II.2.

1 Compoziia chimic a ADN i ARN

Macromoleculele de ADN sunt alctuite din trei tiprui de molecule:
bazele azotate, deoxiriboza i gruparea fosfat.
Bazele azotate pot fi de tip purinic sau pirimidinic. Acestea sunt:
a) baze purinice:
NH2

N
N

HN

H2N

Adenina (A)

Guanina (G)

Remarcai faptul c aceste molecule sunt alctuite din dou cicluri

condensate
b) baze pirimidinice:
NH2

NH

Citozin (C)
Timina (T)
Moleculele bazelor pirimidinice sunt mai mici, formate dintr-un singur
nucleu.
Deoxiriboza este o riboz (o pentoz) la care gruparea OH din poziia
2 a fost nlocuit cu un atom de hidrogen (de unde i denumirea:
deoxiriboz):
25

HO

5'

OH

CH2

4'

1'

3'

2'

OH

H
H

Deoxiriboza
n structura ADN bazele azotate sunt legate la deoxiriboz prin
condensare la gruparea hidroxil din poziia 1 a acesteia din urm (aa
numitul hidroxil glicozidic, mai reactiv). Atomul de hidrogen al bazelor
azotate care este substituit prin aceast condensare a fost explicit
artat n figurile corespunztoare de mai sus.
Complexul astfel format poart numele de nucleozid. Adenina
formeaz deoxiadenozina (prescurtat dA), guanina formeaz
deoxiguanozina etc. De exemplu, structura dA este:
NH2
N

HO
O
H

OH

Deoxiadenozina (dA)
La rndul lor, deoxinucelozidele leag una sau mai multe (pn la 3)
grupri fosfat, la nivelul gruprii hidroxil din poziia 5 a deoxiribozei,
formnd o deoxinucelotid. Pentru exemplul de mai sus, structura
corespunztoare a compusului cu 3 grupri fosfat este:

26

NH2
N

O
-O

O
O

O-

O-

5'

O-

OH

5-deoxiadenozintrifosfat (5-dATP)
Macromolecula ADN se formeaz prin condensarea la nivelul gruprii
hidroxil din poziia 3 a unei deoxinucleotide a gruprii fosfat a unei a
doua deoxinucleotide etc. De exemplu, dac la 5-dGMP se leag 5dAMP, rezult :
A

NH2

O-

5'
O

O-

NH

O
H

O-

3'

NH2

H
OH

Structura prezentat mai sus se denumete 5-AG-3 sau mai simplu

AG, respectnd convenia c prima baz azotat scris are captul 5
fosforilat iar ultima are la captul 3 o grupare hidroxilic liber. Se
poate observa c structura aceasta este diferit de structura GA. O
secven ipotetic mai lung de ADN se poate scrie:
5-GCGGCGACGATAT-3
sau, conform conveniei:
GCGGCGACGATAT
27

Acizii ribonucleici (ARN) se deosebesc de acizii deoxiribonucleici

(ADN) prin urmtoarele particulariti de compoziie chimic
(deosebirile structurale le vom descrie mai trziu):
- n loc de timin (T) au n compoziie uracil (U):
O

NH

pentoza din compoziia chimic a ARN este riboza obinuit

(are grupare hidroxil n poziie 2):
HO

OH
O
H

OH

OH

II.2.2 Structura ADN i ARN

Structura spaial a ADN a fost determinat prin difracie de raze X. Sa stabilit astfel c molecula este alctuit din dou iruri
complementare de nucleotide, nfurate mpreun ntr-o structur
dublu helical. Cele dou elici prezint spre interior bazele azotate
(care sunt mai hidrofobe i se leag ntre ele prin legturi de hidrogen)
i spre exterior resturile de pentoz i gruprile fosfat, hidrosolubile,
aa cum se poate vedea n figura de mai jos, unde am folosit
urmtoarele convenii de culoare:
- bazele purinice sun reprezentate n rou
- bazele pirimidinice reprezentate n albastru
- n gri sunt reprezentate resturile de deoxiriboz i punile de
resturi fosfat care alctuiesc scheletul fiecrei elici

