Capitolul 6

D.
Dinu
162
D. Dinu
Enzime pectinolitice de origine microbian

D. Dinu
Universitatea din Bucureti, Facultatea de Biologie, Spl. Independenei nr. 91-95, Bucureti
Introducere
Reaciile biochimice, reacii deosebit de complexe i variate, sunt
mediate de biocatalizatori cu proprieti remarcabile, cunoscui sub
denumirea de enzime. Capacitatea enzimelor de a crete de pn la
1014ori viteza unei reacii, condiiile blnde de aciune, specificitatea i
posibilitatea de reglare a activitii, constitue un avantaj major al acestora.
Aplicaiile practice ale enzimelor n diferite sectoare de activitate au
condus la necesitatea obinerii n cantiti mari de preparate enzimatice cu
diferite activiti catalitice. n producia mondial de enzime un loc de frunte
l ocup tehnologiile care vizeaz obinerea de preparate proteice cu
activitate pectinolitic. Dezvoltarea biotehnologiilor care urmresc gsirea
de noi surse de izolare a enzimelor pectinolitice este o consecin fireasc
a implicrii i eficienei acestora n diferite procese. Numeroasele utilizri
ale enzimelor pectinolitice n cele mai diverse domenii de activitate industria alimentar, industria prelucrrii fibrelor naturale, industria
farmaceutic, industria chimic - au determinat demararea cercetrilor n
vederea obinerii acestora din surse microbiene. Orientarea ctre
microorganisme a avut n vedere avantajele oferite de astfel de surse i
proprietile enzimelor pectinolitice de origine microbian.
Larga rspndire, variabilitatea, adaptabilitatea i potenialul de
biosintez al microorganismelor pot fi considerate puncte de plecare
pentru noi cercetri consacrate descoperirii i manipulrii unor ageni cu
proprieti superioare.
1.Pectinele, substraturi ale enzimelor

pectinolitice
Substanele pectice reprezint un grup heterogen de polizaharide cu un coninut mare
de sarcini negative datorate resturilor de acid galacturonic din structur. Celulele plantelor
aflate n diferite stadii de dezvoltare sunt acoperite de un perete extensibil. n structura
peretelui celular microfifrilele de celuloz sunt legate necovalent la o matrice alctuit din
hemiceluloze, pectine i proteine structurale.
163
Studiile intreprinse asupra pereilor celulari de provenien diferit

au evideniat un aranjament caracteristic al principalelor componente ale
acestora (Albersheim 1975, Cosgrove 1997, Capita i alii 2001). n acest
aranjament, moleculele adiacente de celuloz ader puternic prin legturi
de hidrogen i formeaz agregate cristaline, numite microfibrile de
celuloz. Microfibrilele de celuloz sunt principalii determinani ai
rezistenei peretelui celular. Seturile de microfibrile sunt aranjate n
straturi sau lamele n structura crora fiecare microfibril se leag de
vecina sa prin molecule de hemiceluloz. Hemicelulozele sunt
heteropolizaharide care se leag la suprafaa microfibrilelor de celuloz,
mai ales prin legturi de hidrogen. Hemicelulozele ajut la legarea
ncruciat a microfibrilelor ntr-o reea complex i previn contactul direct
microfibril-microfibril. Alturi de aceast reea alctuit din microfibrile
celulozice i hemiceluloze, peretele celular conine i o alt reea format
din molecule de pectin legate ncruciat. Pectinele formeaz un gel n
jurul reelei celuloz-hemiceluloz i acioneaz ca un material de
umplutur care previne agregarea i ruperea acestei reele. Prin
intermediul substanelor pectice peretele celular i moduleaz porozitatea
pentru diferite macromolecule. Datorit sarcinii lor negative, pectinele
sunt puternic hidratate i nconjurate de cationi, n special de Ca 2+.
Substanele pectice se gsesc din abunden n lamela mijlocie, fiind
ageni de cimentare intercelular prin intermediul legturilor ncruciate
formate ntre ionii de calciu i catenele pectice din structura a doi perei
adiaceni.
Aranjamentul principalelor componente n cadrul unui perete celular
primar este prezentat n Figura 1.
Substanele pectice sunt macromolecule complexe n structura
crora acidul D-galacturonic este componentul principal. Catena
polizaharidic central are unitile de -D-galacturonat legate (14) i
conine 2-4% uniti de L-ramnoz (aproximativ cte una la 25 uniti
galacturonice) legate -(14) i -(12) la resturile de acid galacturonic.
Catenele laterale sunt de dou feluri: lungi, alctuite din acid galacturonic
(galacturonani) sau din resturi de L-arabinoz (arabinani) i scurte,
alctuite din resturi de D-galactoz, D-xiloz sau L-fucoz. n structura
substanelor pectice au fost evideniate dou tipuri de regiuni: o regiune
grea, alctuit din catene ramnogalacturonanice puternic substituite cu
zaharuri neutre i o regiune uoar n structura creia exist, n special,
catene homogalacturonanice.
Multe din gruprile carboxil din structura resturilor de acid
galacturonic sunt esterificate cu metanol. Gradul de esterificare variaz cu
sursa biologic i cu agentul utilizat pentru extracia substanelor pectice.
Au fost izolate i caracterizate i substane pectice care au cteva din
resturile de acid galacturonic acetilate.
164
D. Dinu
Figura 1. Aranjamentul principalilor constitueni ai peretelui celular primar.
165
Gradul de esterificare, proporia de zaharuri neutre i gradul de

policondensare sunt principalele elemente ale heterogenitii substanelor
pectice de diferite origini (Dick i alii 1989, MacKinnan i alii 2002).
Deesterificarea, proces care se poate realiza chimic sau enzimatic,
determin asamblarea macromoleculelor pectice prin intermediul ionilor
de Ca2+. Acest proces afecteaz semificativ proprietile fizico-chimice ale pectinelor,
i, implicit, arhitectura pereilor celulari (Braccini i alii 2001, Barnavon i alii 2001, Ralet i
alii 2001, Camara i alii 2002)
Clasificarea substanelor pectice se face dup mai multe criterii.
Dup solubilitatea lor n diferite medii, substanele pectice au fost
mprite n trei categorii:
substane pectice solubile n ap (pectine nalt metilate sau acizi
pectinici);
substane pectice solubile n soluii care complexeaz ionii de calciu ca
de exemplu EDTA, oxalat de amoniu (pectine slab metilate sau acizi
pectici);
substane pectice insolubile n ap (protopectinele), considerate o
form nativ a acestor biomolecule. Insolubilitatea protopectinei se
datoreaz att mrimii policondensatului, ct i legturilor ce o
caracterizeaz. n structura protopectinei exist reele complexe de
catene poligalacturonice asociate ntre ele prin legturi ionice stabilite
ntre un ion bivalent (n special calciu) i dou grupri carboxil.
Protopectina se leag, prin legturi de hidrogen, de celelalte
componente din pereii celulari. Protopectina poate fi solubilizat cu
acizi diluai, la cald.
O alt clasificare a substanelor pectice are n vedere gradul de
esterificare a gruprilor carboxil din structur. Dup acest criteriu,
substanele pectice au fost mprite n:
pectine nalt metilate (HMP) cu au un grad de metilare de peste 50%
pectine slab metilate (LMP) cu au un grad de metilare de sub 50%.
Izolarea i caracterizarea pectinelor din diferite esuturi vegetale a
evideniat prezena n pereii celulari a mai multor tipuri de substane
pectice. n funcie de structur, substanele pectice au fost clasificate de
ONeill (1990) n:
homogalacturonani - catene de resturi de acid galacturonic legate (14) glicozidic, metilate sau nemetilate;
ramnogalacturonani de tipul I (RG-I) - o familie de polizaharide nrudite,
la care catena de baz are o structur de forma: 4)--D-Galp A-(12)-L-Rhap-(1. Aproximativ 50% din resturile de ramnoz din structur
sunt substituite la C-4 cu oligozaharide neutre (galactoz, arabinoz i
puin fucoz);
ramnogalacturonani de tipul II (RG-II) - n structura crora unele resturi
de acid galacturonic au ataate la C-2 sau C-3
aldo i ceto
oligozaharide;
arabinani, galactani i arabinogalactani, care alctuiesc catenele
laterale a polizaharidelor pectice.
166
D. Dinu
Substanele pectice se gsesc aproape n toate organele plantelor.

Aceste polizaharide sunt componentele majore ale pereilor primari ai
dicotiledonatelor i monocotiledonatelor. Pereii celulari ai graminaceelor
conin cantiti mai mici de substane pectice. Cantiti mari de substane
pectice se gsesc n pulpa fructelor crnoase (mere, pere, ananas) precum
i n sfecla de zahr.
Cantiti importante de substane pectice au fost determinate n
diferite deeuri rezultate n industria alimentar (coji de citrice, borhot de
sfecl, tre de gru, resturi de pulp de fructe). Prezena substanelor
pectice n aceste deeuri justific utilizarea acestora ca inductori ai
enzimelor pectinolitice microbiene.
2.Clasificarea i nomenclatura enzimelor

pectinolitice
n general, n categoria enzimelor pectinolitice sunt incluse enzimele
care acioneaz asupra homogalacturonanilor i ramnogalacturonanilor.
Enzimele pectinolitice cuprind: o esteraz, apte poligalacturonaze
(nume generic preluat dup Whitaker, 1990) i patru liaze. Dintre acestea
numai o parte sunt incluse n Enzyme Nomenclature i au numr de cod.
Clasificarea i nomenclatura enzimelor pectinolitice este prezentat n
Tabelul 1.
Unii cercettori au inclus -D-arabinofuranozidaza i endoarabinaza,
enzime care acioneaz asupra arabinanilor din structura substanelor
pectice, n categoria enzimelor pectinolitice. Majoritatea enzimologilor i
microbiologilor nu sunt familiarizai cu aceste dou enzime, enzime care
nu au fost incluse n nici un volum din seria Methods in Enzymology.
Modul
de
aciune
al
principalelor
enzime
pectinolitice
(endopoligalacturonaza, exopoligalacturonaza, endopectat liaza, exopectat
liaza, pectin liaza i pectinesteraza) este prezentat n Figura 2.
Cercetri recente au evideniat existena altor dou enzime
implicate n degradarea polimerilor pectici, ramnogalacturonaza i -1,4-Dgalactanaza. Unele tulpini de Aspergillus aculeatus biosintetizeaz o
ramnogalacturonaz, enzim care scindeaz legturile dintre resturile de
acid galacturonic i cele de ramnoz din structura ramnogalacturonanilor
pectici (Beldman i alii 1996, Hennink i alii 1996). Yamaguchi (1995) a
izolat din culturile de Aspergillus niger o endo--1,4-D- galactanaza,
protein cu mas molecular de 32 000 Da, care hidrolizeaz
polizaharidele pectice din soia cu eliminare de oligomeri galactozidici i
galactoz. O tulpin de Echerichia coli s-a dovedit a fi capabil s
biosintetizeze o pectin acetil esteraz (Shevchik i alii 1997).
3. Surse de izolare ale enzimelor pectinolitice

Enzimele pectinolitice sunt larg rspndite la microorganisme i la
plantele superioare.
167
Ele joac un rol important n procesele de cretere, n plantele

superioare permind elongaia celulelor. Enzimele pectinolitice de origine
vegetal sunt implicate n procesele de nmuiere a esuturilor n timpul
maturrii i stocrii. Endopoligalacturonazele, exopoligalacturonazele,
pectinesterazele apar, separat sau mpreun, n diferite organe ale
plantelor. Din surse vegetale nu au fost izolate proteine cu activitate
pectat, sau pectin liazic.
Enzimele pectinolitice au fost separate i caracterizate din: roii,
ciree, piersici, portocale, grepfruit, papaia, mango, soia, in, msline,
polen.
Prezena enzimelor pectinolitice a fost semnalat i la insecte. n
larvele de Conotrachelus nenuphar a fost semnalat prezena
pectinesterazei, endopoligalacturonazei, pectat liazei i pectin liazei.
Aceste enzime sunt eliberate atunci cnd larvele se hrnesc, fiind capabile
s produc o macerare a esuturilor fructelor i, mpreun cu celulazele,
sunt responsabile de cderea prematur a merelor i prunelor infectate de
aceste larve. Activitatea poligalacturonazic a fost decelat n saliva
ploniei verde, Schizaphis graminum i n cea a grgriei orezului,
Sitopilulus oryzae.
Un numr mare de ageni patogeni ai plantelor, n special fungi i
bacterii, produc enzime pectinolitice. Acestea, mpreun cu alte proteine,
trec n mediul interior al gazdei i joac un rol important n procesele de
colonizare i infectare a plantelor.
Majoritatea microorganismelor
investigate produc cel puin dou tipuri de enzime pectinolitice cu aciune
sinergic care formeaz un sistem activ de degradare a polimerilor pectici.
Majoritatea enzimelor pectinolitice de origine microbian sunt inductibile,
fiecare tip de enzim avnd inductori specifici.
168
D. Dinu
169
Figura 2. Modelul unei molecule de pectin i de pectat. Punctele de atac ale enzimelor
pectinolitice.
Din clasa fungilor, speciile de Aspergillus sunt cele mai bune

productoare de enzime pectinolitice. Acestea biosintetizeaz n cantiti
mari endo i exopoligalacturonaze. Poligalacturonazele de la Aspergillus
sp. prezint forme moleculare multiple cu un determinism genetic diferit
(Statilova i alii 1993). Unele Aspergillus sp., ca de exemplu Aspergillus
niger, cultivate pe medii corespunztoare, produc i pectinesteraze, pectat
sau pectin liaze (Dinu i alii 1997, Dinu i alii 1998).
Alte specii de fungi productoare de enzime pectinolitice sunt:
Botrytis cinerea (ten Have i alii 2001, Rho i alii 2001), Fusarium sp.
(Garcia-Marceira i alii 2001, Niture i alii 2001), Penicillium sp.
(Chelegatti i alii 2000), Verticillium sp. (James i alii 2001).
Diferite specii de bacterii, (Cellovibrio, Clostridium, Erwinia,
Lactobacillus, Pseudomonas), produc una sau mai multe tipuri de enzime
pectinolitice. Echipamentul pectinolitic al acestora este diferit de cel al
fungiilor. Bacteriile i fungii secret poligalacturonaze i pectinesteraze.
Diferena ntre cele dou clase const n tipul de enzime care acioneaz
asupra polizaharidelor pectice prin mecanisme de transeliminare: pectin
liazele sunt enzime caracteristice fungilor, iar pectat liazele apar cu
precdere la bacterii.
Enterobacteria
Erwinia
chrysanthemi
realizeaz
degradarea
substanelor pectice din pereii celulari ai plantelor invadate prin
intermediul mai multor tipuri de enzime: pectin metilesteraza, pectin
acetilesteraza, pectat liaza i pectin liaza. Erwinia chrysanthemi se
caracterizeaz prin abilitatea de a secreta mai multe izoenzime ale
endopectat liazei, izoenzime care au un rol major n procesele de putrezire
a plantelor infestate cu aceast bacterie. De la o tulpin de Erwinia
chrysanthemi au fost caracterizate opt endopectat liaze, respectiv PelA,
PelB, PelC, PelD, PelE, PelI, PelL i PelZ i o exopectat liaz, PelX. Primele
cinci forme aparin familiei 1 de pectat liaze, familie care include pectat
liaze bacteriene i pectin liaze fungice, enzime cu structur primar
asemntoare. PelI aparine familiei 2, familie n care sunt ncadrate liaze
de la Erwinia carotovora. PelL i PelX fac parte din familia 4, iar PelZ din
familia 5.
Diversificarea biotehnologiilor care utilizeaz enzime pectinolitice i
nevoia tot mai mare de preparate enzimatice cu activitate pectinolitic
complex, au determinat gsirea de noi surse microbiene care s produc
astfel de enzime. Aceast necesitate a determinat extinderea cercetrilor
i la drojdii. Cercetri recente au artat c unele specii de drojdii, cultivate
pe medii care conin substane pectice, sunt productoare de enzime
pectinolitice. Drojdia metilotrof Candida boidinii
biosintetizeaz
poligalacturonaz, pectinesteraz, pectin i pectat liaz (Nakagawa i alii
2000), Kluyveromyces marxianus numai poligalacturonaz (Jia i alii
2000), iar unele specii de Saccharomyces - poligalacturonaz,
pectinesteraz i pectin liaz (Gomes i alii 2001).
170
D. Dinu
Majoritatea enzimelor pectinolitice produse de microorganisme sunt

