Curs 12

3 Legarea covalent const n reacia chimic care are loc ntre gruprile reactive ale
suportului cu cele ale enzimei, conducnd la imobilizarea ireversibil a enzimei. Un interes
deosebit l reprezint metodele chimice care permit legarea enzimelor prin intermediul unor
grupri funcionale din structura enzimei, indiferente pentru cataliz : amino ( sau ), imido
(de la triptofan), amido (de la asparagin, glutamin), hidroxil (de la serin, treonin),
carboxil (, sau ), tiol (de la cistein), metiltiol(de la metionin), guanidil (de la arginin),
imidazol(de la histidin) etc.
Metodele de imobilizarea prin legare covalent pot fi grupate n dou categorii
principale : metode care implic un suport (insolubil sau nu) i metode care realizeaz
imobilizarea prin reticularea enzimei.
3.1 Imobilizarea enzimelor prin legare covalent de un suport.
n acest caz se urmrete stabilirea modalitilor de legare covalent prin intermediul
unor grupri funcionale ale enzimei de unele grupri funcionale ale suportului astfel nct
activitatea catalitic a enzimei s fie conservat.
Gruprile funcionale enzimatice sunt destul de puin reactive, fapt ce determin
necesitatea existenei unor grupri funcionale suficient de active pe suport astfel nct legarea
s se fac n condiii blnde pentru enzim.
Exist posibilitatea de activare a gruprilor funcionale ale enzimelor, dar aceste studii
au avut loc mai ales la nivel de laborator ca cercetri tiinifice i nu au fost aplicate la scar
deoarece n general condiiile de activare sunt puin compatibile cu conservarea activitii
enzimatice.
Astfel exist unele cercetri originale care utilizeaz activarea gruprilor funcionale
ale enzimelor. De exemplu Zaborsky (Zaborsky O.R., 1974, Immobilized enzymes., C.R.C.
Press, new York) a efectuat experimentri de legare a glucoz-oxidazei, a crei fracie glucidic
reprezint 16 % din masa enzimei, pe diferite suporturi aminate (p-amino-stiren, amino-etilceluloz, sticl aminat, carboximetil-celuloz activat cu hidrazid...)
Se poate de asemenea s se mreasc densitatea de situsuri reactive pe molecul prin
grefarea pe acestea de lanuri de politirozin sau de polilizin sau, de a se introduce grupri
vinilice n molecula enzimei, prin alchilarea funciilor aminice, dup care enzima este
imobilizat copolimerizat prin intermediul gruprilor vinilice cu acrilamid i bisacrilamid.
n marea majoritate a cazurilor ns, nu enzima se activeaz ci suportul.
Pentru conferirea unei capaciti de legare mare se activeaz suprafaa suportului. De
exemplu imobilizarea unei enzime pe o matrice poliglucidic poate fi realizat prin activarea
n prim etap a suportului prin oxidare cu periodat de potasiu pn la formarea unor grupri
1

carbonil la crea se leag enzima prin puni azometinice. Pentru mrirea stabilitii
complexului enzim-suport format, legturile tip baz Schiff sunt reduse cu NaBH4.
Metode principale de activare
Pentru stabilirea metodei de activare se iau n consideraie pe de o parte gruprile
funcionale care particip la legtura covalent din partea enzimei, iar pe de alta gruprile
funcionale implicate n legtur din partea suportului. n acest context principalele metode de
activare sunt :
Grupa funcional
enzim
NH2
NH2

Metoda de activare
suport
NH2
COOH

Glutaraldehida
Azotur

NH2

OH

Carbodiimid
Bromcian

COOH

NH2

Triazine
Carbodiimid
Sare de diazoniu

SH

SH

Puni disulfurice

O imagine sintetic de imobilizare a enzimelor prin legare covalent este prezentat

nb fig...

Fig. Imobilizarea unei enzime pe un suport activat.

