DETERMINRI PRELIMINARE N ANALIZA BIOCHIMIC

Determinarea umiditii
Apa intr n constituia tuturor celulelor i esuturilor, i ca solvent
constituie mediul necesar n care se desfoar reaciile biochimice, permind
stabilirea unor legturi ntre diferite substane, precum i ntre organism i mediu.
n organismele vegetale, apa se gsete repartizat att extracelular ct i
intracelular. Apa din compartimentul extracelular cuprinde apa de circulaie
intravascular (vase lemnoase, liberiene).
n compartimentul intracelular, apa se gsete sub trei forme:
- apa legat = apa care intr n constituia compuilor organici;
- apa absorbit = apa care asigur starea coloidal a materiei vii
protoplasmatice;
- apa liber = apa de mbibaie care pstreaz proprietile obinuite
ale apei n stare pur, pe cnd apa legat are proprieti diferite (nu
nghea nici la - 60o C).
Cantitatea de ap din organism variaz cu vrsta, starea fiziologic,
regiunea geografic, intensitatea metabolismului. Astfel, esuturile tinere conin o
cantitate mai mare de ap dect cele btrne, cantitatea de ap scznd n general
cu vrsta, odat cu creterea coninutului de substane organice n celule;
esuturile fiziologic active conin o cantitate mai mare de ap dect esuturile de
susinere sau cele de protecie.
Determinarea coninutului de ap (umiditii) se ncadreaz n analiza
preliminar, deoarece cantitatea de reziduu uscat sau fix, rezultat prin
ndeprtarea la 100oC a componentelor volatile, reprezint o valoare de referin
pentru alte date analitice cantitative.
n materialul vegetal care nu conine compui organici volatili (uleiuri,
acizi, alcaloizi), apa reprezint compusul volatil la 100 oC, n aceste cazuri
determinarea reziduului uscat este identic cu determinarea umiditii.
Metodele de determinare a coninutului de ap din produsele vegetale sunt
variate, proba trebuind n prealabil mrunit sau pulverizat, i se mpart n dou
categorii:
-metode indirecte, bazate pe msurarea substanei uscate, rmase dup
ndeprtarea printr-un procedeu fizic a apei din produsul vegetal;
-metode directe, bazate pe determinarea direct a coninutului de ap din
produsul vegetal.
n cadrul acestor categorii, determinarea umiditii poate fi efectuat prin
metode fizice, chimice sau instrumentale de analiz.
Metode indirecte

Metoda gravimetric
Determinarea umiditii prin metoda gravimetric const n uscarea probei
de analizat la 105oC, pn la mas constant, cntririle efectundu-se la o
balan analitic. Diferena de mas obinut pe prob, nainte i dup uscare,
reprezint umiditatea care se exprim n procente de mas. n umiditatea
determinat se includ i alte substane volatile care se ndeprteaz concomitent
cu apa, din acest motiv pentru determinarea exact a coninutului de ap este
necesar s se determine n prealabil uleiurile volatile, al crui coninut se va
scdea din diferena de mas obinut prin uscare.
Modul de lucru
ntr-o fiol de cntrire adus la greutate constant prin nclzire n etuv (la
aceeai temperatur la care urmeaz a se face i uscarea), rcit n exicator, se
introduc 5 - 10 grame din proba de analizat. Diametrul fiolei se alege astfel nct
cantitatea de material vegetal luat n analiz s nu formeze un strat mai gros de 5
mm. Fiola cu prob se introduce n etuv i se menine la 105 oC, 2 ore, se rcete
n exicator , se nchide i se cntrete. Se continu uscarea la etuv pn n
momentul n care fiola cu prob va avea greutate constant.
Umiditatea se calculeaz cu urmtoarea relaie:
U(%)=

m1 - m 2
m1 - m 0

100

n care :

- mo reprezint masa fiolei

- m1 reprezint masa fiolei cu proba de analizat
nainte de uscare
- m2 reprezint masa fiolei cu proba de analizat dup uscare
n cazuri speciale, indicate pentru produse vegetale ale cror principii
active se altereaz la temperatura de 100oC, uscarea se realizeaz la temperaturi
mai sczute, n etuve de vid sau n exicatoare, n prezena unor substane
deshidratante ca: H2SO4 sau CaCl2 anhidr.
Metode directe
Metoda antrenrii cu vapori de solveni organici
Separarea apei coninut n proba de analizat se realizeaz prin distilare,
folosindu-se solveni organici nemiscibili cu apa, dar cu care formeaz un
azeotrop ,astfel nct temperatura de fierbere s fie n general mai mic dect a
solventului sau apei. n urma condensrii distilatul se separ n dou straturi
distincte: apa i solventul utilizat. Prin msurarea direct a volumului de ap
rezultat n urma distilrii azeotrope, se determin coninutul de umiditate al
probei. Metoda se aplic produselor vegetale cu coninut ridicat de umiditate i
prezint avantajul c substanele volatile neapoase, care n cazul metodelor
indirecte erau eliminate odat cu apa, de aceast dat trec n solventul organic,
asigurndu-se astfel o mai mare reproductibilitate a determinrilor.
Mod de lucru
Se cntrete exact o cantitate de produs vegetal i se introduce n balonul 1,
peste care se adaug 100 ml xilen sau toluen i cteva fragmente de porelan

