INTRODUCERE

In ultimele deceni, insamantarea artificiala a vacilor a permis obtinerea unui progres

genetic foarte rapid. Pana acum 15-20 de ani, progresul genetic se realiza prin contriubtia
taurilor, de la care se obtin foarte multi descendenti intr-un an, iar contributia femelelor era
limitata, deoarece acestea produc un singur descendent pe an.
Ameliorarea produciei animale a beneficiat n mod tradiional de progresele realizate n
mai multe domenii: selecia geneticii, controlul reproduciei, vaccinarea, echilibrul raiilor
alimentare. Pentru perfecionarea continu a procesului de reproducere n ultimele 2-3 decenii,
att pe plan mondial ct i n ara noastr, se aplic cu succes biotehnologia transferului de
embrioni. Transferul de embrioni este o metod modern de intensivizare a reproduciei care
const n a recolta, dup superovulare i fecundaie, embrioni din aparatul genital al femelei
donatoare i a-i transfera n aparatul genital ale uneia sau mai multor femele receptoare unde
urmeaz ca acetia s se dezvolte.
Prin acest procedeu, gradul de utilizare al femelelor de mare valoare zootehnic crete
considerabil, numrul de produi care pot fi obinui n aceeai perioad de la o femel crescnd
foarte mult. Biotehnologia transferului de embrioni presupune cunoatere a proceselor
fiziologice intime legate de ovulaie, particularitile ciclului sexual al femelelor i evoluia
zigotului n primele zile de la fecundaie.

TRANSFERUL DE EMBRIONI LA BOVINE

La bovine, transferul de embrioni a devenit o biotehnologie de reproducie larg rspndit
n lume. Tehnicile de lucru sunt foarte bine stpnite, astfel nct aceast modern biotehnologie
poate fi extins la aproape toate fermele de creterea vacilor din lume. Astfel, n Europa se ob in
anual circa 100000 de produi prin transfer de embrioni, iar pe plan mondial circa 300000 de
produi, extinderea biotehnologiei fiind limitat de costurile destul de ridicate. Rezultatele
transferului de embrioni la bovine sunt redate n tabelul de mai jos.
Tabelul 1
Continent

Africa
America
de Nord
America
de Sud
Asia
Europa
Oceania
Total

Situaia transferului de embrioni la bovine, n 1996 (dup IETS*)

Nr. vaci
Embrioni
Numr embrioni transferai
superovulat transferabil
Proaspei
Congelai
Total
e
i
2321
17732
6418
3722
10140
41601
228242
94887
7431
169201

% din
total
2.5
41

6375

37922

36309

13552

49861

12

11482
24133
2398
88310

53364
129095
11520
477857

12268
58666
4346
212894

51851
52655
4008
200102

64119
111321
8354
412996

15.5
27
2
100

Sursa: *International Embryo Transfer Society

Transferul de embrioni constituie, totodat, baza unei noi generaii de biotehnici, care
deriv din aceasta sau i sunt asociate, cum ar fi: bisecia embrionilor, sexajul, fecunda ia ,,in
vitro, clonarea, transferul de gene.
Transferul de embrioni presupune parcurgerea urmtoarelor etape
selecia i pregtirea vacilor donatoare ;
selecia i pregtirea vacilor primitoare (receptoare);
sincronizarea estrului i ovulaiei la vacile donatoare i
primitoare;
inducerea poliovulaiei i nsmnarea artificial a vacilor
donatoare;
recoltarea embrionilor;
conservarea embrionilor;
transferul embrionilor.

