Sunteți pe pagina 1din 46

TEHNICI MODERNE N

BIOLOGIA CELULAR

STUDIUL PROCESELOR
CELULARE
2 aspecte:
Tehnici si metode adecvate de
urmrire a fenomenelor celulare
Modelarea experimental a
fenomenelor celulare

MODALITI DE STUDIU
1.

in vivo

2.

in situ

3.

in vitro

MODALITI DE STUDIU
in vivo - cand celulele sau organele ale carui
celule dorim sa le studiem sunt abordate in
organismul intact.
Avantaje: rezultatele obinute sunt edificatoare
pentru procesul studiat la nivel de organism
Dezavantaje: rezultatele experimentelor sunt
dificil de interpretat datorit influenelor
celorlalte componente ale organismului
4

MODALITI DE STUDIU
in situ cand organul de interes este
mentinut la locul sau in organism dar
sunt controlate unele influente cum
sunt cele nervoase sau endocrine
Avantaje: se pot studia variaiile
procesului n condiii controlate
Dezavantaje: nu se poate identifica
rezultatul cu cel n vivo
5

MODALITI DE STUDIU
in vitro cand organul , esutul sau
celulele sunt izolate din organism
Avantaje: se permite un control
riguros al experimentului.
Dezavantaje: nu se poate garanta
obinerea acelorai rezultate in vivo.
6

Tehnici in vitro
Baia de organ
Cultura de celule

Baia de organ
- permite meninerea viabilitii unor fragmente
de organ sau esuturi.
-variate n funcie de organul supus
experimentului
- asigur o temperatura constant , oxigenarea
materialului biologic , posibilitatea control rii
compoziiei mediului din baie i culegerea de
date funcionale i eantioane
8

Culturi de celule - Etape


Digestia enzimatica a tesutului cu obtinerea
unei suspensii de celule
Izolarea unei populaii celulare pure
Insmnarea n flacoane de cultur sau plci
Petri obinndu-se astfel o cultur primar
Pasarea - resuspendarea celulelor din cultura
primara urmat de de rensmnarea n
flacoane de cultur sau plci Petri obinnduse culturi secundare

Culturi celulare - Evoluie


1.

2.
3.

4.

Faza de lag sau de inducie - celulele i


refac suprafaa i se acomodeaz cu mediul
de cultur
Faza exponenial - celulele se divid rapid,
exponenial
Faza staionar - numrul de celule rmne
constant. In aceast faz se efectueaz
pasarea
Faza de declin - scderea nr. de celule
datorit mbtrnirii i morii .
10

Medii de cultur Componente


1.
Amimoacizi i vitamine
2.
3.
4.
5.
6.

Sruri necesare meninerii echilibrului


ionic i pH mediului de cultur
Glucoza pentru necesarul energetic
Ser fetal
Antibiotice
Rosu fenol ca indicator de pH

11

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.

Morfologia si morfometria
Citometria in flux
Fractionarea celulara
Citochimia si citoenzimologia
Imunocitochimia
Fluorescenta si imunofluorescenta
Microfiziologia si microinjectia
Radioautografia
Metode biochimice
Tehnici si metode de biologie moleculara
12

MORFOMETRIA
-

utilizeaz un analizor de imagine.


se stabilete criteriul dupa care se va
efectua analiza, precum i limitele maxim
i minim ale acestuia
Rezultat: diferite populaii celulare.

Rezultatul analizei cantitative este afisat sub


forma unei histograme.
13

Citometria n flux
- permite analiza i separarea celulelor pe
baza unor caractere morfologice i
biochimice
Ofer informaii asupra :
1. mrimii relative a celulelor
2. granularitii interne (neomogenitatea
intern citoplasmatic) relativ
3. intensitatea relativ a fluorescenei.
14

Citometria n flux - utilitate


msurarea caracteristicilor fizice ale
celulei
2. identificarea si separarea populaiilor
de celule sanguine ( granulocite,
monocite , limfocite T sau B)
3. msurarea cantitii de ADN din celul
4. msurarea cantitii intracelulare de
Ca
5. masurarea pH-ului intracelular
1.

