Replicarea ADN

CE ESTE REPLICAREA ADN?

Biosinteza ADN
Are loc astfel nct s fie asigurat
stabilitatea genetic n organism i n
cadrul speciei (este o modalitate
specific de biosintez care permite
conservarea i transmiterea informaiei
genetice de la o generaie la alta).

Cnd i unde are loc replicarea ADN?

La eucariote replicare are loc doar n faza S, de sintez, a ciclului
celular, faza separat de faza mitotic M prin perioadele de gol
(gap) sintetic G1 i G2.

S
Faza S a ciclului
celular
Nucleu

phase

G1

interphase

Mitosis
-prophase
-metaphase
-anaphase
-telophase

G2

REPLICAREA ADN PE SCURT

Dublul helix al ADN se desface i se
construiesc pe fiecare dintre cele dou
catene parentale (numite catene matri
sau template) cte o caten complementar
replica celor parentale.

Replicarea cu ceva mai multe detalii

1. Dublul helix se desface.
2. La jonciunea dintre cele dou
catene parentale desfcute ia
natere bifurcaia de replicare.
3. O nou caten se formeaz prin
mperecherea nucleotidelor libere
cu bazele complementare de pe
catena veche.
4. Rezult dou molecule-fiice
de ADN care conin cte o caten
Parental i o caten nou.

CARACTERISTICILE REPLICARII ADN

1. semi-conservativ
2. complet
3. bi-direcional (dei are loc ntotdeauna n
direcia 5 3 !!!)
4. semi-discontinu

1. Replicarea ADN este semi-conservativ

(Meselson-Stahl, 1958).
Fiecare molecul
fiic de ADN conine
o caten parental
intact asociat cu o
caten nou
sintetizat.

Meselson & Stahls Famous Experiment (1958)

2. Replication este complet

Replicarea ADN antreneaz ntregul
cromozom, rezultand doi cromozomi
identici.

Cromozom circular
(procariote)

3. Replicarea ADN este bi-direcional

(Cairns, 1963).
Replicarea ncepe ntr-un punct bine
determinat numit origine de replicare (ori) i
pornind din acest punct se deruleaz simultan
n ambele direcii.

bidirecional

4. Replicarea este semi-discontinu

Reiji Okazaki a propus i demonstrat n 1968 c n timp ce sinteza
unei catene (catena leading) este continu, sinteza celei de-a doua
catene (catena lagging ) este discontinu (n runde de 150-250 nt).

ntrebare:

1.
2.
3.
4.

Urmtoarele afirmaii n ceea ce privete

replicarea ADN sunt corecte:
Replicarea se realizeaz pe anumite poriuni din
cromozom.
Sinteza ADN pe catena lagging este continu.
Fiecare moleucl fiic de ADN conine dou
catene nou sintetizate.
Fiecare caten a ADNdc acioneaz ca
matri/template pentru o nou caten de ADN.

Elementele eseniale necesare

replicrii

Sunt necesare cinci elemente esniale :

1.

ADN parental- matria (fiecare caten de ADN

servete ca matri)
cele 4 dezoxiribonucleozid trifosfai dNTP (dATP,
dGTP, dTTP, dCTP)
cele 4 ribonucleozid trifosfai NTP (ATP, GTP, UTP,
CTP); aceasta sugereaz necesitatea sintezei de
ARN n cursul sintezei de ADN!!!
Proteine specifice, majoritatea enzime
Mg2+

2.
3.
4.
5.

Proteine specifice implicate n replicare

Proteina

Funcia

Helicaza

Desface dublul helix ADN

Single-stranding
Stabilizeaz ADNmc i previn renaturarea lui
binding proteins (SSB) (refacerea dublu helixului)
Topoisomeraze

Elimin torsiunile produse de helicaz printr-un

mecanism de tiere-coasere

ADN primaza

Iniiaz sinteza ARN (!!!) primer

ADN polimeraze -ADN Polimerizarea dezoxiribonucleotidelor folosind matria

dependente
de ADN
ADN ligaza

Leag fragmentele de ADN nou sintetizate

Enzimele implicate n replicarea ADN

Helicase desface
dublu helix

ADN polimeraza III

leag nucleotidele
pt. a forma noul ADN

SSB stabilizeaz
ADNmc

ADN polimeraza I
(exonucleaza)
nlocuiete ARN primer
cu ADN

Primaza sintetizeaz
un ARN primer pe
matri de ADN

Ligaza leag /coase

fragmentele de ADN
(frag. Okazaki).