inductibile. Fiecare tip de enzim are inductori specifici. Penicillium
frequentans, crescut pe medii n care sursa de carbon a fost pectina,
poligalacturonatul de sodiu sau acidul galacturonic, a biosintetizat 11
poligalacturonaze i 3 pectinesteraze. Acelai microorganism cultivat pe
mediu de glucoz a produs 2 poligalacturonaze i o pectinesteraz
(Chellegatti i alii 2000).
Tehnica DNA recombinat a fost utilizat pentru a obine tulpini nalt
productoare de enzime pectinolitice. Khahn (1991) a clonat gena care
codific pectinesteraza, a expresat-o la o tulpin slbatic de Aspergillus
niger, ceea ce a condus la o cretere de douzeci de ori a activitii
esterazice. Genele care codific endopoligalacturonaze fungice au fost
clonate, secvenializate i expresate la drojdii de tipul Saccharomzces
cerevisiae i Kluyveromzces marxianus (Jia i alii 2000, Vilanova i alii
2000).
4.Enzimele pectinolitice de origine microbian:

specificitate, mecanism de aciune, structur,
proprieti
4.1. Pectinesterazele
Pectinesterazele (EC 3.1.1.11) hidrolizeaz pectinele ndeprtnd
grupri metoxi de la gruprile 6-carboxilice ale resturilor de acid
galacturonic.
Aceste enzime prezint specificitate de grup, recunoscnd din
structura substratului partea D-galacturonic i legtura esteric.
Elucidarea specificitii manifestate de pectinesteraze s-a realizat prin
studii pe pectine modificate chimic. Studiile ntreprinse cu pectine n care
o parte din gruprile carboxil sunt reduse sau pe metilesterii acidului
alginic au artat imposibilitatea pectinesterazelor de a hidroliza astfel de
substraturi. Aceste experimente au evideniat nalta specificitate a acestor
enzime fa de structuri poli-D-galacturonanice. Specificitatea fa de
partea alcoolic este mai redus, pectinesterazele fiind capabile s
hidrolizeze cu viteze mai mici, etil, propil i alil esterii acidului pectinic.
Viteza de hidroliz a substratului este influenat i de gradul de
policondensare al acestuia, diminundu-se odat cu scderea acestuia
(Rexov-Benkov i alii 1976).
Mecanismele prin care acioneaz pectinesterazele au fost elucidate
pe baza experimentelor ntreprinse de Miller i colaboratorii (1971).
Studiile n acest sens au fost realizate pe pectin cu grad de
policondensare 33 i grad de esterificare 96%. Substratul a fost supus
iniial aciunii unei exopectat liaze purificat din Clostridium
multifermentans, enzim care acioneaz secvenial de la captul
reductor. Aciunea liazei asupra substratelor nalt esterificate a fost
neglijabil, dar a crescut rapid la adiia unei pectinesteraze purificate din
Fusarim oxysporum. n urma acestor experimente, s-a tras concluzia c,
majoritatea aciunii esterazei decurge la captul reductor al moleculei de
171
pectin. Monitorizarea simultan i continu a celor dou tipuri de

activiti pectinolitice a indicat c 57% din activitatea pectinesterazei din
Fusarim oxysporum decurge de la captul reductor al substratului.
Experimente similare ntreprinse cu o protein multienzimatic purificat
din Clostridium multifermentans, care posed activitate esterazic i
exopectat liazic, au artat c, n cazul acestui microorganism,
deesterificarea pectinei nalt metilate decurge exclusiv de la captul
reductor.
Modul de aciune i specificitatea pectinesterazei din Aspergillus
niger au fost studiate de Kester i colaboratorii (2000) utiliznd
oligogalacturonai total metilai cu grade de condensare cuprinse ntre 2 i
6 (Kester i colaboratorii 2000). Natura produulor de reacie a fost
determinat prin cromatografie de nalt performan (HPLC) pe anionii,
iar localizarea gruprilor esterice, marcate n prealabil cu 18O , n structura
produilor de reacie a fost posibil prin spectrometrie de mas. Aceste
studii au artat c pectinesteraza din Aspergillus niger este capabil s
hidrolizeze i digalacturonai total metilai. Enzima hidrolizeaz cu vitez
mai mare legturilre esterice localizate pe resturile de acid galacturonic
din interiorul substratului. Dup hidroliza acestor legturi sunt eliberate
gruprile metilice de la resturile de acid galacturonic de la capetele
reductoare ale oligogalacturonailor, n timp ce gruprile de la captul
nereductor nu sunt hidrolizate.
Unele dintre pectinesterazele microbiene au structur glicoproteic.
Rijssel (1993) a izolat un complex pectinolitic din Clostridium
thermosaccharolyticum care posed activitate poligalacturonazic
i
pectinesterazic. Proteina complex s-a dovedit a fi o glicoprotein cu
resturi de N-acetil galactozamin i galactoz.. Pectinesteraza purificat
de Shevchik i colaboratorii (1996a) din Erwinia chrysanthemi s-a dovedit
a fi o lipoprotein din membrana extern, cu o secven palmitat la
extremitatea N-terminal.
Experimentele de mutagenez dirijat realizate de Duwe (1996) pe
pectinesteraza din Aspergillus niger au vizat dou resturi de histidin din
structura enzimei. Substituirea restului de histidin din poziia 137 cu un
rest de alanin a avut ca efect pierderea total a activitii, n timp ce
aceeai substituie la histidina din poziia 188 nu a avut nici un efect. Pe
baza acestor rezultate s-a tras concluzia c restul de histidin din poziia
137 este esenial n activitatea catalitic, fcnd probabil parte din
centrul catalitic activ.
Markovic (1996) a evideniat prezena a ase resturi de histidin n
structura pectinesterazei din Aspergillus niger. Tratamentul cu
dietilpirocarbonat a artat o inactivare a enzimei proporional cu
cantitatea de inhibitor. Aceste rezultate au sugerat c histidina nu face
parte din centrul catalitic al acestei enzime, dar este implicat n
stabilizarea structurilor de ordin superior.
Proprietile pectinesterazelor de origine microbian sunt prezentate
n Tabelul 2. Cu excepia enzimei din Clostridium multifermentans,,
pectinesterazele de origine microbian au mase moleculare cuprinse ntre
27 000 i 48 000 Da. Punctul izoelectric variaz ntre 3,6 i 7,4, iar pH-urile
optime ntre 4,2 i 9,0. Constantele Michaelis variaz n limite largi,
172
D. Dinu
valorile acestora fiind influenate de modul de exprimare a concentraiei

substratului.
Acidul poligalacturonic este un inhibitor al pectinesterazelor. Datorit
acestui fapt, cationii monovaleni (n special Na+ i K+) n concentraii
cuprinse ntre 50 i 100mM, i cationii divaleni (n special Ca2+) n concentraii ntre 5
i 10mM, provoac o cretere a activitii specifice. Schejter (1988) a artat
c poligalacturonatul de sodiu este un inhibitor competitiv pentru cele
dou pectinesteraze din Botridis cinerea, constantele de inhibiie avnd
valori de 2,8 i, respectiv, 0,11 mg/ml.
Manjou (1992) a determinat pentru o pectinesteraz microbian o
constant de inhibiie a acidului poligalacturonic de 0,44 mg/ml. Studiile
sale au artat c aceast inhibiie dispare atunci cnd esteraza a fost
coimobilizat pe suporturi de sticl poroas cu o endopoligalacturonaz.
Un alt inhibitor competitiv al acestor enzime s-a dovedit a fi i metanolul
(Maldonado i alii 1994).
173
Pectinesteraza II, izolat de Lim (1983) din culturi de Aspergillus oryzae a

fost total inhibat de HgCl2. Ali inhibitori ai pectinesterazelor microbiene
s-au dovedit a fi: CuCl2, AlCl3 (Lim i alii 1983, Sakelaris i alii 1989a),
iodul (Markovic i alii 1989), reactivi pentru grupri SH de tipul Netilmaleiimida, p-cloromercuribenzoatul de sodiu, iodacetamida (Lim i alii
1983, Cardello i alii 1995).
4.2. Protopectinazele
Degradarea protopectinei a fost atribuit iniial aciunii sinergice a
pectinesterazei i endopoligalacturonazei i/sau pectin liazei. Studiile
ntreprinse de Sakai i colaboratorii si au pus n eviden capacitatea
unor microorganisme de a produce o enzim care solubilizeaz
protopectina. Aceast nou enzim, denumit protopectinaz, degradeaz
protopectina cu eliberare de polimeri pectici solubili, fr a produce
macerarea esuturilor plantelor. Cercetrile ntreprinse de Sakai i grupul
su asupra acestei enzime, au fost sumarizate i publicate n volumul 161
din seria Methods in Enzymology (Sakai i alii 1988).
Protopectinaza a fost purificat i cristalizat de Sakai (1988) din
Kluyveromyces fragilis (protopectinaza F), Galactomyces reessii (protopectinaza L) i din Trichosporon penicillatum
(protopectinaza S).
Proprietile fizice- chimice i cinetice ale acestor enzime sunt prezentate
n Tabelul 3.
Masele moleculare ale celor trei protopectinaze, estimate prin
aceeai tehnic, au avut valori foarte apropiate. Coeficienii de extincie la
280nm (E280) au valori apropiate, dar nu identice, datorit diferenelor
existente ntre cele trei protopectinaze la nivelul compoziiei n aminoacizi
aromatici. Valorile pI indic c protopectinaza F este o protein acid, iar
protopectinazele L i S sunt proteine bazice. Toate trei protopectinazele
sunt glicoproteine, dar cantitatea de carbohidrai este diferit.
174
D. Dinu
Compoziia n aminoacizi, diferit pentru cele trei protopectinaze,

are o caracteristic comun: lipsa metioninei (protopectinaza L) sau
prezena ei n cantitate foarte mic (protopectinazele F i S au un singur
rest de metionin n structur). Protopectinazele S i L au la captul Nterminal un rest de glicin i o secven identic de 27 resturi de
aminoacizi.
Datele prezentate n Tabelul 3 arat asemnri la nivelul unora
dintre proprieti, mai ales ntre protopectinazele L i S, enzime care s-au
dovedit a fi identice din punct de vedere imunologic. Pentru toate cele trei
protopectinaze poligalacturonatul de sodiu s-a dovedit a fi un substrat mai
bun dect protopectina de diferite proveniene.
Utiliznd ca substrate tri-, tetra- i pentagalacturonai, Sakai (1988)
a determinat modul de aciune i constantele cinetice pentru cele trei
protopectinaze (Figura 3). Rezultatele obinute au evideniat o aciune
similar a protopectinazelor F, L i S asupra substratelor cu 3 i 4 resturi
de acid galacturonic. Hidroliza trigalacturonatului decurge prin
ndeprtarea unui rest de acid galacturonic de la captul reductor, iar
degradarea tetragalacturonatului decurge prin eliminarea unei molecule
de acid galacturonic sau de digalacturonat de la captul reductor (Figura
3).
Modul de aciune asupra pentagalacturonatului a fost diferit. Astfel,
protopectinazele F i S ndeprteaz o molecul de acid galacturonic sau
una de digalacturonat de la captul reductor al moleculei
pentagalacturonice, n timp ce protopectinaza L ndeprteaz doar un rest
de acid galacturonic din structura acestui oligogalacturonat. Pe baza
raportului Vmax / KM , numit coeficient specific, Sakai (1988) a demonstrat c
specificitatea celor trei enzime pentru substrate crete n ordinea tri-,
tetra- i penta-galacturonai. n ceea ce privete aciunea asupra
poligalacturonailor,
modul de scindare depinde i de gradul de
policondensare. Cnd cele trei protopectinaze au acionat asupra acidului
poligalacturonic, produii de reacie obinui au avut 2-3 resturi de acid
galacturonic n structur. Cnd substratul a fost o pectin cu grad de
metilare de 30%, produii au avut 4-5 resturi de acid galacturonic n
structur; utilizarea unei pectine cu grad de metilare de 70% a condus la
obinerea de produi avnd ntre 9 i 15 resturi de acid galacturonic n
structur. Pe baza acestor rezultate, Sakai (1988) a sugerat posibilitatea
ca aceste enzime s reacioneze cu protopectina la situsuri care conin
trei, sau mai multe resturi de acid galacturonic nemetilate i s scindeze
hidrolitic substratul.
Tabelul 3. Proprietile protopectinazelor F, L i S
Proprietate
175

Mas molecular relativ
Electroforez SDS-PAGE
Gel-cromatografie
Echilibru de sedimentare
E280
pI
Coninut n glucide (%)
pH optim
Temperatur optim(oC)
Termostabilitate (oC)
Stabilitate la pH
Activitate ( U/mg)
Protopectin
Poligalacturonat
KM (mg/ml)
Protopectin
Poligalacturonat*
Inhibitori
a
*
40 000
33 000
32 800
10,0
5,0
5,9a
5,0
60
pn la 40
2-8
40 000
30 000
29 200
11,9
8,4-8,5
5,1b
5,0
55
pn la 50
3-7
40 000
30 000
29 300
9,2
7,6-7,8
1,7a
5,0
50
pn la 55
3-7
556
2 050
3 940
16 200
5 770
21 100
90
6,6
Hg2+,Hg+,Ag+
Ca2+,Ba2+,Pb2+
50
7,7
Hg2+,Hg+,Ca2+,
Ba2+,Co2+
30
9,0
Hg2+,Hg+,Ca2+,
Ba2+,Co2+
determinat ca manoz; b determinat ca ramnoz

