Sunteți pe pagina 1din 47

Diagnostic in infectia cu

virusuri gripale

Orientare clinica
febra (3-5 zile), mialgie, cefalee, astenie (>2
saptamani), tuse neproductiva, faringita, rinoree.

Gripa nu se diagnosticheaza
clinic!!!
Simptomatologie asemanatoare cu infectii determinate de:

Mycoplasma pneumoniae, adenovirusuri, virusul


respirator sincitial, rhinovirusuri, virusuri paragripale,
si Legionella spp.

Forma clinic

Etiologie viral Etiologie viral


comun
rar

Guturai,
Rhinofaringite

Rhino,
v. gripale,
coronavirusuri Enterovirusuri
(Cox)

LaringoVRS, V.
traheobronsite paragripale

Adeno-, v.
rujeolic

Bronsite

V. gripale

V. paragripale

Pneumonii

V. gripale,
SARS

V. gripei
aviare,
Micoplasme

DIAGNOSTICUL DE GRIPA

ETIOLOGIE
POSIBILA

Produs
Patologic

V GRIPALE
(A, B, C)

SNF (ENF)
ANF
ATB

IZOLARE

OGE
Culturi
celulare

Dg. DIRECT
=detectie
directa

Dg.
INDIRECT
=serologie

DA PCR
si IF

DA studii
epidemiolog
ice

Produse patologice :
a)Spalatura nazo faringiana (SNF) =
Exsudat nazo faringian
Recoltare.
N- tampoane sterile cu coada introduse in cornetul nazal inferior,
secretii de la nivelul peretelui posterior al nazofarinxului.
F - tampon prin cavitatea bucala pentru secretii de pe peretele
lateral/posterior al orofaringelui si din orice arie adiacenta cu
inflamatie, exudat sau ulceratie.
se evita atingerea tamponului de limba, obraji sau buze pentru evitarea
cotaminarii.
Stocare si transport.
optim imediat dupa recoltare (cand nu este posibil: -70 C, cu transport
pe zapada carbonica)
Prelucrare.
tamponul sau secretiile recoltate sunt dispuse intr-un tub steril cu circa
15 ml mediu minim o ora, timp necesar elutiei virusului. centrifugare
la 2500 - 15 minute, la 4 C. Supernatantul este indepartat si
sedimentul este resuspendat in 3-4 ml TFS sau mediu. In final
depozitul de celule reluat in TFS serveste pentru izolare virala sau
pentru efectuarea de frotiuri ce vor fi testate in imunofluorescenta.

Produse patologice :
a) exsudat nazo faringian
b) aspiratul nazofaringian se obtine folosind un
speculum nazal prin administrarea a 3 ml ser fiziologic in
nari cu o seringa atasata la un tub de plastic.

c) lavaj traheobronsic se obtine prin bronhoscopie


in conditii speciale de catre personal calificat.

Directii de diagnostic

IZOLARE OGE/ c.c.

DETECTIE RAPIDA RIF / Rt PCR

DIAGNOSTIC SEROLOGIC

Izolare virala
diagnostic de electie

1.-culturi primare de rinichi


de maimuta rhesus.
-linia continua epiteliala de
rinichi de caine
(MDCK).
2. pe OGE- 9-11 zile,
inoculat
intraamniotic
intraalantoidian.

V. GRIPAL ESTE NONCITOPATOGEN!!


HA - hemaglutinina
NA - neuraminidaza
Nucleocapsida helicoidala
ARNss
anvelopa

Tipuri v gripal: A, B, C

transcriptaza

Subtipuri: A(H1N1)
A(H3,N2)
Matrice

Dupa HA si NA
16 tipuri de HA
9 tipuri de NA

Demonstrarea izolarii v.gripale


pe culturi de celule - HEMADSORBTIE

48 ore dupa inocularea


v. gripal se incearca
detectia virusului prin
hemadsorbtie, obisnuit
cu eritrocite de cobai
Hematiile adsorbite
specific rozeteaza la
periferia celulelor
infectate.

DEMONSTRAREA PREZENTEI
VIRUSULUI IN OGE
REACTIA DE HEMAGLUTINARE -RHA

UHA

Etape:
Ag. viral - dilutii binare
suspensie de hematii

Se incubeaza la temperatura camerei - 30 minute


Martorul reactiei contine suspensie hematii
Rol RHA:
Demonstrarea prezentei virusului hemaglutinant
Titrarea antigenului hemaglutinant

IDENTIFICAREA V. GRIPALE
R. HEMAGLUTINO-INHIBARE
RHAI
Etape:

Ag. viral hemaglutinant


Dilutii binare din serurile imune de referinta
cunoscuti)-

60 min la 37C.
Sistem indicator - suspensia de hematii.
Se incubeaza 60 min la temperatura camerei

Reactia de identificare a virusurilor gripale

UHAI

(Ac antivirali

DIAGNOSTIC SEROLOGIC
RHAI = Tulpini de referinta + ser pacient

diagnostic retrospectiv,
recoltarea de probe de ser
pereche
cresteri semnificative (de
peste 4 ori) a titrului Ac
specifici
sau determinarea
rezultatului vaccinarii

OMS - Global Influenza


Surveillance Network
2012-2013 Emisfera de Nord
A / California/7/2009 (H1N1) -like virus;
A / Victoria/361/2011 (H3N2)-like virus;
B / Wisconsin/1/2010-like virus.