Activarea cu ajutorul glutaraldehidei este una dintre cele mai utilizate metode att
pentru legarea unei enzime de un suport ct i pentru reticularea moleculelor unei enzime sau
a unor celule ntregi. Cu funciunile aminice ale suportului sau enzimei glutaraldehida nu
reacioneaz sub form sa de dialdehid ci sub forma de polimer rezultat n urma condensrii
aldolice a moleculelor de reactiv. Cu ct valoarea de pH este mai ridicat polimerizarea este
mai important. Astfel la pH mai mare de 10,5 are loc precipitarea polimerilor de
glutaraldehid care au funciuni aldehidice , nesaturate. Aceste funciuni reacioneaz cu
gruprile aminice ale suportului (enzimei) conducnd la formarea unor legturi iminice care
2

sunt apoi stabilizate prin rezonan cu legturi etilenice (legturi duble conjugate). Aceste
structuri explic stabilitatea derivailor obinui prin activare cu glutaraldehid. Aceti
compui rezist de exemplu la atacul unei soluii de acid clorhidric 6N la temperatura de
1100C timp de 24 de ore.
La modul general imobilizarea unei enzime pe un suport activat cu glutaraldehid are
loc n dou etape. n prima etap suportul aminat este activat prin punerea n contact cu o
soluie de glutaraldehid (1% - 5%) la un pH cuprins ntre 7,0 i 8,6 i temparatura ambiant.
Dup splarea cu un tampon corespunztor pentru ndeprtarea excesului de glutaraldehid
enzima este meninut n contact cu suportul la temperatura de 4 0C. Deci condiiile de
imobilizare ale enzimei sunt blnde. Mecanismul de activare cu glutaraldehid este :
(n+2) OHC(CH2)3CHO

RNH2

Glutaraldehida, utilizat de asemenea ca agent de fixare n histochimie sau pentru

ameliorarea proprietilor mecanice ale pieilor n tbcrii, ofer avantajul de a fi un produs
dispinibil la nivel industrial.
Azotura permite activarea eficace a suporilor ce posed grupri de acizi carboxilici.
Metoda de activare cu azotur are loc n cteva etape: esterificarea gruprilor carboxilice cu
metanol n mediu acid, reacia esterilor formai cu hidrazin rezultnd hidrazide, tratarea
acestora cu azotit de sodiu pentru a rezulta azotura i apoi prin reacia compusului format cu
gruprile aminice ale enzimei se obine imobilizarea enzimei prin legare covalent de tip
amidic. Succesiunea reaciilor chimice implicate n acest proces este prezentat n fig...

RCOOH

RCOOCH3

RCONHNH2

RCON N N

RCONHE

Fig. metoda de imobilizare dup activarea suportului cu azotur

Carbodiimida este de asemenea un reactiv utilizat pentru imobilizarea unor enzime
prin legarea gruprilor aminice de o grupare carboxil activat de pe suport. Modul de
imobilizare este similar cu cel aplicat pentru sinteza legturilor peptidice ntre aminoacizi n
prezena carbodiimidei (fig. ). Aceast reacie decurge n mediu acid . Dac se dorete a se
opera n mediu bazic se poate folosi reactivul K al lui Woodward (N etilfenil 5
izoxazoliu sulfat 3).

RCONHE +

RCOOH

R1NHCONHR2

Fig. metoda de imobilizare cu carbodiimid

Bromcianul este utilizat pentru activarea suporturilor care au grupri de tipul glicolice cum sunt suporturile de natur poliozidic ( dextran, agaroz, celuloz, amidon...).
Tratarea acestor suporturi cu bromcian conduce la obinerea de imidocarbonai care vor
reaciona cu gruprile aminice ale proteinelor pentru a da izo-uree N- substituit.

imidocarbonat

Izouree N-substituit

Fig. Metoda de imobilizare prin intermediul activrii cu bromcian

Aceast metod este una dintre cele mai utilizate la nivel de laborator

pentru

imobilizarea enzimelor sau a moleculelor aminate (de exemplu n cromatografia de afinitate).

n acest context suporturi preactivate cu bromcian sunt disponibile pe pia.
Triazinele sunt utilizate pentru activarea suporturilor care au grupri funcionale
hidroxil (fig..). Cele mai utilizate triazine sunt : 2,4,6 tricloro S triazina (clorura de
cianuril), 2-amino- 4,6-dicloro S triazina, coloranii Procion M etc. Triazinele fiind
4

produse industriale este convenabil a fi utilizate pentru prepararea de cantiti importante de

suporturi active n special de celuloz activ.