28

Datorit diferenelor mari de volum ntre bazele azotate purinice pe de

o parte i cele pirimidinice pe de alt parte, acestea nu pot exista n
structura spaial a acidului nucleic la acelai nivel n lungul axei
principale a dublei elici, dect dac sunt complementare: o baz
purinic dintr-o elice, la acelai nivel cu o baz pirimidinic la cealalt
elice. Mai mult, s-a observat c ntotdeauna o adenin dintr-o elice se
afl n contact cu o timin din cealalt elice (realitndu-se o pereche
AT ntre cele dou elici), iar guanina este ntotdeauna n contact cu
citozina (pereche GC). n cazul ARN timina este nlocuit cu uracil.
Aceste perechi poart numele de perechi Watson-Crick, dup numele
celor doi fizicieni care au stabilit structura tridimensional a ADN.
Acest mod mperechere a dou baze din elici diferite se poate explica
dac suprapunem imaginile celor dou perechi de baze; se poate
observa c cele dou imagini sunt aproape identice, asigurnd o
geometrie compact dublei elici a ADN:
H

NH

N
O

N
H

Perechea citozin - guanin

Perechea timin adenin

29

H
N
O

N
N

H
N
O

N
N

N
O
O

N
H

Cele dou structuri suprapuse

Prin urmare, cele dou secvene de baze aparinnd celor dou elici
vor fi complementare. Dac una dintre elici are secvena ipotetic
ilustrat mai sus (5-GCGGCGACGATAT-3), atunci perechea sa va fi:
5-GCGGCGACGATAT-3
3-CGCCGCTGCTATA-5
O proprietate foarte important a dublei elici este aceea c ea poate fi
topit reversibil, sau chiar, n anumite condiii, se pot desface cele
dou irurui de baze ale sale (n mediu acid sau alcalin, care
favorizeaz ionizarea bazelor azotate). Cele dou lanuri se
recombin n mod spontan atunci cnd condiiile fizico chimice revin
la normal (procesul se numete de renaturare, sau, n englez,
annealing pentru c nseamn de fapt realinierea celor dou lanuri).
Aceast proprietate este intens speculat de metodele ingineriei
genetice.
Exist de asemenea n natur (dar se poate prepara i n laborator)
forme de ADN circulare, numite plasmide. Termenul de circular este
folosit aici n sensul c irul de baze azotate nchide o structur n
care captul 5 este legat la captul 3, forma geometric real a
acestui obiect fiind foarte neregulat, nicidecum circular.
Atunci cnd o celul se divide, materialul su genetic trebuie s se
divid de asemenea. Acest lucru se mtmpl n timpul procesului de
replicare. Elicea dubl se desface pe o anumit poriune ca un
fermoar (proces reglat de anumite enzime) i, sub aciunea unei alte
enzime numit ADN-polimeraz, pe fiecare ir (strand) de nucleotide
sunt aduse i se condenseaz nucleotidele complementare (sub
form de trifosfai). n urma fiecrui pas de condensare se elibereaz
o molecul de pirofosfat care este apoi transofrmat enzimatic n
fosfat. Acest proces are loc ntotdeauna ncepnd de la captul 3 al
ADN iniial (numit template), sinteza noului ir, complementar,
30

realizndu-se deci ncepnd cu captul 5 al acestuia din urm, aa

cum se ilustreaz n schema de mai jos:
3

OH

O
H2

Pi

Pi

Pi

Pi

Pi

OH

OH

P
i

Pi

P
i

5
Pi

HO

Pi

Pi

Pi

Pi

Pi

HO

Pi

Pi

ADN polimeraza

Pi

Pi

al treilea
ciclu

al doilea
ciclu

primul
ciclu

ADN
original

La fiecare replicare a unui lan de ADN se introduce material genetic

nou, astfel nct dup mai multe cicluri de replicare se obin lanuri
complet noi, ca n schema de mai jos:

unde s-a reprezentat cu rou materialul genetic original i cu albastru

materialul genetic nou. Se poate observa c numai dou molecule din
toate care vor fi prezente dup mai multe cicluri de replicare mai
conin material genetic original. Acest tip de replicare poart numele
de replicare semiconservativ.