Poligalacturonatul utilizat a avut un grad de policondesare de 130.
Experimentele realizate de Iguchi (1996) au evideniat c, sub

aciunea radiaiilor se obin mutante de Trichosporon penicillatum
capabile de a produce trei protopectinaze cu proprieti asemntoare,
desemnate ca protopectinazele SE1, SE2 i SE3. Din filtratele culturilor de
Bacillus subtilis au fost purificate protopectinaze (protopectinaze C) care
nu acioneaz asupra acidului poligalacturonic. Una dintre acestea a avut
o mas molecular de 50 000 Da, pI 5.3 i a prezentat termostabilitate
pn la 70OC. Aceast enzim a manifestat activitate protopectinazic pe
fibre de bumbac i pe protopectina din lmie, dar i activitate pectat
liazic (Takao i alii 2000). Din culturile de Bacillus subtilis au fost izolate
alte dou protopectinaze, una cu activitate ramnogalacturonazic (Sakai i alii 1993), iar
cealalt cu activitate arabinazic (Sakamoto i alii 1995).
Protopectinazele descrise n literatur manifest specificitate diferit
fa de protopectinele de diferite proveniene. Astfel, protopectinaza din
Trichosporon penicillatum acioneaz cu viteze diferite asupra
protopectinelor din portocale, grapefruit, cartofi, morcovi, pere, piersici
(Sakamoto, 1995), i o degradeaz cel mai bine pe cea din cartofi
(Nakamura, 1995). Protopectinaza din Bacillus subtilis degradeaz cel mai
rapid protopectinele din morcovi (Nakamura, 1995).
Existena unor enzime capabile s degradeze protopectina, forma insolubil a
polizaharidelor pectice, este contestat de multe cercetri din domeniu. Majoritatatea
cercetrilor consider c degradarea protopectinei se datoreaz aciunii
sinergice a poligalacturonazei, pectinesterazei i pectat sau pectin liazei. Aceast
ipotez se bazeaz pe faptul c toate enzimele capabile s acioneze asupra protopectinei
izolate i caracterizate pn n prezent posed i o a doua funcie catalitic. Aceast a doua
funcie poate fi, de la caz la caz, poligalacturonazic, pectat liazic, ramnogalacturonazic sau
arabinazic.
176
D. Dinu
4.3. Endopoligalacturonazele
177
Endopoligalacturonazele (EC 3.2.1.15) sunt enzime care hidrolizeaz

legturile glicozidice din structura poligalacturonailor ntr-o manier mai
mult sau mai puin ntmpltoare, formnd oligogalacturonai. Aciunea
acestor enzime determin scderea pronunat a vscozitii soluiei
substratului.
Endopoligalacturonazele acioneaz preferenial asupra acizilor
pectici i a pectinelor slab esterificate. Studiile ntreprinse asupra
endopoligalacturonazei purificate din Corticium rolfsii au artat c aceast
enzim scindeaz, n ordine, acidul poligalacturonic, pectina 67%
esterificat i pectina 91% esterificat, cu viteze de 100%, 12% i,
respectiv, 1,5%.
Utilizarea acizilor pectinici n calitate de substrate a
acestor enzime a condus la obinerea de rezultate neconcludente, n
structura acestora existnd poriuni de resturi de acid galacturonic
neesterificate, poriuni suficient de mari ca s permit aciunea
endopoligalacturonazei. Studiile ntreprinse de Chen i colab. (1996)
asupra produilor de reacie obinui sub aciunea endopoligalacturonazei
din Erwinia carotovora au evideniat capacitatea acestei enzime de a
hidroliza pectinele cu grade de metilare de 16%, 32% i 52%, care au n
structur patru resturi adiacente de acid galacturonic.
Mrimea moleculei substratului este un factor care influeneaz
activitatea acestor enzime. Ele acioneaz cu vitez maxim asupra
substratelor cu numr mare de resturi de acid galacturonic, cu viteze
reduse asupra oligogalacturonailor i nu scindeaz digalacturonatul.
Determinarea produilor de reacie formai n fazele incipiente ale
reaciei
a
permis
diferenierea
ntre
endo
i
exo
enzime:
endopoligalacturonazele produc oligozaharide diferite i cantiti mici de
mono-i digalacturonai, n timp ce exopoligalacturonazele produc mono i
digalacturonai
n cantitate mare.
Lim (1980)
a artat c
endopoligalacturonaza din Rhizopus arrhizus nu produce oligomeri n
primele 40 minute de reacie, iar molecule monomere de acid galacturonic
apar abia dupdouore.
Elucidarea mecanismului prin care acioneaz aceste enzime s-a
realizat n urma analizei produilor de reacie obinui pe substrate
polimere i oligomere. Rezultatele obinute au artat c natura produilor
depinde de mrimea regiunii de contact dintre substrat i situsul activ,
mrime care afecteaz constantele cinetice de reacie, K M i Vmax.. Astfel,
sub aciunea endopoligalacturonazelor, pentru care mrimea substratului
este relativ neesenial n legare, se formeaz cantiti mici de produi
intermediari, iar mecanismul dup care acioneaz aceste enzime a fost
denumit
impropriu
single
chain
attack.
n
cazul
endopoligalacturonazelor, care se leag mai puternic de poligalacturonaii
cu mase mari dect de cei cu mase mici, concentraia produilor
intermediari este ridicat, mecanismul de aciune fiind denumit multichain attack. Studiind cinetica reaciei de hidroliz a substratelor sub
aciunea endo-poligalacturonazei purificate din Saccharomyces fragilis,
Demain (1954) a observat trei etape de reacie. n prima etap, etap care
decurge rapid, sunt scindate aproximativ 25% din legturile glicozidice din
structura substratului cu eliberarea tetra-, tri- i digalacturonai. n etapa a
178
D. Dinu
doua, etap mult mai lent, gradul de hidroliz crete la 50%, iar
tetragalacturonaii sunt hidrolizai la tri- i monogalacturonai. n ultima
etap, etap foarte lent, trigalacturonaii sunt scindai la digalacturonai
i acid galacturonic.
Pentru a explica diversitatea produilor rezultai sub aciunea
poligalacturonazelor de proveniene diferite, Rexov-Benkov (1976) a
propus trei modele care s explice modul de aciune al
poligalacturonazelor. Cele trei modele, numite A, B i C, sunt prezentate n
Figura 4. Endopoligalacturonazele din Aspergillus niger i cele din
Trichoderma reessi urmeaz modelul A, caracterizat prin scindarea
tetramerilor la trimeri i acid galacturonic, i prin scindarea extrem de
lent a trimerilor. Modelul B, caracterizat printr-o scindare alternativ a
tetramerilor (la trimeri i acid galacturonic sau la dou molecule de
digalacturonat) i prin degradarea rapid a trimerilor, a fost evideniat la
endopoligalacturonazele din roii. Modelul C, pus n eviden pentru endoenzima de la Erwinia carotovora, se deosebete de celelalte mecanisme
printr-o scindare specific a pentamerilor i a hexamerilor.
Avnd n vedere faptul c modul de aciune i specificitatea de
substrat a enzimelor depinde de natura situsului activ, Rexov-Benkov
(1976) a considerat c endopoligalacturonazele care acioneaz dup unul
din cele trei modele au centre catalitice diferite, alctuite dintr-un numr
diferit de subsitusuri.
Studii recente (Bonnin i alii 2001) au evideniat atacul multiplu
asupra substratelor i n cazul endopoligalacturonazei din Fusarium
moniliforme. Afinitatea i viteza maxim de reacie cresc cu creterea
lungimii catenei substratului. Situsul catalitic al enzimei este alctuit din
cinci subsitusuri, iar produii finali de hidroliz ai homogalacturonanilor
sunt monomeri i dimeri ai acidului galacturonic.
Stereochimia aciunii hidrolitice a dou endopoligalacturonaze din
Aspergillus niger, a fost investigat de Biely (1996a i b) cu ajutorul
spectroscopiei 1H-RMN. n mediu de D2O, toi produii de reacie au avut
noul capt reductor n conformaie , fapt care arat aciunea invertiv a
acestor enzime.
Model
A
Substrat
O-O-O
Produi de reacie
O-O + O
O-O-O + O
O-O-O-O + O
O-O-O + O-O
O-O-O-O-O + O
O-O-O-O + O-O
O-O-O + O-O-O
O-O-O-O
O-O-O-O-O
O-O-O-O-O-O
179
O-O-O
O-O-O-O
O-O-O-O-O
C
O-O-O
O-O-O-O
O-O-O-O-O
O-O-O-O-O-O
O-O + O
O-O-O + O
O-O + O-O
O-O-O-O + O
O-O-O + O-O
O-O + O-O-O
O-O + O
O + O-O
O-O-O + O
O-O + O-O
O-O-O + O-O
O-O-O + O-O-O
O-O-O-O + O-O
Figura 4. Posibiliti de aciune a endopoligalacturonazelor pe substraturi mici

(O reprezint o molecul de acid galacturonic).
Pe baza studiilor de variaie a constantelor cinetice cu pH-ul, RexovBenkov (1976) a sugerat implicarea n mecanismul de aciune al
endopoligalacturonazei din Aspergillus niger a unei grupri carboxil i a
unei grupri imidazol protonate a histidinei.
Cercetrile intreprinse de Statilova i colab. (1996b) au evideniat
prezena n structura situsului activ al endopoligalacturonazei de la
Aspergillus niger a unui rest de tirozin, rest ionizat la pH 10,5. Studiile de
modificare chimic a unor resturi de aminoacizi din structura
endopoligalacturonazei din Aspergillus ustus au indicat participarea unui
rest de triptofan n legarea substratului i a unui rest de histidin n actul
catalitic (Rao i alii 1996 a i b, Niture i alii 2001). Pe baza acestor
studii, Rao i colab. (1996b) au presupus c n mecanismul de aciune al
acestei enzime are loc transferul unui singur proton de la restul de
histidin la O glicozidic din structura substratului, transfer urmat de
hidroliz prin adiia unei molecule de ap.
Studiile structurale realizate de Statilov (1998b) au pus n eviden
caracterul glicoproteic al formelor multiple ale poligalacturonazei din
Aspergillus niger. n structura celor dou forme majore ale
poligalacturonazei sunt prezente resturi de N-acetilgalactozamin i
manoz. i endopoligalacturonaza din Aspergillus aculeatus s-a dovedit a
fi o glicoprotein cu o structur secundar n care motivul predominant
este -structura paralel (Cho i alii 2001).
Endopoligalacturonazele au fost purificate i caracterizate din mai
multe surse microbiene. Proprietile ctorva endopoligalacturonaze sunt
prezentate n Tabelul 4. Aceste enzime au mase moleculare cuprinse
ntre 30 000 i 85 000 Da, pI variind n domeniul 3,7-8,3. Toate
endopoligalacturonazele au pH optim acid, cuprins ntre 3,8 i 5,5.
180
D. Dinu
Comparativ cu alte enzime pectinolitice, valorile K M pentru poligalacturonat

variaz pe un domeniu destul de ngust, cuprins ntre 0,14 i 4,7 mg/ml.
Efecte inhibitoare asupra endopoligalacturonazelor au urmtoarele
substane:
HgCl2, cu o valoare a constantei de inhibiie de 6,8x10 -5M (Blanco i
alii 1994);
acidul tanic (Liu 1978 , Elegado 1994);
pectina, n concentraii de ordinul 10 -3 g/100ml, determin o inhibiie
competitiv (Schejter 1988);
NaCl n concentraie de peste 1o/oo inhib endopoligalacturonazele din
bacteriile marine (Mountfort 1995);
epicatechina, n concentraii cuprinse ntre 20-80 g/ml, inhib cu 6,5%
i respectiv 43% cele dou endopoligalacturonaze din Colletotrichum
gloeosporioides (posibil ca epicatechina s regleze activitatea endopoligalacturonazelor fungice n fructele infestate) (Pruski 1989);
CaCl2 i BaCl2, n concentraii de 5x10-3M, au efect inhibitor datorat
precipitrii pariale a acidului poligalacturonic.
4.4. Exopoligalacturonazele
Exopoligalacturonazele (EC 3.2.1.67) hidrolizeaz poligalacturonaii
cu eliberarea acidului galacturonic, producnd o scdere mai redus a
vscozitii soluiei substratului comparativ cu endopoligalacturonazele.
Aciunea exopoligalacturonazelor de origine vegetal i microbian ncepe
de la captul nereductor al moleculei. Modul de aciune al acestor enzime
a fost determinat pe baza observaiilor experimentale care au artat c,
aceste enzime nu atac substratele care au la extremitatea nereductoare
un rest de acid galacturonic 4:5 nesaturat sau un deoxizahar.
n literatura de specialitate au fost descrise i exopoligalacturonaze
care
atac
substratul
la
captul
nereductor
cu
eliberarea
digalacturonatului. Astfel de enzime au fost izolate de la Erwinia aroideae
i de la unele specii de Pseudomonas i au denumirea corectde poli-(1,4-D-galacturonid) digalacturonohidrolaza.
Exopoligalacturonazele nu degradeazcomplet poligalacturonaii,
activitatea lor depinznd de gradul de policondensare al acestora i de
proveniena lor. Astfel, exopoligalacturonaza din Aspergillus tubingensis
(Kester i alii 1996 a i b) a fost capabil
s hidrolizeze i
oligogalacturonai cu grade de condensare cuprinse ntre 2 i 7, dar
activitatea cea mai mare s-a nregistrat pe poligalacturonai cu mase
moleculare mari.
181
182
D. Dinu
Studiile
ntreprinse
de
Biely
(1996a)
au
artat
c
exopoligalacturonaza
din
Aspergillus
tubingensis,
ca
i
endopoligalacturonazele din Aspergillus niger, determin modificarea
configuraiei la nivelul gruprii reductoare a produsului de reacie.
Proprietile fizico-chimice au fost stabilite pentru un numr mic de
exopoligalacturonaze microbiene.
183
Hara (1984) a izolat dou exopoligalacturonaze din culturile de

