Caracteristici morfologice i schimbarea compoziiei chimice elementale de suprafa a

salivei umane cristalizate

G. ZEGANa, C. MUNTEANUb, D. CHICETc, C.G. DASCLUa, R. B. MAVRUa
Abstract
Experimentul nostru s-a focalizat pe identificarea morfologiei i compoziiei chimice
elementale de suprafa a cristalelor salivare obinute de la subiecii cu/far aparate ortodontice
sau coroane metalo-ceramice prin metoda SEM-EDS, pentru a testa influena acestora asupra
salivei. S-au identificat trei tipuri morfologice de cristale salivare cu aspecte particularizate,
formate din complexe chimice majoritare diferite: tipul I de aspect polyhedral regulated format
dintr-un complex K-Cl; tipul II de aspect ovoid irregular format dintr-un complex Na-O-Si; tipul
III de aspect ovoid luminescent format dintr-un complex P-O-K. Elementele chimice de suprafa
ale cristalelor salivare obinute nainte (control group), n timpul (study A group) i dup
ndeprtarea aparatelor ortodontice (study B group) au fost identice (cu excepia Zn) i au
provenit din compoziia ionic a salivei (Na, Mg, P, S, Cl, K i Ca). Prezena elementelor
metalice (Ni, Al i Zn) n cristale salivare la toate loturile studiate a artat c au existat mai multe
surse de eliberare ale acestor metale n saliv i s-au gsit diferene semnificativ statistice pentru
Ni ntre loturile study B and control group (p=0.021 Wt% and p=0.033 At%). Aparatele
ortodontice inserate n cavitatea oral au avut o durat limitat i nu a reprezintat sursa principal
de eliberarea a elementelor chimice metalice n saliv, iar influena lor asupra valorilor medii ale
Wt% i At% nu au fost semnificativ statistice (p>0.05). Astfel, studiul nostru arat c schimbarea
compoziiei chimice elementale de suprafa a salivei umane cristalizate se poate datora mediului
nconjurtor al vieii actuale.
Keywords: Salivary cristalls, Stainless steel, Nickel-Titanium, Orthodontic appliances,
SEM-EDS.
Introduction
Stainless steel (SS) i Nickel-Titanium (NiTi) alloys sunt cele mai utilizate materiale
metalice n dentistry, pentru avantajele lor mecanice i chimice [1]. Se cunoate faptul c SS alloy
conine 70-72% Iron (Fe), 18-19% Chromium (Cr), 8-12% Nickel (Ni) and Carbon (C) less than
0.2%, iar NiTi alloys conine 55% Ni, 43-44% Titanium (Ti) and 1.6-3% Cobalt (Co) [2]. n
ortodonie, metallic brackets, bands, archwires, springs and ligature wires sunt fabricate din SS
alloy, iar unele archwires of fixed orthodontic appliances sunt din NiTi alloy. Fixed orthodontic
appliances sunt aplicate temporar n cavitatea oral a pacienilor cu diferite malocluzii,
aproximativ 1-3 ani, pentru corectarea malpoziiilor dentare.
Saliva uman reprezint un fluid heterogen complex, care conine proteine, electrolii,
hormoni i ali compui transportai din snge. Variaiile pH-ului salivar, a temperaturii cavitii
orale i a dietei ingerate, pot crea un mediu agresiv asupra compomentelor metalice ale aparatelor
ortodontice. Multe studii au demonstrat c n mediul salivar, SS i NiTi alloys devin corosive la
suprafaa lor i determin schimbarea caracteristicilor de suprafa cu reducerea
biocompatibilitii acestora, prin eliberea ionilor metalici n saliv. Potenialii ioni metalici
eliberai de SS alloys sunt Copper, Cr, Fe i Ni, iar cei eliberai de NiTi wires sunt Ni i Ti [3, 4].
De asemenea, Ni, Cr i Co au fost identificai ca fiind cei mai frecveni alergeni din practica
ortodontic [5]. In addition to the allergic issue, carcinogenic, mutagenic, and cytotoxic effects
have been assigned to nickel and, to a lesser extent, chromium [7-9].