II.2.3 Secvenierea ADN prin metoda dideoxi (Sanger)

Determinarea modului de niruire a bazelor azotate ntr-un lan ADN
se numete secveniere. Aceast tehnic utilizeaz nite molecule
numite 2',3'-dideoxinucleotidtrifosfat (pe scurt ddNTP, unde N este
una din bazele azotate: A, G, C sau T). Aceste molecule difer de
nucleotidele obinuite care se gsesc n componena ADN prin faptul
31

Pi
5

c le lipsete gruparea hidroxil din poziia 3', aa cum se poate

observa n figura de mai jos.
O
-O

P
O-

O
O

P
O-

O
O

Baza azotata

O-

Atunci cnd o asemenea molecul intervine n procesul de

polimerizare a ADN, ea oprete procesul, deoarece poziia 3' nu mai
este disponibil pentru a forma un fosfoester cu o nou nucleotid
care ar urma s continue creterea lanului.
Pentru a se realiza secvenierea moleculei de ADN este mai nti
necesar denaturarea acesteia, ceea ce se realiizeaz de obicei prin
tratare cu hudroxid de sodiu.
Se realizeaz apoi un amestec avnd urmtoarea compoziie:
ADN-ul de secveniat, denaturat aa cum s-a artat mai sus;
primeri pentru ADN (secvene de ADN scurte, sintetice,
complementare cu captul 3' al ADN de secveniat) marcai fie
fluorescent fie radioactiv la captul 5';
un amestec echimolar din toate cele 4 nucleotide standard;
una dintre cele 4 nucleotide sub form dideoxi, de exemplu
ddATP (concentraia sa n amestecul total de nucleotide ar
trebui s fie de ordinul 1%);
ADN polimeraz
Procesul ncepe prin ataarea primerului radioactiv la captul 3 al
ADN-ului de secveniat i continu prin alungirea lanului
complementar, cu ajutorul polimerazei i utiliznd nucleotidele
prezente n amestec, pn cnd se ntmpl s se lege o molecul de
ddATP, ceea ce va ntrerupe procesul de polimerizare (de aceea este
important procentul de 1 % din amestecul de baze: o cantitate prea
mare ar produce ntreruperi prea dese, iar o cantitate prea mic,
ntreruperi prea rare). Rezultatul final va fi obinerea unui amestec de
fragmente de ADN de diferite lungimi, toate complementare cu ADN-ul
pe care dorim s-l secveniem i care au toate, la captul 3 adenin.
Se reia ntregul proces folosind, pe rnd, celelalte baze sub form
dideoxi: ddTTP, ddCTP i ddGTP. n felul acesta se determin poziia
fiecrei baze azotate din lanul ntreg al ADN iniial.
Cele patru amestecuri de fragmente de ADN se supun electroforezei,
ncrcnd cte un amestec pe cte un culoar al gelului. Se determin
32