Figura 1
transferului de

Etapele
embrioni

Selecia i pregtirea vacilor donatoare

Vacile donatoare de embrioni trebuie s ntruneasc la cel mai nalt nivel caracterele
zootehnice care intereseaz. De aceea, cnd se face selecia donatoarelor, se are n vedere
evaluarea urmtoarelor criterii: performana reproductiv, superioritatea genetic i valoarea
produsului obinut prin transfer embrionar.
Vaca donatoare va fi mai performant reproductiv atunci cnd vrsta se situeaz ntre 3 i
10 ani, a nscut anual cte un viel, a rmas gestant n maxim dou cicluri sexuale, ciclurile de
clduri au o succesiune fiziologic i nu a avut antecedente ginecologice (distocii, reten ii
placentare, infecii genitale etc.). Practic, criteriile care se au n vedere sunt: o stare ginecologic
perfect, intervalul dintre parturiie i primul estru s fie mai mic de 60 de zile, intervalul
parturiie- nsmnarea fecund s fie mai redus de 80 zile, iar indicele de gestaie s fie mai
mic de 1,5.
Superioritatea genetic const ntr-un ritm superior de cretere, nainte i dup nrcare i
un randament ridicat la sacrificare. n cazul vacilor de lapte, nsu irile cu heritabilitate ridicat se
refer la producia de lapte, procentul de grsime din lapte i conformaia corporal. Vacile
donatoare trebuie s fie sntoase, ele suportnd mai multe intervenii de supraovulare i
recoltare de embrioni. O atenie deosebit trebuie s se acorde alimenta iei raionale a acestei
categorii de vaci. Pentru vacile de carne, necesarul de hran minim variaz cu greutatea
corporal a femelei, cu stadiul gestaiei, cu stadiul i nivelul lactaiei. Alimentaie pentru gesta ie
i lactaie nu este necesar pentru vacile donatoare, ns trebuie s fie inclus n raia de hran a
primitoarelor, dup instalarea gestaiei. De regul, vacile donatoare de embrioni sunt grupate
dup mrime i/sau necesiti nutriionale pentru care se ntocmesc de nutriioniti, raii ct mai
complete care s asigure necesarul de hran zilnic pentru fiecare grup. Vacile donatoare dup
supraovulare, vor fi nsmnate artificial cu material seminal provenit de la cei mai valoro i
tauri. nsmnarea artificial se face n perioada optim, n vederea asigurrii unui nivel ridicat
de fecunditate, evitndu-se infectarea tractusului genital al femelei donatoare etc.
4

Selecia i pregtirea vacilor primitoare (receptoare)

Vacile receptoare de embrioni trebuie s fie sntoase, fr afeciuni ginecologice, s aib
aceeai talie cu donatoarele, s fie apte s nasc descendeni cu aceeai greutate la natere ca
donatoarele, avndu-se n vedere c gestaia constituie un fenomen morfo-fiziologic complex ce
presupune eforturi suplimentare deosebite din partea organismului matern. Cele mai bune
rezultate se obin atunci cnd transferul de embrioni se face la tineretul femel n vrst de 18-20
de luni.
Sincronizarea estrului i ovulaiei la vacile donatoare i primitoare
Sincronizarea ciclului sexual la vacile donatoare i receptoare de embrioni se poate
realiza pe cale natural sau medicamentoas. n cazul sincronizrii femelelor prin mijloace
naturale se urmresc, n lotul receptoarelor femelele care n mod spontan manifest estrul n
acelai timp cu donatoarele. Principalul dezavantaj const n fapul c sunt necesare multe
animale receptoare n ateptare.
Aceast modalitate de sincronizare s-a practicat n perioada de nceput a transferului de
embrioni, cnd s-au folosit pentru transfer embrionii proaspt recoltai. n aceast situa ie, n
aceeai unitate trebuia s fie i vaci donatoare i receptoare, iar transferul embrionilor trebuia s
se realizeze ntr-un timp relativ scurt (4-6 ore de la recoltare). Sincronizarea estrului prin
mijloace medicamentoase se bazeaz pe faptul c se urmresc succesiv dou-trei cicluri de
clduri la vacile donatoare i se stabilete durata ciclului. n acest fel se poate calcula data
apariiei ciclului care intereseaz n transferul de embrioni.
n funcie de data previzibil, se acioneaz prin tratamente hormonale asupra unui grup
de female primitoare n vederea inducerii cldurilor, sincronizate cu cldurile naturale ale
donatoarei. n acest caz se acioneaz asupra donatoarei numai n ceea ce privete inducerea
poliovulaiei. Sincronizarea medicamentoas a ciclului estral al femelelor donatoare i receptoare
de embrioni se realizeaz pe dou ci: blocarea eliberrii hormonilor gonadotropi sau prin
inducerea luteolizei. Prima cale presupune folosirea progesteronului, sau a progestinelor sintetice
care prin retroaciune i exercit efectul negative asupra hipotalamusului, diminund nivelul
hormonilor gonadotropi.
Inducerea poliovulaiei i nsmnarea artificial a vacilor donatoare
Provocarea eliberrii concomitente la aceeai perioad de clduri a unui numr sporit de
ovocite dect cel caracteristic speciei se numete poliovulaie (supraovulaie, superovulaie).
Coordonarea neurohormonal a dezvoltrii i maturrii foliculilor ovarieni ca i a ovula iei sunt
cunoscute pn n cele mai mici detalii, ceea ce a permiscercettorilor experimentarea unei serii
de scheme de tratamente hormonale care s induc poliovulaia. Dintre multiplele scheme de
tratament experimentate, practica zootehnic a reinut pe cele mai simple i mai eficiente.
Tratamentele actuale aplicabile in vitro se sprijin pe cunoaterea mecanismelor
foliculogenezei, a efectului tonic al hormonilor gonadotropi (FSH, LH) care intervin ndeosebi n
ultima faz a creterii i maturrii foliculare. Potenialul ovarian de foliculi teriari (cu antrum)
rmne relativ constant (ns variabil cu individul) de la vrsta de dou luni pn la 12 ani.
Fiziologic, la vac, un singur folicul ajunge la maturitate n preajma ovula iei, n timp ce,
n timpul unui ciclu sexual, 10-20 de foliculi degenereaz. Injecia unui hormon cu activitate de

