Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Albine PDF
Albine PDF
CUPRINS
pag.
Lista figurilor ........................................................................................
Introducere ............................................................................................
CAPITOLUL I.
BOLILE I PARAZIII ALBINELOR .....................................
17
1.1.
18
18
28
32
36
39
41
42
51
1.2.
CAPITOLUL II
BAZELE GENETICE ALE REZISTENEI
ALBINELOR LA BOLI I PARAZII .....................................
53
2.1.
55
2.2.
57
2.3.
EVIDENIEREA COMPORTAMENTULUI
IGIENIC LA APIS MELLIFERA L. N STUPINE
2.4.
69
69
71
79
CAPITOLUL III
MARKERI MOLECULARI ASOCIAI CU REZISTENA
LA PARAZII I BOLI LA ALBINE ......................................
82
3.1.
91
92
92
94
3.2.
95
98
110
112
3.3.
118
123
CAPITOLUL IV
TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULAR UTILIZATE
N ANALIZA GENETIC LA ALBINE ..................................
4.1.
129
4.2.
134
139
142
146
4.3.
153
4.4.
156
156
162
165
171
182
Bibliografie ...........................................................................................
188
LISTA FIGURILOR
LISTA TABELELOR
INTRODUCERE
Bolile necontagioase cel mai frecvent ntlnite la albine sunt: puietul rcit (boala
apare primvara n familiile slabe care au cuiburile nerestrnse i nempachetate),
diareea albinelor (este n principal consecina consumului de hran de calitate
inferioar) i anomaliile mtcilor (apar ca rezultat al distrofiilor sistemului neuroendocrin, sau sunt de natur congenital).
Clim
Alimentaie
Sistem de cretere
Puietul rcit
Diareea albinelor
Anomaliile mtcilor
Maladii congenitale
Cele mai frecvente boli micotice ale albinelor sunt: ascosferoza (boala puietului
vros) provocat de Ascosphaera apis, aspergiloza (boala puietului pietrificat)
provocat de Aspergillus flavus i uneori de Aspergillus niger i melanoza al
crei agent patogen este Melanosella mors apis.
tricuspis)
triunghiulinoza
proscarabeus).
13
(Melo
verigatus
Melo
convenionale
ce
utilizeaz
mtci
cu
caracteristici
dezirabile
14
Microsateliii
16
CAPITOLUL I
18
Tipul hranei administrate larvei diploide femele dup vrsta de 3 zile va conduce
la obinerea unei lucrtoare, sau regine. Iniial, toate larvele sunt hrnite cu
lptior de matc (secreie bogat n proteine a glandelor mandibulare i
hipofaringiene a doicilor).
Larvele destinate a ajunge regine sunt hrnite cu cantiti mai mari de lptior de
matc pe toat perioada existenei lor. Dup vrsta de 3 zile, larvele albinelor
lucrtoare i ale trntorilor nu mai sunt hrnite cu lptior de matc, ci cu nectar
(care cu ajutorul enzimelor salivare este convertit n miere) i polen (D e n h o l m ,
C.H., 1999).
19
Cea mai mare parte a viruilor care atac albinele au drept efect scurtarea vieii
acestora. Acetia produc boli grave sau chiar fatale, se nmulesc i se rspndesc
n organismele gazd pe o perioad ndelungat, fr a cauza semne aparente ale
bolii pe
Paralizia cronic
Dei aceast boal a fost descris nc de acum un secol, cauza sa a fost
identificat abia n anul 1963. Iniial s-a considerat c parazitul Acarapis woodi ar
fi cel care provoac boala, abia ulterior demonstrndu-se c aceasta este rezultatul
aciunii unui virus virusul paraliziei cronice.
Acest virus este probabil ntotdeauna nsoit de un virus satelit - virusul asociat
al paraliziei cronice a crui aciune nu se cunoate cu exactitate, dar se pare c
este implicat n mecanismele de aprare.
21
Paralizia acut
Aceast boal este provocat de virusul paraliziei acute i afecteaz albinele
adulte, n special pe perioada de var. Iniial nu a fost asociat cu inducerea
vreunei boli sau cu provocarea morii pentru c albinele infestate preau
sntoase. Mecanismul inducerii bolii nu este nc elucidat, se tie doar c
purttor al virusului ce o provoac este parazitul Varroa destructor (jacobsoni),
ce acioneaz ca un vector de transmitere a lui la albine adulte, sau la puiet, aa
cum demonstreaz i observaiile efectuate n Europa, SUA i America central
(H u n g i col., 2000; B a l l i col., 1988, B a i l e y i col., 1979; S h i m a n u k i
i col., 1994, citai de M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997). Analize
serologice au demonstrat prezena masiv a acestui virus n Ungaria (B e k e s i ,
L. i col., 1999).
Spre deosebire de virusul paraliziei acute, toate tulpinile KBV sunt extrem de
virulente, virusul se nmulete rapid n hemolimfa albinelor adulte sau a
puietului, producnd moartea doar n trei zile.
Virusul se nmulete rapid n mai multe esuturi larvare, iar larvele par s aib o
dezvoltare normal pn dup cpcire. Apoi devin galbene, cenuii sau brune, cu
capul de culoare mai nchis dect corpul, sunt ntoarse complet cu partea ventral
n sus i cea dorsal se sprijin pe pereii inferiori ai celulei lund aspectul unor saci
cu lichid. Acest lichid care conine milioane de particule virale este situat ntre
corpul larvei i pereii celulei. Larvele mor apoi curnd, se usuc i primesc o
coloraie maro nchis. Viruii existeni n larvele moarte i pierd repede capacitatea
de a infecta noi indivizi, n special pe timpul iernii. Pericolul de infestare este mai
23
La vrsta de dou zile larvele sunt cel mai susceptibile la aciunea virusului.
Perioada de vrf a infestrii este cea de la sfritul primverii i nceputul
verii. Este interesant de observat faptul c efectele virusului puietului n sac sunt
identice cu cele produse de anestezia rapid cu CO2.
Malformaia aripilor
Este o anomalie produs de un virus, numit virusul ce produce malformaia
aripilor, care a fost iniial identificat la Apis mellifera din coloniile infestate cu
Varroa destructor (jacobsoni) n Japonia. Albinele din coloniile infestate au aripile
slab sau foarte slab dezvoltate. Virusul are o perioad ndelungat de nmulire. n
cazul infestrii oulor, la scurt timp dup eclozionare larvele mor, la puiet moartea
se produce n stadiile de dezvoltare timpurie, iar dac infecia se produce la albinele
adulte, acestea nu prezint malformaii, dar moartea se produce. Se pare c virusul
produce mortalitate i n coloniile neinfestate cu Varroa destructor (jacobsoni), iar
mecanismul su de transmitere este similar cu ce ntlnit la virusul paraliziei
acute (B a l l , 1989, citatde M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997).