astfel masele moleculare ale fragmentelor i deci numrul de baze

azotate din compoziia fiecruia. Deoarce tim c fiecare fragment se
termin, de exemplu, pentru primul culoar de electroforez, cu o
adenin (pentru c n acest caz am folosit ddATP), rezult c putem
determina poziiile tuturor adeninelor din secven. Din poziiile liniilor
pe celelalte culoare se determin respectiv poziiile T, C, G.
Pentru a nelege mai bine mecanismul acestui proces s lum ca
exemplu urmtoarea secven de ADN:
5'-CATAGCTGTTTCCTGTGTGAAA-3'
S presupunem c primerul utilizat are formula:
3'-CTTT---O
unde simbolul O repzint marcarea radioactiv sau fluorescent. S
presupunem mai departe c introducem n amestecul de reacie
urmtoarele nucleotide:
ddCTP, dATP, dGTP, dCTP i dTTP (deci lanul de polimerizare se va
opri acolo unde se va ataa o dideoxi citozin). Va rezula urmtorul
amestec:
3'-CACTTT---O
3'-CACACTTT---O
3'-CAAAGGACACACTTT---O
3'-CGACAAAGGACACACTTT---O
unde ultimele patru baze de la captrul 5' corespund primerului
utilizat.
Se repet raionamentul utiliznd, pe rnd, celelalte baze azotate
dideoxi.
Gelul de electroforez (citit n lumin ultraviolet dac markerul a fost
fluorescent) al celor patru amestecuri finale de reacie va arta,
shematic, ca mai jos:

33

ddATP

ddGTP

ddCTP

ddTTP
3
G
T
A
T
C
G
A
C
A
A
A
G
G
A
C
A
C
A
5

5
C
A
T
A
G
C
T
G
T
T
T
C
C
T
G
T
G
T
3

Coloana din extrema stng reprezint gelul amestecului de

fragmente obinute utiliznd ddATP, a doua corespunde utilizar
ddGTP, etc.
Ducnd mai departe exeplul utilizrii ddCT, observm c linia
corespunztoare fragmentului cel mai uor, care migreaz cel mai
repede (poziia cea mai de jos n figura gelului) se afl la nivelul de
mas corespunztor unui fragment cu 5 baze. Asta nseamn c n
poziia 5 a secvenei avem o citozin, ceea ce corespunde unei
guanine n ADN-ul iniial, numrnd de la captul 3'. Raionamentul se
repet pentru toate liniile i coloanele gelului, reconstitnuidu-se astfel
ntreaga secven.
n partea dreapt a figurii de mai sus este reprezentat secvena
complementar reconsituit din fragmentele de polimerizare precum i
(desenat n rou) secvena dedus a ADN-ului iniial: 5'CATAGCTGTTTCCTGTGTGAAA-3' (mai puin captul corespunztor
primerului).

II.2.4 Sinteza proteinelor n ribozom

Procesul de de sintetizare a unei proteine pornind de la informaia
coninut n ADN ncepe cu procesul de transcripie, n cadrul cruia
secvena de baze azotate a ADN care codific proteina respectiv
este copiat n ARNm. Alungirea lanului ARNm se face cu ajutorul
unei enzime numite ARN polimeraz, urmnd un mecanism similar
celui de replicare, prezentat mai sus. Ceea ce se copiaz este
secvena din strandul ADN complementar celui care codific
proteina. Locurile exacte de pe secvena ADN unde ncepe i se
oprete procesul de transcripie este semnalat de anumite secvene
specifice sunoscute sub numele de situsuri promotor (promoter sites)
34

i terminator, recunoscute ca atare de ARN polimeraz. Prin urmare,

ARNm are o secven identic cu a ADN-ului original care codific
proteina (fiind complementar cu complementarul acestuia!), cu
deosebirea c n loc de timin are n compoziia sa uracil. Molecula
ARNm mai sufer cteva modificri, pn s fie eliberat din nucleu,
prin adugarea unor secvene suplimentare la ambele capete (o aa
numit secvena cap la captul 5 i o secven poli(Adenilat) la
captul 3).
ARNm odat produs este transportat la ribozom (organit celular
compus din mai multe proteine i o cantitate mare de ARNr). Aici are
loc procesul de translaie (sintetizarea proteinei pe baza informaiei
aduse de ARNm), conform unui protocol care respect urmtoarea
regul: fiecrui aminoacid din cei 20 aminoacizi care pot intra n
compoziia unei proteine, i corespunde o anumit secven de 3
nucleotide (triad sau codon) din secvena ARNm. Aceast
coresponden se numete cod genetic. Codul genetic este practic
universal, aceeai coresponden triadaminoacid fiind valabil la
aproape toate organismele cunoscute. n tabelul de mai jos se pot
vedea diferite combinaii de baze care codific aminoacizi:
Prima poziie
din triad
(captul 5)