Helicaza

desface dublul helix

Proteina DnaB
Hexamer
Catalizeaz un fel de denaturare in vivo a
ADN (catenele dezrsucite pot fi citite de
ctre enzimele replicrii)
necesit energie; consum 2 molecule de
ATP per 2 legturi de hidrogen desfcute.

Single stranded proteins (SSBs)

Tetramer
Se leag de cele dou catene ADN i le
menine separate prevenind renaturarea lor
Trebuie s fie ndepartate nainte ca noua
caten de ADN s poat fi sintetizat

Topoisomerazele
enzime care rezolv tensiunile sterice (torsiuni
+, de dreapta) aprute n cursul dezrsucirii (cu o
vitez de 100 revoluii/sec !!!) duplexului ADN, i
care ar putea bloca replicarea

Clase de topoizomeraze: topoizomeraza I

acioneaz ca o endonucleaz reversibil, printr-un mecanism
de tiere-coasere care permite rotaia liber a ADNmc (aciune
de suveic) .
economic (nu necesit aport energetic): hidrolizeaz o
legtur fosfat diesteric a crei energie o conserv ntr-o legtur
fosfat esteric implicnd Tyr din centrul activ al enzimei i
ulterior o folosete la refacerea catenei incizate
Enzima

ADN

Enzima

coasere

tiere
relaxare

Clase de topoizomeraze: topoizomeraza II

ADN-giraza
Dimer
Introduce n molecula de ADN supertorsiuni
(-), spre stnga, n sens contrar celor create de
naintarea bifurcaiei de replicare; astfel
compeseaz n avans constrngerile impuse de
desrsucirea duplexului de ADN
Necesit energie (consum de ATP)

ADN polimerazele-ADN dependente:

Copiaz catena matri n direcia 3
Sintetizeaz catena nou n direcia 5

5
3: formeaz legturi

fosfat diesterice ntre dou dNTP vecine dictate de template, prin atacul
nucleofil realizat de ctre gruparea 3-OH al primului nucleotid asupra gruprii
fosfat din dNTP urmtor)

Necesit un primer deoerece nu poate initia sinteza unei catene noi (ARNul sintetizat de primaz servete drept primer)

AUTO-CONTROL: Au activitate 3' -> 5' exonucleazic, care st la baza

capacitii de autocontrol sau de PROOF-READING: desface nucleotidele
greit mperecheiate de la captul 3 al catenei n cretere.

PROCESIVITATE (Procesivitatea este capacitatea polimerazei de a se menine

legat de matri; este o expresie a numrului de nucleotide adugate la lanul
ADN n cretere nainte ca polimeraza s se disocieze de matir)

REACTIA CATALIZAT DE ADN POLIMERAZ

P

P
CH2

Base

Cap 5'
CH2

Base

P
CH2

Base

CH2

Base

H20
+

3'

OH

P
CH2

P
5' CH2

3'
OH

P
Base

Pirofosfat

Base

OH
Cap 3 (n cretere)

Clase ADN polimeraze -ADN

dependente:
procariote:
ADN pol I, II, III, IV, V

eucariote:
- ADN pol , , , ,

Proprietile ADN polimerazelor la procariote

ADN polimeraza

II

III

Gena

Pol A

Pol B

Pol C

Nr. subuniti

>4

>10

Activitate exonucleazic (3' -> 5')

sau proofreading?

da

da

da

Activitate exonucleazic 5' -> 3'?

da

nu

nu

Viteza polimerizrii (nucleotide

adugate/sec)

16-20

5-10

250-1000

Procesivitatea (nucleotide
adugate nainte de disociere)

mic
(3-200)

mare
(10,000)

foarte mare
(500,000)

Este ADN polimeraza I polimeraza

replicativ principal?