Cercetri similare efectuate n Anglia de B o w e n - W a l k e r i col. (1998) i de
van O e r s i col. (2000) n Olanda confirm rolul de vector pe care l are Varroa
destructor (jacobsoni) n transmiterea virusului ce provoac malformaia aripilor
la albine (DWV deformed wing virus). Cu toate acestea, pentru a cauza boala
virusul trebuie s se gseasc peste o anumit concentraie n pupele albinelor
infestate (B r o w e n W a l k e r i col., 1998).
24
Paralizia lent
Virusul paraliziei lente este responsabil de producerea acestei boli. Indivizii
infestai mor la 12 zile de la inducerea experimental a bolii prin injectarea
virusului n hemolimf, iar cu dou zile nainte de colaps se produce paralizia
celor dou perechi de membre anterioare. Recent s-a descoperit ca acest virus
este letal n coloniile infestate cu Varroa destructor (jacobsoni), dar nu se cunosc
nc date referitoare la istoricul bolii sau la rspndirea acesteia (M o r s e , R . A .
& F l o t t u m , K ., 1997).
27
Loca american
W h i t e n 1907 (Morse, R.A. & Flottum, K. Eds., 1997) a fost primul care a
demonstrat faptul c loca american este rezultatul infestrii cu bacteria sporulat
B.larvae. Este foarte contagioas i dac nu este tratat la timp i corespunztor
poate conduce la dispariia ntregii colonii, rspndindu-se i la alte stupini.
28
Aceast boal este una dintre cele mai grave boli ale albinelor n ntreaga lume,
agentul patogen fiind Bacillus larvae.
Dei la indivizii aduli infestarea este greu de identificat, diagnosticul poate fi stabilit
prin examinarea puietului infestat. Larvele au culoare galben maronie i miros
similar cu cel al cleiului de oase. Cel mai frecvent larvele mor dup cpcire,
cpcelele fiind perforate i concave. Cadavrul larvei se deshidrateaz i ader la
peretele celulei cu care formeaz un corp comun.
Loca european
Aceast boal este considerat de majoritatea apicultorilor mai puin grav dect
loca american.
Dei a fost studiat nc de la sfritul secolului al XVIII-lea (S c h i r a c h , 1771 n Honey Bee Pests, Predators, and Diseases, 45, Morse, R.A. & Flottum, K.
Eds., 1997) detaliile referitoare la aceast boal nu sunt nc elucidate.
29
Cnd boala apare la puietul cpcit, cpcelele celulelor se adncesc i devin mai
nchise la culoare.
n 1984, P i n n o c k i
(enzyme-linked
Septicemia
La albine, septicemia este o boal bacterian a albinelor adulte descris pentru
prima dat de B u r n s i d e nc de la nceputul secolului XX (n Honey Bee
Pests, Predators, and Diseases, 51, Morse, R.A. & Flottum, K. Eds., 1997). Boala
este provocat de Bacillus apisepticus, bacterie reclasificat n anul 1959 de ctre
30
Paratifoza
Aceast boal este tot o boal a albinelor adulte favorizat de condiiile
nefavorabile de ntreinere. Agentul patogen este Bacillus parathyphi alvei.
Contaminarea se face pe cale bucal prin intermediul apei infestate. Albinele
infestate i pierd capacitatea de zbor, au abdomenul inflamat, prezint diaree
dup care intervine moartea. Boala poate fi confundat cu nosemoza i acarioza i
pentru stabilirea unui diagnostic corect trebuie utilizat examenul microscopic.
31
a descoperit n SUA o
32
Dei s-au efectuat multe studii referitoare la protozoarele care infesteaz albinele
i la bolile pe care acestea le produc, sunt nc multe necunoscute cu privire la
genetica i ciclul de via al protozoarelor (M o r s e , R . A . & F l o t t u m , K .
E d s ., 59, 1997).
Nosemoza
Boala este produs de protozoarul Nosema apis. Acesta infecteaz celulele
epiteliale ale peretelui intestinal al albinelor unde se nmulete, mpiedicnd
digestia i asimilarea hranei. Agentul patogen are dou forme, vegetativ i
sporulat. n forma vegetativ se multiplic n ventricul, care devine n ntregime
infestat n dou sptmni de la contaminare (F r i e s i col., 2003). Forma
sporulat apare dup moartea albinelor, sau cnd protozoarul este eliminat n
mediul exterior, unde rezist timp ndelungat, iar cnd ajunge din nou n
organismul albinei se transform n form vegetativ.
Amoeboza
Boala a fost identificat n 1916 de ctre Maassen care observat prezena unor
chiti amoebici n tubii Malpighi ai albinelor infestate. Aceast amoeb a fost
denumit Malpighamoeba mellificae (P r e l l , 1962b, citat de M o r s e , R.A. &
F l o r t t u m K., Eds., 1997). Acest protozoar este rspndit n toate continentele
dar are o frecven mai redus de ct Nosema apis.
Trntorii i mtcile sunt foarte rar infestate. Boala se transmite prin chitii de
Malpighamoeba mellificae din depozitele de fecale, mai ales primvara cnd
albinele cur fagurii.
35
Boala are o rspndire larg peste tot n lume i apare n lunile aprilie
mai. Primele observaii privitoare la boal au fost efectuate n 1913 de
ctre Maassen n Germania (L o t m a r , 1946, citat de M o r s e , R.A. &
F l o r t t u m K., Eds., 1997).
n primul rnd este atacat puietul de trntori, pentru c de obicei acesta se afl la
periferia fagurilor, unde umiditatea este mai mare i temperatura mai sczut,
extinzndu-se mai apoi i la restul puietului de albine.
36
Boala este provocat de specii de ciuperci aparinnd genului Aspergillus. Cel mai
frecvent boala este produs de Aspergillus flavus, dar ocazional este produs i de
A.fumigatis i A.niger. Sunt atacate larvele, nimfele i albinele adulte.
Melanoza
Este o boal ce afecteaz sistemul reproductor al mtcilor, producnd sterilitate.
Boala a mai fost denumit H melanoz (de la cuvntul german Hefe care
nseamn drojdie) pentru a fi deosebit de B melanoza care este produs de o
bacterie. Nu se cunosc detalii despre incidena natural a bolii.
38
Agentul patogen care produce H melanoza este Melanosella mors apis. Se pare c
acesta intr prin orificiul vaginal n oviducte i ovare unde produce melanoza, adic o
coloraie neagr.
gsesc n cea mai mare parte n resturile din stup. Cu mici excepii,
acetia nu au drept habitat stupul, dar se afl acolo unde organismele pe
care le atac i procur hrana. Majoritatea aparin subordinului
Mesostigmata, fiind parazii cu micri rapide i corp aplatizat. Cei mai
des ntlnii aparin familiilor Ascidae, Macrochelidae i Parasitidae.