Ultima poziie
din triad
(captul 3)

A doua poziie a triadei

U
Phe
Phe
Leu
Leu
Leu
Leu
Leu
Leu
Ile
Ile
Ile
Met
Val
Val
Val
Val

C
Ser
Ser
Ser
Ser
Pro
Pro
Pro
Pro
Thr
Thr
Thr
Thr
Ala
Ala
Ala
Ala

A
Tyr
Tyr
Stop
Stop
His
His
Gln
Gln
Asn
Asn
Lys
Lys
Asp
Asp
Glu
Glu

G
Cys
Cys
Stop
Trp
Arg
Arg
Arg
Arg
Ser
Ser
Arg
Arg
Gly
Gly
Gly
Gly

U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G

Este de remarcat faptul c cele 4 baze azotate pot da 64 de triade

diferite (vezi numrul de csue din tabelul de mai sus), de aceea
exist posibilitatea (care se i ntmpl n reralitate pentru cei mai
muli dintre aminoacizi) ca mai multe triade s codifice un acelai
aminoacid (spunem despre codul genetic c este degenrat).
35

Semnalul care definete punctul de ncepere a procesului de

translaie este destul de complex n cazul eucariotelor. Este vorba
despre o secven AUG (codific metionina) aflat la captul 5 al
zonei din ARNm care codific proteina, precedat de secvena cap.
Aceast zon este recunoscut de un ARNr care catalizeaz apoi
ataarea ARNt corespunztor la secvena AUG. Odat ce acest ARNt
este fixat n poziia corect, este stabilit punctul de origine a citirii
codonilor, aa numitul cadru de citire, reading frame. Aceasta explic
faptul c, nainte de orice modificare post-translaional, orice protein
are la captul N-terminal o metionin.
Aici intervine rolul ARNt. Aceste molecule au o structur n form de
ac de pr care conine n bucla sa o secven complementar cu cea
a codonului unui anumit aminoacid (care se numete anticodon al
acelui aminoacid). Pe de alt parte, la captul 3 al acestei molecule
ARNt, se gsete ataat ca ester (n poziia 3 sau 2 a ribozei
respective) molecula aminoacidului al crui anticodon se afl n bulc,
aa cum se poate vedea n schema de mai jos:

CCA aa i
5
Structura schematic a unei molecule ARNt

anticodonul aa i

Astfel, fiecrui tip de aminoacid i corespunde un ARNt, care poart n

bucla sa anticodonul acelui aminoacid.
Procesul de translaie se defoar astfel: la primul codon din
secven se prezint acel ARNt care poart anticodonul potrivit i
aminoacidul corespunztor. Urmeaz ataarea, la cel de-al doilea
codon, a urmtorului ARNt, care conine animoacidul numrul 2 din
secvena proteinei. Cei doi aminoacizi vor forma legtura peptidic
corespunztoare, primul se desprinde de pe ARNt care,la rndul su
se desprinde de pe ARNm. Procesul se repet apoi pentru codonul
nr.3 etc.
Punctul de oprire a procesului de translaie este semnalat de una din
secvenele stop UAA, UGA i UAG. La nivelul acestora se ataeaz o
protein specific, numit factor de eliberare, care, cnd este ntlnit
de proteina n curs de sintetizare provoac desprinderea acesteia din
urm de pe ARNm i deci ncetarea procesului de sintez.
Toate aceste procese (ncepnd cu legarea aminoacidului corect la
ARNt-ul su specific, pn la eliberarea ultimului rest de ARNt de pe
ARNm) sunt catalizate de un complex de enzime care se gsesc n
ribozom.
36