Fig. Metoda de activare cu triazine.

X = Cl : 2,4,6 tricloro S triazina; X = 2-amino- 4,6-dicloro S triazina; X = cromofor
(Colorant Procion M)

Fig. Metoda utilizrii srurilor de diazoniu

Srurile de diazoniu se pot obine uor la suporturile care au grupri funcionale amine
aromatice prin adugarea de azotit de sodiu n mediu acid (fig..). Srurile de diazoniu care se
obin pot reaciona cu nucleul fenolic al restului tirozinic sau cu imidazolul din restul
histidinic pentru a forma legturi de tip azoic.
Puni disulfurice se pot stabili ntre gruprile tiol ale suportului i gruprile tiol din
resturile de cistein ale enzimei. Pentru aceste cazuri suportul este cel mai adesea activat prin
5

intermediul reaciilor cu dipiridil 2,2 disulfur dup care este pus n contact cu enzima de
interes (fig..).

Aceast metod reprezint una dintre puinele metode de imobilizare prin legare
covalent care ofer posibilitatea de regenerare a enzimei dup dezactivarea sa. Astfel este
suficient ca punile disulfurice s fie reduse, de exemplu cu ajutorul cisteinei, pentru
regenerarea gruprilor tiol ale suportului i ale enzimei, dup care se poate din proceda la
imobilizare.
Suporturi principale
Legarea se poate realiza pe suporturi anorganice (sticl poroas, materiale ceramice),
pe suporturi organice naturale (celuloz, chitin, dextran, agaroz) sau polimeri sintetici
(nailon, polistiren, poliacrilamid), prin intermediul unor grupri imidocarbonat, oxiran,
azid, diazo, izotiocianat, triazinil etc. Suporturile organice prezint fa de cele anorganice o
densitate mai mare de grupri funcionale n timp ce cele anorganice au mai bune proprieti
mecanice.
Principalele suporturi organice sunt :
Compui naturali
Suport
Grupare funcional
Poliozide
Dextran
Agaroz
Celuloz
Carboxi-metil-celuloz
Amino-etil-celuloz
p-aminobenzil celuloz

Polimeri sintetici
Suport

Grupare

funcional
Poliacrilamida
CONH2
Poliacrilai
divers
Polimetacrilai
divers
Copolimer etilen Anhidrid acid