Cea mai mare parte pot fi observai cu ochiul liber i nu aduc nici un
prejudiciu albinelor i/sau puietului.
la locul din care acestea i procur hrana (flori, stupi). Cei mai
rspndii aparin genului Neocypholaelaps. Acetia se ataeaz ntr-un
anumit stadiu al dezvoltrii lor de o insect adult proaspt aprut
pentru fi transportai ntr-un cuib nou.
Dintre categoriile de parazii mai sus menionate doar trei produc mortalitate
masiv n familiile de albine, respectiv Varroa destructor (jakobsoni), Acarapis
woodi i Tropilaelaps clareae n Asia.
Toi fac parte din categoria celor care paraziteaz albinele adulte i puietul lor.
41
(P e t t i s i col., 2003), dei trntorii datorit tuburilor traheale mai largi sunt
infestai preferenial (D a w i c k e , 1991, citat de M o r s e , R.A. & F l o r t t u m
K., Eds., 1997).
Iniial Apis cerana, albina asiatic, a fost gazda parazitului. Se pare c Varroa
destructor (jacobsoni) a nceput s infesteze Apis mellifera doar n ultima sut de
ani, odat cu ptrunderea ei n Asia, adaptndu-se la noua gazd. Doar dou
tulpini ale parazitului Varroa destructor au devenit parazii ai albinei europene
(Apis mellifera L.) peste tot unde este prezent (A n d e r s o n , D., 2000).
Este un parazit extern care poate fi observat cu ochiul liber. Femela are o lungime
de 1,1 1,2 mm i 1,5 1,6 mm lime, de culoare maro-rocat, corpul
transversal oval, aplatizat. Masculul, de culoare alb cenuie, are dimensiuni mai
reduse, cu lime i lungime de aproximativ 0,7 mm (http://MAAREC.
cas.psu.edu,2000, http://www.beekeeping.com/vita/bdiseases/varroam.htm, 2003,
http://www.main.org/cahbs/varroam. htm, 2003).
43
Cnd infestarea atinge 30 40% din efectivul stupului, familia slbete i moare
(M r g h i t a , L. Al., 2003).
Varroa destructor (jacobsoni) este un parazit care are aciune destructiv major
asupra familiilor de albine predominant n zonele temperate (W i l k i n s o n , D. i
col., 2002; F r i e s , I. i col., 2003; H a r r i s , J. W. i col., 2004).
45
Combaterea eficient a parazitului constituie una dintre cele mai mari provocri
ale apicultorilor din ntreaga lume (T e w , J. E., 2000; M o o s b e c k h o f e r , R. i
col., 2003; D o n z , G., 1998).
Una dintre cele mai mari probleme ale apicultorilor de azi const n rezistena
parazitului la tratamentul cu Apistan (pesticid piretroid avnd component activ
tau fluvalinatul), una dintre substanele cu cea mai mare utilizare n combaterea
Varroa destructor (jacobsoni), dar i la cele cu Amitraz i Cumafos (P e t t i s , J.
S., 2003).
46
cu
1994,
au
demonstrat
experimental
prezena fenomenului
Unul
dintre
ele
este
reprezentat
de
prezena
anumitor
esteraze
Reacia de baz prin care Citocromul P450 i manifest rolul catalitic, este tipic
monooxigenazelor (oxidare prin introducerea unui atom de oxigen ntr-un
substrat organic RH i reducere prin formarea apei cu participarea celuilalt
atom de oxigen):
NADH/NADH+
ROH + H2O
RH + O2 + 2H + 2e
n cazul insectelor,
51
52
CAPITOLUL II
53
Dei eliminarea riscului apariiei bolilor prin selecie nu este un obiectiv realist
pentru cresctori, prin aplicarea seleciei se ajunge la reducerea considerabil a
riscului la mbolnviri. Creterea albinelor pe principiile seleciei implic mai
multe etape:
54
56
58
Rothenbuhler
(1964)
concluzionat
exprimarea
M a r l a , 1998). Studiile
60
61
62
Sistemul imunitar al insectelor este mult mai simplu dect cel uman, al crui
mecanism nu este nc pe deplin elucidat, n ciuda progreselor tiinifice realizate
n ultimele decade (R o i t t i col., 1989, citat de D e n h o l m , C.H., 1999).
Din punct de vedere filogenetic, explicaia existenei unui sistem imunitar mai
puin evoluat la insecte n comparaie cu mamiferele, se datoreaz faptului c
acestea au o via relativ scurt, iar la majoritatea indivizilor reproducerea se
realizeaz n primul an de via, n timp ce mamiferele sunt nevoite s
supravieuiasc ntr-un mediu mai mult sau mai puin ostil pentru o perioad mult
mai ndelungat n vederea asigurrii perpeturii speciei.
63
Astfel, la Apis mellifera L. a fost pus n eviden bagajul imunitar ce const din
patru polipeptide care sunt induse de infeciile cu patogeni i care produc un
spectru larg de mecanisme de aprare antibacterian (C a s t e e l s - J o h n s o n , K.
i col., 1994).
polipeptide ce conin prolin apidecinele Ia, Ib, II, III; abaecina (fig.
8). O supraproducie de apidecine este nregistrat ca urmare a aciunii
G
G
G
G
N
N
N
N
NRPVYIP
NRPVYIP
NRPVYIP
NRPVYIP
Q
Q
Q
Q
PRPP
PRPP
PRPP
PRPP
HPR
HPR
HPR
HPR
I
L
L
I
65
66
67
Figura 10. Localizarea zonelor de prelevare a probelor i testare a strii de sntate a albinelor
68
69
CHESTIONAR APICOL
Nr.
1.
2.
3.
4.
ntrebarea
De cnd practicai apicultura ?
mai puin de 1 an
11- 15 ani
2 5 ani
16 20 ani
6 10 ani
peste 20 ani
Ce fel de sistem de apicultur practicai?
Pastoral
Staionar
Mixt
Cte intervenii sanitare efectuai pe an ?
0
2 5 intervenii
1 intervenie
peste 5 intervenii
Facei tratamente profilactice mpotriva parazitului Varroa ?
Da
Nu
70
2.3.2. Rezultate
Rezultatele chestionarului privitoare la experiena cresctorilor de albine
demonstreaz faptul c n majoritatea judeelor predomin cresctorii de albine cu
experien de 2 5 ani, respectiv 37,70% apicultori n judeul Alba, 25% n
judeul Bistria - Nsud, 42,85% n judeul Braov, 45% n judeul Cluj, 57,14%
n judeul Covasna, 39,21% n judeul Hunedoara, 67 n judeul Mure, i 44,25%
n judeul Sibiu, n timp ce 34,29% n judeul Harghita i 44,41% n judeul Slaj
au reprezentat cresctorii cu experien mai mare de 20 de ani (fig.11).