15

Citometria in flux

16

Fracionarea celular
- tehnic ce permite izolarea

diferitelor elemente ultrastructurale


si biochimice ale celulelor

17

Fracionarea celular Etape

Omogenizarea distrugerea integritii


tisulare i apoi celulare cu obinerea
unei suspensii de organite i
membrane veziculate n mediul de
omogenizare

Separarea prin centrifugare i/ sau


ultracentrifugare
18

OMOGENIZAREA
a. prin soc osmotic. Diferena de osmolaritate
ntre mediul i.c. si cel e.c. duce la umflarea
celulelor pana la ruperea membranelor.
b. prin ultrasonicare presupune ruperea
membranelor sub aciunea undelor ultrasonice
c. cu omogenizatoare se realizeaza sub
aciunea forelor de frecare i torsiune care
contribuie la ruperea membranelor.
19

SEPARAREA
diferenial cand organitele se
depun la baza tubului , n ordinea
densitii lor prin centrifugari repetate
la fore din ce n ce mai mari

n gradient de densitate printr-o


singur centrifugare la fore suficient
de ridicate se obin organitele ca fracii
separate .

20

S e p a ra re a c o n s titu e n ti lo r
c e lu la ri p ri n v it e z e d e c e n trif u g a re c re s c a n d e

P u ri fi c a re in
g ra d ie n t
d e d e n s ita t e

M ito c o n d rii
L iz o z o m i

N U C LE I

M e m b ra n e
c e lu la re
G o lg i
m ic ro s o m i

U lt ra s o n ic a re
R ib o s o m i

re t ic u l e n d o p la s m ic

21

AUTORADIOGRAFIA
-tehnica de investigare celular ce permite

identificarea morfologic i ultrastructural a


unor compui radioactivi.

trasori radioactivi :
- aminoacizi, glucide, nucleotide Marcarea unor
componente
- fosfat sau sulfat radioactiv
celulare

liganzi radioactivi specifici

receptori sau
anticorpi radioactivi
22

METODE BIOCHIMICE
ELECTROFOREZA
IMUNOELECTROFOREZA
TRANSFERUL ELECTROFORETIC

23

ELECTROFOREZA
PRINCIPIU: particulele ncrcate
electric migreaz ntr-un mediu
vscos , sub aciunea unui cmp
electric.
Aplicaii practice: studiul proteinelor i a
acizilor nucleici.
24

ELECTROFOREZA
PROTEINELOR
unidimensional , cand migrarea se
realizeaz n gel ntr-o singur direcie
b. bidimensional , cnd migrarea se
realizeaz succesiv n dou direcii
a.

Aplicaii practice electroforeza unidimensional

SDS PAGE
FOCALIZAREA IZOELECTRICA
25

ELECTROFOREZA SDSPAGE

-realizeaz separarea proteinelor dintr-un

amestec pe baza gabaritului molecular


direct proporional cu masa molecular.
Principiu: adsorbia dodecilsulfatului de
sodiu unitar pe proteine, realiznd o
densitate de sarcin negativ uniform.
26

ELECTROFOREZA SDSPAGE

27

Focalizarea izoelectrica
-

separarea proteinelor dintr-un amestec


se face pe baza punctului lor izoelectric.