DNA polimeraza I nu este

polimeraza replicativ principal!
Enzima este prea lent!
ADN polimeraza I catalieaz ncorporarea dNTP cu o vitez maxim de 20
nt/sec: ar avea nevoie de 53 zile pentru a replica integral cromozomul E.coli,
care n realitate se divide la fiecare 20 min.

Enzima nu este suficient de procesiv.

Enzima este prea abundent.
Exist aproxiamtiv 400 molecule de ADN polimeraza I per celul E.coli i
doar 2 bifurcaii de replicare per celul.

Celulele prezentnd mutaii polA1 sunt viabile.

DNA polimeraza III este

polimeraza replicativ
Proprietile ADN pol III sunt potrivite pentru o
enzim care deine un rol central n replicarea
ADN: are o procesivitate foarte mare i
catalizeaz polimerizarea la o vitez foarte
nalt (250-1000 nt/sec).
Sinteza catenei leading.

Care este rolul ADN polimerazei I ?

La ce folosete activitatea 53exonucleozic, specific
acestei polimeraze?

ndeprtarea primerului de la
captul 5 al lanului n
cretere

La ce folosete activitatea
polimerazic a ADN pol I ?

Sinteza catenei lagging,

nlocuirea cu dNTP a locului
lsat liber de primer i
repararea leziunilor ADN (ex.
leag dNTP pe locul liber
aprut dup ndeprtarea baze
greit mperechiate)

ADN polimerazele la procariote

(continuare)
ADN pol II este implicat n reparea leziunilor ADN (are activitate
3' -> 5 exonucleazic.
ADN pol IV
- Pol IV este o ADN polimeraz predispus la erori de mperechere
(nu are activitate de proof-reading ca la pol III, pol II i pol I)
- Pol IV este responsibil de 50% din mutaiile adaptative.
ADN pol V
- Pol V aparine unei ci speciale de reparare (un fel de ultima
barier) denumit calea SOS de reparare a ADN.
- Pol V este sintetizat cnd celula este expus la doze mari de
radiaii sau de mutageni, cnd pot s apar lez. majore ADN.

Proprietile ADN polimerazelor la eucariote

ADN pol

localizare

nucleu

nucleu

mitocondrie

nucleu

nucleu

funcie

nlocuire
primer

reparare

sinteza ADN
mitocondrial

Replicaza reparare

Sinteza
catena
lagging
similaritate Pol I
cu enzime
de la
procariote

Sinteza
caten
leading
Pol II

Pol II

Pol III

Pol II

Primaza:
-

Sintetizeaz
oligoribonucleotidul
(ARN primer) iniial
pe care se ataeaz
ADN polimeraza.

ARN primer este

format din 4-12
ribonucleotide.

Noua caten de ADN

se constuiete prin
adugarea de
nucelotide la captul 3
al ARN primer.

- ARN primer e nlocuit

n final cu ADN.

ntrebare:
ADN polimeraza:
A. Initiaz sinteza lanului polinucleotidic
B. Sintetizeaz un lan polinucleotidic n diercia 3- 5
C. Citete matria de ADN n direcia 5- 3
D. Produce cte o molecul de pirofosfat la adugarea
fiecrei nucleotide la catena n cretere.

