Tehnici de separare si caracterizare

a proteinelor
Studiul proteinelor -obiective:
prepararea extractului
1. Purificarea proteinei

precipitarea
dializa
ultrafiltrarea
centrifugarea
separarea cromatografica
verificarea puritatii

Studiul proteinelor -obiective:

M
2. Caracteizarea
proteinei

compozitia/ str. primara

str. secundara/tertiara
str. cuaternara
stabilirea mecanismului
de actiune

1. Purificarea proteinei
1.1. Prepararea
extractului
ultrasonicare
Ruperea
membranelor
celulare

utilizarea presei franceze

cicli inghetare-dezghetare
distrugerea enzimatica
a membranei celulare

1. Purificarea proteinei
1.1. Prepararea extractului
ultrasonicare

presa franceza

1. Purificarea proteinei
1.1. Prepararea extractului
cicli inghetare-dezghetare

distrugerea membranei celulare

- Utilizarea lizozimei
- Utilizarea detergentilor

joy-of-bioprocess.blogspot.com

www.plospathogens.org

1. Purificarea proteinei
1.2. Precipitarea proteinelor
A. Precipitarea la pH = pI
Papaina (papaia) pI = 8,85
Ureaza (fasole) pI = 5 - 5,1

B. Precipitarea cu (NH4)2SO4

precipitat

Precipitarea fractiunilor care contin HSA

a) Inainte de adaugarea sarii;
b) Suspensie de precipitat proteic in solutie 85% de sulfat de amoniu;
c) Precipitat proteic rezultat in urma centrifugarii (60 min la 5000 rpm).

1. Purificarea proteinei
1.2. Precipitarea proteinelor
C. Precipitarea cu PEG
D. Precipitarea cu solventi organici
Acetona

EtOH
Amestec
supus
dializei

1.3. Dializa

difuzie

Proteina

Sac de
dializa

Molecule mici
Solutie
tampon

1. Purificarea proteinei
1.4. Ultrafiltrarea
Membrane semipermeabile
- Acetat de celuloza
- Nylon
- polivinilidena

N2 (presiune)

Mai rapida decat dializa

Solutia de proteina
supusa concentrarii
Sticla
sinterizata

Magnet
pentru
agitare
Membrana
Ultrafiltrat
Agitator magnetic

1. Purificarea proteinei
1.5. Centrifugarea
r

Precede operatii
sonicare
precipitare
Separarea
M
forma
densitate
natura solventului

Viteze mici < 6000 rpm

Particule mai mari

nucleu

celule
rosii

1. Purificarea proteinei
1.5. Ultracentrifugarea
Viteze mari > 20000 rpm

Organite celulare

mitocondrii

reticulul
endoplasmatic

1 Svedberg = 1S = 1 x 10-13 s
Hemoglobina 4,5 S
Mioglobina 1,8 S

1. Purificarea proteinei
1.6. Separarea cromatografica
1.6.1. Cromatografie de permeabilitate in geluri
Amestec
supus
separarii

Coloana
cromatografica
A

Gel

1.6. Separarea cromatografica

1.6.1. Cromatografie de permeabilitate in geluri

Intervalul de
separare
(M, KDa)

Sephadex G-10
Sephadex G-25
Bio-Gel P-60
Sephadex G-75
Sephadex G-100
Bio-Gel P-100
Sephadex G-200
Sephacryl S-300
Sepharose 2B

< 0.7
1-5
3-60
3-70
4-100
5-100
30-200
10-1.500
70-40.000

1000

MW/kDa

Tipul gelulului

100

10
0

20

40

60

80

Volume/ml

100

120

1. Purificarea proteinei
1.6. Separarea cromatografica
1.6.2. Cromatografie de schimb ionic

Proteina

Ioni din
tampon

Schimbator
anionic

1. Purificarea proteinei
1.6. Separarea cromatografica
1.6.2. Cromatografie de schimb ionic
Grupe functionale ale schimbatorilor de ioni
Schimbatori anionici

Gruparea functionala

Dietil-amino-etil (DEAE)
Cuaternara aminoetil
(QAE)
Cuaternara amoniu (Q)
Schimbatori cationici

-O-CH2-CH2-N+( CH2CH3)2
-O-CH2-CH2-N+( C2H5)2- CH2-CH2OH-CH3

Carboximetil (CM)
Sulfopropil (SP)
Sulfonat de metil

-O-CH2-COO-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2- CH2- CH2-SO3-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2- CHOH- CH2-SO3-

-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3
Gruparea functionala

Taria
schimbatorului
slaba
puternica
puternica
Taria
schimbatorului
slaba
puternica
puternica

1. Purificarea proteinei
1.6. Separarea cromatografica
1.6.2. Cromatografie de schimb ionic
Stabilitatea
pH 4-5
(261,5 nm, 1%) = 26,4

