Sunteți pe pagina 1din 55

IZOLAREA VIRUSURILOR IN

CULTURI CELULARE

EFECTE CITOPATICE

AVANTAJE / DEZAVANTAJE ALE


SISTEMELOR DE IZOLARE VIRALA

AVANTAJE

DEZAVANTAJE

ANIMAL DE LAB Infectie naturala

Cost / etica

O.G.E.

Cost

Susceptibilitate
limitata

CULTURI DE
CELULE

Sensibilitate buna
/ disponibilitate

Susceptibilitate
variabila

Componentele culturilor de celule: Celule dispersate+ mediu nutritiv

Mediu nutritiv

solutie salina tamponata - Earle, Hanks


substane nutritive (SFV, lizate proteice)- Serul fetal de vitel (SFV) contineo
serie de factori ce actioneaza pentru a stimula cresterea si diviziunea
celular (hormoni nonpeptidici, factori de adeziune ce intervin n atasarea
celulelor pe un substrat celular solid, factori de crestere) SFV este
adugat n proportie de 10% n mediul de cretere si 2-5% n mediul de
ntretinere
vitamine si aminoacizi eseniali
antibiotice i antifungice

Condiii necesare
Asespsie riguroasa
pH adecvat
Temperatur constant
atmosfer cu 5-10% CO2

CLASIFICAREA CULTURILOR DE CELULE


Culturi de organ
Culturi de celule dispersate
Culturi primare- pot fi mentinute n vitro timp
limitat (3-5 pasaje).
Tulpini celulare pot fi mentinute n vitro timp de
50-60 de pasaje. - Cariotipul cromozomial este cel
al tipului de origine - diploid - ceea ce certific
netumorigenitatea culturii
Linii celulare - CELULE TRANSFORMATE

CELULE TRANSFORMATE
1. conin gene implicate n imortalizarea n vitro (cultivare nr. infinit
pasaje) modificari cromozomiale => cariotip heteroploid

2. se multiplic haotic, cerine nutritive foarte sczute (se multiplic


la concentraii foarte sczute de SFV), glicoliza anaerob = sursa
principala de energie
3. membran celular modificat n compoziie (absena fibronectinei
=> independente de aderarea la un suport solid
4. nu au inhibitie de contact, se dispun dezordonat diferit de esutul
din care deriv
5. telomeraza activa
6. inoculate la animale, pot reproduce tumora de provenienta
7. modificarea morfologiei
8. au antigene de suprafa diferite codificate de virus sau de celulele
gazda=> neoantigene
9. aglutineaz uor cu lectinele (antigene vegetale)
10. modificarea mesagerilor secunzi (AMPc)

Echipament de laborator

Hote cu flux laminar pentru obtinerea, si


propagarea culturilor de celule si izolarea
virala

TIPURI DE EFECTE CITOPATICE


SINCITIAL: HIV, v rujeolos, VRS, herpes
PICNOTIC LITIC- enterovirusuri (v.
poliomielitice; v. Coxsackie; ECHO)

INCLUZIONAR- intranuclear,
intracitomplasmatic, mixt

EFECT CITOPATIC SINCITIAL

Celule normale

ECP picnotic litic

EFECT CITOPATIC
INCLUZIONAR
Intracitoplasmatic acidofil: v rabic, v vaccinal

Intranuclear

-acidofil: papovavirusuri
- bazofil: adenovirusuri

Mixt: v herpetice, v rujeolos

INCLUZII
CITOPLASMATICE
(RABIE)
patognomonic in SNC - CORPII
BABES NEGRI in cornul lui Ammon
si neuronii piramidali din cerebel

INCLUZII INTRANUCLEARE
(BOALA CU INCLUZII CMV)

INCLUZII
INTRANUCLEARE

IZOLAREA VIRUSURILOR IN
CULTURI CELULARE
EFECTE CITOPATICE

Direciile diagnosticului virusologic


1. Izolare virala in:
Culturi de celule
Ou de gaina embrionat
Animal de laborator

2. Detectia directa a :
Particulelor virale EM , IEM
Antigene virale ELISA, IF
Genom viral PCR; Rt-PCR

3. Teste Serologice:
a. Ac virus- specifici tip IgM
b. seroconversia in ac virus- specifici tip IgG

Izolare virala in:


Culturi celulare
OGE
animal de laborator

Alegerea sistemului de izolare


virala
AVANTAJE

DEZAVANTAJE

Animalul de
laborator

Infectie naturala Cost crescut

Oul de gaina
embrionat

Cost scazut

Culturi de celule Sensibilitate


buna,
disponibilitate

Susceptibilitate
variabila

Susceptibilitate
variabila,
Infectie
nenaturala

Animal Facility

from Stefan S. Nicolau Institute of Virology use

Techniplast Sealsafe technology


which combine the barrier at the cage level with a ventilation system controlled by a
microprocessor and HEPA filter decontamination. The system confer a double protection
barrier for the animals involved in experiments and human staff protection during
quarantine period.