71
judeul Slaj i 71,22% n judeul Sibiu, n timp ce n judeul Cluj predomin cei
care practic sistemul mixt, respectiv 55%.
Subieci chestionai, %
AB
BN
BV
CJ
CV
HR
HA
MU
SJ
SB
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
mai mult de 1 an
2-5 ani
6-10 ani
11-15 ani
16-20 ani
peste 20 de ani
Experiena cresctorului
72
AB
BN
BV
CJ
CV
HD
HA
MU
SJ
SB
100
90
Subieci chestionai, %
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Pastoral
Mixt
Stationar
Tipul de apicultur
Cea mai mare proporie ns o ocup n toate judeele apicultorii care efectueaz
ntre 2 i 5 intervenii pe an, respcetiv 49,51% n judeul Alba, 44,23 % n judeul
Bistria-Nsud, 62,12% n judeul Braov, 54,33% n judeul Cluj, 52% n
judeul Covasna, 44,98% n judeul Harghita, 45 % n judeul Hunedoara, 58,14%
n judeul Mure, 58,14% n judeul Slaj i 62,14% n judeul Sibiu (fig.13).
Privitor la tratamentul mpotriva varoozei, acesta a fost practicat n proporie de
100% de ctre toi apicultorii din toate judeele n care a fost distribuit
chestionarul (fig.14).
73
Subieci chestionai, %
AB
BN
BV
CJ
CV
HD
HA
MU
SJ
SB
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
1 intervenie
2-5 interventii
peste 5
interventii
Nr. intervenii
Subieci chestionai, %
AB
BN
BV
CJ
CV
HD
HA
MU
SJ
SB
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Varoa
Parazitul
74
76
Tabelul 1. Valorile medii i indicii dispersiei pentru procentul de celule descpcite n cadrul
experimentului de testare a comportamentului igienic la albinele din stupinele studiate n judeele
din Transilvania
Judeul
Numrul de
celule testate
Alba
Bistria - Nsud
Braov
Cluj
Covasna
Harghita
Hunedoara
Mure
Slaj
Sibiu
TOTAL
400
400
400
400
400
400
400
400
400
400
4000
sX
V%
71,375
69,625
69,625
78,725
71,400
67,548
70,225
69,100
70,350
77,825
71,58
0,231
0,322
0,192
0,343
0,306
0,257
0,473
0,284
0,331
0,275
0,298
1,462
2,034
1,213
2,172
1,932
1,628
2,991
1,795
2,095
1,738
1,873
2,049
2,922
1,742
2,759
2,706
2,411
4,260
2,597
2,977
2,233
2,349
Frecvena rezultatelor
E = 0,35 > 0
= 0,38
% descpcire
Figura 25. Distribuia valorilor medii ale procentului de celule descpcite
78
Cea mai mic medie pentru procentul de descpcire a fost nregistrat n judeul
Harghita, 67,54%.
79
acestora
(defensinele,
apidecinele,
abaecina
80
81
CAPITOLUL III
83
Copiile multiple corespund de asemenea unui marker ideal, dac toate copiile
prezint aceeai secven, astfel nct rezultatul s fie identic indiferent de copia
secvenat. Acestea sunt uor de amplificat i produc benzi consistente, uor de
vizualizat.
genele mitocondriale i
84
poate produce o rat foarte mare a substituiilor sinonime dei iniial s-au produs
puine substitui nesinonime.
86
87
nefuncionale
replicate
de-a
lungul
Att markerii ADN ct i cei proteici au revoluionat tiinele biologice, lrgindule cu mult domeniile de studiu att n domeniul biologiei aplicate ct i a celei
pure, gsindu-i utilitatea chiar i n studiile de dinamic a populaiilor i
filogenie.
88
Alozime
Markeri proteici
Izozime
Markeri moleculari
RFLP
Minisateliii (VNTR)
Markeri ADN
Microsateliii (SSR)
AFLP
RAPD
Figura 26. Clasificarea markerilor moleculari utilizai n studiile de biologie molecular
aplicate la insecte
89
Din acest motiv sunt preferai markerii ADN, datorit polimorfismului lor ridicat
i abundenei acestora n genom. De asemenea, ei prezint avantajul c sunt
neutrii din punct de vedere fenotipic, nu prezint efecte de epistazie i sunt
codominani (W i l k e s , K. i col., 2002).
Acestea nu sunt altceva dect variante modificate ale reaciei n lan a polimerazei
- PCR. Utilizarea lor conduce la obinerea mai rapid a hrilor de linkage,
precum i a unei acuratei mai mari n determinarea numrului i localizrii n
genom a locilor de interes (QTL) studiai n acest tip de investigaii tiinifice.
91
3.1.1. Izozimele
Izoenzimele sau izozimele sunt proteine complexe formate din subuniti de
perechi polipeptidice ce catalizeaz importante ci metabolice (King, R.C. i
Stansfield, W.D., 2002). Ele pot fi definite ca enzime cu funcii similare
produse la loci diferii, sau mai simplu, forme multiple ale unei singure enzime.
Dei izoenzimele unei anumite enzime catalizeaz aceeai reacie, ele pot
prezenta proprieti diferite (ex. pH-ul sau concentraia la care au activitatea
maxim poate fi diferit pentru izoenzimele aceleai enzime).
3.1.2. Alozimele
Alozimele sunt markerii proteici cu cea mai larg utilizare. Alozimele unei
anumite enzime sunt produii diferitelor alele la un locus specific, sau altfel
exprimat, sunt proteine produse de forme alelice la acelai locus. Organismele
diploide (2n) pot fi homozigote pe un anumit locus al unei enzime avnd dou
copii ale aceleai alele, sau heterozigote avnd alele diferite ce codific variantele
aceleai enzime. De aici provine denumirea de alozime.
Acest proces de separare, dup cum se va vedea n continuare, include patru etape
(Loxdale, H.D. i G. Lushai, 1998):
92
Extracia. Cea mai mare parte a enzimelor separate prin electroforez sunt
solubile, deci o rupere simpl a pereilor celulari este suficient pentru a le
obine n soluie.
Extracia. ADN-ul total este extras din celule prin liz cu ajutorul unei
proteaze i separat prin precipitare cu soluie srat de etanol 100%, sau
printr-un procedeu simplificat cu Chelex (un agent de chelare polivalent de
natur rezinic). Daca extracia s-a efectuat corect, molecula de ADN nu este
degradat i este compus din fragmente e dimensiuni mari, 29 100 kb.
94
Pentru a putea fi utilizai, markerii ADN trebuie s posede cel puin dou alele.