OH
OH
OH
COOH

anhidrid maleic
Polistiren
Poliamide

NH2

divers
CONH

Proteine
Colagen

COOH

Dextranul i Agaroza : Dextranul este un homoplimer ramificat format din uniti de

D glucoz i este sintetizat de ctre diferite bacterii (n special de Leuconostoc
mesenteroides) pornind de la zaharoz. Agaroza este un polimer natural ce se extrage din alge.
Aceste dou poliozide sunt utilizate n mod curent n biochimia analitic n diferite scopuri,
cele mai obinuite fiind de cernere molecular, determinri de greuti moleculare,
cromatografii de exemplu de excludere. Datorit utilizrilor multiple aceti compui sunt
disponibili pe pia n diferite forme active sau nu : Sephadex, Sepharose, Bio-Gel, Ultrogel
etc.
Cea mai utilizat form de activare a poliolilor este cea cu BrCN dar prezena
gruprilor hidroxil pe aceste suporturi permite de asemenea i activarea cu ali ageni cum
sunt de exemplu triazinele.
Proprietile mecanice ale acestor geluri pot fi mbuntite prin asocierea cu polimeri
sintetici, de exemplu agaroza cu acrilamida sau glutaraldehida.
Celuloza i derivaii si (Carboxi-metil-celuloz, Amino-etil-celuloz, p-aminobenzil
celuloz). Celuloza este un homopolimer liniar format din uniti de D-glucoz i este
utilizat n mod obinuit n domeniul analitic sub diferite forme. Acest suport natural cu o
larg rspndire i disponibilitate, pe lng utilitatea sa pentru diferite industrii (hrtie, vat...)
este i obiectul a numeroase studii chimice i structurale astfel nct se cunosc numeroase
modaliti de activare a celulozei. n plus exist n prezent numeroi derivai ai celulozei
disponibili n mari cantiti i care permit utilizare a variate metode de activare, aa cum sunt
cei menionai anterior.
Gruprile hidrtoxilice ale celulozei pot fi acxtivate foarte uor prin halogenare, n
particular cu ajutorul unor ageni de clorurare cum sunt clorura de tionil(SOCl2) sau clorura de
sulfuril(SO2Cl2). De asemenea activri eficace se pot realiza att a celulozei ct i a derivailor
si cu triazine. Exist de altfel numeroi compui activi gata preparai de ctre firme
recunoscute. De exemplu Grupul Lilly activeaz i vinde diferite tipuri de DEAE-celuloz
activat.n plus celuloza poate fi activat att sub form de hrtie (reactivi analitici) ct i de
particlule (celuloz micro-cristalin). Este de asemenea posibil s fie activat i celuloza
prezent n derivaii naturali sub form de compleci ligno-celulozici, compui care prezint
proprieti mecanice net superioare celulozei pure. De exemplu resturile celulozice de porum
constituie excelente suporturi pentru imobilizarea de enzime.
Colagenul, o protein care joac un rol structural foarte important n esutul conjuntiv,
este un subprodus abundent n abatoare i poate fi obinut sub form de fibre sau membrane.
Coninutul bogat n aminoacizii aminai ( acidul glutamic i acidul aspartic) permite activarea
7

colagenului prin metoda cu azotur. Membranele activate astfel sunt utilizate pentru
imobilizarea de enzime care apoi sunt folosite pentru realizarea de electrozi specifici.
Polimerii acrilici (Poliacrilamida, Poliacrilai Polimetacrilai) sunt derivai care se
produc adesea la scar industrial prin polimerizarea acidului acrilic, acidului metacrilic,
acidului cloroacrilic i derivaii lor. S lum de exemplu cazul poliacrilamidei pentru a
sublinia varietatea de metode de modificare chimic i activare care pot fi puse n lucru n
cazul acestor tipuri de polimeri (fig...) i a cror structur general este urmtoarea :

Fig. Metode de modificare chimic i de activare a poliacrilamidei

Pe baza acestor proprieti au fost dezvoltai numeroi copolimeri ai acrilamidei, ai

N,N- metilen bisacrilamidei i derivailor acestora cu o mare varietate de funciuni reactive.
Civa din numeroii compui Enzacryl sunt :
Enzacryl
AA

Grupa funcional

Metoda de activare
Diazotare

AH
Politiolactona

Azotur
Reacie direct

Politiol

Punte disulfuric

Poliacetal

Acid diluat

Copolimerul etilen anhidrid maleic (EMA) prezint avantajul c este un reactiv

direct datorit funciilor sale anhidridice. Reacia cu enzima conduce la un derivat cu
ncrctur negativ (fig....) care poate fi neutralizat prin reacia cu 1,6-diamino-etan sau 1,6diamino-hexan. Condensarea acestor molecule bifuncionaleconduce printre altele i la o
ameliorare a proprietilor mecanice a suportului.

Fig... Imobilizarea enzimelor pe copolimerul etilen anhidrid maleic (EMA)

Polistiren : copolimerii stiren divinil benzen cu structura de baz :

sunt baza a numeroase preparate ca rini schimbtoare de ioni obinute prin modificri
chimice ale acestor polimeri, n vederea introducerii de grupe schimbtoare de ioni. De
exemplu se poate nitra polistirenul prin aciunea acidului azotic n prezena acidului sulfuric i
9

apoi reducerea funciilor nitro cu ajutorul hidrosulfitului de sodiu obinndu-se astfel funcii
amino-aromatice care pot fi activate prin diazotare.
Poliamidele sunt preparate prin polimerizarea fie a acizilor dicarboxilici i diaminelor
alifatice, fie a aminoacizilor sau a lactamelor lor. Una dintre cele mai cunoscute poliamide
este nylonul. Aceti polimeri au grupri amidice a cror hidroliz acid parial permit
eliberarea simultan a unei grupri funcionale aminice i a unei grupri carboxilice:
R1CONHR2