Aspergillus niger. Exopoligalacturonaza I a avut masa molecularde 66 000
Da, pH optim 3,8, temperatura optim 600C, pI 5,6, KM pentru acid pectic
de 20 mg/ml i de 6,5 mg/ml pentru acid digalacturonic.
Exopoligalacturonaza II a avut masa molecularde 63 000 Da, pH optim
4,5, temperatura optim 600C, pI 5,8, KM pentru acid pectic 3,85 mg/ml i
de 5,0 mg/ml pentru acid digalacturonic. Concentraii de HgCl 2, cuprinse
ntre 0,002M i 0,2M, au activat ambele enzime, dar mai ales forma
molecular I.
Prezena a dou exopoligalacturonaze n culturile de Aspergillus
niger a fost evideniati de Behere (1993). Ambele forme ale exoenzimelor
au avut pH optim de 5,0, iar valorile K M raportate la
poligalacturonatul
de
sodiu
au
fost
de
0,24%
i
0,12%.
Exopoligalacturonaza purificatde Heinrichova (1976) din culturi de
Aspergillus niger a avut un pH optim de 5,2.
Mikhailova (1995) a caracterizat dou exopoligalacturonaze din
Aspergillus alliaceus. Exopoligalacturonaza I a avut pH optim 3,5 i
temperatura optim 45-500C, iar pentru forma molecular II aceti
parametri au fost 6,8 i 350C.
Cele dou exopoligalacturonaze izolate de Devi (1996) de la
Aspergillus carbonarius au avut masele moleculare de 61 000 Da i,
respectiv 47 000 Da, acionnd optim la 430C, respectiv 540C.
O alt specie productoare de exopoligalacturonaz s-a dovedit a fi
Aspergillus tubingensis (Kester 1996 a i b). Enzima din aceast surs a
avut masa de 70 000 Da, pI cuprins ntre 3,7-4,4, pH optim de 4,2 i K M
fa de acidul poligalacturonic de 3,2 mg/ml. Enzima a fost inhibat
competitiv de acidul galacturonic (Ki= 0,3mM) i de acidul digalacturonic
(Ki= 0,4mM) O tulpin de Fusarium oxysporum s-a dovedit a fi capabil s
produc patru exopoligalacturonaze cu valori pI de 9,3, 7,35, 6,85 i 6,55.
Toate cele patru forme ale enzimei au fost inhibate de ionii de calciu
(Guevara, 1997).
O exopoligalacturonaz a fost purificat pn la omogenitate din
mediul de cultur al unei tulpini de Bacillus (Kobajashi i alii 2001).
Enzima a avut o mas molecular de
45 000 Da, pI 5,8 i o vitez
maxim de aciune asupra poligalacturonatului de sodiu la 60 0C i pH 7,0.
Spre deosebire de alte exopoligalacturonaze bacteriene, aceast
exopoligalacturonaz elibereaz doar acid monogalacturonic atunci cnd
acioneaz asupra acidului poligalacturonic, di-, tri,-tetra- i penta
galacturonailor.
Cercetri recente (Antov i alii 2001) au studiat cultivarea microorganismului
Polyporus squamosus ntr-un sistem apos bifazic, polietilen glicol/dextran, n prezena
melasei de sfecl de zahr ca surs de pectin. n supernatantul mediului de cultur activitatea
exopoligalacturonazic s-a dovedit a fi mai mare dect cea decelat n urma cultivrii n
sistem monofazic.
Datele prezentate arat necesitatea unor studii mai detaliate asupra
aceastei categorii de enzime pectinolitice. Singura proprietate care
difereniaz clar exopoligalacturonazele de oligogalacturonat hidrolaze
(enzime prezentate n paragraful 4.5) este preferina acestora pentru
substrate cu mase moleculare mari.
184
D. Dinu
4.5. Oligogalacturonat hidrolazele i oligogalacturonat liazele

Oligogalacturonat hidrolazele i oligogalacturonat liazele sunt
enzime pectinolitice cu aplicaii practice reduse i destul de puin studiate.
Oligogalacturonat hidrolazele scindeaz legturile glicozidice de la
captul nereductor al substratului. Aceste enzime difer de
exopoligalacturonaze prin faptul c manifest activitate specific mult mai
mare
fa de oligogalacturonai comparativ cu cea fa de
poligalacturonai i pectai. Oligogalacturonat liazele (EC 4.2.2.6)
acioneaz asupra oligogalacturonailor saturai i nesaturai prin trans
eliminare, ndeprtnd monomeri nesaturai de la captul reductor al
acestora. Pentru ambele tipuri de enzime, viteza de reacie descrete rapid
cu creterea gradului de policondensare, fiind de pn la 400 ori mai mic
pe substrate macromoleculare.
n Tabelul 5 sunt prezentate tipurile de oligogalacturonaze pectice
i specificitatea manifestat de acestea fa de diferite substraturi.
Cercetri recente (Heinrichowa, 1992) au evideniat biosinteza unei
D-galacturonan
digalacturonohidrolaze
de
ctre
Selenomonas
ruminantium enzim capabil s degradeze oligogalacturonai cu grade de
condensare cuprinse ntre 3 i 5.
Heinrichowa i colaboratorii (1994) au evideniat c Clostridium
lochheadii produce un complex de enzime pectinolitice n structura cruia
intr o galacturonat digalacturono hidrolaz (EC 3.2.1.82), o oligo-(Dgalactoziduronat) liaz (EC 4.2.2.6) i o endopectat liaz (EC 4.2.2.2).
Tabelul 5. Proprietile ctorva oligogalacturonaze microbiene dup
Whitaker (1990)
Substratea,b
Microorganism
Oligogalacturonat
hidrolaze
Bacillus sp.
Bacillus sp
Aspergillus nigerc
Oligogalacturonat
liaze
Erwinia aroideae
Erwinia carotovora
PH
opti
m
trimer > tetramer > pentamer >

dimer > acid pectic solubil;
6,5
n-dimer > n-trimer > n-tetramer

>
n-pentamer;
6,5
dimer > acid pectic solubil > ndimer;

7,0
n-dimer > n-trimer > dimer >
trimer > tetramer > acid pectic
solubil;
185
7,2
Pseudomonas sp.
n-dimer > dimer > trimer >

tetramer > pectat;
7,0
tetramer >trimer > n-trimer >

dimer > n-dimer > acid pectic
solubil >
pectat;
a
substratele sunt prezentate n ordinea vitezei cu care sunt scindate;
b
terminologia
utilizat: dimer, trimer, tetramer, pentamer - substrate
cu 2, 3, 4, respectiv 5 resturi de acid galacturonic; n-substrate nesaturate
cu resturi de acid 4,5 dehidrogalacturonic la captul nereductor; gradul
de policondensare a acidului pectic solubil este de 15-20; c proteina
posed dou tipuri de activiti hidrolazice acionnd asupra
digalacturonailor saturai i nesaturai.
4.6. Endopolimetilgalacturonazele
Prezena endopolimetilgalacturonazelelor (endopectin hidrolaze) la
unele microorganisme a fost raportat de o serie de cercettori; Friedurek
(1983), Wick (1982), Reddy (1983), Silley (1985). Toate aceste cercetri nu
au
reuit
s
evidenieze
aciunea
acestor
enzime
asupra
poligalacturonatului 100% metilat n absena pectinesterazei i pectin
liazei. Datorit acestui fapt, existena acestui tip de enzime este pus sub
semnul ntrebrii.
4.7. Endopectat liazele
Endopectat liazele (EC 4.2.2.2) hidrolizeaz poligalacturonai
ndeprtnd din structura acestora oligogalacturonai 4:5 nesaturai.
Dei endopectat liazele i endopoligalacturo-nazele acioneaz asupra
acelorai tipuri de substrate, endopectat liazele se difereniaz de
endopoligalacturonaze prin patru trsturi caracteristice:
sunt biosintetizate numai de microorganisme, n special de
bacterii i de fungii patogeni ai plantelor i alimentelor;
au pH-uri optime alcaline;
prezena ionilor de calciu este absolut necesar;

scindeaz legturile glicozidice prin mecanism de trans
eliminare, rezultnd un produs de reacie cu o dubl legtur
ntre atomii de carbon 4 i 5 ai galacturonatului.
n general poligalacturonaii i pectinele slab metilate sunt
substratele preferate ale endopectat liazelor. Exist totui diferene de la o
enzim la alta. Astfel, endopectat liazele izolate din dou tulpini de
Arthrobacter i dintr-o tulpin de Bacillus polymyxa, acioneaz cu viteza
cea mai mare asupra acizilor pectinici cu grade de esterificare de 21%,
44% i, respectiv, 26% (Whitaker i alii 1990).
Studiile ntreprinse de Bruhlmann (1995) au artat c endopectat
liaza, biosintetizat de o specie nesporulant de Amycolata, degradeaz
poligalacturonaii prin trans eliminare ntmpltoare, produii intermediari
186
D. Dinu
fiind o gam larg de oligogalacturonai 4,5 nesaturai. Aceti produi

intermediari sunt scindai n continuare sub aciunea catalitic a enzimei,
produii finali ai reaciei fiind de tipul dimerilor i trimerilor.
Activitatea endoliazic scade cu scderea lungimii catenei
substratelor, majoritatea endopectat liazelor degradnd extrem de lent
trigalacturonaii i tetragalacturonaii nesaturai. Pe baza acestor
constatri experimentale, Rexov-Benkov (1976) a propus dou tipuri de
mecanisme de aciune diferite (modele A i B). Endopoligalacturonazele
care acioneaz dup modelul A au ca substrate limit trigalacturonaii
nesaturai, n timp ce enzimele aparinnd modelului B nu pot scinda
aceti trimeri nesaturai.
Un mod de aciune diferit a fost evideniat de Preston (1992) n cazul
formelor moleculare ale endopectat liazei din Erwinia chrysanthemi. Forma
molecular notat PLa acioneaz prin mecanism random, conducnd la
formarea mai multor tipuri de produi, de la dimeri la decameri. Formele
PLb i PLc genereaz trimeri i tetrameri printr-o combinaie de
mecanisme endolitice i exolitice. Forma PLd produce prioritar dimeri i
acioneaz printr-un mecanism endolitic non random.
Dintre toate enzimele pectinolitice, endopectat liazele au fost cel
mai mult investigate din punct de vedere al structurii. Comparnd
secvenele de aminoacizi ale celor cinci pectat liaze produse de Erwinia
chrysanthemi, Tardy (1997) a pus n eviden existena a dou familii
enzimatice cu proprieti diferite. Prima familie include formele moleculare
de tip B i C, forme care pot aciona numai asupra pectinelor slab metilate
i au o afinitate de 10 ori mai mare pentru aceste substrate dect
endopectat liazele aparinnd familiei a doua. Cea de a doua familie
include formele A, D i E, forme active i pe substrate al cror grad de
metilare ajunge pnla 45%.
Studiile de difracie cu raze X au evideniat prezena n structurile de
ordin superior ale pectat liazelor C i E din Erwinia chrysanthemi, a unui
nou tip de domeniu structural care a fost numit -helix paralel (Yodler i
alii 1993a i b). Structura tridimensional a endopectat liazei C cuprinde
numai -structuri paralele, structuri care sunt pliate ntr-o spiral rsucit
spre dreapta (large right handed coil). Divizarea structurii teriare n
elemente de structur secundar a artat prezena a trei -structuri
paralele. Dou din aceste structuri sunt pliate una fa de cealalt
antiparalel, rezultnd o structur de tip -sandwich, iar cea de a treia este
perpendicular pe acest -sandwich. Pectat liaza E din Erwinia
chrysanthemi a avut o structur tridimensional asemntoare cu cea a
formei C (Lietzki i alii 1994). Studiile de mutagenez dirijat realizate de
Jurnak (1996) au evideniat c pectat liazele C i E, proteine similare din
punct de vedere al plierii globale, prezint diferene semnificative n cea
ce privete mrimea i configuraia regiunilor loop din structur. n
aceste regiuni de tip loop sunt localizate situsurile active ale enzimelor.
Studiul structurilor tridimensionale ale endopectat liazelor C i E a
evideniat existena a dou centre catalitice diferite responsabile pentru
activiti diferite (Henrissat i alii 1995).
187
Analiza structurii tridimensionale a pectat liazei din Bacillus subtilis

n complex cu calciul, a evideniat existena unui domeniu -helix paralel i
a unei regiuni de tip loop, ntre care existo cavitate la nivelul creia ar
putea fi localizat situsul catalitic activ. Situsul catalitic activ al acestei
enzime are n structur un rest de arginin (Pickersgill i alii 1994).
Endopectat liaza din Aspergillus niger are o structur asemntoare
cu cea a pectat liazelor C i E produse de Erwinia chrysanthemi i este o
protein cu dou funcii catalitice (Heffron i alii 1995).
Studiile de modificare chimic a unor resturi de aminoacizi din
structura endopectat liazei biosintetizat de Fusarium moniliforme, au
evideniat implicarea unui rest de tirozin n legarea substratului i a unui
rest de lizin (situat n/sau lng centrul catalitic activ) n mecanismul
catalitic (Rao, 1996a).
Proprietile ctorva endopectat liaze microbiene sunt centralizate n
Tabelul 6. Aceste enzime se caracterizeaz prin pH-uri optime de aciune
situate n domeniul bazic i prin valori K M destul de mici. Studiile
ntreprinse de Tierny (1994) au evideniat modificarea proprietilor pectat
liazei de la Bacteroides thetarotaomicron atunci cnd gena acesteia a fost
clonat la Echeria coli.
Aspergillus niger, n culturi n faz solid (solid-state fermentation) n
care sursa de carbon a fost un amestec de tre de gru i borhot de
sfecl, s-a dovedit a fi capabil s produc dou endopectat liaze cu
aciune n domeniul acid de pH. Endopectat liaza I, enzim cu masa de 41
700 Da i KM pentru pectatul de sodiu 6,25 mg/ml, a acionat cu viteza cea mai
mare la pH 6,0. Endopectat liaza II, enzim cu masa de 30 200 Da i K M
pentru pectatul de sodiu 1,35 mg/ml, a acionat cu viteza cea mai mare la pH 4,8
(Dinu i alii 1998, Dinu 1997).
Endopectat liazele sunt activate de ioni de Ca 2+. Studiile de
spectrometrie de emisie atomic au artat c acest ion este o parte a
holoenzimei. Calciul se leag de protein la nivelul gruprilor carboxil din
structura acesteia, dar prezena acestui ion nu afecteaz legarea
substratului la enzim (Rao i alii 1996a). Ionii de Ba 2+, Co2+, Cu2+, Mg2+,
Mn2+, Sr2+, Zn2+ nu afecteaz activitatea endopectat liazic (Tardy i alii
1997).
Inhibitori ai endopectat liazelor s-au dovedit a fi ionii bivaleni de
mercur, EDTA i doi compui din plante, epicatechina i acidul salicilic
(Tardy i alii 1997).
188
D. Dinu
4.8. Exopectat liazele

Exopectat liazele (EC 4.2.2.9) scindeaz penultima legtur
glicozidic din structura poli-D-galacturonailor cu ncepere de la captul
reductor al acesteia i elibereaz molecule de acid digalacturonic 4:5
nesaturate.
Prezena exopectat liazelor a fost semnalat doar la cteva
microorganisme: Clostridium multifermentans, Erwinia aroideae, Erwinia
dissolvens, Fusarium culmorum, Streptomyces nitrosporeus (citate dup
Whitaker 1990). Guevara (1997) a pus n eviden existena a dou
189
exopectat liaze la Fusarium oxisporum sp. radicis lycopersici, proteine cu

pI de 8,65 i, respectiv, 9,0.
pH-ul optim al acestor enzime este cuprins ntre 8,0 i 9,0. Cu
excepia enzimelor izolate de la speciile de Erwinia, toate celelalte au
necesitate absolutpentru ionii de calciu. Exopectat liazele nu
manifestpreferinfade
mrimea
moleculei
substratului,
poligalacturonaii i oligogalacturonaii, inclusiv trigalacturonaii, fiind
degradai cu aproximativ aceeai vitez.
Exopectat liaza din Clostridium multifermentans face parte, alturi
de o pectinesteraz, dintr-o protein complex avnd masa de 400 000
Da. Cele
dou enzime
din acest complex acioneaz sinergic n
degradarea pectinelor (Miller i alii 1970).
4.9. Pectin liazele
Pectin liazele (EC 4.2.2.10) manifest specificitate pentru substrate
nalt esterificate, aciunea lor aleatoare conducnd la formarea de oligo-Dgalacturonai nesaturai. Majoritatea pectin liazelor purificate i
caracterizate sunt de origine fungic.
Activitatea acestui tip de liaze este afectat de distribuia gruprilor
esterificate n catena poli-D-galacturonanic. Studiile realizate pe
substrate cu diferite grade de esterificare i cu o distribuie diferit a
gruprilor esterificate, au artat o activitate mai mare asupra substratelor
deesterificate enzimatic comparativ cu cea manifestat pe substrate
deesterificate n mediu alcalin. Pectinele deesterificate enzimatic au o
distribuie regulat a gruprilor esterice, n timp ce deesterificarea chimic
conduce la o distribuie statistic a acestor grupri.
Pectinele nalt esterificate sunt cele mai bune substrate pentru
pectin liaze. Pectaii, amidele acidului pectic i glicilesterii pectinei nu sunt
degradai de pectin liaze.
Modul de aciune al pectin liazelor (Figura 5) a fost pus n eviden
prin analiza produilor rezultai n urma scindrii tetra-, penta- i hexagalacturonailor.
Substrat
Produi de reacie
O-O-O +
-O-O
O-O-O-O-O-O
O-O
O-O-O
O-O-O-O-O
O
O-O-O-O
O
190
O-O +
-O-
O +
-O-
D. Dinu
O rest de acid galacturonic esterificat

rest de acid galacturonic esterificat, cu o dubl legtur ntre
C4 i C5
Figura 5. Modul de aciune al pectin liazelor.
Cteva din proprietile pectin liazelor microbiene sunt prezentate n