Doar trei tipuri de secvene de ADN ndeplinesc aceast cerin: Polimorfismele
Lungimii Fragmentelor de Restricie (RFLPs Restriction Fragment Length
Polymorphisms), Polimorfismele Lungimii Secvenelor Simple (SSLPs
Simple Sequence Length Polymorphisms) i Polimorfismele unei singure
Nucleotide (SNPs Single Nucleotide Polymorphisms) Markerii ADN cel mai
frecvent utilizai pentru identificarea la populaiile de albine a unor markeri
moleculari asociai cu rezistena la parazii i boli sunt: RFLP, SSLP (minisateliii
i microsateliii), RAPD i AFLP.
poziiile
20
ALV
101
PCR
semicuibrit
cu
primerii
ALV
102
Minisateliii
Minisateliii, cunoscui i sub denumirea de Numr Variabil al Repetiiilor n
Tandem (VNTRs Variable Number of Tandem Repeats) sunt formaiuni n care
unitatea repetitiv are o lungime mai mare de 25 pb. Acetia nu sunt rspndii n
tot genomul, ci se gsesc n zona telomeric de la captul cromozomilor.
98
Cele mai multe alele ale minisateliilor au dimensiuni mai mari de 300 pb pentru
c unitile repetitive sunt relativ mari i tind s se adune mai multe ntr-o singur
formaiune.
Microsateliii
Datorit dificultilor tehnice ntmpinate de procedeele utilizate n biologia
molecular, folosirea microsateliilor ca markeri moleculari n studiile efectuate
asupra insectelor cu comportament social este de dat recent (E s t o u p i col,
1993, 1994 citat de R o w e i col, 1997).
Microsateliii sau secvenele simple repetate (SSR simple repeat sequence) sunt
fragmente de ADN compuse din secvene foarte scurte (2 6 pb) bazate pe
repetiii n tandem. Acetia pot fi homopolimeri ('... TTTTTTT ...'), repetiie
dinucleotidic
('....
CACACACACACACA
.....'),
trinucleotidic
('....
99
Microsateliii au variabiliti foarte mari, motiv pentru care exist lungimi diferite
ale aceluiai microsatelit n doi cromozomi diferii. Microsateliii alctuiesc cea
mai mare parte a heterocromatinei din jurul centromerului.
Unicitatea lor const n faptul c muli dintre acetia sunt asociai cu locii care
conin regiuni codificatoare.
Exemple de microsatelii:
(CA)n repetiie simpl
(CAAAC)n - repetiie simpl
(CACTG)n - repetiie simpl
Harta genetic obinut de acetia are o lungime de 4061 cm, cu 18% mai mare
dect cea obinut de H u n t i P a g e (1995).
localiti (de la Ra, P. i col., 2003). La aceste probe au fost analizai opt
microsatelii polimorfici: B124, A113, A7, A8, A35, A24, A28 i A88.
TCTATACCACGACGTTATTC
105
Secvena ADN a unui STS poate conine elemente repetitive, secvene care mai
apar i n alte regiuni ale genomului, ns atta vreme ct secvenele situate la
ambele capete ale sit-ului sunt unice, se pot sintetiza primeri ADN unici
complementari acelor terminaii, apoi se amplific regiunea cu ajutorul PCR i
astfel se demonstreaz specificitatea reaciei prin electroforeza n gel produsului
amplificat (D o g g e t t , N.A., 1992).
Primerul utilizat pentru generarea acestor markeri bazai pe STS a fost stsQl6.58,
5 AGTGCAGCCAGCTACTGAGAG.
PCR este o tehnic ce s-a dovedit indispensabil n evidenierea STS (sequencetagged sites), markeri moleculari ce constau din secvene scurte de ADN (200
500 pb) ce iniial au fost identificate n genomul uman i au proprietatea c se
gsesc doar ntr-o anumit zon a genomului i ntr-o singur copie. Ele provin
din ADNc (www.hyperdictionary.com).
Ulterior, aceti markeri au fost utilizai i la alte specii, la albine fiind implicai n
studiile de identificare a comportamentului igienic (L a p i d g e , K.L. i col.,
2002). Utilizarea STG faciliteaz identificarea QTL n genomul Apis mellifera
L. i alctuirea hrilor de linkage (H u n t G.J., 1997 citat de L a p i d g e , K.L. i
col., 2002).
108
Prini
Descendeni
Lungimea fragmentului
140 -
Acest tip de markeri sunt de fapt forme modificate ale RFLP, n care este
evideniat prezena sau absena fragmentelor de restricie i nu diferenele dintre
acestea n ceea ce privete lungimea lor.
Din acest motiv, nu este posibil identificarea imediat a formei homo- sau
heterozigoiei unui locus din prezena sau absena unei benzi pe gelul de
electroforez. ADN-ul genomic este evideniat prin utilizarea unui situs comun i
rareori cu ajutorul unei enzime specifice care cliveaz situs-ul la un anumit locus.
111
ADN-ului
amplificat
la
ntmplare
(RAPD)
reprezint
112
Fiecare primer va dirija amplificarea mai multor loci n genom, fcnd din acest
test o cale eficient de evideniere a polimorfismului secvenelor nucleotidice la
diferii indivizi.
n acest caz, un anumit fragment de ADN care este generat doar pentru un individ
i care nu coincide cu cel generat pentru alt individ prezint un polimorfism
caracteristic al ADN-ului respectiv, putnd fi astfel utilizat ca marker genetic.
Aceti markeri sunt transmii la descendeni pe cale mendeleean (T i n g e y i
col., 1993).
113
Aceasta a fost apoi introdus ntr-o colonie, iar 94 dintre descendenii ei masculi
(haploizi) au fost utilizai n vederea analizelor de linkage. S-a preferat utilizarea
populaiei haploide pentru a evita pierderile de informaie cauzate de dominana
markerilor RAPD.
Au fost evideniai 1000 primeri pentru cei doi prinie F ct i pentru matca F1.
Markerii RAPD au fost denumii dup denumirea primer-ului urmat de o linie i
dimensiunea aproximativa, exprimat n kilobaze.
Secvena
primerilor
utilizai
pentru
markerii
RAPD
fost
AGTTGACAGAGATTAC i 5 - GCAGCCAGAATATAAGACGCTGTT.
Dei o mare parte din markerii RAPD utilizai de Hunt i Page (1995) au fost
utilizai i n acest experiment, a fost imposibil identificarea grupurilor de
linkage individuale comune celor dou hri.
Aceasta era i de ateptat innd cont de faptul c locii markerilor produc benzi
diferite i prezent niveluri diferite de polimorfism n ncruciri diferite.