R1COOH + R2NH2

Gruprile astfel eliberate pot fi activate prin una dintre metodele deja prezentate.
Principalele suporturi minerale.
Silice i sticl poroas, suporturi disponibile cu o mare varietate granulometric i
porozitate, cu suprafee de legare variind de la 10 m 2/g la 400 m2/g care au porozitile
corespunztoare de la 300 nm la 8 nm. n plus este foarte uor s se grefeze aproape orice
grupare chimic pe aceste suporturi prin condensare cu silani. Silanii sunt utilizai industrial
ca promotori de adeziune.
(RO)3SiR
Silan
-aminopropil trietoxi silan
Namino etilamino

R
C2H5
etil CH3

A
(CH2)3NH2
(CH2)3NH(CH2)2NH2

trimetoxi silan
(Clorometilfenil)etiltrimetoxi silan

CH3

Cloropropiltrietoxi silan
glicidoxipropil trimetoxi silan

C2H5
CH3

(CH2)3Cl

mercaptopropil trimetoxi silan

metacriloxipropil trimetoxi silan

CH3
CH3

(CH2)3SH

n funcie de gruparea funcional enzimele pot fi imobilizate direct sau dup activarea
suportului. Metoda cea mai utilizat este de a se grefa grupri amino alifatice prin
condensarea -aminopropil trietoxi silan pe suport apoi activarea acestor grupri prin aciunea
glutaraldehidei (Fig...).
n cazul sticlei poroase proprietile derivailor obinui pot fi ameliorate folosindu-se
sticl a crei pori sunt cptuii cu zirconiu (oxid de zirconiu). Acest tip de suport a fost i este
utilizat la nivel pilot i industrial pentru imobilizarea a diferite enzime cum sunt : glucoz
izomeraza, amiloglucozidaza, lactaza etc.

10

Oxizii metalici se funcionalizeaz chimic prin aceleai metode care se aplic silicei
sau sticlei. Am exemplificat cazul cptuirii cu oxid de zirconiu dar putem exemplifica i cu
oxid de titan, de nichel, de fier, de aluminiu (alumina).
Diferite tipuri de ceramic pot fi activate prin introducerea de grupri chimice reactive
sau activabile prin metoda silanrii.

Fig..Aminarea silicei prin condensare cu silan (-aminopropil trietoxi silan)

n prezent tehnica de imobilizare prin legare covalent a enzimelor este una dintre cele
mai utilizate i nu prezint dezavantajele tehnicilor anterioare.
3.2 Imobilizarea enzimelor prin reticulare.
Imobilizarea enzimei se poate realiza i fr a se utiliza suporturi prin efectuarea de
puni covalente cu ajutorul unor reactivi polifuncionali. Se obin astfel structuri cu nalt
mas molecular care devin insolubile. Pentru realizarea unei astfel de reacii se pot folosi
numeroi reactivi, dintre care cei mai utilizai sunt :