Tabelul 6. Analiza datelor prezentate n acest tabel arat c majoritatea
pectin liazelor au pH-ul optim n domeniul acid i valori mici ale constantei
Michaelis. Aproximativ 10% din pectin liazele izolate i caracterizate s-au
dovedit a fi enzime care acioneaz la pH alcalin. O pectin liaz cu afinitate
mic este enzima izolat din Penicillium italicum, enzim cu KM mare fa
de pectina 86% metilat (15 mg/ml), dar i cu activitate catalitic mare.
Afinitatea sczut a acestei enzime a fost explicat de Alana (1991) prin
repulsiile electrostatice care apar ntre enzim i substrat, ambele fiind
ncrcate negativ la pH 9,0. Dup depirea dificultilor de formare a
complexului enzim-substrat, activitatea catalitic este mare. Proprietile
pectin liazei din Penicillium italicum s-au modificat n urma imobilizrii
covalente pe nylon (Alkorta i alii 1996). Creterea stabilitii enzimei
imobilizate a permis utilizarea acesteia n 12 cicluri de degradare a
pectinei.
Manifestarea activitii catalitice a pectin liazelor nu necesit
neaprat prezena ionilor de calciu n mediu
(excepie enzima din
Fusarium oxysporum), dar ionii divaleni de calciu, cupru, magneziu,
mangan i mercur, n concentraie 2mM, s-au dovedit a fi activatori pentru
unele pectin liaze (Lim i alii 1983). Activitatea pectin liazic s-a dovedit
a fi inhibat de: acidul p-cloromercuri-fenil-sulfonic, anhidrid maleic,
N-etilmaleimida (Manachini i alii1988) i de unii hormoni ai plantelor sau
analogi ai acestora.
Mikhailova (1994) a artat c unele specii de Penicillium produc
forme moleculare ale pectin liazelor care difer din punct de vedere al
controlului biosintezei. Unele dintre acestea sunt represate de glucoz i
depresate prin intermediul AMP ciclic. Fuziunea protoplatilor de la fungii
pectinolitici de tipul Aspergillus a condus la obinerea a patru hibrizi cu
activiti endopoligalacturonazice, exopoligalacturonazice i pectin liazice
nemodificate (Solis i alii 1997).
O bacterie endofilic izolat de pe suprafaa smburilor de ciree s-a
dovedit ca produce o pecin liaz cu aciune optim la 40 0C i pH 7,9 i o
valoare KM fa de pectin de 4,5 mg/ml (Sakiyana i alii 2001).
5.Importana i utilizrile enzimelor pectinolitice

5.1. Implicaiile enzimelor pectinolitice n fiziologia i patologia
plantelor
Conversia protopectinei, substan parental, insolubil n ap, la
pectin solubil i pectat i, ulterior, la produii lor de degradare, este un
proces cu rol important n maturarea i infectarea plantelor.
La plante, protopectina are rol de adeziv intracelular, transformarea
sa n forme solubile determinnd o scdere a rigiditii esuturilor
191
reflectat prin nmuierea i, ulterior, prin lichefierea materialului plantei.

Chiar dac mecanismul acestei conversii nu este pe deplin elucidat, este
evident faptul c n aceste procese un rol major l au enzimele pectinolitice
ale plantelor i ale patogenilor, primele fiind implicate n schimbrile
fiziologice, iar celelalte n alterrile patologice.
Paralelismul ntre creterea activitilor pectinesterazice i endopoligalacturonazice, pe de o parte, i formarea pectinelor solubile n ap, pe
de alt parte, paralelism observat n cursul maturrii fructelor,indic o
strns corelaie ntre aceste dou procese. n fructele necoapte prezena
endopoligalacturonazei nu a fost depistat, iar activitatea pectinesterazic
este foarte mic. Cele dou activiti ncep s creasc, existnd o corelaie
ntre creterea acestora i gradul de coacere. n fructele roiilor
transgenice, la care este expresat un RNA antisens pentru
poligalacturonaz, activitatea poligalacturonazic este foarte mic,
ajungnd pn la 1% din cea depistat n fructele normale (Langley i alii
1994, Grierson i alii 1994).
192
D. Dinu
Expresia unei gene antisens pentru pectinesteraz, a determinat o

scdere de 10 ori a activitii pectinesterazice n roii (Treman i alii
1994). Roiile transgenice au unele proprieti modificate, proprieti care
sunt exploatate n procesele de stocare i prelucrare a acestora.
Enzimele pectinolitice joac un rol important n interacia microorganismelor cu plantele superioare, interacie cu efecte multiple asupra
esuturilor plantelor. Cteva dintre aceste efecte sunt:
macerarea i distrugerea celulelor (Salinas i alii 1995, Federici i
alii 2001)
apariia reaciilor de aprare ale plantei contra patogenului;
pereii celulari devin mai succeptibili la atacul altor polizaharidaze
microbiene;
creterea concentraiei de etilen, hormon care produce cderea
fructelor (Agravante i alii 1991).
Bolile plantelor cauzate de patogeni sunt procese complexe la care
particip mai muli factori. Mecanismul inducerii patogenicitii este
asociat cu o interacie ntre patogen i peretele celular polizaharidic al
gazdei, interacie care influeneaz producia de enzime care degradeaz
peretele celular (Alghisi i alii 1995, Yang i alii 1994). Rolul direct al
enzimelor pectinolitice produse de patogen n procesul de infecie este
indicat prin:
capacitatea tuturor patogenilor cunoscui de a produce enzime
pectinolitice (Rodriguezpalenzuela i alii 1991);
corelaia direct ntre producia acestor enzime i virulena
observat (Erampalli i alii 1995);
prezena enzimelor pectinolitice produse de patogen n esuturile
plantelor infestate (Chilosi i alii 1997).
Producia de enzime pectinolitice, n particular a celor cu mecanism
random, de ctre patogen este una din condiiile eseniale pentru
succesul infeciei. Aceste enzime determin o alterare a peretelui celular,
fcnd posibil penetrarea patogenului n plantele gazd. O mutant de
Colletotrichum magna deficitar n secreia extracelular a pectat liazei s193
a dovedit a fi nepatogen, dei acest microorganism este cunoscut ca fiind

un patogen major al fructelor de avocado (Wattad i alii 1995).
Capacitatea microorganismelor de a produce enzime pectinolitice
in vitro nu este o dovad a patogenicitii lor, unele dintre ele fiind
capabile s produc aceste enzime pe medii sintetice, neavnd
capacitatea de a le produce in vivo. n procesele de infecie un rol
important l are susceptibilitatea sau rezistena plantei la efectele
patogenului (Baayen i alii 1997)
Recent, un grup de cercettori canadieni (Laurent i alii 2000) au
reuit s obin anticorpi policlonali fa de o pectinesteraz produs de o
gen de la Erwinia chrysanthemi expresat la de E. coli. Aceti anticorpi nu
au interacionat cu pectinesterazele fungice sau cu cele produse de
plante, cea ce face posibil utilizarea lor n identificarea timpurie a
interaciei plant-patogen.
La plante au fost puse n eviden mai multe mecanisme de
protecie contra infeciior microbiene. Cteva dintre acestea sunt:
conversia acidului pectic la pectatul de calciu rezistent la
aciunea enzimelor pectinolitice;
efectul inhibitor asupra enzimelor pectinolitice exercitat de unele
substane
din
plante:
acidul
cafeic,
antocianidinele,
epichatechina, compui fenolici acidul salicilic, zaharoz (Tardy
i alii 1997 );
inhibiia enzimelor pectinolitice de ctre hormonii plantelor sau
de analogi ai acestora (Chilosi i alii 1997);
biosinteza unor inhibitori proteici naturali ai enzimelor
pectinolitice, inhibitori care formeaz complexe cu enzimele
pectinolitice i care contraatac aciunea nociv a acestora.
Proteinele cu efect inhibitor asupra poligalacturonazelor microbiene
au fost purificate i caracterizate din fructe i vegetale.
Din zmeur necoapt a fost izolat o protein cu mas molecular
de 38 500 Da, care inhib necompetitiv dou endopoligalacturonaze
produse de Botrytis cinerea i o endopoligalacturonaz din Aspergillus
niger (Johnston i alii 1993).
Perele au o glicoprotein cu mas molecular de 43 000 Da care
inhib difereniat formele moleculare ale endopoligalacturonazei din
Botrytis cinerea (Stotz i alii 1993)
Din semine germinate de soia a fost izolat o protein care
interacioneaz
diferit
endopoligalacturonazele
din
Sclerotinia
sclerotiorum i Aspergillus niger (Flavaron i alii 1994).
Fructele de mr a fost pus n eviden o protein heterogen,
avnd grade diferite de glicozilare, care inhib diferit cele cinci forme ale
poligalacturonazelor din Botrytis cinerea (Yao i alii 1995).
Cu ajutorul unui biosensor, Mattei (1997) a artat existena unei
afiniti diferite ntre inhibitorul proteic izolat din Phaseolus vulgaris i
diferite endopoligalacturonaze obinute prin mutagenez dirijat din
Fusarium moniliforme. Resturile de arginin, lizin i histidin din structura
acestui inhibitor joac un rol esenial n interacii cu poligalacturonaza
(Federici i alii 2001).
194
D. Dinu
Un inhibitor proteic natural al pectinesterazelor a fost izolat i din

fructele de kiwi. Inhibitorul s-a dovedit a fi o glicoprotein care este
biosintetizat sub forma unui precursor inactiv n fructele necoapte
(Giovane i alii 1995, Camardella i alii 2000).
Mecanismul prin care aceste proteine inhib activitatea enzimelor
pectinolitice nu este cunoscut.
5.2. Aplicaii biotehnologice ale enzimelor pectinolitice
Enzimele pectinolitice, singure sau n amestec cu ali biocatalizatori,
sunt utilizate pe scar larg n diferite procese biotehnologice.
Enzimele pectinolitice sunt absolut necesare n extracia, clarificarea
i depectinizarea sucurilor de fructe (Alkorta i alii 1995, Chang i alii
1995, Meyer i alii 2001). Clarificarea acestora decurge i sub aciunea
enzimelor pectinolitice din fructe, dar procesul de autoclarificare este prea
lent pentru a fi utilizat la scar industrial. n procesele industriale sunt
utilizate preparate concentrate de enzime pectinolitice produse de
microorganisme, preparate care realizeaz o degradare rapid a
polimerilor pectici. Clarificarea diferitelor sucuri necesit aciunea
sinergic a mai multor tipuri de enzime pectinolitice. Astfel, sucurile de
mere
au
fost
clarificate
rapid
prin
combinarea
activitilor
endopoligalacturonazice (din Aspergillus niger) i pectinesterazice (din
Aspergillus oryzae). Exopoligalacturonazele nu au avut efecte n astfel de
procese, aceste enzime fiind adsorbite n proporie destul de mare pe
protopectina din mere (Hara i alii 1986). Sucurile de grapefruit, sucuri
mai rezistente n procesele care implic degradarea polimerilor pectici, au
fost clarificate cu ajutorul unei pectin liaze izolate din Aspergillus sojae
(Ishii i alii 1973). Clarificarea sucurilor de citrice, sucuri cu pH foarte acid
a putut fi realizat prin aciunea combinat a pectinesterazei ce se
gsete n aceste sucuri i a poligalacturonazei din Corticium rolfesii.
Poligalacturonaza biosintetizat de Corticium rolfesii are o utilitate
deosebit, deoarece ea acioneaz la un pH foarte sczut - 2,5 -, pH la
care reacia enzimatic se desfoar n condiii apropiate de cele aseptice
(Tagawa i alii 1988).
Aciunea combinat a enzimelor pectinolitice, celulazelor i
hemicelulazelor poate conduce la lichefierea fructelor (Grassin i alii
1996)
Enzimele pectinolitice sunt utilizate n procesele de vinificaie, mai
ales pentru obinerea vinurilor din soiuri de struguri bogate n substane
pectice (Colagrande i alii 1994). Extracia aromelor i a pigmenilor
vegetali se poate face cu ajutorul acestor enzime (Solehah i alii 1994)
n procesele tehnologice care urmresc prelucrarea boabelor de
cafea n vederea obinerii cafelei instant, utilizarea enzimelor pectinolitice
s-a dovedit a fi eficient (Vkari i alii 1993).
Enzimele pectinolitice au fost utilizate pentru macerarea fructelor i
vegetalelor, pentru obinerea alimentelor pentru sugari i a piureurilor
(Recourt i alii 1996, Dijkvan i alii 1996).
nmuierea mai rapid a fibrelor vegetale s-a realizat cu ajutorul
enzimelor pectinolitice (Brumaro i alii 1993, Baracat-Pereira i alii 1993).
195
O serie de studii au evideniat mbuntirea calitii esturilor atunci