M: 14,3 KDa

129 de AA

Caractersticile
lizozimei
(albusul de ou)

pH optim
9,2

Inhibitori

SDS
pI = 11.0

alcooli
imidazol

acizi
grasi

1. Purificarea proteinei
1.6. Separarea cromatografica
1.6.3. Cromatografie prin interactii hidrofobe

www.pall.com

1. Purificarea proteinei
1.6. Separarea cromatografica
1.6.4. Cromatografie de afinitate
ADN cu secventa suplimentara

Indepatare
secventa
suplimentara

Insertie in
bacterii (E coli)
Spalare
Elutie
Distrugerea membranelor
Matrice de afinitate

proteina cu
secventa
adiacenta

legare

alte
proteine
= ligand

1. Purificarea proteinei
1.6. Separarea cromatografica
1.6.4. Cromatografie de afinitate
Secvente adiacente - cromatografia de afinitate
Denumirea
secventei
adiacente

Lungimea
secventei
adiacente

Caracteristici

His-tag

scurta

Leaga cationii imobilizati (Co2+, Ni2+, Cu2+)

Elutia se face cu imidazol 250 mM

Flag-tag

scurta

S-tag

medie

GST-tag

mare

Secventa adiacenta DYKDDD-DK complexeaza

Ca2+ permitand imobilizarea anticorpilor M1, M2 si
M5; ultimii 5 aminoacizi pot fi clivati de
enterokinaza
Secventa KETAAKFERQHMDS se leaga de
fragmentul S din ARNaza A
Elutia se face cu citrat 0,2 M
GST= glutation S-transferaza (26 KDa) se leaga
specific de o matrice pe care este imobilizat
glutationul; proteinele fuzionate cu GST sunt in
general stabile si solubile

1. Purificarea proteinei
1.6. Verificarea puritatii - electroforeza

1000

66 kDa

M W/kDa

97 kDa
100

45 kDa

30 kDa

10
0

20 kDa
14 kDa

10

20
distance/mm

30

1. Purificarea proteinelor
1.6. Verificarea puritatii SDS electroforeza
Avantajele SDS electroforezei
SDS (detergent) solubilizeaza aproape
toate proteinele;
Micelele de SDS-proteina, fiind puternic incarcate
negativ, poseda o mobilitate electroforetica;
Lanturile polipeptidice sunt despachetate
separarea = f(dimensiune a porilor, M);
Proteinele separate prin SDS-electroforeza leaga bine colorantul.

Dezavantaje
Izoproteinele nu apar sub forma unor
benzi diferite;

www.pnas.org

1. Purificarea enzimei
1.6. Verificarea puritatii - electroforeza
Sisteme de electroforeza folosite
Tris-glycine SDS PAGE (Laemmli)
7.5% 40-400 kDa
12.5% 20-100 kDa
20% 3-25 kDa
Tris-Tricine SDS PAGE (Schaegger)
16.5% 2-25 kDa

1. Purificarea proteinei
1.6. Verificarea puritatii - electroforeza
Sisteme de electroforeza folosite

1. Purificarea proteinei
1.6. Verificarea puritatii SDS - electroforeza
Mecanism de polimerizare

1. Purificarea proteinei
1.6. Verificarea puritatii SDS - electroforeza
Mecanism de polimerizare

Acrilamida
(%)

Intervalul
de separare
(KDa)

15

15-45

12,5

15-60

10

18-75

7,5

30-120

60-210

1. Purificarea proteinei
1.6. Verificarea puritatii SDS - electroforeza
Reducerea puntilor disulfidice

1. Purificarea proteinei
1.6. Verificarea puritatii HPLC

dionex.com

elte.prompt.hu

1. Purificarea proteinei
1.6. Verificarea puritatii spectrometria de masa (MALDI-TOF)

www.atdbio.com

http://www.kcl.ac.uk/

1. Purificarea proteinei
1.6. Verificarea puritatii spectrometria de masa (ESI-MS)

1. Purificarea proteinei
1.6. Verificarea puritatii spectrometria de masa (ESI-MS)

1. Purificarea enzimei
1.6. Verificarea puritatii spectrometria de masa (ESI-MS)

Aplicatiile MS
Caracterizarea proteinelor
recombinate
Modificarile postranslationale
ale proteinelor
Identificarea proteinelor
(2D gel)
Expert Protein Analysis System
ExPASy

Determinarea masei moleculare

Proba din ficatul uman
1- si -globine ( 12 KDa); 2- -actine ( 12 KDa)
3- acetil colin esteraza; 4- spectrine cu lant -actine

Structura primara
Structura primara este descrisa de secventa
aminoacizilor care formeaza lantul polipeptidic

Secventa aminoacizilor in insulina (porc). Fiecare molecula contine 2 lanturi polipeptidice

Structura primara a insulinei din porc

(hormon) a fost decoperita de Frederick
Sanger (premiul Nobel in 1958).