ETAPELE REPLICRII ADN

(i elementele-cheie ale fiecrei etape)
Iniierea: primozomul- un complex de proteine
i originea replicrii ori
Elongarea: replizomul- un complex de proteine,
asociate cu ADN cu rol n sinteza
catenelor noi de ADN
Terminarea: proteina Tus- situsul de
terminare ter

REPLICAREA ADN LA
PROCARIOTE

1. INIIEREA
controleaz ntregul proces de
replicare!

Origineareplicrii

Iniierea replicrii

Identificarea originii de
replicare

5
3

3
5

5
3

3
5

5
3

3
5

Dezrsucirea mediat de
ctre helicaz (denaturarea)
duplexului ADN cu fomarea
ADNmc i a bifurcaiilor de
replicare
Legarea SSB la ADNmc
Formarea primozomului
(conine i primaza)

Sinteza ARN primer

5
3

5
5

3
5

Originea replicrii
Originea replicrii
(oriC) este o regiune de
245 perechi baze bogat
n AT
OriC este recunoscut
de ctre proteina dnaA
care se leag la oriC, i
care mpreun cu
proteina dnaB (helicaza)
desface ADNdc
(folosind ATP).

oriC

Primozomul
- elementul cheie al iniierii Primozomul este un complex de proteine care este
format din:
- dnaB (helicaz)
- dnaC (aperon al dnaB: asist plicaturarea dnaB)
- primaza
- alte proteine
Primozomul se deplaseaz mpreun cu bifurcauia
de replicare, consumnd ATP
Primozomul este responsabil pentru sinteza ARN
primer.

2. ETAPA DE ELONGARE

Etapa de elongare
-Sinteza de ADN prin adugarea de dezoxiribonucleotide (una cte
una) iniial la captul 3 al ARN primer, ulterior la captul 3 end
al catenei n cretere.
3

5
3

3
5

5
5

Etapa de elongare
-Catena parental 3- 5 (care este citit n aceei direcie cu
deplasarea bifurcaiei de replicare) este copiat continu.
-Catena nou astfel sintetizat este catena leading.

Etapa de elongare
-Catena parental 5- 3 (care este citit n direcie opus fa de
deplasarea bifurcaiei de replicare) este copiat discontinu.
Catena nou astfel sintetizat este catena lagging i este sintetizat
n fragmente mici (1fragment per rund sintez)-fragmentele Okazaki

Etapa de elongare

Replicarea ADN la E. coli are viteza ~1000 nt/s

Polimeraza III (subunitatea ) formeaz un inel care
alunec pe ADN matri i care crete procesivitatea
miezului Pol III de la 10-15 la>5000 perechi baz
35 diametru; (+) interior, (-) exterior

Replicarea bidirectionala
a cromozomului circular la
procariote produce un
intermediar n forma literei
Theta.
ori

ter
Replication
Forks

Replizomul
- elementul cheie al elongarii complex de proteins care cuprinde toate
enzimele i factorii necesari replicrii ADN.
Probabil ataat de membrana nuclear, iar
ADN ar strbate replizomul.
este responsibil pentru sinteza a dou catene
noi de ADN.

Schema etapelor de iniiere i elongare

5
3

5
3

3
5

Primase

LagingStrand
Okazaki
fragment

5
RNA
Primers

Singlestrand
binding
proteins

DNA
Polymerase

5
3
Helicase

5
3

LeadingStrand

3. ETAPA DE TERMINARE

Terminarea replicrii
Regiunea de terminare :
- situat la 180 grade fa de ori;
conine capcane petur bifurcaia
de replicare
- la acest nivel bifurcaiile de
replicare se ntlnesc i dezleag
catenele de ADN nc asociate.
Situsurile de terminare
- sunt pori care permit trecerea
bifurcaiei de replicare ntr-un
singur sens;
- conin 23 perechi de baze

TerD
TerA

oriC

TerC
TerB

Terminarea Replicarii
Un set de situsuri Ter opresc bifurcaia de replicare
care progreseaz n sensul acelor de ceasornic, al 2-lea
set blocheaz bifurcaia de replicare care avanseaz n
Invers acelor de ceasornic:
Situsurile Ter
foreaz cele dou
bifurcaii de
replicare s se
ntlneasc ntr-un
punct specific.

Cromozom

TerB

TerA

ELEMENTELE CHEIE ALE TERMINRII REPLICRII:

SITUSURILE TER I PROTEINA TUS
Situsurile Ter sites sunt locurile de legare ale proteinei Tus.
Tus: 35.8 kD
activitate de legare la Ter
Monomer
Bifurcaia de replicare
Tus
oprit ntr-o
DNA
manier polar
Ter
Tus poate inhiba progresiunea bifurcaiei de replicare
direct prin legarea de DnaB helicaz,
inhibnd dezrsucirea
helixului.