Studiile in vitro a diferitelor metal alloys of fixed orthodontic appliances au raportat

eliberarea ionilor metalici n saliva artificil n condiiile pH-ului acid [10-12], dar s-a ajuns la
concluzia unanim c aceste condiii simulate nu sunt asemntoare cu cele din cavitatea oral.
Studiile in vivo au raportat existena ionilor metalici n saliva uman la subiecii fr aparate
ortodontice, provenii din dieta ingerat sau din cauza fumatului [13]. De asemenea, studiile
realizate pe pacienii cu fixed orthodontic appliances au raportat o cretere a ionilor de metal n
saliv sau o variaie a nivelului de Ni salivar n diferite faze ale tratamentului ortodontic [10, 14,
15]. Alte studii au ajuns la concluzia c existena infim de Ni n saliv, ingerat i absorbit de
tractul gastro-intestinal nu constituie o acumulare toxic cumulativ pentru organismul uman,
pentru c 90% se elimin prin urin [16] i nu pune n pericol organismul uman.
n acest context, studiul nostru i propune s analizeze saliva uman nestimulat,
provenit de la subiecii cu/fr aparate ortodontice sau coroane metalice. Studiul nostru are ca
scop s identifice prin metoda SEM-EDS, morfologia i compoziia chimic elemental de
suprafa a cristalelor salivare nainte, n timpul i dup ndeprtarea aparatelor ortodontice.
Material and methods
n acest studiu a fost analizat saliva uman cristalizat, colectat de la subieci cu/far
aparate ortodontice cu elemente metalice, pentru a testa influena acestora asupra caracteristicilor
morfologice i a compoziiei chimice elementale de suprafa a cristalelor salivare. The ethical
approval was attained from the institutes ethical committee.
Subjects
Eantioanele de saliv au fost colectate de la 19 subieci (11 males 57.89% and 8
females 42.11%), cu vrste ntre 11-26 ani (mean age of 20.645.316 years) from North-East
Romania (14 urban 73.69% and 5 rural areas 26.31%). Criteriile de selecie au fost
urmtoarele: fr probleme de sntate, fr medicaie sau alte substane administrate intra-oral i
fr piercing. Grupul de control a fost format din 5 (26.32%) subieci fr aparate ortodontice sau
coroane fizionomice ceramo-metalice. Grupul de studiu a fost format din 14 (73.68%) pacieni
care au fost tratai n Othodontics Clinic from St. Spiridon University Emergency Hospital
Iassy, Romania. Pacienii au fost divizai n dou grupe: grupul A de studiu format din 8 (42.10%)
pacieni cu aparate ortodontice sau coroane fizionomice ceramo-metalice i grupul B de studiu
format din 6 (31.58%) foti pacieni, care au purtat aparate ortodontice n antecedente. The
informed consent was obtained before salivary collection from all of the participants or of the
patients parents.
Orthodontic appliances
The removable orthodontic appliances consisted acrylic baseplate and metallic elements
of SS alloy (orthodontic screw, clasps and springs). The fixed orthodontic appliances consisted of
four SS bands on first molars; 16-20 SS brackets of 0.022 inch slot size on all teeth; NiTi alloy
and SS archwires (DENTSPLY GAC International). The fixed retention wires consisted banded
canine to canine lingual retainer (Unitek 3M, Monrovia, USA) (tab. 1).
Table 1 Composition of the types of wires used for orthodontic appliances by EDS analysis
Salivary samples
De la fiecare subiect s-au colectat 0.5 mm saliv nestimulat pe o lam de sticl, degresat
i decontaminat n prealabil. Pacienii au fost instruii nainte de colectarea salivei (s nu
mnnce sau s bea dup periajul dentar matinal pn la colectare). Colectarea s-a fcut
dimineaa, la aceeai or pentru fiecare subiect, ntre orele 10-11 am. Eantioanele salivare au fost
2

uscate n mediu controlat, sub cupol, pentru a evita depunerile din atmosfer. Dup uscare,
probele de saliv au fost transportate la laboratorul de analiz.
Scanning electron microscopy (SEM) observation
The morphological characteristicsof crystals of salivary sampling wereobservation using
Scanning Electron Microscopy (SEM) on Quanta 200 3D microscope (FEI COMPANY Holland)
at the Research Laboratory of Discipline of Material Science and Surface Engineering,
Department of Machine Elements and Mechatronics, Faculty of Mechanical Engineering, Gh.