Definitie culturi celulare


Metodologia propagarii in vitro a unui
fragment de tesut sau a unor celule
dispersate obtinute din tesuturi cu ajutorul
unor enzime proteolitice si introduse intrun mediu nutritiv capabil sa le asigure
homeostazia si proliferarea.

CLASIFICAREA CULTURILOR
CELULARE
CULTURI DE ORGAN = mentinerea in vitro a
unor fragmente de organ in vederea pastrarii arhitecturii
si functiei intacte a celulelor. Corona, rhinovirusurile nu
cultiva decat pe culturi de trahee

CULTURI DE CELULE DISPERSATE =


provin din disocierea tesuturilor intr-o suspensie de
celule prin tratare enzimatica asociata cu agitare
mecanica. Se clasifica dupa timpul de supravietuire in
vitro:
CULTURI PRIMARE
TULPINI CELULARE
LINII CELULARE

Culturi primare
Direct din dispersia enzimatica a unui tesut
proaspat recoltat
Formeaza monostrat
Celulele tind sa mentina caracteristicile
organului din care deriva
Pot apare proprietati de suprafata noi (devin
susceptibile pentru infectii virale noi) ex: v. polio
care nu creste in rinichiul de maimuta intact , dar
creste si distrugeaceleasi celule renale separate
si aderente la sticla
Se mentine in vitro timp limitat (3-5 pasaje)

Tulpinile celulare
Omogene, durata de viata 50-60 de
pasaje
V. respiratorii cresc foarte bine pe tulpini
derivate din piele, intestin si amigdale
Cariotipul cromozomial este cel de origine
diploid
Pot fi utilizate in producerea de vaccinuri
virale si pentru diagnosticul virusologic

Liniile celulare
Populatii de celule derivate dintesut
normal sau malign ce pot fi subcultivate un
timp nelimitat
Au caracter heteroploid (numar variabil de
cromozomi)
Nu pot fi folosite in producerea de
vaccinuri din cauza instabilitatii genomului.

Culturile de celule dispersate


componente

Celule vii dispersate


Mediu nutritiv

reflecta tesutul de provenienta


TESUT EMBRIONAR
TESUT ADULT
TESUT TUMORAL

MRC-5
fibroblast
(Prod. No. 84101801-1vl)

Hela
epithelial
(Prod. No. 93021013-1vl)

Culturile de celule dispersate


componente

Celule dispersate
Mediu nutritiv

Sruri tamponate izotone Earle: 1)NaCl; 2) KCl; 3)MgSO4; 4)CaCl2; 5)


NaH2PO4 6) D-glucoz;

Sruri tamponate izotone Hanks: 1)NaCl; 2)KCl; 3)MgCl2 ;

4) MgSO4;

5) CaCl2; 6) KH2PO4; 6) Na2HPO4; 8) D-glucoz;

Substante nutritive: Aminoacizi eseniali:


1) L-arginin; 2) L-cistin; 3) L-fenilalanin: 4) L-glutamin; 5) L-histidin; 6) Lizoleucin; 7) L-leucin; 8) L-lizin; 9) L-metionin; 10) L-tirozin; 11) Ltreonin; 12) L-triptofan; 13) L-valin.

SER DE VIEL 2-10%, n funcie de tipul de cultur folosit:


factori de cretere i factori de adeziune

Vitamine : 1) Colin HCl: 0,01g; 2) Acid folic: 0,01g; 3) Inozitol: 0,02 g; 4)

Nicotinamid: 0,01 g; 5) D-pantotenat de calciu: 0,01 g; 6) Piridoxal HCl: 0,01 g;


7) Riboflavin: 0,001 g; 8) Tiamin HCl: 0,01 g.

Antibiotice si antifungice: penicilin i streptomicin //


griseofulvina

SER DE VIEL 2-10%


pentru cultivarea celulelor renale de maimu si
liniei celulare ICRM23 se adaug 2% ser de viel,
pentru cultivarea celulelor de embrion de gin i
unele linii celulare (BSC, Vero, FL etc.), se
adaug 5% ser de viel,

pentru cultivarea celulelor embrionare de


hamster, rinichi de hamster, alte linii celulare (KB,
HeLa, Hep, etc.) se adaug 10% ser de viel.
De importan deosebit este calitatea serului de
viel utilizat, care trebuie testat n prealabil.