cnd fibrele de bumbac au fost tratate cu un amestec de hemicelulaze i
pectinaze (Csizer i alii 2002, Sawado i alii 2001).
Amestecuri de enzime pectinolitice din surse microbiene au fost
utilizate n prelucrarea biomasei vegetale (Kravtchenko i alii 1993). Prin
intermediul acestor enzime se realizeaz astfel curirea mediului i
reciclarea resurselor naturale. Deeurile rezultate n urma prelucrrii
citricelor sunt bogate n glucide, fapt care permite utilizare lor pentru
producerea furajelor. Tratarea acestor deeuri cu pectinesteraze
microbiene are ca rezultat formarea pectatului de calciu concomitent cu
apariia aa numitului fenomen de coagulare. Acest fenomen uureaz
ndeprtarea apei, realizndu-se i o economie de combustibil n procesele
de uscare.
Pectinesteraza din Penicillium felutatum a fost utilizat de ctre
Aizenberg (1996) pentru producerea pectinelor slab metilate, substane cu
aplicaii n medicin i n producerea hranei pentru diabetici.
Viteza cu care amidonul din plante este hidrolizat sub aciunea
glucoamilazei produse de Aspergillus niger a fost crescut n prezena unui
amestec de endopoligalacturonaz i pectinesteraz obinut din specii de
Rhizopus (Chitradon i alii 1996).
Multe procese biotehnologice folosite n industria alimentar se
utilizeaz, alturi de alte tipuri de enzime pectinolitice, pectinesteraza.
Aciunea pectinesterazei conduce la eliberarea de metanol, substan
toxic pentru organismele animale. n acest sens au fost efectuate teste
toxicologice pe diferite animale. Administrarea oral, timp de 13 zile, a
unei cantiti de 10 g preparat proteic cu activitate pectinesterazic /kg
corp, nu a afectat greutatea, semnele vitale, comportamentul sau parametrii biochimici ai
obolanilor (Lissau i alii 1998). Cu toate acestea, efectele fiziologice i nutriionale
produse sub aciunea metanolului trebuie avute n vedere.
Izolarea protoplatilor din plante necesit prezena enzimelor
pectinolitice, a celulazelor i hemicelulazelor (Ruesink i alii 1988).
Lacours (1994) a artat c enzimele pectinolitice pot fi utilizate n caracterizarea
taxonomic a speciilor de Gremmenniela.
Castaldo (1996) a pus la punct o metod enzimatic pentru dozarea
concentraiilor de pectin cu ajutorul enzimelor pectinolitice. n aceast
tehnic, acidul D-galacturonic, rezultat din degradarea pectinelor sub
aciunea pectinesterazei i a endopoligalacturonazei, este transformat n
lacton sub aciunea unei glucuronolacton oxidaze. Acest proces este
nsoit de o scdere a absorbanei la 340 nm, scdere datorat oxidrii
NADPH, cofactor al oxidazei. O metod asemntoare de determinare a
concentraiei pectinelor din fructe i vegetale a fost pus la punct de
Yoskioka (1992).
Enzimele pectinolitice au fost ntrebuinate i n sinteza acidului
ascorbic (Kulbe i alii 1987). n acest sens, pectina din mere a fost
convertit, sub aciunea pectinesterazei i endopoligalacturonazei, la acid
D-galacturonic. Acidul galacturonic recuperat din hidrolizat prin
electrodializ, a fost convertit la acid 2-ceto-L-galacturonic. Ciclizarea
catalitic, acid sau bazic, a cetoacidului a condus la obinerea acidului
ascorbic.
196
D. Dinu
Studii recente (Ruiz-Teran i alii 2001) au artat o extracie de 3 ori

mai eficient a glucovanilinei (substan din care se obine vanilina) din
pstile de mazre n prezena enzimelor pectinolitice.
Bibliografie
1.
Agravante, J., Matsui, T., Kitagawa, H. (1991). Changes in pectin methylesterase,

polygalacturonase and pectic substances of ethanol and ethylene trated bananas during
ripening. Nippon Skokukim Kogyo Gakkaishi, 38 , 127-132.
2.
Aizenberg, V.L., Syrchin, S.A., Sedina, S.A., Shinkarenko, L.N., Demchenko,P.I.,
Vitte, P.N. (1996). Properties of pectinesterase from Penicillium fellutanum Biourge and
new development in pectin applications. Prog. Biotechnol., 14 [ Pectins and pectinases],
947-954.
3.
Alaa, A., Llama, M., Serra, J. (1991). Purification and some properties of the pectin
lyase from Penicillium italicum. FEBS Lett., 280, 335-340.
4.
Albersheim, P., Killias, U. (1962). Studies relating to the purification and properties of
pectin transeliminase. Arch. Biochem.Biophys., 97, 107-115.
5.
Albersheim, P. (1975). The wall of growing plants cells. Scientific American, 3, 81-95.
6.
Alghisi, P., Favaron, F. (1995). Pectin degrading enzymes and plant parasite
interactions. Eur. J. Plant Pathol., 101, 365-375.
7.
Alkorta, I., Garbisu, C., Llema, M.J., Serra, J.L. (1996). Immobilization of pectin
lyase from Penicillium italicum by covalent binding to nylon. Enzyme Microb. Technol.,
18, 141-146.
8.
Antov, M.G., Pericin, D.M., Dimic, G.R. (2001). Cultivation of Polyporus squamosus
for pectinase production in aqueous two-phase system containing sugar beet extraction
waste. J. Biotechnol., 91, 83-87.
9.
Baayer, R.P., Schofffellmmeer, E.A.M., Toet, S., Elgersma, D.M. (1997). Fungal
polygalacturonase activity reflects susceptibility of carnation cultivars to Fusarium wilt.
Eur. J. Plant Pathol.,103, 15-23.
10.
Barnavon, L., Doco, T., Terrier, N., Ageorges, A., Romieu, C., Pellerin, P. (2001).
Involvement of pectin methyl-esterase during the ripening of grape berries: partial cDNA
isolation, transcript expression and changes in the degree of methyl-esterification of cell
wall pectins. Phytochemistry, 58, 693-701.
11.
Baracat-Perreira, M.C., Santas, V.M.C., Fernandes de Aranjo,E., Olzany, S.D. (1993).
Partial caracterization of Aspergillus fumigatus polygalacturonases for the degumming of
natural fibers. J. Ind. Microbiol., 11, 139-140.
12.
Barnby, F.M., Morpeth, F.F., Pyle, D.L. (1990). Polygalacturonases production by
anaerobic fermentation of Klyveromyces maxianus. Enzyme Microb. Technol., 12, 891897.
13.
Beldman, G., Mutter, M., Searle-van Leeuwen, M.J.F., Van Den Broek, L,A.M.,
Schols, H.A., Voragen, A.G.J. (1996). New enzymes active towards pectic structures.
Prog. Biotechnol., 14, [Pectins and pectinases],231-245.
14.
Behere, A., Satyanarayan, V., Padwal-Desai, S.R. (1993). Separation and limited
characterization of three polygalacturonases of Aspergillus niger. Enzyme
Microb.Technol., 15, 158-161.
15.
Biely, P., Benen, J.A.E., Kester H.C.M., Heinrichova, K., Visser, J. (1996a).
Srereochemistry of hydrolysis of glycosidic linkage by three Aspergillus
polygalacturonases. Prog. Biotechnol., 19, 706-710.
197
16.
Biely, P., Benen, J.A.E., Heinrichova, K., Kester H.C.M., Visser, J. (1996b). Inversion
of configuration during hydrolysis of -1,4-galacturonidic linkage by three Aspergillus
polygalacturonases. FEBS Lett., 323, 249-255.
17.
Blanco,P., Sieira, C., Diaz, A., Villa, T.G. (1994). Production and partial
characterization of an endopolygalacturonase from S. Cerevisiae. Can.J. Microbiol., 40,
974-977.
18.
Bonnin, E., Le Goff, A., Korner, R., Van Alebrek, G.W., Christensen, T.M., Voragen,
A.G., Thibault, J. (2001). Study of the mode of action of endopolygalacturonase from
Fusarium moniliforme. Biochem. Biophys. Acta, 1526, 301-309.
19.
Braccini, I., Perez, S. (2001). Molecular basis of Ca 2+-induced gelation in alginates
and pectins: the egg box model revisited. Biomacromolecules, 2, 1089-1096.
20.
Bruhlmann, F. (1995). Purification and characterization of an extracellular pectate
lyase from Amycolata sp. Appl. Environ. Microbiol., 61, 3580-3585.
21.
Brumaro, M.H.N., Coelho, J.L.C., De Aranjo, E.F., Silva, D.A. (1993). Pectin lyase of
P. griseoroseum related of deguming of ramie. J. Rev.Microbiol., 24, 175-178.
22.
Camara Hurtado, M., Greve, L.C., Labavitch, J.M. (2002). Changes in cell wall
pectins accompanying tomato (Lycopersicon esculentum Mill) paste manufacture. J.
Agric. Food Chem., 50, 273-278.
23.
Camardella, L., Carratore, V., Servillo, L., Giovane, A., Balestieri, C. (2000). Kivi
protein inhibitor pectin methylesterase amino acid sequence and structural importance of
two disulfide bridges. Eur. J. Biochem., 267, 1561-1565.
24.
Capita, N.C., Defernez, M., Findlay, K., Wells, B., Shoue, D.A., Catchpole, G.,
Wilson, R.H., McCann, M.C. (2001). Cell wall aehitecture of the elongating maize
coleoptide. Plant Physiol., 127, 551-565.
25.
Cardello, L., Lourenco, E.J. (1995). Inhibitors of pectinesterases. Aliment. Nutr., 6, 2537.
26.
Chellegatli, M.A., Kawano, C.Y., Said, S., Fonseca, M.J. (2000). Sequential synthesis
and secretion of pectinases by penicillium frequentans. J.Basic Microbiol., 40, 319-326.
27.
Chen, E.M.W., Mort, A.J, Andrews, J., (1996). Nature of sites hydrolyzable by
endopolygalacturonase in partially esterified homogalacturonans. Carbohydr. Polym., 29,
129-136.
28.
Chilosi, G., Magro, P. (1997). Pectin lyase and polygalacturonase isoenzymes
production by Botrytis cinerea during the early stages of infection on different host plants.
J. Plant Pathol., 78, 61-69.
29.
Chitradon, L., Poonpairoj, P., Mahakahan, P., Kitpreechavanich, V., Lotong, N. (1996).
Pectinases from Rhizopus sp. efficient in enhancing the hydrolyzation of raw cassaya
starch: purification and characterization. Prog. Biotechnol., 14 [Pectins and pectinases],
715-722.
30.
Cho, S.W., Lee, S., Shin, W. (2001). The X-ray structure of Aspergillus aculeatus
polygalacturonase
and a
modeled
structure
of
the
polygalacturonaseoctopolygalacturonate complex. J.Mol.Biol., 311, 863-878
31.
Colagrande, o., Silva, A., Fumi, M.D. (1994). Recent applications of biotechnology in
wine production. Biotechnol. Prog., 10, 2-18.
32.
Cooke, R.D., Ferber, E.M., Kanagasabapathy, H. (1976). Purification and
characterization of polygalacturonase from a commercial Aspergillus niger preparation.
Biochim. Biophys. Acta, 452, 440-44.
33.
Cosgrove D.J. (1997). Assembly and enlargement of the primary cell wall in plants.
Annu.Rev.CellDev.Bio., 13, 171-201
198
D. Dinu
34.
Crotti, L.B., Jorge, J.A., Terezi, H.T., Polizeli, M.L.T. (1996). Purification and
characterization of galactase induced pectinase from the exo 1-mutant strain of
Neurospora crassa. Prog. Biotechnol., 14 [Pectins and pectinases], 787-792.
35.
Csiszar, E., Losonczi, A., Szabacs, G., Ruszuals, I., Reicher, J. (2001). Enzymes and
chelating agent in cotton pretreatment. J. Biotechnol., 89, 271-279.
36.
Demain, A.L., Phaff, H.J. (1954). J. Biol. Chem., 210 , 381-393, citati dup RexovBenkov, L., Marcovic, O. (1976). Pectic enzymes. In Advancces in carbohydrate
chemistry and bichemistry, editori Tripton, R.S. si Horton, D., vol. 33, pag. 347.
37.
Devi, N.A., Rao, A.G. (1996). Fractionation, purification and preliminary
characterization of polygalacturonase from Aspergillus carbonarius. Enzyme Microb.
Technol., 18, 59-65.
38.
Dick, A.J. (1989). Cell wall metabolism in ripening fruit. Part II. Characterization of
pectic polysaccharides solubilized during softening of Bartlett pear fruit. Plant
Physiol.,89, 1394-1400.
39.
Dijkvan, C. (1996). Pectins and pectolytic enzymes in relation to development and
processing of green beans (Phaaseolus vulgaris L ). Prog. Biotechnol., 19, 399-404.
40.
Dinu, D., Dumitru, I.F. (1997). Isolation and partial characterization of a
pectinesterase from Aspergillus niger. Roum. Biotechnol. Lett., 2, 489-494.
41.
Dinu, D., Dumitru, I.F. (1998). Studies concerning the purification and properties of
pectate lyase isolated from Aspergillus niger. Roum. Biotechnol. Lett., 3, 23-29.
42.
Dinu, D. (1999). Pectic enzymes produced by Aspergillus niger MIUG 16 in solidstate fermentation on wheat bran and beet draft.. Roum. Biotechnol. Lett., 4, 287-293.
43.
Di Pietro, A., Roncero, M.J.G. (1996). Purification and characterization of a pectate
lyase from Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici produced on tomato vascular tissue.
Physiol. Mol. Plant Pathol., 49 , 177-185.
44.
Duwe, B., Kha, N.G., Nguyen, Q. (1996). Site-directed mutagenesis of the active site
of pectin methylesterase from Aspergillus niger RH 5344. Biotechnol. Lett., 18, 621-626.
45.
Elegado, F.B., Fujio, Y. (1994). Purification and some properties of
endopolygalacturonase from Rhizopus sp LKN. World J. Microbiol. Biotechnol., 10, 256259.
46.
Elumalai, R.P., Mahadevan, A. (1995). Characterization of pectate lyase produced by
Pseudomonas marginalis and cloning of pectate lyase genes. Physiol. Molec. Plant
Pathol., 46, 109-119.
47.
Errampalli, D., Kohn, L.M. (1995). Comparison of pectic zymograms produced by
produced by different clones of Sclerotinia sclerotiorum in culture. Phytopathology, 85,
292-296.
48.
Federici, l., Caprari, C., Mattei, B., Sanno, C., Matteo, A., De Lorenzo, G., Cervone,
F., Tsernoglou, D. (2001). Structural requirements of endopolygalacturonase for
interaction with PGIP (polygalacturonase-inhibiting protein). Proc. Natl. Acad. Sci., 98,
13425-13430.
49.
Fiedurek, J., Ilczuk, L. (1983). Acta Alimentaria Polonica, 9, 89-92, citat din
Chemical Abstract, vol. 101, 166843f (1984).
50.
Flavaran, f., Davidio, R., Porcedder, F., Alghidi, P. (1994). Purification and
characterization of a soybeen polygalacturonase inhibiting protein. Planta, 195, 80-87.
51.
Frster, H. (1988). Pectinesterases from Phytophthora infestans. In Methods in
Enzymology, vol. 161, pag. 335-350.
52.
Garcia-Maceira, F.I., Di Pietro, A., Huertes-Gonzalez, M.D., Ruiz-Roldau, M.I.
(2001). Molecular characterization of an endopolygalacturonase from Fusarium
oxysporum expressed during early stages of infection. Appl. Envirom. Microbiol. 67,
2191-2196.
199
53.
Gardner, J.M., Kado, C.I. (1976). Polygalacturonic acid transeliminase in osmotic