Asachi Technical University Iassy, Romania.
All specimens were examined with a SEM microscope operating at the high voltage (HV)
of 20kV, with a working distance (WD) of 14.5-15.3mm, on a large field detector (LFD) specific
for low vacuum, and secondary electrons (SE mode), at a horizontal field with the width of
(HFW) 59.7m and magnification 5000x, under the pressure of 59.66.04 Pa, at the temperature
of 20 degrees Celsius.
Energy Dispersive X-ray spectroscopy (EDS) analysis
The surface composition of crystals ofsalivary sampling was evaluated by SEM-EDS
analysis. The surface's qualitative elemental micro-analysis of crystals of each salivary sampling
was examined with the same electron microscope and under the same working conditions, to
identify the chemical composition of the salivary crystals surface.
The Energy Dispersive X-rayspectrum (EDS), the mass (Wt%) and atomic (At%)
percentage of chemical composition was determined for the surfaces of all examined samples.
Pentru a evita erorile de msurare cauzate de prezena materiilor organice din saliva analizat, sau efectuat msuratori fr a lua n considerare elementul chimic C.
Statistical analysis
Analiza statistic a fost realizat n SPSS 20.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) pentru Windows.
Datele au fost caracterizate prin statistici descriptive, distribuii de frecven i tabele de
contingen. Pentru a compara variabilele numerice ntre loturile de studiu am folosit testul t
pentru eantioane independente, avnd n vedere c legea de repartiie normal este respectat
(fapt verificat cu testul de fitare Kolmogorov-Smirnov). Pentru a estima intervalele de ncredere
(CI) 95% ale valorilor medii i ale deviaiei standard (SD) am utilizat procedura de bootstrapping,
pe 1000 eantioane de bootstrap. The entire statistical analyses were conducted at 5% level of
significance and p value<0.05 was regarded as significant.
Results
SEM observations
S-au examinat 4-6 cristale salivare din regiuni diferite ale filmului de saliv, de pe fiecare
eantion i s-au obinut 110 fotomicrografii SEM pentru grupele de subieci (tab. 2).
Table 2 Distribution of salivary crystals for subjets groups by SEM examination
The photomicrographs showed salivary crystals, with various shapes and sizes, including
rectangular, polyhedral, ovoid, rhomboid and rod-like forms, separated or congested in the
organic matter of dried saliva. According to their morphological characteristics, there were taken
into consideration three main salivary crystals types:
(a) type I, big size crystals with polyhedral regulated shape (rectangular, polyhedral),
single or in cluster arrangements (n=102 92.72%) (fig. 1 and 2);
(b) type II, big and medium size crystals with irregular shape (irregular polyhedron,
ovoid, rod-like forms), in cluster arrangements (n=3 2.72%) (fig. 3);
3

(c) type III, medium and small size crystals with irregular shape (irregular polyhedron,
ovoid, rod-like forms), isolated, characterized by luminescence phenomena when analyzed by
scanning electron microscopy (n=5 4.54%) (fig. 4).
Figure 1 SEM photomicrographies of salivary cristalls tipul I, rectangular single (Original
magnification x5000)
Figure 2 SEM photomicrographies of salivary cristalls tipul I, polyhedral in cluster
arrangements (Original magnification x5000)
Figure 3 SEM photomicrographies of salivary cristalls tipul II, ovoid in cluster
arrangements (Original magnification x5000)
Figure 4 SEM photomicrographies of salivary cristalls tipul III, luminescence ovoid
(Original magnification x5000)
EDS analysis
S-a identificat compoziia chimic elemental de suprafa a tuturor cristalelor salivare
examinate i s-au determinat valorile medii, deviaiile standard i erorile standard (SE) pentru Wt
% i At%. S-a determinat, de asemenea, CI 95% al mediei prin bootstrapping (tab. 3).