FSH mpiedic atrezia unor foliculi i stimuleaz dezvoltarea i maturarea simultan a mai
multor foliculi teriari, n cursul aceluiai ciclu estral.
n prezent, dou scheme clasice de tratament poliovulator sunt aplicate, ambele bazate pe
efectul foliculo stimulant al hormonilor gonadotropi: serul gonadotrop de iap gestant, liofilizat
i standardizat - PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) denumit i Ecvin Chorionic
Gonadotropin (ECG), produs de celulele corionice ale iepei gestante i hormonul de stimulare
folicular (FSH) extras din hipofiza anterioar. PMSG se extrage din serul sanguin al iepei
gestante i are o dubl activitate: de tip FSH i LH, raportul FSH/LH variaz de la 1/1 la 1/5
(Saumande J., 1987). Perioada de njumtire destul de lung - 120 ore - a acestui hormon
determin o uurin n folosire, o singur injecie de 2000-2500 U.I. i.m. fiind eficient n
provocarea poliovulaiei. La dou- trei zile de la injectarea PMSG se administreaz i.m. o doz
de 500-750 g prostaglandin F2, cldurile aprnd la circa 48-60 de ore de la injectarea
prostaglandinei. Folosirea PMSG antreneaz i unele efecte negative traduse prin creterea
folicular i secreia ridicat de estradiol i dup descrcarea preovulatorie de LH. Acest efect
negativ poate fi contracarat prin injectarea i.v. a unui anticorp anti PMSG concomitent cu prima
sau cea de a doua nsmnare artificial (de ex. Neutra PMSG intervet). Fecundarea ovocitelor
se face, de regul, prin nsmnarea artificial a vacilor la un interval de 12 ore de la nceputul
estrului cu repetare la 8-12 ore interval.
FSH se prepar din extractele purificate parial, provenite din hipofiza mamiferelor - n
principal de suine - care conine FSH i LH. Coninutul n cei doi hormoni i raportul dintre
acetia variaz cu lotul. Perioada de njumtire foarte scurt (circa 70 minute a acestui hormone
necesit injectarea lui bicotidian timp de 4 zile, n vederea meninerii unui nivel sanguin suficient
de ridicat. Funcie de preparatul comercial, raportul dintre FSH i LH, de regul variaz de la 1 la
0,5. Dozele totale care se administreaz, n vederea producerii poliovulaiei, variaz de la 28 mg
la vielele de lapte, la 40 mg pentru vaci, injeciile fcndu-se n ritm descresctor, intramuscular
sau subcutanat. Preparatele care conin aceti hormoni au denumiri care difer cu unitatea
productoare: FSH-p, Stimufol, Ovaset, Follitropin, Superov, Ovagen, Pluset etc.
Ca i cealalt schem de tratament, injectarea prostaglandinei F2, n doz de 500-750 g
se face la 48-72 de ore de la nceperea tratamentului, estrul aprnd la circa 50-60 ore de la
injectarea prostaglandinei. Fecundarea ovocitelor se face prin nsmnarea
artificial a femelelor supraovulate de dou ori, la 12 i 24 ore de la apariia estrului.
Scheme de tratament pentru inducerea poliovulaiei
Preparatele medicamentoase care conin hormoni gonadotropi sunt injectate n faza
luteal a unui ciclu natural sau indus, cel mai frecvent ntre ziua a 9-a i a 13-a. Dou zile dup
injecia de PMSG sau concomitent cu a 5-a injecie de FSH, se injecteaz un analog de PGF2
(de ex. 0,5-1 mg Cloprostenol) care are efect luteolitic permind ovulaiile.