Principiu: migrarea proteinelor n funcie


de punctul izoelectric, pn n zona cu
pH-ul identic cu cel al punctului lor
izoelectric, unde devin neutre oprindu-i
miscarea.
28

Focalizarea izoelectrica

B e n z i p ro te ic e la p u n c tu l iz o e le c tric

29

Electroforeza
bidimensionala

-migrarea proteinelor n dou direcii :


1. in prima direcie n funcie de punctul lor
izoelectric - FOCALIZARE IZOELECTRICA
2. a doua direcie - SDS PAGE , n funcie
de greutatea molecular a proteinelor.
Rezultatul se prezinta sub forma unei hri cu
proteinele separate n planul gelului.
30

Electroforeza
bidimensionala

E le c tro fo re z a la p u n c t iz o e le c tric

SD S-

31

IMUNOELECTROFOREZA
- o variant a electroforezei ce combin
migrarea n cmp electric a proteinelor cu
realizarea unei reactii imune de tip Ag-Ac
Reactia imuna:
-dupa terminarea migrarii electroforetice,
-concomitent (imunoelectroforeza n rachet) apreciere cantitativ a Ag (= suprafaa descris
de linia de precipitare cu linia de start ).
32

IMUNOELECTROFOREZA

33

TRANSFERUL
ELECTROFORETIC
-metod de extragere a proteinelor

separate electroforetic dintr-un gel , cu


adsorbirea lor pe niste hrtii cu proprieti
speciale.

Proteinele sufer reacii de recunoatere


specific prin intermediul unor interaciuni
de tip receptor ligand sau Ag Ac.
34

Bloturile
-

Metod de transfer a unor proteine,


secvente ADN sau ARN, dintr-un gel
electroforetic pe un suport care permite
vizualizarea lor ulterioar
Utilizate pentru identificarea prezenei
unor proteine/ secvene ADN ntr-un
lizat celular
35

Southern Blot
-

Utilizat pentru identificarea unei anumite


secvene ADN, prin folosirea unei probe
ce conine secvena complementar
celei cutate.
Proba de hibridizare este marcat
fluorescent sau radiografic, permind
depistarea ulterioar a preparatelor care
conin secvena cutat
36

Northen Blot
-

Detectarea anumitor secvente de ARN


Similar ca procedur Southern Blot
ului
Furnizeaz informaii legate de
exprimarea anumitor gene n anumite
populaii celulare

37

Western Blot
identificarea unei anumite
proteine ntr-un omogenizat
tisular
-Proteinele din preparat sunt
separate prin electroforez n
gel, apoi transferate pe o
membran suport unde, prin
adugarea Ac specific, se va
identifica prezena/absena
proteinei sau cantitatea ei n
proba dat.
-

38

Western Blot
Utilizri:
Cea mai folosit metod pentru
determinare cantitativ de proteine
Ofer informaii legate de modificarea
cantitativ a unei proteine n funcie de
tipul celular sau tratamentele aplicate
unei populaii celulare
39

PCR (POLYMERASE CHAIN


REACTION)
- Folosit pentru obinerea unui numr mare
de copii a unei anumite secvene de ADN
Etape
1. denaturarea ADN cu separarea catenelor
complementare
2. adaugarea primerilor (secvene ADN
complementare secvenei-int)
3. sub aciunea Taq-polimerazei se
sintetizeaz noi secvene de ADN dc
40

41

RT PCR (REVERSE
TRANSCRIPTASE PCR)
-

Metod foarte sensibil de detectare i


cuantificare a ARNm
Iniial din ARN-ul int se sintetizeaz
secvena cADN, apoi urmeaz etapele PCR
Utilizat n diagnosticul unor boli genetice,
cuantificarea expresiei diverselor gene prin
determinarea cantitii de ARNm

42

Animale transgenice
-

Animale de laborator crora li se inser


gene mutante pentru a studia efectul lor
asupra organismului gazd.
Mediu de studiu pentru evoluia unor boli cu
determinism genic i a opiunilor
terapeutice

43

Animale de laborator transgenice

44

Animale knockout
-

nlocuirea genei de interes cu o gen


inactiv sau o alel mutat
Animalul purttor nu va exprima
aceast gen, putndu-se studia efectul
absenei ei in organism.

45

leptin knockout mouse

46