Table 3 Parametrii de statistic descriptiv pentru valorile medii ale Wt% i At% ale
elementelor chimice de suprafa ale cristalelor salivare
S-a analizat compoziia chimic elemental de suprafa a celor trei tipuri morfologice de
cristale salivare identificate i s-au gsit diferene ale valorilor medii ale Wt% i At% ale
componentelor chimice (fig. 5). Cele mai crescute valori medii ale Wt% i At% s-au nregistrat:
(a) pentru Potassium (K) (35.36 Wt% and 29.08 At%) i Chloride (Cl) (36.07 Wt% and
32.52 At%) la cristalele salivare de tip I;
(b) pentru Sodium (Na) (19.19 Wt% and 23.42 At%), Oxygen (O) (19,25 Wt% and 31.12
At%) i Siliceous (Si) (22.86 Wt% and 24.23 At%) la cristalele salivare de tip II;
(c) pentru Phosphor (P) (19.22 Wt% and 15.54 At%), O (30.42 Wt% and 47.80 At%) i K
(32.20 Wt% and 20.88 At%) la cristalele salivare de tip III.
Figure 5 Reprezentarea grafic a valorilor medii ale W% ale elementelor chimice de
suprafa a celor trei tipuri de cristale salivare
S-a analizat compoziia chimic elemental de suprafa a cristalor salivare pentru grupele
de subieci (fig. 6).
Figure 6 Reprezentarea grafic a valorilor medii ale W% ale elementelor chimice de
suprafa ale cristalelor salivare pe grupele de subieci
Valori medii ale Wt% and At% ale elementelor chimice de suprafa a cristalelor salivare
au fost comparat ntre control and study A groups i nu s-au gsit diferene semnificativ statistice
(p>0.05) (tab. 4). S-au gsit diferene semnificativ statistice ntre valori medii ale Wt% and At%
ale Ni (p=0.021 Wt% and p=0.033 At%) i Calcium (Ca) (p=0.000 Wt% and p=0.000 At%) ntre
control and study B groups (tab. 5).

Table 4 Testul t pentru eantioane independente compararea valorilor medii ale Wt% i At
% ale elementelor chimice de suprafa ale cristalelor salivare ntre lotul de control i lotul de
studiu A
Table 5 Testul t pentru eantioane independente compararea valorilor medii ale Wt% i At
% ale elementelor chimice de suprafa ale cristalelor salivare ntre lotul de control i lotul de
studiu B
Elementele metalice din compoziia chimic elemental de suprafa a cristalelor salivare
au prezentat valori medii ascendente ale Wt% and At% de la control la study A i la study B
groups pentru Ni i Al (fig. 7 and tab. 6).
Figure 7 Reprezentarea grafic a valorilor medii ale W% ale elementelor chimice metalice de
suprafa ale cristalelor salivare pe grupele de subieci
Table 6 Media valorilor WT% i AT% ale elementelor chimice metalice de suprafa ale
cristalelor salivare pe grupele de subieci
Discussions
Influena elementor metalice ale aparatelor ortodontice asupra caracteristicilor
morfologice i compoziiei chimice elementale de suprafa a salivei umane nestimulate
cristalizate a fost experimentat n studiul nostru.
Studiile anterioare au cercetat prezena ionilor metalici n saliva pacienilor cu aparate
ortodontice la diferite intervale de timp, comparativ cu un lot control fr aparate ortodontice [13,
16, 18]. Studiul nostru a constituit dou loturi de studiu (A pacieni cu aparate ortodontice sau
coroane fizionomice ceramo-metalice i B foti pacieni cu aparate ortodontice, dar n prezent
fr aparate ortodontice sau coroane fizionomice ceramo-metalice), care au fost comparate cu
lotul control (subieci fr aparate ortodontice sau coroane fizionomice ceramo-metalice).
Includerea lotului de studiu B a avut ca scop verificarea prezenei elementelor chimice metalice
pe suprafaa cristalelor salivare, care provin din alte surse dect saliva uman. Comparaia datelor
lotului de studiu B cu grupul control a condus la rezultate suplimentare fa de studiile anterioare.
Studiile anterioare au cercetat prezena ionilor metalici utiliznd dilute saliva, distilled
water or lactic acid prin atomic absorption spectrophotometer [13, 15, 17, 18]. Studiul nostru a
analizat cristalele de saliv prim metoda SEM-EDS, aducnd date noi fa de studiile anterioare.
