de interes, ajungndu-se la o amplificare de 10 6-109 ori,
1

n funcie de numrul de cicluri. Durata unui ciclu este n jur de 5 minute, astfel nct tehnica
PCR permite amplificarea ADN n decurs de dou-trei ore, comparativ cu cteva zile
necesare pentru metodele de clonare standard, cu ajutorul bacteriilor.

Dup terminarea amplificrii, ampliconul (produsul PCR) este supus migrrii

electroforetice n gel. Electroforeza ADN se realizeaz, n general, n gel de agaroz.
Moleculele de ADN, avnd o ncrcare negativ conferit de gruprile fosfat ionizate, vor
migra spre anod pe o distan variabil, n funcie de talia lor molecular: moleculele mai
lungi migreaz cu o vitez mai mic (deci pe o distan mai mic ntr-un interval de timp dat)
fa de moleculele mai scurte, deoarece ntmpin o rezisten mai mare la trecerea prin porii
gelului de agaroz.
Electroforeza ADN se poate realiza i n gel de poliacrilamid, n cazul moleculelor
mai mici de 500 perechi de nucleotide, acest suport avnd o rezoluie mai bun i permi nd
separarea moleculelor care difer ca lungime printr-un singur nucleotid.
Pentru a putea vizualiza benzile de ADN migrate n gel, ADN-ul este marcat cu un
colorant fluorescent n lumina UV i anume bromura de etidiu.
Electroforeza care urmeaz unei amplificri PCR permite verificarea ctorva aspecte,
care trebuie s fie cunoscute nainte ca ampliconul s fie utilizat pentru investigaii ulterioare:
- verificarea formrii produsului PCR (deci reuita amplificrii);

- verificarea dimensiunii ampliconului, care corespunde distanei dintre secvenele

ADN la care hibridizeaz cei doi primeri utilizai la amplificarea PCR; aceasta se realizeaaz
prin compararea cu o scar etalon (amestec de fragmente de ADN de mrimi diferite
cunoscute, care sunt migrate n acelai timp cu ampliconul).
Utilitatea tehnicii PCR
PCR a devenit o tehnic larg utilizat pentru o varietate de aplicaii n domenii
diverse. Cteva dintre acestea sunt:
1. Diagnosticul medical
- diagnosticul molecular: tehnica PCR permite amplificarea unui fragment int dintro anumit gen, n vederea investigrii ulterioare, prin diverse tehnici (ex. digestie cu
endonucleaze de restricie, secvenare) a unor mutaii asociate cu diverse boli genetice;
- depistarea precoce a unor forme de cancer, prin detectarea mutaiilor n genele care
controleaz ciclul celular i repararea ADN, responsabile de apariia cancerului;
- detectarea bacteriilor i virusurilor cu ajutorul primerilor specifici (ex. virusul HIV
la pacienii care nu au dezvoltat un rspuns imun i nu pot fi detecta i prin cercetarea
anticorpilor anti-HIV, detectarea bacilului tuberculozei, care are o cretere lent pe medii de
cultur, etc); diferenierea tulpinilor patogene de cele nepatogene prin identificarea unor gene
specifice.
2. Secvenarea ADN, n diverse scopuri.
3. Tehnologia ADN recombinant, care implic inserarea unei secvene de ADN de la
un anumit organism ntr-un plasmid sau n materialul genetic al altui organism.
4. Determinarea nivelului de expresie al anumitor gene, prin PCR cantitativ (sau RTPCR PCR n timp real).
5. n medicina legal, criminalistic: tehnica PCR permite identificarea suspecilor
prin analiza ADN dintr-o prob biologic redus cantitativ rmas la locul crimei (fir de pr,
pictur de snge, etc.).
6. Paleontologia molecular: amplificarea i analiza ADN din probe prelevate din
organisme fosile umane sau animale vechi de mii de ani; acest lucru este posibil datorit
faptului c ADN este o molecul remarcabil de stabil n timp.