Reactia de Imunofluorescenta directa


(RIF)
test rapid, reproductibil, ieftin
detecteaza ANTIGENE VIRALE cu anticorpi marcati
cu fluorocromi
Anticorpi marcati cu

fluoresceina sau rhodamina

ID

PP

Reactia de Imunofluorescenta
(RIF)
Aplicatii DIAGNOSTIC IN
Infectiile herpetice
Infectiile respiratorii (Gripa)
Rabia

Teste moleculare

NAT (nucleic acid tests)


RT PCR
Swine flu real-time PCR kit
Quick Diagnosis of Flu Strains Possible with New
Microchip Test - FluChip,
Inexpensive Test Detects influenza Infections Quickly
and Accurately MChip
FDA Approves New Laboratory Test To Detect Human
Infections With Avian Influenza A/H5 Viruses (

DIAGOSTIC IN VIROZE
RESPIRATORII

VIROZE RESPIRATORII

Diagnostic in infectia cu
virusuri gripale

Orientare clinica
febra (3-5 zile), mialgie, cefalee, astenie
(>2 saptamani), tuse neproductiva,
faringita, rinoree.
Gripa nu se diagnosticheaza clinic.
Simptomatologie asemanatoare cu infectii determinate de:

Mycoplasma pneumoniae, adenovirusuri,


virusul respirator sincitial, rhinovirusuri,
virusuri paragripale, si Legionella spp.

ORTHOMIXOVIRUSURI-V. GRIPALE A, B, C
myxa-mucus

HA - hemaglutinina
NA - neuraminidaza
Nucleocapsida helicoidala
ARNss
anvelopa
transcriptaza

Matrice
tip A, B, C : NP, M
subtipuri: HA si NA 15 tipuri de HA si 9 de NA

Produse patologice :
a) spalatura nazo faringiana se obtine cu

ajutorul unor tampoane cu coada (sterile)


introduse in cornetul nazal inferior.
b) aspiratul nazofaringian se obtine folosind
un speculum nazal prin administrarea a 3 ml ser
fiziologic in nari cu o seringa atasata la un tub de
plastic.
c) lavaj traheobronsic se obtine prin
bronhoscopie in conditii speciale de catre personal
calificat
Pentru a mari sansa de izolare probele se recolteaza
in primele 72 ore de la debutul infectiei.

Produse patologice
Exsudat naso-faringian/SNF

Recoltare. tampon steril - recoltare secretii de pe peretele


posterior si lateral al orofaringelui si din orice arie adiacenta cu
inflamatie, exudat sau ulceratie. Se evita atingerea tamponului
de limba, obraji sau buze pentru evitarea contaminarii;
recoltarea nazala se obtine cu ajutorul unui tampon cu coada
introdus in cornetul nazal inferior.
Stocare si transport. Optim se inoculeaza imediat dupa
recoltare. Daca aceasta nu este posibil se ingheata la -70 C si
se transporta pe zapada carbonica
Prelucrare. Tamponul este dispus intr-un tub steril cu circa 15
ml mediu de transport pentru virusuri si 2% SFV minim o ora,
timp necesar elutiei virusului. Tubul se centrifugheaza la 2500
g, 15 minute, la 4 C. Supernatantul este indepartat si
sedimentul este resuspendat in 3-4 ml TFS sau mediu de
cultura. Spalarea celulelor se poate repeta pentru indepartarea
urmelor de mucus din secretii. In final depozitul de celule reluat
in TFS serveste pentru izolare virala sau pentru efectuarea de
frotiuri ce vor fi testate in imunofluorescenta cu intreaga baterie
de seruri antivirale disponibile.

Diagnosticul de laborator al gripei


Directii de diagnostic

Izolare virala + identificare

Detectie directa
antigene virale- RIF
acid nucleic- PCR

Diagnostic serologic

Izolare virala

diagnostic de electie

1.-culturi primare de rinichi


de maimuta rhesus.
-linia continua epiteliala
de rinichi de caine (MDCK
- Madin-Darby Canine
Kidney).
2. pe ou de gaina embrionat,
de 9-11 zile, inoculat
intraamniotic sau
intraalantoidian.