Analizele
de
linkage
au
fost
efectuate
cu
ajutorul
programului
Dei conform studiilor lui Rothenbuhler (1964) sau a celor realizate de Moriz
(1988) s-ar fi ateptat s obin 2 sau respectiv 3 markeri, autorii acestui studiu au
reuit evidenierea existenei a 6 markeri ce au prezentat un linkage sugestiv
116
117
Sunt necesare dou categorii de informaii n vedere realizrii unei analize QTL:
1. Hart de linkage a genomului speciei studiate.
2. Utilizarea unei metode adecvate n vederea msurrii modului de variaie
a comportamentului la animalele studiate.
Spre exemplu, dac exist doi markeri genetici diferii n cromozom, sunt anse
mari ca recombinarea s se produc dac acetia sunt situai la distan mare unul
de altul, ansele fiind mici dac sun apropiai.
Dac genele care regleaz comportamentul studiat sunt apropiate de marker ele
vor sta legate de marker pe parcursul recombinrii. Dac sunt situate la distane
mari, probabilitatea ca acestea s rmn legate de marker este sczut.
downstream dinspre cellalt). Acest lucru este posibil tehnic, dac distana
dintre cei doi markeri nu este prea mare.
Dac variaia comportamentului este mai mult sau mai puin ntmpltor legat
de prezena marker-ului, ntre comportament i zona cromozomial respectiv
exist linkage sczut, sau nu exist. Nivelul asocierii dintre comportament i
120
Se utilizeaz formula:
121
Metoda impune folosirea mai multor astfel de distane de linkage la care se aplic
formula de mai sus i astfel se ajunge la obinerea a mai multor astfel de punctaje
LOD. Distana de linkage pentru care s-a obinut cel mai mare punctaj LOD este
considerat estimata distanei de linkage.
122
123
Regiunile necodificatoare
Acestea includ regiunea mitocondrial de control, intronii genelor nucleare i
regiunile spaiului transcripional intern al genelor ribozomale nucleare. Pentru
c aceste regiuni se afl sub o presiune de selecie sczut tind s evolueze rapid
i sunt utilizate doar n studiile efectuate la speciile nrudite.
Datorit
heterozigoie, motiv pentru care este necesar clonarea produilor PCR naintea
secvenrii.
Genele mitocondriale
Datorit faptul c se gsesc ntr-un numr mare de copii sunt mult mai uor de
utilizat dect genele nucleare existente ntr-o singur copie, iar transmiterea
caracterelor acestora strict pe cale matern are mare utilitate la nivel intraspecific.
Genele mitocondriale sunt de dou categorii: gene ribozomale i gene ce codific
proteinele. Exist dou gene mitocondriale ribozomale, 12S ADNr i 16S ADNr,
care nu sunt separate prin spaii transcripionale interne.
126
127
128
CAPITOLUL IV
Liza se efectueaz n:
- 400 l TEN (Tris-HCl 10mM, pH = 8; EDTA 0,2 mM, pH = 8; NaCl 0,4 M)
- 40 l SDS 20%
- 8 l proteinaz K
Se amestec si se incubeaz la 550C timp de 1 or.
131
Soluia de liz:
- tiocianat de guanidiu 0,5 M
- EDTA 0,1 M
- acetat de amoniu 7,5 M de la ghea
Se adaug izopropanol.
ADN-ul este precipitat la - 200C i colectat dup centrifugare la 14.000 g timp
de 20 minute.
Peletul de ADN este splat de trei ori cu etanol 70%, uscat n curent de aer i
resuspendat n ap steril.
132
kit-uri sunt mai mult sau mai puin utile n funcie de analiza ADN ce se
urmrete a fi efectuat.
Probele sunt extrase n mod repetat prin inversie lent cu 100 l fenol (pH =
7,4) i 100 l cloroform i centrifugare la 15000 g timp de 10 minute. Stratul
apos superior este transferat n alt Eppendorf.
133
Peletul rezultat este splat n etanol 70% rece, uscat sub vid i dizolvat n 100 l
TE0,1:
- tampon Tris 10 mM (pH = 7,6)
- EDTA 0,1 mM
prin nclzire la 650C timp de 10 minute. ADN-ul concentrat este diluat 1 : 200
n ap steril pentru a fi apoi utilizat pentru amplificare.
MELLIFERA L.)
Probele au fost recoltate din 358 stupine din judeul Slaj, 24 stupine apicultori
din judeul Cluj, 14 stupine din judeul Satu Mare, 40 stupine din judeul Alba i
35 stupine din judeul Tulcea.
Aparatura utilizat
Autoclav, Raypa
Vortex, Bioblock
Acesta acoper ntreg spectrul UV VIS (220 750 nm) i este destinat n
principal msurrii absorbanei probelor de ADN, ARN i proteine.
Are dimensiuni relativ reduse (20 cm x 14 cm). Durata msurrii este doar de 10
secunde, iar domeniul de msurare acoper un domeniu larg de concentraii att
pentru ADN dublu catenar (2 - 3700 ng/l) ct i pentreu ADN i ARN
monocatenar ( 2400 ng/l i respectiv 3000 ng/l).
135
Cnd aparatul este nchis, braul adus la poziia iniial comprim pictura de
prob care este supus msurtorii spectrale. Tensiunea de suprafa este singura
for care menine proba.
136
Cnd msurarea este finalizat, aparatul se deschide, iar proba este ndeprtat
prin simpla tergere cu un ervet de laborator.
Fluxul luminos rezultat n urma trecerii prin prism este alctuit din radiaii cu
diverse lungimi de und i este direcionat diferit. Prin fant trece doar radiaia cu
lungimea de und dorit.
137
138
2. Dac
direcionat spre celula de referin, apoi este orientat spre al doilea disc rotativ
i direcionat spre detector.
3. Dac radiaia vine n contact cu zona neagr a discului, aceasta este blocat.
Detectorul convertete semnalul luminos n semnal electric. Intensitatea
luminoas a radiaiei msurat n celula de referin este notat cu I0, iar cea
rezultat n urma trecerii prin celula ce conine proba cu I. Raportul dintre cele
dou intensiti luminoase poart numele de absorban i este dat de relaia A =
log I0/I.
Datele rezultate de la msurtori sunt stocate automat n memoria dispozitivului
specific i pot fi vizualizate fie cu un software tip DataViewer sau programe tip
MS Excel.
CTAB 1%
EDTA 10mM
NaCl 750 mM
Probele sunt extrase n mod repetat prin inversie lent cu 100 l fenol (pH = 7,4)
i 100 l cloroform i centrifugare la 15000 g timp de 10 minute.
Stratul apos superior este transferat n alt Eppendorf. Extracia este repetat cu
200 l cloroform agitare lent prin inversie i centrifugare 2 3 minute.
n continuare:
ADN-ul este precipitat cu 20 l acetat de sodiu 3M (pH = 5) i 400 l
etanol rece 100%.
Probele sunt centrifugate 10 minute la 4000 g.
Peletul rezultat este splat cu etanol 70% rece i apoi se adaug Tris 10mM (pH =
7,6) i EDTA 1mM.