II.2.5 Controlul exprimrii genelor

Ansamblul proceselor de transcripie i de translaie poart numele de
exprimare a unei gene. Nu toate genele cuprinse n genomul unei
celule se exprim la un moment dat. Sinteza proteinelor este un
proces complex care trebuie s rspund nevoilor celulei la un
moment dat, modificrilor de mediu etc. Prin urmare, trebuie s existe
un mecanism molecular de control al acestui proces.
Unul dintre mecanismele cele mai bine studiate n literatura de
specialitate, i care prezint un interes deosebit pentru exprimarea
artificial a proteinelor, este cel al exprimrii -galactozidazei de ctre
Escherichia coli. Aceast enzim (necesar metabolizrii lactozei de
ctre bacterie) nu se exprim niciodat singur. S-a observat c
bacteria sintetizeaz ntotdeauna, simultan, i alte dou enzime:
galactozid permeaza (care faciliteaz ptrunderea lactozei prin
peretele extracelular al bacteriei) i tiogalactozid transacetilaza, cu rol
(pribabil) n eliminarea unor produi toxici ai metabolismului lactozei.
Se poate deci observa c aparatul genetic al celulei este astfel
construit nct sintetizeaz simultan uncomplex de proteine care s
rspund adecvat prezenei n mediul extracelular a unui anumit
component chimic (n cazul de fa, lactoza, care nu este unaliment
tipic pentru E. coli).
S-a constat c genele care codific cele trei proteine se afl n poziii
adiacente pe lanul ADN al E. coli, i c sunt precedate de alte cteva
secvene cu rol de reglare a exprimrii. Acest ansamblu de gene,
implicate toate n exprimarea unei proteine (sau a unui complex de
proteine care se exprim simultan), se numete operon. n cazul
prezentat aici, al operonului pentru b-galactozidaz, operonul de
numete lac operon. Dm mai jos reprezentarea sa schematic:
p r p o -galactozidaza permeaza transacetilaza

Ultimele trei secvene codific cele trei proteine despre care am vorbit.
Blocurile care preced aceast zon sunt:
p promotor (prezent, aa cum se vede din schem, n dou puncte
ale operonului) direcioneaz ARN polimeraza n poziia corect
pentru nceperea transcripiei
r gena represor
o operator
Dac mediul n care triete bacteria nu conine lactoz, exprimarea
celor trei enzime nu este necesar i ar consuma inutil energia
bacteriei. n aceast situaie primul promotor genereaz exprimarea
genei represoare, ducnd la sintetizarea unei proteine numit
37

represor. Aceasta are afinitate pentru zona celui de-al doilea operator
din cadrul operonului, care precede genele enzimelor. Odat
represorul fixat pe zona operatorului, el mpiedic ataarea ARN
polimerazei n acest punct i deci exprimarea enzimelor.
Dac n mediu exist lactoz, aceasta se fixeaz pe proteina represor
i i afecteaz conformaia astfel nct aceasta nu mai are afinitate
pentru zona operatorului. Astfel, ARN polimeraza este liber s se
ataeze pe cel de-al doilea promotor i s nceap generarea ARNm
(care este unul singur pentru toate cele trei enzime).
Exist anumite substane sintetice care pot pcli sistemul, n sensul
c se poate declana artificial exprimarea unei anumite gene. Aceste
substane poart numele de inductori, i au proprietatea de a scdea
afinitatea represorului pentru ADN. n cazul lac operonului, un
promotor foarte mult utilizat n laborator este izopropiltiogalactoza
(prescurtat IPTG):
HO

HO
H

O
S

OH

HO

H
H

Controlul exprimrii proteinelor n celulele eucariote este mult mai

complex.

38