shock fluid of Erwinia rubrifaciens: characterization of the purified enzyme and its effect
on plant cells. J. Bacteriol., 127, 451-460.
54.
Giovane, A., Balestieri, C., Quagliuolo, L., Castaldo, C., Servillo, L. (1995). A
glycoprotein inhibitor of pectin methylesterase in kiwi fruits. Purification by affinity
chromatography and evidence of a ripening related precursor. Eur. J. Biochem., 233, 926929.
55.
Gomes, S., Simon, G., Belarbi, A. (2001). Regulation of the expression of
endopolygalacturonase gene PGU 1 in Saccharomices. Yeast, 18, 423-432.
56.
Grassin, C., Fauquembergue, P. (1996). Application of pectinases in beverages. Prog.
Biotechnol., 14, [Pectins and pectinases],453-462.
57.
Guevara, M.A., Gonzales J.M.T., Estevez, P. (1997). Multiple forms of pectic lyase
and polygalacturonase from Fusarium oxysporum f. sp. Radicis lycopersici: regulation of
their synthesis by galacturonic acid. Can. J. Microbiol., 43, 245-253.
58.
Hang, Y.D., Woodams, E.E. (1994). Production of fungal polygalacturonase from
apple pomace. Food Sci . Technol., 27, 194-197.
59.
Hara, T., Lim, J.Y., Fujio, Y. (1984). Purification and some properties of exopolygalacturonase from Aspergillus niger cultured in the medium containg Satsuma
mandarin peel. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 31, 581-586.
60.
Hara, T., Fujio, Y., Ueda, S. (1986). Clarification of apple with polygalacturonase of
Aspergillus niger and pectinesterase of Aspergillus oryzae ang their protopectin adsorption
and degradation behaviour. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 33, 336-341.
61.
Heinrichov, K., Rexov-Benkov, L. (1976). Purification and characterization of an
exo-D-galacturonase of Aspergillus niger. Biochim. Biophys. Acta, 422, 349-356.
62.
Heinrichov, K., Dzurova, M., Rexov-Benkov, L. (1992). Mechanism of action of
D-galacturonan digalacturonohydrolase of
Selenomonas ruminatium on oligogalactosiduronic acids. Carbohydr. Res., 235, 269-280.
63.
Heinrichov, K., Stachova, M. (1994). Pectinolytic enzymes of Clostridium
lochheadii. Biologia (Bratislava), 49, 813-818.
64.
Hennink, A., Ham, H., van Oort, M.G. (1996). Production, characterization and
application of rhamnogalacturonase. Prog. Biotechnol., 14 [ Pectins and pectinases], 485494.
65.
Henrissat, B., Heffron, S.E., Yoder, M.D., Lietzke, S., Yurnak, F. (1995). Functional
implications of structure-based sequence alignment of proteins in the extracellular pectate
lyase superfamily. Plant Physiol., 107, 963-976.
66.
Iguchi, K., Kishida, M., Sakai, T. (1996). Purification and characterization of three
extracellular protopectinases with polygalacturonase activities from Trichosporon
penicillatum. Biosci. Biotechnol. Biochem., 60, 603-607.
67.
James, J.., Dubery, A. (2001). Inhibition of polygalacturonase from Verticillium
dahliae by a polygalacturonase inhibiting protein from cotton. Phytochemistry, 52, 149156.
68.
Jia, J., Wheals, A. (2000). Endopolygalacturonase genes and enzymes from
Saccharomices cerevisiae and Kluyveromyces maxianus. Curr. Genet., 38, 264-270.
69.
Johnston, D.J., Rammanathan, V., Williamson, B. (1993). A protein from immature
raspberry fruits which inhibits endopolygalacturonase from Botrytis cinerea and other
microorganisms. J. Exp. Bot., 44, 971-976.
70.
Jurnak, F., Kita, N., Garrett, M., Heffron, S.E., Scavetta, R., Boyd, C., Keen, N.
(1996). Functional implications of the three-dimensional structures of pectate lyases.
Prog. Biotechnol., 14, [Pectins and pectinases], 295-308.
200
D. Dinu
71.
Joyce, A.M., Fogarty, W.M. (1975). Proc.Soc. Gen. Microbiol., 3, 79-89, citai dup
Whitaker, J.R. (1990). Microbial pectolytic enzymes. In Microbial enzymes and
biotechnology (editia a 2 a), editori Fogarty, W.M. si Kelly, C., Elsevier Applied Science,
London, pag. 157.
72.
Kester, H.C.M., Kustters-van-Someren, M.A., Margo, A., Mueller, Y., Visser, J.
(1996a). Primary structure and characterization of an exopoligalacturonase from
Aspergillus tubingensis. Eur. J. Biochem., 240, 738-746.
73.
Kester, H.C.M., Kustters-van-Someren, M.A., Muller, Y., Visser, J. (1996b). The exopolygalacturonase from Aspergillus tubingensis: characterization and cloning of the gene.
Prog. Biotechnol., 14 [ Pectins and pectinases], 817-823.
74.
Kester. H.C.M., Benen, J.A., Visser, J., Orlando, R., Bermann, C., Magaud, D., Anker,
D., Douthean, A. (2000). Tandem mass spectrometric analysis of Aspergillus niger pectin
methylesterase: mode of action on fully methylesterified oligogalacturonates. Biochem. J.,
349(part 2), 469-474.
75.
Khahn, O.N., Ruthamski, E., Leidinger, K. (1991). Characterization and expression of
a genomic pectin methylesterase-encoding gene in Aspergillus niger. Gene, 106, 717-720.
76.
Kobajaschi, T., Higoki, N., Yajima, N., Suzumatsu, A., Hagilava, H., Kawai, S., Ito, S.
(2001). Purification and properties of a galacturonic acid realising exopoligalacturonase
from a strain of Bacillus. Biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 842-847.
77.
Koller, A., Neukom, H. (1969). Research on the degradation mecanism of a purified
polygalacturonase from Aspergillus niger. Eur. J. Biochem., 7, 485-489.
78.
Konno, H. (1988). Endopectate lyase from Erwinia aroideae. In Methods in
Enzymology, editori Wood, W.A. si Kellogg S.T., vol. 161, pag. 381-385.
79.
Kravtchenko, T.P., Penci, M., Voragen, A.G.J., Pilnik, W. (1993). Enzymic and
chemical degradation of some industrial pectins. Carbohydr. Polym., 20, 195-205.
80.
Kulbe, K.D. (1987). Enzymatic synthesis of L-ascorbic acid via D-uronic acids
membrane-reactor integrated recovery of D-galacturonic acid from pectin hydrolysates.
Ann. N.Y.Acad. Sci., 506, 543-551.
81.
Lacours, N., Toti, L., Sieber, T.N., Petrini, O. (1994). Pectic enzyme patterns as a
taxonomic tool for characterization of Gremmennielo sp. Isolates. Can. J. Bot., 74, 891896.
82.
Laangley, K.R., Martin,A., Stenning, R., Murray, A.J., Hobson, G.E., Schuch, W.,
Bird, C.R. (1994). Mecanical and optical assessment of the ripening of tomato fruit with
reduced polygalacturonase activity. J. Sci. Food Agric., 66, 547-554.
83.
Laurent, F., Kotoujansky A., Berteau, Y. (2000). Overproduction in E.Coli of pectin
methylesterase from Erwinia chrysanthemi 3937: one-step purification, bichemical
characterization, and production of polyclonal antibodies. Can. J. Microbiol., 46, 474-480.
84.
Lietzki, S., Yader, K., Jurnak, F. (1994). The three-dimensional structure of pectate
lyase E, a plant virulance factor from Erwinia chrysanthemi. Plant Physiol., 106, 849-862.
85.
Lim, Y.K., Yamasaki, Y., Suzuki, Y., Ozawa, J. (1980). J. Agric.Biol., 44, 473-476,
citati dup Whitaker, J.R. (1990). Microbial pectinolytic enzymes. In Microbial enzymes
and biotechnology (editia a 2 a), editori Fogarty, W.M. si Kelly, C., Elsevier Applied
Science, London, pag. 151.
86.
Lim, J.Y., Fujio, Y., Ueda, S. (1983). Purification and characterization of
pectinesterase and pectin lyase from Aspergillus oryzae A-3. J. Appl. Biochem., 5, 91-98.
87.
Lissau, B.G., Pedersen, P.B., Petersen, B.R., Budolfsen, G. (1998). Safety evaluation
of a funga pectinesterase enzyme preparation and the use in food. Food Addit. Contam.,
15, 627-636.
88.
Liu, Y.K., Luh, B.S. (1978). Purification and characterization of
endopolygalacturonase from Rhizopus arrhizus. J. Food Sci., 43, 721-726.
201
89.
MacKinnen, J.M., Jardine, W.G., OKennedy, N., Renard, C.M., Jarvis, M.C. (2002).
Pectin methyl and nonmethyl esters in potato cell walls. J. Agric. Food Chem., 50, 342346.
90.
MacMillan, J.D., Phaff, H.J. (1966). Exo-polygalacturonase lyase from Clostridium
multifermentans. In Methods in enzymology, editori Neufeld, E.F. si Ginsburg, V.,
Academic Press, vol. VIII, pag 632- 645.
91.
Maldonado, M.C., Shasser de Sad, A.M., Callieri, D.A.S. (1994). Purification and
characterization of pectinesterase produced by a strain of Apergillus niger. Curr.
Microbiol. 28, 193-196.
92.
Maldonado, M.C., Shasser de Sad, A.M. (1998). Production of pectinesterase and
polygalacturonase by Aspergillus niger in submerged and solide state systems. J. Ind.
Microbiol. Biotechnol., 20, 34-38.
93.
Manachini, P.L. (1988). Pectic enzymes from Aureobasidium pullulans LV 10.
Enzyme Microbiol. Technol., 10, 682-685.
94.
Manjou, A., Ibarro, J.L., Romaro, C., Canovas, M. (1992). Properties of pectinesterase
and endo-D-polygalacturonase coimmobilized in a porous glass support. Appl. Biochem.
Biotechnol., 32, 19-31.
95.
Marcovic, O. (1989). Biologia (Bratislava), 44, 1185-1189, citat din Chemical
abstracts, vol. 113, 147666g (1990).
96.
Marcovic, O., Stovickov, J., Joernvall, H. (1996). Modification of tomato and
Aspergillus niger pectinesterase with diethyl pyrocarbonate.. Protein Chem., 15, 127-130.
97.
Martel, M.B., Letoublon, R., Fevre, M. (1998). Purification and characterization of
two endopolygalacturonase secreted during the early stages of the saprophytic growth of
Sclerotinia Sclerotiorum. FEMS Microbiol. Lett., 158, 133-138.
98.
Mattei, B., Salvi, G., Caprari, C., Lorrenzo, G., Crescenzi, V., Cervone, F. (1996).
Analysis of interaction between PGIP from Phaseoleus vulgaris L anf fungal
endopolygalacturonase using biosensor technology. Prog. Biotechnol., 14 [ Pectins and
pectinases],775-782.
99.
Mayer, A.S., Koser, C., Adler-Nissen, J. (2001). Efficiency of enzymatic and other
alternative clarification and fining treatments and haze in chery. J. Agric. Food Chem., 49,
3644-3650.
100. Mc Millan, G.P., Idnston, D.I., Perombelon, M.C. (1992). Purification to homoganity
of extracellular polygalacturonase and isoenzymes of pectate lyase of Erwinia carotovora,
subs. atroseptica by column chromatography. J. Appl. Bacteriol., 73, 83-86.
101. Mikhailov, R.V., Sapunov, L.I, Lobanok, A.G. (1994). Biosynthesis of pectin lyases
in Penicillium adametzi, Penicillium citricum, Penicillium janthinellum. Word J.
Microbiol. Biotechnol., 10, 457-461.
102. Mikhailov, R.V., Sapunov, L.I, Lobanok, A.G. (1995). The three polygalacturonases
constitutively synthesized by Aspergillus alliaceus. World J. Microbiol. Biotechnol., 11,
330-332.
103. Miller, L., Macmillan, J.D. (1970). Mode of action of pectic enzymes. II. Further
purification of exopolygalacturonate lyase and pectinesterase from Clostridium
multifermentans. J. Bacteriology., 102, 72-78.
104. Miller, L., Macmillan, J.D. (1971). Purification and pattern action of pectinesterase
from Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum. Biochemistry, 10, 570-576.
105. Mountfort, D.O., Atkinson,M. (1995). Evidence for the role of Na+ ang galacturonic
acid in the regulation of polygalacturonase production by marine anaerobe Eubacterium
sp. Strain P-1. Botanica Marina, 38, 195-201.
202
D. Dinu
106. Nakagawa, T., Miyaji, T., Yurimoto, H., Sakai, H., Kato, N., Tomizuko, N. (2000). A
methylotrophic pathway participates in pectin utilization by Candida boidimii. Appl.
Envirom. Microbiol., 66, 4253-4257.
107. Nakamura, T., Hours, R.A., Sakai, T. (1995). Enzymatic maceration of vegetables with
protopectinases. J.Food Sci., 60, 468-472.
108. Nikaidou, N., Naganuno, T., Kamio, Y., Izaki, K. (1995). Production, purification, and
properties of a pectin lyase from Pseudomonas marginalis N 6301. Biosci. Biotechnol.
Biochem., 59, 320-324.
109. Niture S.K., Pant, A., Kuma, A.R. (2001). Active site characterization of the single
endopolygalacturonase produced by F. moniliforme NCIM 1276. Eur. J. Biochem., 268,
832-840.
110. ONeill, M., Albersheim, P., Darvill, A. (1990). The pectic polysaccharides of primary
cell wall. n Methods in Enzymology, vol. 2, pag. 415-441.
111. Pickersgill, R., Jenkins, J., Nasser, H., Robert-Boudouy, J. (1994). The structure of
Bacillus subtilis pectate lyase in complex with calcium. Nat. Struct. Biol., 1, 712-723.
112. Pitkanen, K., Heikinheimo, R., Pakkanen, R. (1992). Purification and characterization
of Erwinia chtysanthemi B 374 pectin methylesterase produced by Bacillus subtilis.
Enzyme Microb. Technol., 14, 832-836.
113. Preston, J.F., Rice, J.D., Jugan,O., Keen, N.T. (1992). Differential depolymerization
mechanisms of pectate lyases secreted by Erwinia chrysanthemi EC 16. J. Bacteriol., 174,
2039-2042.
114. Prusky, D. (1989). Purification and characterization of an endopolygalacturonase
produced by Colletotrichum gloeosporioides. Physiol. Mol. Plant Pathol., 35, 121-133.
115. Ralet, M-C, Dronnet, V., Buchholt, H.C. Thibault, J-F. (2001). Enzymatically and
chemically de-esterfied lime pectins: characterization, polyelectrolyte behaviour and
calcium binding properties.. Carbohydr. Res., 336, 117-125.
116. Rao, M., Narsimha, K., Asha, A., Pant, A. (1996a). Role of lysine, tryptophan and
calcium in the -elimination activity of a low molecular-mass pectate lyase from
Fusarium moniliforme. Biochem. J., 319, 159-164.
117. Rao, M., Narsimha, K., Asha, A., Pant, A. (1996b). Implication of tryptophan anh
histidine in the active site of endo-polygalacturonase from Aspergillus ustus: elucidation
of the reaction mechanism. Biochim. Biophys Acta, 1296, 167-176.
118. Recourt, K., Stolle-Smith, T., Laats J.M., Beekhuizan, J.G., Eddelaan, C.E.M.,
Voragen, A.G.J., Wichers, H.I. (1996). Pectins and pectolytic enzymes in relation to
development and processing of green beans (Phaseolus vulgaris L). Prog. Biotechnol.,
19, 399-404.
119. Reddy, S.R., Reddy, S.M. (1983). Comp. Physiol. Ecol., 8, 69, citati dup Whitaker,
J.R. (1990). Microbial pectolytic enzymes. n Microbial enzymes and biotechnology
(ediia a 2 a), editori Fogarty, W.M. i Kelly, C., Elsevier Applied Science, London, pag.
155.
120. Reignault, P., Mercier, M., Bompeix, G., Boccara, M. (1994). Pectin methylesterase
from Botrytis cinerea: physiological, biochemical and immunochemical studies.
Microbiology., 140, 3249-3255.
121. Rexov-Benkov, L., Marcovic, O. (1976). Pectic enzymes. In Advancces in
carbohydrate chemistry and bichemistry,editori Tripton, R.S. si Horton, D., vol. 33, pag.
323-381.
122. Rexov-Benkov, L., Mrackov, M. (1978). Active groups of extracellular endo-Dgalacturonase of Aspergillus niger derived from pH effect on kinetic data. Biochim.
Biophys. Acta, 523, 162-169.
203
123. Rho, E., Park, H.J., Kim, M.O., Chung, Y.R., Lee, C.W. (2001). Expression of
exopolygalacturonase in Botrytis cinerea. FEMS Microbiol. Lett., 201, 105-109.
124. Rijssel, M., Geewig, J.G., Hansan,A.T.(1993). Isolation and characterization of an
extracellular glycosylated protein complex from Clostridium thermossaccharolyticum
with pectic methylesterase and polygalacturonate hydrolases activities. Appl. Environ.
Microbiol., 59, 828-836.
125. Rodriguezpalenzuela, P., Burr, T.J., Collmer, A. (1991). Polygalacturonase is a
vitulence factor in A. grobacterium tumefianas. J. Bacteriol., 173, 6547-6552.
126. Rombouts,
F.M.,
Pilnik,
W. (1980).
Pectic
enzymes.n
Economic
microbiology:enzymes and bioconversion, editor Ros, A.H., Academic Press, New York,
vol. 5, pag. 227-282.
127. Ruiz-Teran, F., Perez-Amador, I., Lopez-Munguia, A. (2001). Enzymatic extraction
and transformation of glucovanillin to vanillin from vanilla green pods. J. Agric. Chem.,
49, 5207-5209.
128. Sakai, T. (1988). Protopectinase from yeasts and yeasts like fungus. In Methods in
enzymology (Biomass, Part B ), editori Wood, W.A. si Kellogg, S.T., Academic Press, vol.
161,pag. 366-373.
129. Sakai, T., Sakamoto, T., Hallaert, J., Vandamme, E.J. (1993). Pectin, pectinase and
protopectinase: production, properties, and applications. Adv. Appl. Microbiol. 39, 213290.
130. Sakellaris, G. (1989a). Production, purification and characterization of extracellular
pectinesterase from Lactobacillus plantarum Biotechnol. Appl. Biotechnol., 11, 503-507.
131. Sakellaris, G. (1989b). Purification and characterization of an extracellular
polygalacturonaase from Lactobacillus plantarum strain B A 11. J.Appl. Bacteriol., 67,
77-85.
132. Sakiyama, C.C., Paula, E.M., Pereira, P.C., Borges, A.C., Silva, D. (2001).
Characterization of pectin lyase produced by an endophylic strain isolated from cofee
cherries. Lett. Appl. Microbiol., 33, 117-121.
133. Salinas, J., Verhoeff, J. (1995). Microscopical studies of the infection on gerbera
flowers by Botrytis cinerea. J. Plant Pathology, 101, 377-386.
134. Sawada, K., Ueda, M. (2001). Enzyme processing of textiles in reverse micellar
solution. J. Biotechnol., 89, 263-269.
135. Schejter, A., Marcus, L. (1988). Isozymes of pectinase and polygalacturonase from
Botrytis cinerea Pers. In Methods in enzymology (Biomass, Part B ), editori Wood, W.A.
si Kellogg, S.T., Academic Press, vol. 161,pag. 366-373.
136. Shanley, N.A., Van den Broek, L.A.M., Voragen, A.G.J., Coughlan, M.P. (1993a).
Izolation and characterization of an endopolygalacturonase from phanerochaete
chrysosporium. J. Biotechnol., 28, 179-197.
137. Shanley, N.A., Van den Broek, L.A.M., Voragen, A.G.J., Coughlan, M.P. (1993b).
Physicochemical and catalytic properties of three endopolygalacturonase from
Penicillium pinophilum. J. Biotechnol., 28, 199-218.
138. Shevchik, V.E., Condemine, G., Hugouvieux-Cotte-Pattat, N., Robert-Boudouy, J.
(1996a). Characterization of pectin methylesterase B, an outer membrane lipoprotein of
Erwinia chrysanthemi 3937. Mol. Microbiol., 19, 455-466.
139. Shevchik, V.E., Condemine, G., Hugouvieux-Cotte-Pattat, N., Robert-Baudouy, J.
(1996b). Pectin methylesterase B of Erwinia chrysanthemi, the first pectinase
characterized as a membrane lipoprotein. Prog. Biotechnol., 14, [Pectins and pectinases],
837-844.
140. Shevchik, V.E., Hugouvieux-Cotte-Pattat, N. (1997). Identification of a bacterial
pectin acetyl esterase in Echerichia coli 3937. Mol. Microbiol. 24, 1285-1301.
204
D. Dinu
141. Silley, P. (1985). A note on pectolytic enzymes of Lachnospira multiparus. J. Appl.