Condiii necesare pentru pstrarea


n via a celulelor din cultura
celular
pH adecvat
temperatur constant
atmosfer cu 10% CO2
condiii aseptice

ECHIPAMENTE
Diagram of microbiological
safety cabinet airflow patterns

Obtinerea unei culturi celulare


-se prelev esutul surs n condiii aseptice
- se fragmenteaz esutul n buci, se spal cu soluie salin tamponat
- disocierea enzimatic a celulelor: tripsinizarea n soluie de tripsin 0,25%

-suspendarea celulelor n mediu nutritiv


-controlul viabilitii celulelor cu coloraie vital albastru de tripan
- repartizarea celulelor in volume egale n flacoane de culturi celulare

-incubare n poziie culcat


- urmrirea formrii culturii cu microscopul invers

Subcultivarea culturilor celulare


Dup 5-7 zile de la realizarea culturii se epuizeaz substanele nutritive,
sursele de energie, se acidific mediul.
Pentru meninerea celulelor n via, acestea trebuie pasate, subcultivate.
Celulele se detaeaz de pe peretele flaconului cu soluie de tripsina si
EDTA , se centrifugheaz, se spal cu soluie salina tamponata i se
resuspendeaz n mediu nutritiv.
Se verific viabilitatea celulelor, se numr celulele i se ajusteaz la
concentraia optim.
Se repartizeaz volume egale n flacoane de cultur celular.

Culturile primare pot fi subcultivate de cteva ori, 3-5x.

Tulpinile celulare pot fi subcultivate de mai multe ori, 50-60x.

Liniile celulare pot fi subcultivate la infinit.

Culturi provenite din celule


- normale: celulele se ataeaz de peretele
flaconului, se multiplic pn acoper
peretele flaconului, realizeaz o cultur
monostrat
- tumorale: se multiplic i dup acoperirea
suprafeei disponibile, cresc n mai
multe straturi i n suspensie

CELULELE TRANSFORMATE
Sunt linii celulare care au suferit o modificare stabila, spontana
sau prin expunere la diferiti agenti (virali, chimici, radiatii),
modificare care este mentinuta indefinit prin cultivare in vitro
sau transplant in vivo.

Sunt morfologic distincte si se dispun dezordonat


Inoculate la animale produc tumori
Multiplica haotic: nu au inhibitie de contact, nu adera
la substratul de izolare
Cerinte nutritive mici, se divid la concentratii mici de
ser fetal de vitel
Prezinta antigene de suprafata diferite de celulele
normale
Prezinta modificari cromozomiale, cariotip aneuploid

Inocularea virusurilor n culturile celulare


Se arunca mediul nutritiv i se introduce suspensia
viral.
Incubare 1 or (adsorbtia virusurilor n celulele
receptive).
Se adaug mediu de ntreinere, se incubeaz.
n 3-5 zile apar modificrile survenite n cultura celular.

Izolare:
urmrirea efectelor citopatice = ECP

ECP
fara ECP

Vero

MA-104

Huh-7

pCMK

COS

MEK

EFECTE CITOPATICE
SINCITIAL: HIV, v rujeolos,
VRS

PICNOTIC LITIC:
enterovirusuri

INCLUZIONAR:
Intranuclear acidofil: papovavirusuri
Intranuclear bazofil: adenovirusuri
Intracitoplasmatic acidofil: v rabic, v
vaccina
Mixt: v herpetice, v rujeolos

ECP SINCITIAL

Binding

Reverse transcription

Fusion

Integration
Transcription

Endocytosi
s

Nuclear localization

Uncoating

Splicing

Lysosome

RNA export
Genomic RNA

Modification
mRNA

Translation

Assembly

Budding

Maturation

EFECT CITOPATIC SINCITIAL


(HIV)

SINCYTIA

INCLUZII
CITOPLASMATICE
(RABIE)
Sus - neuron fara incluzii Negri

Jos neuron cu incluzii Negri (col HE)

INCLUZII INTRANUCLEARE
(BOALA CU INCLUZII CMV)

HSV corpii Cowdry tip A

Infectia CU
adenovirusuri
se multiplica in nucleu
unde proteinele
capsidare, produse in
exces, formeaza
incluziile intranucleare

reovirus

HPV

ECP picnotic litic

Robert Hooke's microscope (1665)


- an engineered device used to study living systems.

An old pocket microscope