Repetiia este mama

nvturii

Replicarea
3
3

5
3
5

Helicaza se leag la originea de replicare i

dezrsucete dublu helixul ADN.
SSB previn renaturarea ADN.
Primaza sintetizeaz ARN primer.

Replicarea
Direcia de avansare a
bifurcaiei de replicare

3
3

5
3
5

3
5

DNA pol adaug nucleotide la ARN primer.

Replicarea
Direcia de avansare a
bifurcaiei de replicare

3
5

5
3
5

3
5

DNA pol verific bazele mperecheate i le nlocuiete

pe cele greit mperecheate.

Replicarea
Direcia de avansare a
bifurcaiei de replicare

3
3

5
3
5

3
5

Sinteza catenei leading continu n direcia 5 to 3.

Replicarea
Direcia de avansare a
bifurcaiei de replicare

3
3

5
Fragment Okazaki

3
5

3 5

3
5

Sinteza discontinu produce segmente ADN numite

fragmente Okazaki.

Replicarea
Direcia de avansare a
bifurcaiei de replicare

3
3

5
Okazaki fragment

3
5

Alungirea fragmentului Okazaki.

3 5

3
5

Replicarea
3
5

3
5
3
5

3 5

35

3
5

Alungirea catenei leading i sinteza de noi fragmente

pe Okazaki msur de bifurcaia mai avanseaz.

Replicarea
3
5

3
5
3
5

35

35

3
5

Alungirea noului fragment Okazaki, n paralel cu

alungirea catenei leading .

Replicarea
3
5

3
5
3
5

35

35

3
5

Activitatea exonucleazic a ADN pol I

ndeprteaz ARN primer.

Replicarea
3
3
5
3
5

35

3
5

Activitatea polimerazic a ADN pol I umple golurile.

Ligaza formeaz legturi fosfatdiesterice ntre
gruparea 3 OH de la captul unui fragment Okazaki cu
gruparea 5 fosfat de la captul altui fragment Okazaki.
.

REPLICAREA ADN

2
Topoisomerase
nicks DNA to
relieve tension
from unwinding

3 Pol III synthesises leading strand

1 Helicase opens helix
4 Primase synthesises RNA primer
5

Pol I excises RNA primer; fills gap

7

Pol III elongates primer;

produces Okazaki fragment

DNA ligase links Okazaki

fragments to form
continuous strand

ntrebare:
Fragmentele Okazaky sunt:
Produsul aciunii helicazei
Lanuri ADN sintetizate n cadrul catenei leading
n cursul replicrii
Regiuni ale ADN care nu codific informaie
pentru sinteza de ADN.
Fragmente relativ scurte de
polidezoxiribonucleotide cu cteva ribonucleotide
la captul 5.

Replicarea simultan prin

formarea de bucle ale matriei
catenei lagging.

Replicarea simultan: molecula ADN pol III este

responsabil de sinteza ambelor catene de ADN.

Caracteristici ale replicrii la

eucariote
Multiple origini de replicare
Replicarea este bidirectional
Are mai multe origini de replicare
deoarece molecula de ADN este foarte
lung i viteza de aciune a replizomului
este mic
Histonele vechi se asociaz cu duplexul
nou care conine catena leading.

Multiple regiuni ori la eucariote

Bubbles

Bubbles

Tabel comparativ:
Procariote

Eucariote

1 ori region

Multiple ori regions

2 bifurcaii de replicare per

cromozom

100 bifurcaii de replicare per

cromozom

Viteza replicrii
1.000 perechi baze/sec

Viteza replicrii
100 perechi baze/sec

Lungime frag. Okazaki

1000-2000 nucleotide

Lungime fragmente Okazaki

150-200 nucleotide

1 eoare la 1mil-10mil

1 eroare la 1000 mil

replication.s wf