Cte 10 masculi din stupinele studiate din fiecare dintre judeele analizate au fost
supui protocolului de izolare a ADN-ului propus de Hunt i col. (1997).
Puritatea ADN-ului extras, a fost nesatisfctoare (cu valori cuprinse ntre 1,34%
i 1,55%) dar coeficienii de variabilitate au fost mici, ntre 5,77% (albinele din
Slaj) i 11,56 % (Cluj).
Slaj
Cluj
Satu Mare
Alba
Tulcea
100
69,65
80
59,1
54,22
60
48,54
43,12
32,11
35,31
40
40,21
20,63 34,17
18,98
17,14 14,37 16,25
14,22
20
0
Media
Coeficientul de variabilitate
Deviaia standard
Parametru statistic
141
Slaj
Cluj
Satu Mare
Alba
Tulcea
15
11,56
10,19
10
8,91
5,77
6,71
5
1,55
1,49
1,48 1,34
1,43
0,15
0,08 0,18
0,17 0,21
Media
Coeficientul de variabilitate
Deviaia standard
Parametru statistic
142
CTAB 1%
EDTA 10mM
NaCl 1,1 M
Probele sunt extrase n mod repetat prin inversie lent cu 100 l fenol (pH = 7,4)
i 100 l cloroform i centrifugare la 15000 g timp de 10 minute. Stratul apos
superior este transferat n alt Eppendorf.
Peletul rezultat este splat n etanol 70% rece, uscat sub vid i dizolvat n 100 l
TE0,1:
EDTA 0,1 mM
prin nclzire la 650C timp de 10 minute. ADN-ul concentrat este diluat 1 : 200 n
ap steril pentru a fi apoi utilizat pentru amplificare.
143
Slaj
Cluj
Satu Mare
Alba
Tulcea
100
76,15
80
72,19
80,11
68,34
60
40
9,15
20
19,26
18,22
20,23
14,76
16,22 11,43
11,42
15,34
10,21
13,81
0
Media
Coeficientul de variabilitate
Deviaia standard
Parametru statistic
Puritatea ADN-ului extras, a fost satisfctoare (cu valori cuprinse ntre 1,75% i
1,93%) iar coeficienii de variabilitate au fost mici, ntre 3,14% (albinele din
Slaj) i 9,11 % (Cluj).
144
Slaj
Cluj
Satu Mare
Alba
Tulcea
15
9,11
10
5
1,82
1,75
8,88 8,91
7,81
3,14
1,93
1,91 1,78
0,19
0,12 0,16
0,14 0,21
Media
Coeficientul de variabilitate
Deviaia standard
Parametru statistic
145
146
Elongaia (extensia)
ADN-polimeraza
sintetizeaz
caten
gena A
gena B
gena C
147
n prima etap, denaturarea (fig. 40), reacia este nceput prin nclzirea
amestecului de reacie la 940C, temperatur la care se rup legturile de hidrogen
dintre cele dou catene polinucleotidice ale helixului, ADN-ul denaturndu-se i
devenind o molecul unicatenar.
n etapa a doua, cuplarea (fig. 40), temperatura se reduce la 50 600C, ceea ce
are drept rezultat realturarea unora dintre catenele simple ale ADN-ului, dar n
acelai timp permite i primerilor s se ataeze n poziiile complementare aflate
la capetele genei de interes. Cei doi primeri se leag la capetele 3 ale genei
urmrite pe cele dou catene, motiv pentru care acetia se numesc primeri sens
i antisens.
ADN-ul int
5
Denaturare
la 940C
3
Rcire la
50 600C
148
Primeri
Sinteza ADN-ului
la 720C
5
5
Produi lungi
Din acest moment ncepe sinteza ADN-ului, iar temperatura este ridicat la 720C,
temperatur optim pentru aciunea Taq polimerazei.
149
Cnd n acest ciclu se utilizeaz ultima matri se replic doar regiunea int.
Cnd se repet ciclul denaturare cuplare sintez (fig. 41), produii lungi
acioneaz ca matrie pentru noile sinteze de ADN dnd natere la produi
scuri a cror terminaii 3 i 5 sunt stabilite de poziiile de cuplare a
150
5
Produii rezultai din primul ciclu
5
Denaturare
Sinteza ADN-ului
151
Denaturare
Sinteza
ADN-ului
Produii
celui de
al reilea
ciclu
Produs scurt
(se acumuleaz exponenial)
Aceasta nseamn c dup 30 de cicluri vor exista peste 250 milioane de produi
provenii din fiecare molecul iniial. Adic, din cteva nanograme de fragment
de ADN ce se dorea a fi amplificat (ex. gena B) vor rezulta cteva micrograme de
152
produs al PCR. Astfel, este amplificat doar gena de interes (B) care va fi
purificat pentru a fi n continuare utilizat.
4.3.VIZUALIZAREA PROBELOR
Ei pot fi vizualizai direct prin colorare cu bromur de etidiu sau argint, sau prin
marcare cu radioizotopi i autoradiografie.
a). Colorarea
Colorarea cu bromur de etidiu este convenabil n cazul n care sunt
disponibile cantiti mari de ADN, cum este cazul produilor PCR, cnd rezult
ADN purificat utilizat apoi n analize de ADN specifice, fiind mai puin adecvat
n cazul ADNm, care este detectat cu acuitate mai mare utiliznd alte tehnici.
Molecula de bromur de etidiu capabil s se intercaleze ntre cele dou brae ale
helixului ADN-ului absoarbe lumina UV (la 300 nm), oscileaz, pierde energie i
emite fluorescen de culoare portocalie (cu lungimea de und de 590 nm).
b).Marcarea
Marcarea cu radioizotopi se realizeaz prin ncorporarea marker-ului respectiv
(radioactiv sau fluorescent) ntr-o copie nou sau parial sintetizat a secvenei
iniiale de ADN. Aceasta se poate realiza prin mai multe procedee (marcare
ntpltoare, translaie Nick, sau marcarea captului moleculei de ADN).
154
32
P,
33
P i
35
Proba este iniial purificat, dup care este denaturat pentru a obine ADN
unicatenar, dup care se pstreaz la ghea pn n momentul amestecului cu
markerul radioactiv.
Frecvenele relative cu care apar aceste capete n secvena total sunt identice
cu cele ale diferitelor molecule de ARNm din proba original. Etapele SAGE
sunt prezentate schematic n fig. 43.
Etapa a 4-a. Enzimele de tipul IIS scindeaz secvena ADNc punnd n libertate
un fragment de ADN care conine linkerul la un capt i aproximativ10 pb ale
ADNc la cellalt capt. Aceast secven de 10 pb constituie captul (tag).
Fragmentele sunt purificate prin simpla colectare urmat de eliminarea paturilor.