Astfel, am putut indentifica trei tipuri morfologice de cristale salivare, care au prezentat valori
medii crescute ale Wt% i At% pentru unele elemente chimice de suprafa. Am considerat tipul I
de cristal salivar de aspect polyhedral regulated format dintr-un complex K-Cl; tipul II de cristal
salivar de aspect ovoid irregular format dintr-un complex Na-O-Si; tipul III de cristal salivar
ovoid luminescent format dintr-un complex P-O-K.
Studiile anterioare au artat c cationul K i ionul P sunt predominani n saliva uman
fa de cationul Na. Concentraia ionilor de Na i Cl crete odat cu rata fluxului salivar, n timp
ce cationul K este independent de fluxul salivar [19, 20], aa se explic prezena crescut a
cristalelor de tipul I formate din complexul K-Cl.
Studiul nostru a fcut analiza chimic elemnetar de suprafa a cristalelor salivare pentru
toate elemetele componente. Na, Magnesium (Mg), P, Sylphs (S), Cl, K i Ca gsite n cristalele
salivare provin din coninutul ionic al salivei umane. Si poate proveni din particulele de praf din
atmosfer sau din compoziia lamei din sticl utilizate. Ni, Al i Zn nu provin din coninutul ionic
al salivei.

Comparaia dintre loturile de studiu A i control a valorilor medii ale Wt% and At% ale
elementelor chimice de suprafa a cristalelor salivare nu a artat diferene statistice, ceea ce
conduce la concluzia c prezena elementelor metalice ale aparatelor ortodontice sau ale
coroanelor metalice nu a influenat compoziia salivei. ns, s-au constatat diferene semnificativ
statistice pentru Ni i Ca la comparaia valorilor medii ale Wt% and At% ale elementelor chimice
de suprafa a cristalelor salivare dintre loturile de studiu B i control. Studiile anterioare au artat
c concentraia ionului Ca depinde de vrst, pH i fluxul salivar [20, 21].
Ni i Al au fost identificai la toate cele trei grupe de subieci, cu/far aparate ortodontice
cu elemente metalice, ceea ce nseamn c aceste aparate nu au fost sursa principal de eliberarea
a elementelor chimice anorganice. S-a constatat o cretere constant a valorilor medii ale Wt% i
At% de la grupul control la cele dou grupe de studiu, chiar i dup un anumit timp de la
ndeprtarea aparatelor ortodontice din cavitatea oral. Aceste constatri conduc la idea
schimbrii compoziiei chimice elementale de suprafa a salivei umane cristalizat, n contextul
mediului nconjurtor al vieii actuale. Studiile anterioare au evideniat creterea eliberrii ionilor
metalici n saliv, n prezena aparatele ortodontice [10, 14, 15, 17, 18], ca urmare a fenomenelor
de corosiune [22, 23]. Creterea valorilor medii ale Wt% i At% ale Ni la pacienii foti purttori
de aparate ortodontioce poate fi cauzat de compoziia dietei ingerate [15] sau de alte surse ale
mediului nconjurtor care au contact cu saliva. Valorile gsite n studiul nostru nu pot fi
comparabile cu ale studiilor anterioare, pentru c se utilizeaz metode diferite n experimente.
Conclusions
Studiului nostru efectuat prim metoda SEM-EDS pe saliva uman nestimulat cristalizat
a subiecilor cu/fr aparate ortodontice sau coroane metalice a identificat trei tipuri morfologice
de cristale salivare cu aspecte particularizate, formate din complexe chimice majoritare diferite.
Elementele chimice de suprafa ale cristalelor salivare obinute nainte, n timpul i dup
ndeprtarea aparatelor ortodontice au fost identice, cu excepia Zn. O parte din aceste elemente
chimice de suprafa ale cristalelor salivare provin din compoziia ionic a salivei umane.
Prezena elementelor metalice Ni, Al i Zn n cristalele salivare nu provin din compoziia ionic a
salivei, iar sursele de provenie mai trebuie investigate prin cercetri ulterioare ale mediului
nconjurtor. Influena elementele metalice ale aparatelor ortodontice inserate n cavitatea oral
asupra compoziiei chimice a salivei a fost minor i pasager i nu a reprezintat sursa principal
de eliberare a elementelor chimice metalice n saliv, pentru c s-au gsit la toate loturile de
subieci studiai.