Principalii reactivi polifuncionali

Nume
Glutaraldehid

Structur

Acid bis-diazobenzidin-2,2-disulfonic

Acid

difenil-4,4-diizotiocianat-2,2-

disulfonic

11

1,5-difluoro-2,4-dinitro-benzen

3-metoxi-4,4-difenil

diizotiocianat-

metan
De departe glutaraldehida este reactivul cel mai utilizat nu numai pentru a se reticula
enzimele ci i pentru realizarea aa numiii imuno-adsorbani.
n acest proces enzima este diluat cu o protein inert, cum este albumina, pentru a se
limita fenomenele de denaturare i a crete eficacitatea metodei de imobilizare. Derivaii
rezultai pot fi i sub form de membrane. Observaii la microscopul electronic au permis
precizarea structurii fine a acestor tipuri de derivai.
Pentru obinerea unor derivai cu o structur foarte poroas asemntoare bureilor,
amestecul de enzim, albumin i glutaraldehid este congelat rapid dup care se crete
temperatura pn la 40C n mod lent.
Un astfel de proces de reticulare se poate aplica nu numai enzimelor ci i celulelor
ntregi. Acestea prezint avantajul, mai ales n cazul n care celula conine o enzim uor
accesibil (cum este cazul enzimelor periplasmatice), c permit utilizarea activitii catalitice
fr a se efectua procesele de extracie i purificare consumatoare de energie, timp i bani. n
acest caz putem spune c celula este suportul. De asemenea se evit eliberarea sistemelor care
determin autodegradarea celular printr-o nclzire a sistemului timp scurt la o temperatur
de 700- 800C. n plus acest procedeu permite scderea important a costului enzimei
imobilizate i este utilizat pe larg pentru imobilizarea glucoz izomerazei folosit pentru
producerea de izoglucoz, una dintre cele mai importante aplicaii industriale de enzime
imobilizat.
De exemplu cu glutaraldehid firma NOVO a reticulat Bacillus coagulans, iar GISTBROCADES micelii de Actinoplanes missouriensis.
Avantaje i dezavantaje
Avantaje
Soliditatea legturii enzim suport care permite obinerea de compurezisteni la
diferite variaii importante ale condiiilor de mediu (pH, trie ionic) i, n particular,
la splri repetate cu soluii concentrate de clorur de sodiu.
Exist o foarte mare varietate de suporturi i metode de activare, dei este aproape
imposibil de a prevedea a priori eficacitatea unei metode de imobilizare, este

12

ntotdeauna posibil s se gseasc pentru o enzim dat o metod care s dea un

randament de imobilizare bun.
Stabilitatea legturilor covalente ntre enzim i suport se poate traduce i prin
rigidificarea structurii tridimensionale a enzimei. Din aceasta rezult noi proprieti, n
special printr-o cretere general a rezistenei la factorii de denaturare(temperatur,
pH, ageni denaturani). Este semnificativ c foarte multe enzime imobilizate prezint
o temperatur optim de activitate mai mare dect a enzimei libere fapt deosebit de
important pentru utilizarea enzimei n flux continuu. Pentru ca rigidificarea enzimei s
nu fie total, fiind necesar o anumit elasticitate, este obligatoriu s se stabileasc
condiiile optime de imobilizare pentru fiecare enzim n parte i pentru fiecare
procedur de imobilizare.
Dezavantaje
Imobilizarea prin legare covalent este mult mai complex dect prin incluziune sau
adsorbie. Chimia heterogen aplicat pentru a se ajunge la imobilizare nu duce
ntotdeauna la rezultatele ateptate considernd reaciile care au loc n fazele omogene
ca urmare a fenomenelor de interferen din micromediul nconjurtor prezent n
sistemele heterogene.
Formarea legturilor covalente ntre diferitele grupri funcionale ale enzimei i
suportului conduce la o important modificare a structurii enzimei, care dei este
benefic n ceea ce privete ameliorarea rezistenei la factori de denaturare, provoac
totui o denaturare a structurii moleculei enzimei. De aceea randamentul de
imobilizare exprimat n funcie de activitatea enzimatic rezidual poate avea valori
procentuale de la cteva uniti la mai mult de 90%. De exemplu este suficient ca la
legtur s participe i grupri din situsul catalitic al enzimei ca activitatea sa s fie
perturbat. De asemenea pot fi amintite i efectele de stnjenire steric i de schimbare
a sensibilitii enzimei la variaii de pH saiu chiar la modificarea valorii optime de pH.
Este practic imposibil de a se prevedea, chiar dac structura enzimei este cunoscut i
reacia de cuplare perfect stpnit, care va fi randamentul de imobilizare covalent cu
o metod sau alta, fiind variabil de la o enzim la alta pentru aceiai metod i pentru
o enzim dat diferit pentru diferite metode.
Cantitatea de enzim imobilizat per g de suport este n general mai mic dect n caz
de incluziune sau adsorbie.
Suporturile organice au adesea inconvenientul c prezint proprieti mecanice
necorespunztoare i sunt sensibile la atacul microorganismelor. Suporturile minerale
nu prezint acest dezavantaj dar capacitatea lor de cuplare este mai redus.
13

n prezent tehnica de imobilizare prin legare covalent a enzimelor este una dintre cele
mai utilizate i nu prezint dezavantajele tehnicilor anterioare.

14