159
sunt
compuse n cea mai mare parte din secvene ale celor dou capete (tags).
Etapa a 7-a. Aceste fragmente sunt apoi purificate i ligate formnd concatemeri
lungi n care fragmentele sunt ncorporate ntmpltor. Concatemerii sunt apoi
clonai pentru a forma o bibliotec SAGE. Apoi, clone individuale sunt luate la
ntmplare i secvenate.
160
162
Adic, la acest nivel exist dou alele, una cu secvena specific situs-ului de
restricie la nivelul creia enzima de restricie va scinda molecula de ADN, iar
cealalt alel prezint modificri secveniale i nu va fi recunoscut de enzim,
care nu va scinda molecula la nivelul acesteia.
Rezultatul modificrii secvenei uneia dintre cele dou alele este acela c cele
dou fragmente de restricie adiacente rmn legate mpreun i dup tratamentul
cu enzima de restricie, ceea ce conduce la apariia unui polimorfism al lungimii.
Acesta este de fapt un polimorfism al fragmentelor de restricie (RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism), ce poate fi utilizat ca marker ADN.
Tehnica RFLP const din scindarea moleculei de ADN n dou pri cu ajutorul
unei enzime de restricie la fiecare parte a regiunii ce prezint polimorfism, astfel
nct aceasta s rmn intact.
Rezultatul final este obinut prin utilizarea a patru probe diferite cu puteri
discriminatorii diferite.
Pentru aceasta se poate utiliza amplificarea segmentului genic 16s ADNr (965
pb) se va utiliza perechea de primeri: 5 CAACATCGAGGTCGCAAACATC
3 i 3 AGTTGGGACTATGTTTTCCATG 5, iar pentru amplificarea
segmentului
genic
CO
(1028
pb),
perechile
de
primeri:
GATTACTTCCTCCCTCATTA 3 i 3 AATAAGTCTGATAGGTCTAA
5 (Nielsen i col., 1999, citai de B r o w n T.A., 2001).
164
165
Fiecare primer va dirija amplificarea mai multor loci n genom, fcnd din acest
test o cale eficient de evideniere a polimorfismului secvenelor nucleotidice la
diferii indivizi. Astfel, un anumit fragment de ADN care este generat doar pentru
un individ i care nu coincid cu cel generat pentru alt individ prezint
polimorfism al ADN-ului, putnd fi astfel utilizat ca marker genetic. Aceti
markeri sunt transmii la descendeni pe cale mendeleean.
3
5
..............
................
5
Primul culoar din stnga corespunde mamei mtcii F1, iar celelalte culoare conin
ADN amplificat de la descendenii trntorilor haploizi ai mtcii F1 cu excepia
markerul-ui de greutate molecular situat pe culoarul central (*).
167
Cei cinci markeri care au contribuit la cartarea grupelor de linkage au fost: 239-1,
239-96f, 239-59, 239-4 i 239-29f.
Figura 45. Gelul obinut n urma amplificrii ADN-ului polimorfic generat de primerul
UBC-239 (dup , H u n t i col., 1995)
Acetia s-au dovedit foarte eficieni n cartare, cu aproximativ 2,8 loci cartai la
fiecare primer 10-nucleotidic utilizat n PCR (fig. 46).
168
Figura 46. Harta de linkage la Apis mellifera L. alctuit pe baza markerilor RAPD
(dup , H u n t i col., 1995)
169
Figura 46 continuare
Harta de linkage la Apis mellifera L. alctuit pe baza markerilor RAPD
(dup , H u n t i col., 1995)
170
Aceast tehnic este o variant a RFLP, prin care este evideniat prezena sau
absena fragmentelor de restricie i nu lungimea lor.
modificrilor
situs-urilor
de
restricie/adaptorului,
sau
Pentru analiza AFLP sunt necesare cantiti reduse de ADN genomic purificat, iar
principiul metodei este prezentat n fig.47.
172
173
Amplificarea preselectiv
Primerii utilizai n aceast etap constau dintr-o secven miez, o secven
specific enzimei de restricie i o extensie selectiv alctuit dintr-o singur baz
la captul 3.
Produii primari ai acestei etape sunt acele fragmente ce au fost scindate o dat de
MseI i o dat de EcoRI i posed nucleotidele pereche.
174
Incubare iniial
20 de cicluri
Extensie final
60 C ................. 30 minute
Incubare final
176
Denaturare iniial
940C .................. 20 secunde ..... denaturare
560C .................. 20 secunde ..... cuplare
720C .................. 20 secunde ..... extensie
940C ................................ 20 secunde ..... denaturare
Se scade 10C/ciclu ......... 30 secunde ..... cuplare
9 cicluri
20 de cicluri
Incubare final
RE , situs-ul 1
RE, situs-ul 2
ADN genomic
ADN restricionat
178
179
Primer 1
+T
C+
Primer 2
Populaia fragmentelor preselective generate prin PCR const n primul rnd din
cele cu urmtoarea frecven:
Produii preselectivi sunt din nou amplificai la fel ca n etapa anterioar, dar
unul dintre primeri, cu posibile nucleotide selective multiple va fi marcat cu
fluorofor. Doar fragmentele ce conin un situs cu primer complementar primerului marcat cu fluorofor va fi vizualizat n continuare.
180
Primer 1
+ TX
XC +
Primer 2
5 ARNm
Revers
Transcriptaz
5
3 ADNc
182
Copia de ADN este apoi amplificat n prezena Taq polimerazei, prin tehnica
specifica RT-PCR.
183
Tot cu ajutorul RT-PCR a fost evideniat rolul de agent viral al parazitului Varroa
destructor n vehicularea unei mari varieti de virui. Aplicaia cea mai
important a fost demonstrat n cazul virusului aripilor diforme la albine n
stupinele din Anglia i Suedia (B o w e n - W a l k e r , P.L. i col., 2002;
N o r d s t r m , S., 2003).
*
*
185
Sigma
Stratagene
Promega
Pharmacia
Clonetech
Cambridge
Bioscience
Boehringer
Mannheim
Bio-Rad
Extracia ADN-ului
genomic
Marcare
ntmpltoare
Translaie Nick
Marcare final
Radioizotopi
Marcare cu biotin
Colorare cu argint
Fluorescen
PCR
Clonare
Secveniere (normal)
Secveniere pe cicluri
Geluri pretratate
Markeri moleculari
Amersham
Kit-uri
Appligene
Companiile
comerciale
New England
Biolabs
Tabelul 2. Kit-uri comerciale disponibile pentru utilizare n tehnicile moleculare folosite la Apis
mellifera L. (dup L o x d a l e i col., 1998)
186
prezint
importan,
pot
fi
187
efectuate
BIBLIOGRAFIE
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
189
190
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
192
193
194
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
196
119. Spivak
146. ***,
200