Figura 2 Schema 1 de inducere a poliovulaiei la vacile donatoare de embrioni

Figura 3 Schema 2 de inducere a poliovulaiei la vacile donatoare de embrioni

Figura 4 Schema 3 de inducere a poliovulaiei la vacile donatoare de embrioni

Figura 5 Schema 4 de inducere a poliovulaiei la vacile donatoare de embrioni

7

Prin provocarea poliovulaiei se pot obine de circa 8-10 ori mai muli embrioni, dect n
cazul recuperrii unui singur ou de la femelele nesupuse tratamentului poliovulator.
n ceea ce privete repetarea tratamentelor de superovulaie la aceeai donatoare, s-a
constatat c tratamentele pot fi repetate pe intervalul a mai multor luni sau a mai multor ani.
Producia total de embrioni de la aceeai donatoare depinde de aceasta i de ritmul de colectare.
Este necesar un interval de cel puin 60 de zile dup ftare n vederea nceperii
tratamentului poliovulator. Unii cercettori constat o reducere a numrului de embrioni
transferabili o dat cu repetarea tratamentului cu PMSG, fapt ce se explic prin formarea n
organismul femelei tratate a anticorpilor anti-PMSG i reducerea categoriilor de foliculi sensibili
la stimulare. Pentru a se evita acest efect negativ, repetarea tratamentului trebuie s se fac la un
interval de 54-60 de zile i s se intercaleze tratamentele pe baz de PMSG i FSH-p. Rezultatele
tratamentelor de superovulare sunt influenate de vrsta femelelor, ras, mascul, sezon, nivelul
produciei de lapte, starea general, etc. De regul, vielele produc un embrion viabil mai puin
dect vacile adulte.

Figura 6 - Ovare superovulate ale bovinei

Fecundarea ovocitelor
Ovocitele sunt fecundate n urma nsmnrii naturale sau artificiale. De regul, se
efectueaz dou nsmnri artificiale la interval de 12-24 de ore de la nceputul cldurilor
observate clinic sau, sistematic, dup 56 i 72 de ore de la injecia cu PGF2, sau dup 36 i 48
de ore de la retragerea implantelor sau pesariilor.
Recoltarea embrionilor
Embrionii sunt colectai atunci cnd se gsesc n cornul uterin, dup ieirea lor din
oviduct (ntre zilele 4-5). Din motive sanitare i de congelare se prefer colectarea embrionilor
nc inclui n zona lor pelucid (ies n a 9-a zi). Cel mai frecvent, colectarea se realizeaz ntre
8