Bacteriol., 58, 145-149.
142. Solehah, A., Balaumani, K.D., Amizo, M.A. (1994). Enzymes for improved extraction
and stabilization of colour and flavour of orange juice. J. food Sci. Technol., 31, 508-510.
143. Solis, S., Flores, M.E., Huitron, C. (1997). Improvement of pectinase production by
interspecific hybrids of Aspergillus strains. Lett. Microbiol., 24, 77-81.
144. Statilov, E., Markovic, O., Skrovinov, D., Jrnavall, H. (1993). Pectinase of
Aspergillus sp. polygalacturonase: multiplicity, divergence, and structural patterns linking
fungal, bacterial and plant polygalacturonases. J. Protein Chem., 12, 15-22.
145. Statilov, E., Breierov, E., Vadkertiov, R. (1996a). Candida boidinii-a new found
producer of pectic enzymes complex. Prog. Biotechnol., 14, [Pectins and pectinases], 453462.
146. Statilov, E., Dzurov, M., Markovic, O., Jrnavall, H. (1996a). An essential tyrosine
rezidue of Aspergillus polygalacturonase. FEBS Lett., 382, 140-146.
147. Statilov, E., Mislovicov, D., Kacurakov, M., Machov, E., Kolarov, M.,
Markovic, O., Jrnavall, H. (1998b). The glycoprotein character of multiple forms of
Aspergillus polygalacturonases. J. Protein Chem., 17, 173-179.
148. Stotz,H.V., Powell, A.L.T., Damon, S.E., Greve, L.C., Bennett, A.B., Labavitch, J.M.
(1993). Molecular characterization of a polygalacturonase from Pyrus communis L. cv.
Bartlett. Plant Physiol., 102, 130-138.
149. Stotz,H.V., Contos, J.A., Powell, A.L.T., Bennett, A.E., Labavitch, J.M. (1994).
Structure and expression of an inhibitor of fungal polygalacturonases from tomato. Plant
Mol. Biol., 25, 607-617.
150. Tagawa, K., Kaji, A. (1988). Polygalacturonase from Corticium rolfsii. In Methods in
enzymology (Biomass, Part B ), editori Wood, W.A. si Kellogg, S.T., Academic Press, vol.
161,pag. 361-365.
151. Takao, M., Nakaniwa, T., Yoshikawa, K., Terashita, T., Sakai, T. (2001). Purification
and characterization of thermostable pectate lyase with protopectinase activity from
thermophillic Bacillus sp. TS 47. Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 2360-2367.
152. Tierny, Y., Bechat, M., Joncquiert, J-C., Dubourguier, H-C., Guillaume, J. (1994).
Molecular cloning and expression in Escherichia coli og genes encoding lyase and pectin
methylesterase activities from Bacteroides thetarotaomicron. J. Appl. Bacteriol., 76, 592602.
153. ten-Have, A., Breuil, W.O., Wublen, J., Visser, J., van Kar, J. (2001). Botrytis cinerea
endopolygalacturonase genes are differentially expressed in various plant tissues. Fungal
Genet. Biol., 33, 97-105.
154. Treman, D,M., Handa, A.K. (1994). Reduction of pectin methylesterase activity
modifies tissue integrity and cation levels in ripening tomato fruits. Plant Physiol., 106,
429-436.
155. Ueda, S., Fujio, Y., Liu, J.V. (1982). Pectic enzymes from Aspergillus oryzae. J. Appl.
Biochem., 4, 524-535.
156. Vilanova, M., Blanco, P., Cortes, S., Villa, T.G., Siliro, C. (2000). Use a PGU 1
recombinat saccharomyces cerevisiae strain in oenological fermentations. J. Appl.
Microbiol., 89, 876-883.
157. Vucari, L, Tenkanen, M, Buchert, J., Rathr, M., Barley, M., Linko, M. (1993). In
bioconversion of forest and agricultural plant residues, editor Saddler, J.N., International
Oxford, pag. 131-182.
158. Wattad, C., Freeman, S., Dinoor, A., Pruski, D. (1995). Colletotrichum magna is
deficient in extracellular secretion of pectate lyase. Mol. Plant-Microbe Interact., 8, 621626.
205
159. Whitaker, J.R. (1990). Microbial pectolytic enzymes. In Microbial enzymes and
biotechnology (editia a 2 a), editori Fogarty, W.M. si Kelly, C., Elsevier Applied Science,
London, pag. 133-176.
160. Yamaguchi, F., Inoue, S., Hatanaka, C. (1995). Purification and properties of endo-1,4D-galacturonase from Aspergillus niger. Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 1742-1744.
161. Yang, H.A., Zhou, J., Sivasithamparam, H., Tommerup, I.C., Barton, J.E., Obrien, P.A.
(1994). Genetic variability in pectic enzymes of Rhizoctonia solarii isolates causing barepatch disease of cereals. J. Phytopathology, 141, 259-266.
162. Yao, C., Conway, W.S., Sams, C.E. (1995). Purification and characterization of a
polygalacturonase produced by Penicillium expansum in apple fruit. Phytopathology, 86,
1160-1166.
163. Yoder, M.D., Keen, N.T., Jurnak, F. (1993a). New domain motif of the structure of
pectate lyase C, a novel secreted plant virulance factor. Science, 260, 1903-1907.
164. Yoder, M.D., Lietzke,S.E., Jurnak, F. (1993b). Unusual structural features in the
parallel -helix in pectate lyases. Structure, 1, 241-251.
165. Yoskioka, S., Ukedo, H., Matsunuoto, K., Osajimo, Y. (1992). Enzymatic
determination of pectin and related lower-molecular weight compounds in fruits and
vegetables using polygalacturonase, pectinesterase, glucuronolactone reductase and
ascorbat axidase. Nippon Skokukin Kogyo, 39, 821-826.
206

Capitolul 6

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Capitolul 6

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

D.

Enzime pectinolitice de origine microbian

1.Pectinele, substraturi ale enzimelor

Enzime pectinolitice de origine microbian

Studiile intreprinse asupra pereilor celulari de provenien diferit

Figura 1. Aranjamentul principalilor constitueni ai peretelui celular primar.

Enzime pectinolitice de origine microbian

Gradul de esterificare, proporia de zaharuri neutre i gradul de

Substanele pectice se gsesc aproape n toate organele plantelor.

2.Clasificarea i nomenclatura enzimelor

3. Surse de izolare ale enzimelor pectinolitice

Enzime pectinolitice de origine microbian

Ele joac un rol important n procesele de cretere, n plantele

Enzime pectinolitice de origine microbian

Din clasa fungilor, speciile de Aspergillus sunt cele mai bune

Majoritatea enzimelor pectinolitice produse de microorganisme sunt

4.Enzimele pectinolitice de origine microbian:

Enzime pectinolitice de origine microbian

pectin. Monitorizarea simultan i continu a celor dou tipuri de

valorile acestora fiind influenate de modul de exprimare a concentraiei

Enzime pectinolitice de origine microbian

Pectinesteraza II, izolat de Lim (1983) din culturi de Aspergillus oryzae a

Compoziia n aminoacizi, diferit pentru cele trei protopectinaze,

Enzime pectinolitice de origine microbian

determinat ca manoz; b determinat ca ramnoz

Experimentele realizate de Iguchi (1996) au evideniat c, sub

Enzime pectinolitice de origine microbian

Endopoligalacturonazele (EC 3.2.1.15) sunt enzime care hidrolizeaz

Enzime pectinolitice de origine microbian

Figura 4. Posibiliti de aciune a endopoligalacturonazelor pe substraturi mici

Comparativ cu alte enzime pectinolitice, valorile K M pentru poligalacturonat

Enzime pectinolitice de origine microbian

Enzime pectinolitice de origine microbian

Hara (1984) a izolat dou exopoligalacturonaze din culturile de

4.5. Oligogalacturonat hidrolazele i oligogalacturonat liazele

trimer > tetramer > pentamer >

n-dimer > n-trimer > n-tetramer

dimer > acid pectic solubil > ndimer;

Enzime pectinolitice de origine microbian

n-dimer > dimer > trimer >

tetramer >trimer > n-trimer >

au pH-uri optime alcaline;

prezena ionilor de calciu este absolut necesar;

fiind o gam larg de oligogalacturonai 4,5 nesaturai. Aceti produi

Enzime pectinolitice de origine microbian

Analiza structurii tridimensionale a pectat liazei din Bacillus subtilis

4.8. Exopectat liazele

Enzime pectinolitice de origine microbian

exopectat liaze la Fusarium oxisporum sp. radicis lycopersici, proteine cu

O rest de acid galacturonic esterificat

Cteva din proprietile pectin liazelor microbiene sunt prezentate n

5.Importana i utilizrile enzimelor pectinolitice

Enzime pectinolitice de origine microbian

reflectat prin nmuierea i, ulterior, prin lichefierea materialului plantei.

Expresia unei gene antisens pentru pectinesteraz, a determinat o

Enzime pectinolitice de origine microbian

a dovedit a fi nepatogen, dei acest microorganism este cunoscut ca fiind

Un inhibitor proteic natural al pectinesterazelor a fost izolat i din

Enzime pectinolitice de origine microbian

O serie de studii au evideniat mbuntirea calitii esturilor atunci

Studii recente (Ruiz-Teran i alii 2001) au artat o extracie de 3 ori

Agravante, J., Matsui, T., Kitagawa, H. (1991). Changes in pectin methylesterase,

Enzime pectinolitice de origine microbian