poros; se monteaz instalaia ca n figura de mai sus, se d drumul apei de rcire

la refrigerent i se nclzete balonul (pe baie de nisip, ulei sau de ap, funcie de
solventul utilizat), astfel nct debitul condensului s fie de aproximativ 2 - 3
picturi pe secund. Distilarea se continu pn ce volumul de ap separat
rmne constant. Picturile de ap, care eventual ar adera pe pereii
refrigerentului, se antreneaz ntr-o eprubet gradat prin splare cu 5 ml solvent.
Antrenarea dureaz cel puin 2 ore, dup care se citete volumul apei colectate n
cilindrul gradat i se raporteaz la 100.
Distilarea se execut n urmtorul aparat:

1 - balon
2 - solvent
3 - eprubet gradat pentru
separarea apei
4 - refrigerent

1
2

Metode chimice. Metoda Karl - Fischer.

Metoda se bazeaz pe reacia de reducere cantitativ a iodului de ctre
anhidrida sulfuroas n prezena apei;
I2 + SO2 + 2 H2O Py 2 HI + H2SO4
Reacia se execut sub forma unei titrri care se efectueaz n mediu
neapos de piridin - metanol. n acest mediu iodul i dioxidul de sulf se gsesc
sub form asociat:
I2 + Py Py I2

SO2 + Py Py SO2
ntr-o prim etap are loc reacia de reducere a I2 i de oxidare a SO2 ;
Py I2 + Py SO2 + Py + H2O 2 PyH+I + Py SO3
apa servind n acest caz ca surs de ioni oxid.
ntr-o a doua etap intervine metanolul :
Py SO3 + CH3OH

PyHSO3 - OCH3

care are un rol deosebit de important,deoarece mpiedic desfurarea unei reacii

secundare de tipul:
Py SO3 + H2O

PyHSO3 - OH

Din aceste considerente titrarea se efectueaz ntotdeauna n prezana unui exces

de metanol.
Punctul de echivalen se poate aprecia vizual,deoarece soluia de reactiv
este de culoare brun (prin prezena I2), iar produii de reacie incolori, astfel
nct, primele picturi de reactiv n exces, produc colorarea soluiei n brun.
Pentru evitarea contactului cu umiditatea atmosferic, biuretele trebuie astupate
cu dopuri prevzute cu tuburi umplute cu CaCl2 anhidr sau silicagel.
Combinarea metodei Karl - Fischer cu metoda de separare a apei prin
distilare azeotrop prezint avantajul eliminrii compuilor oxidani sau
reductori ce ar putea interfera n reacia redox.
Metoda se aplic probelor cu coninut sczut de umiditate (produse
cerealiere utilizate ca materii prime n biotehnologii).
Mod de lucru
Apa cu solventul rezultat de la antrenare se trateaz cu metanol n exces
(circa o jumtate din volumul de solvent cu ap) i se titreaz cu reactivul Karl Fischer pn la dispariia coloraiei brune date de prezena iodului. Sfritul
titrrii se observ prin decolorarea soluiei adugndu-se n acest moment cteva
picturi de soluie de amidon 1 % I se titreaz pn la soluie incolor.
Cantitatea de ap se calculeaz pe baza volumului de reactiv folosit la titrare.

II.2. Cenua
II.2.1. Determinarea coninutului de cenu
Dintre elementele care se gsesc n organismele vii, sub form de
combinaii organice, C, H, O, N , sunt elemente volatile,deoarece prin distrugerea
oxidativ a materialului vegetal acestea se elimin sub form de CO2 , H2O, N2
,restul elementelor sunt elemente fixe rmnnd sub form de combinaii
constituind cenua brut.

Cenua brut se determin prin metoda gravimetric , prin cntrirea

reziduului rezultat n urma calcinrii materialului vegetal, la o temperatur de
aproximativ 500-600oC.
Mod de lucru
ntr-un creuzet de mrime convenabil, cntrit n prealabil, se introduce
materialul vegetal pulverizat i se cntrete exact, la balana analitic, 1-2 g
produs. Creuzetul se nclzete pe sit pna la carbonizare, apoi se calcineaz n
cuptor la 550oC pn la greutate constant. Dac reziduul dup rcire mai conine
particule de crbune se adaug cteva picturi de H2O2, HNO3 concentrat. Se
nclzete creuzetul cu prob pe sit pn la evaporarea lichidului, apoi se
calcineaz pn cnd reziduul devine alb sau colorat uniform. Creuzetul cu
reziduul se cntrete la balana analitic, coninutul de cenu brut se
calculeaza prin raportarea masei reziduului rezultat n urma calcinrii, la masa
iniial a probei:
C (%) =

m2 mc
m1 m c

100

n care: -m2 reprezint masa creuzetului cu cenu dup calcinare;

- m C reprezint masa creuzetului gol;
- m1 reprezint masa creuzetului cu prob nainte de calcinare.