zilele 6-8 dup fecundaie, de regul n ziua a 7-a. Recoltarea embrionilor se face chirurgical i
nechirurgical.
Mult timp, metoda chirurgical a fost singura utilizat. Tehnica operatorie presupunea
parcurgerea a dou etape: laparotomia, cu exteriorizarea aparatului genital n plag i recoltarea
propriu-zis a embrionilor prin splarea cu un lichid cu o compoziie special, a oviductelor
(dup un interval de timp mai mic de 3 zile dup nsmnare) sau a coarnelor uterine (dup un
interval de timp mai mare de 4 zile de la nsmn are). n prezent, metoda chirurgical de
recuperare a embrionilor la vac este abandonat, datorit inconvenientelor pe care le prezint.
Astzi, este generalizat metoda nechirurgical de prelevare a embrionilor, a crei principiu
const n splarea coarnelor uterine cu un mediu special preparat, splare care se realizeaz n
condiii de asepsie n a 7-a zi de la nsmnare. Tehnica nechirurgical de colectare a
embrionilor s-a perfecionat continuu, firme specializate produc pe scar industrial mediul de
recoltare, congelare, decongelare i ntreaga aparatur necesar recoltrii i transferului
embrionilor.
Tehnicile nechirurgicale de recoltare a embrionilor presupun mai multe operaii:
contenia femelei, anestezia, vidarea rectului, toaleta vulvei i a regiunii perivulvare,
identificarea prezenei corpilor galbeni pe ovar, introducerea lichidului de splare n lumenul
coarnelor uterine, splarea acestora, recuperarea lichidului mpreun cu embrionii, identificarea
i recuperarea embrionilor din lichidul recuperat i supus decantrii i aprecierea morfologic a
acestora. n condiii de ferm, recoltarea embrionilor se face la locul unde se gse te femela
donatoare, dup ce n prealabil, vecinele acesteia au fost ndeprtate. Femela se contenioneaz
adecvat, astfel nct s-i fie limitate micrile, trecerea sondei prin canalul cervical care este
nchis, provocnd dureri animalului i implicit, reacie de aprare. Pentru a suprima durerea, se
practic anestezia epidural cu 4-6 ml procain 2% sau cu 10 ml ludocain 1%, care blocheaz
nervii coccidieni i ultimele perechi de nervi sacrali (S3, S4, S5). Acul se introduce ntre prima i
a doua vertebr coccigian sau ntre ultima vertebr sacral i prima vertebr coccigian,
anestezia instalndu-se dup circa 10-15 minute i
dureaz n jur de 90 de minute, zonele insensibilizate fiind: coada, anusul, rectul, vulva, vaginul
i uterul.
Se introduce, cu precauiile de rigoare, mna n rect, acesta se videaz de con inut, apoi
se apreciaz rspunsul femelei la tratamentul poliovulator, palpndu-se cu atenie ambele ovare
i numrdu-se corpii galbeni. n cazul n care rspunsul la tratamentul de superovulare este
pozitiv, se procedeaz cu precauie la introducerea cateterului de tip Folley cu dou sau trei ci,
prin conductul cervical pn n cornul uterin. Pentru rigidizarea cateterului, se introduce pe
lumenul acestuia un mandren (tij metalic), care se menine pn se ajunge n lumenul cornului
uterin, apoi se retrage. Cateterul este introdus circa 5-8 cm de la bifurca ia coarnelor uterine, pe
unul dintre acestea, apoi se introduce de la exterior, cu seringa, 8-15 ml de aer n scopul fixrii
cateterului i pentru a mpiedica refularea din cervix a lichidului de splare.
Vasul din sticl, ce conine lichidul de splare se suspend la 1,5 m de la sol i, prin
cdere, acesta ajunge prin calea de admisie a cateterului n coarnele uterine. Irigarea acestora se
face continuu, calea de evacuare a lichidului este conectat, printr-un tub de plastic, la vasul de
colectare a mediului recuperat (de splare). Recuperarea lichidului de splare se face prin calea
de admisie (n cazul cateterului cu dou ci la care s-a adaptat o pies n forma literei y) prevzut
cu canal de admisie i evacuare al lichidului, ramura de evacuare a lichidului fiind conectat la
un filtru de colectare a crui orificii au un diametru de 75 m, care are rolul de re inere a
embrionilor, lichidul ce traverseaz filtrul fiind colectat ntr-un recipient situat sub filtru. Mediul
9

folosit la splarea unui corn uterin se folosete la splarea, n acelai mod, a celui de-al doilea
corn uterin. Cantitatea de mediu care se folosete pentru splarea unui corn uterin este de 300500 ml, efectundu-se irigri repetate i un masaj transrectal permanent al cornului uterin
perfuzat. Exist diverse sonde de recuperare a embrionilor, imaginate de diveri cercettori, care
se bazeaz pe acelai principiu constructive. ntre momentul recuperrii embrionilor i cel al
inoculri lor n uterul receptoarelor, zigoii trebuie s fie meninui n via n condiii speciale i
s fie manipulai n cele mai bune condiii tehnice i igienice. Compoziia mediilor de recoltare i
cultivare a embrionilor s-a modificat frecvent n decursul timpului, pe msur ce cuno tin ele n
domeniu au avansat i pe baza multiplelor experiene ntreprinse. n ultimii ani s-a generalizat
folosirea unei soluii tampon fosfat - PBS (Fosfat bufferet salin) pentru splarea coarnelor
uterine i pentru pstrarea embrionilor recuperai. Acest lichid are un pH de 7,2, o presiune
osmotic de 290 miliosmoli i conine multe sruri minerale, glucoz i protein (albumin
bovin seric, 2-4 g/l, sau ser de viel fetal decomplementat 10%
Tabel 2
Compoziia mediului PBS (Fosfat bufferet salin)
Specificare
U.M.
Cantitatea
Ap deionizat
ml
1000.0
Clorur de sodium
g
8.00
Piruvat de sodium
g
0.036
Clorur de potasiu
g
0.2
Na2HPO4
g
1.15
KH2PO4
g
0.2
Glucoz (D+) anhidr
g
1.0
MgCl2-6H2O
g
0.1
CaCl2-2 H2O
g
0.1
Penicilin
U.I.
100000
Streptomicin
mg
50
Albumin bovin liofilizat
g
2-4
Sursa: *International Embryo Transfer Society