Cunoasterea structurii
primare

Mw
Localizare AA
Identificarea de parti
functionale
Stabilirea relatii
de evolutie

Determinarea structurii primare

Proteine
-clivarea
alternativa;
-separarea si
secventierea
Set de
secvente
individuale

Etapa 1
Reactii
de
clivare

Amestec
de
fragmente

Etapa 2
Separarea
fragmentelor

Fragmente
purificate

Etapa 3
secventarea

Alinierea
secventelor
individuale

Alinierea
secventelor
individuale
Secventa
completa

Secvente
individuale

Determinarea structurii primare

Pehr Edman
1972-secventa
fibrinogenului

Structura secundara
Structura secundara descrie modalitatile de impachetare
ale lantului polipeptidic

Structura -Helix
L. Pauling in 1951
(Premiu Nobel)
3,6 aa / rotatie

Linus Pauling
singurul detinator a 2 premii Nobel
(1954-Chimie, 1962-Pace)
prieten cu Albert Einstein.
s-a dedicat chimiei cu scopul
de a ajuta umanitatea
Profesorul a fost considerat
campionul vitaminei C.
A fost angajat al Institututului de
Stiinta si Medicina in Palo Alto,
California.

Structura -Helix

Reprezentarea schematica
a helixului prin 3 modele:
A) Modelul cu bile si bete;
B) Modelul panglica;
C) Modelul cilindric

Moment de dipol
in
helix

Diagrama Ramachandran pentru helixuri

Structura -pliata
1951 Pauling si Corey

Structura -pliata antiparalela

Structura -pliata paralela

Structura -pliata mixta

Structura -pliata

Structura -pliata paralela

Structura -pliata antiparalela

Structura -pliata

Structura -pliata rasucita

A) Modelul cu bile si bete;
B) Modelul cu sageti;
C) Modelul cu sageti rotit cu 90

Keratina
Proteina stabila (punti disulfidice)

localizare

par
coarne
unghii

Difractie cu raze X
2 lanturi polipeptidice

pene

Structura superhelix (eratina din par)

Colagenul
Proteina frecventa la vertebrate

localizare

oase
dinti
tendoane
matrici fibroase
(piele)
15-30% proline

continut
3 lanturi -helix
Poli-L-prolina

Colagenul (2)

Stanga - Fibre de colagen din

tendoanele aflate in gatul
unei pasari
Dreapta-fibre de colagen din
coada unui soarece

Structuri supersecundare
Motivul

Michael Rossmann
Structura butoi TIM

Structuri supersecundare

Structura butoi TIM (rotatie 90 de grade)

Structuri supersecundare
a1,2

a2,3

a3,4 C

N
b1

b2

b3

Structura butoi

b4

b4

b3

a1,2

a3,4

N
b1

Structura deschisa

b2

Motivul cheii grecesti

C
b1

b4

b3

b2

b3

b1

b2

C
b4

Motivul

Structura proteinei umane

care leaga retinolul

Motivul ruladei

Motivul

Determinarea structurii tertiare

Functia
proteinelor
Structura
primara

Structura
tertiara
Specificitatea
enzimelor

Difractie
raze X

Structura
3D
RMN

Difractia cu raze X

Difractia cu raze X

1.
2.
3.
4.

Determinarea structurii proteinelor prin difractie cu raze X:

Cristalizarea proteinei
Imprestierea radiatiei X de catre planurile cristalului
Din diagrama de difractie este modelata harta densitatii electronice
Contruirea unui model de proteina pe baza densitatii electronice

Cristalografie cu raze X

Harta tridimensionala
de densitate electronica

Harta densitatii electronice a complexului

Proteina talomera-ADN

Harta de densitate electronica a moleculelor

Forma
generala

unghi de refractie mic

Rezolutie modesta (5-6 )

Spoturi cu unghi
de refractie mai mare

Rezolutie medie (3,5 )

Traseu lant
polipetidic

Spoturi cu unghi
de refractie mai mare

Rezolutie medie (3 )

Catena
laterala

Spoturi cu unghi
de refractie mai mare

Rezolutie buna (2,5 )

Spoturi cu unghi
de refractie mai mare
cristal omogen

Determinarea
pozitiei atomilor
0,4

Rezolutie mare (1,9 )

Pozitia atomilor
0,2

Harta de densitate electronica a moleculelor

Harta densitatii electronice
Structura tridimensionala
Structura primara

Legaturi
amidice

Resturi din
catena laterala

Structura quasistatica

rotatii

vibratii

Determinarea structurii in solutie

Stingerea fluorescentei
Schimb izotopic (H-D)
RMN
Dicroism circular

in solutie

Structuri
flexibile

Modele teoretice
Structura 3D
a proteinelor

Mecanisme de reactie
Similaritati structurale

Motivul Rossman

lactate dehidrogenaza

Caseta de legare
a nucleotidelor

alcool dehidrogenaza

Motiv
Rossman

Structura cuaternara

Interactiuni dintre monomeri

Aldolaza KDPG
trimer

Neuramidaza
tetramer

Structura cuaternara

Insulina hexamer

Kinaza-octamer

Nivele de organizare a proteinelor

Primara

Secundara

Super-secundara

Tertiara

Cuaternara