Hemadsorbtia

demonstreaza izolarea v.gripale


pe culturi de celule

Virusurile gripale nu sunt


citopatogene.
La 48 ore dupa inocularea v.
gripal se incearca detectia
virusului prin hemadsorbtie,
obisnuit cu eritrocite de
cobai la 4 C.
Hemadsorbtia rezulta din
incorporarea in membrana
plasmatica celulara a HA
virale. Hematiile adsorbite
specific rozeteaza la
periferia celulelor infectate.

Izolare virala

diagnostic de electie

1.-culturi primare de rinichi de


maimuta rhesus.
-linia continua epiteliala de
rinichi de caine (MDCK Madin-Darby Canine
Kidney).
2. pe ou de gaina
embrionat, de 9-11 zile,
inoculat intraamniotic
sau intraalantoidian.

Izolarea pe OGE

Izolarea se dem. prin proprieratea v.


gripale de a aglutina hematii

REACTIA DE HEMAGLUTINARE
Capacitatea unor virusuri de a aglutina
hematiile unor specii de animale
Virusurile care poseda capacitatea de a
aglutina hematii se numesc virusuri
hemaglutinante (rubeola, rujeola, urlian,
unele adenovirusuri, enterovirusuri, gripale
si paragripale)
Punerea in contact a unor dilutii succesive,
binare de antigen hemaglutinant cu
hematiile corespunzatoare virusului
incriminat

DEMONSTRAREA PREZENTEI VIRUSULUI


IN OGE
REACTIA DE HEMAGLUTINARE

UHA

Etape:
Ag. viral - dilutii binare
suspensie de hematii
Se incubeaza la temperatura camerei - 60 minute

Rol RHA:
Demonstrarea prezentei virusului hemaglutinant
Titrarea antigenului hemaglutinant inaintea reactiei de hemagutino-inhibare

CLASIFICAREA V. HEMAGLUTINANTE
I. HA structurala care distruge R
V gripale, paragripale

II. HA structurala care nu distruge R


Arbovirusuri, v rubeolos

III. HA non-structurala
poxvirusuri

IDENTIFICAREA V. GRIPALE
R. HEMAGLUTINO-INHIBARE
Tehnica reactiei:

dilutii binare din ser imun de referinta


ag. viral hemaglutinant - 60 min la 37C.
sistem indicator - suspensia de hematii.
Se incubeaza 60 min la temperatura camerei

Reactia de identificare a virusurilor gripale

UHAI

Diagnosticul de laborator al gripei


Directii de diagnostic

Izolare virala + identificare

Detectie directa
antigene virale- RIF
acid nucleic- PCR

Diagnostic serologic

Imunofluorescenta directa
test rapid, reproductibil, ieftin

Diagnostic rapid in
gripa,
infectie herpetica,
rabie.

Reactia de

Imunofluorescenta
directa

ID
PP

Amprenta se va usca bine:


pp. amprentat direct pe lama

Imersie in acetona la 2-8C timp de 10


minute si uscare.

Reactivii trebuie sa fie la temp.camerei


Incubare cu anticorp fluorescent (30 min la 37 C)
Spalare
Citire la MO in lumina UV
Anticorpi monoclonali marcati
cu ITCF
anti epitopi specifici de la
nivelul anvelopei,
ex. anti H1N1; anti H3N3

ID
PP

Diagnosticul de laborator al gripei


Directii de diagnostic

Izolare virala + identificare

Detectie directa
antigene virale- RIF
acid nucleic- PCR

Diagnostic serologic

Diagnosticul serologic
Necesita recoltarea de probe de ser pereche de la
acelasi pacient.
Nu se practica in mod curent decit in caz de epidemii,
pentru diagnostic retrospectiv.
Diagnosticul necesita demonstrarea unei cresteri
semnificative (de peste 4 ori) a titrului Ac
specifici antivirali intre proba de faza acuta, recoltata
la o saptamana de la debutul bolii si cea din
convalescenta, recoltata 2-3 saptamani mai tarziu.
Metoda preferata de evidentiere a anticorpilor anti
virali specifici este hemaglutinoinhibarea.

DIAGNOSTIC SEROLOGIC
RHAI = Tulpini de referinta + ser pacient

diagnostic retrospectiv,
recoltarea de probe de ser
pereche
cresteri semnificative (de
peste 4 ori) a titrului Ac
specifici

Pacient cu febra, cefalee, astenie,


tuse neproductiva. Ce produse
patologice utilizati?
Cum faceti diagnosticul rapid?
Pe ce substraturi se poate face
izolarea virala?
Este diagnosticul serologic de prima
intentie in aceasta viroza?

Precizati tipul de reactie reprezentata in sirurile de godeuri C, D, E


si principiul tehnicii.
Pentru ce viroze tehnica aceasta este de electie si ce simptome
clinice prezinta pacientul?

Precizati tipul de reactie si infectiile virale


care pot fi diagnosticate cu aceasta.

Cum demonstrati izolarea unui


virus hemaglutinant?
Cum se face identificarea
virusurilor hemaglutinante?