Toate mediile, soluiile, serurile, enzimele i substanele crioprotectoare care vin n

contact cu embrionii trebuie s fie sterile. Tot materialul care nu se arunc (sonde colectoare,
filtre, recipieni din sticl, sonde de transfer, etc.) care necesit a fi sterilizate, se spal cu o
soluie de detergent netoxic, se cltete n ap distilat, se usuc i se nvelete n hrtie n
vederea sterilizrii. Alegerea metodei de sterilizare depinde de natura materialului (cldur
uscat, cldur umed, substane antiseptice, vapori de formol etc.). Rezultatele recuperrii
embrionilor depind n cea mai mare msur de abilitatea i antrenamentul operatorului. Propor ia
embrionilor recuperai, oscileaz n medie, ntre 60-70% comparativ cu numrul de corpi galbeni
identificai pe ambele ovare. Dup colectarea embrionilor se injecteaz donatoarei o doz de
PGF2, care are rolul de a liza corpii galbeni, evitndu-se astfel gestaia multipl.
Cutarea i aprecierea calitii embrionilor
Dup prelevarea embrionilor, vasul cu lichidul recoltat (100-150 ml) este lsat timp de
20-30 minute pentru decantare. Se ndeprteaz supernatantul iar stratul inferior n care se
regsesc i embrionii recoltai, se transfer ntr-o plac Petri cadrilat cu diametrul de 10 cm sau
se agit n mediu din filtrul colector i se toarn n placa Petri. Recipientele de recoltare a
mediului ca i filtrul folosit la recuperarea embrionilor se cltesc de dou trei ori. Examenul
10

embrionilor n lichidul recoltat trebuie s se fac n cele mai bune condiii de asepsie, curenie i
la o temperatur constant a laboratorului (20o-25o). Embrionii bovinelor au un diametru de
150-190 microni, zona pelucid avnd o grosime de 12-15 m. Pentru identificarea embrionilor,
se examineaz cu mare atenie, la o stereolup (grosisment 30-60 uneori 80-200) fiecare ptrat de
la nivelul plcii Petri, ntr-o anumit ordine, pentru a se evita omiterea vreunuia. Pentru
identificarea i examenul morfologic al embrionilor se folosesc microscoape inversate,
obiectivele
fiind
dispuse n partea de jos, iar
lumina proiectat prin
partea superioar

Figura 7 - Placa PETRI cadrilat folosit la cutarea embrionilor

O dat identificai, embrionii sunt transferai cu ajutorul unei seringi de aspirare, la care
s-a adaptat, printr-un tub de plastic, o micropipet, n plci Petri mai mici, cu diametrul de 5 cm
n care se gsete mediul de splare la care s-a adugat 20% albumin seric bovin (BSA).
Operaiunea se repet de 3-5 ori, embrionii fiind transferai dintr-o plcu n alta, schimbndu-se
de fiecare dat pipeta de aspirare. n cazul n care embrionii sunt destinai exportului, acetia sunt
trecui prin zece astfel de bi de splare.
Amestecul crioprotectorului cu mediul de conservare (PBS 40% BSA sau 10-20% ser
de viel fetal) provoac o cretere a presiunii osmotice. Pentru a reduce ocul osmotic, embrionii
sunt trecui succesiv i pe cte o durat de 5 - 10 minute n dou-trei bi cu mediu de conservare
cu o concentraie crescnd n crioprotector: glicerol 0,7 M i apoi 1,4 M, DMSO sau etilen
glicol 0,5 M, 1,0 M apoi 1,5 M. Aceast trecere a embrionilor n mediul de conservare cu adaos
de crioprotector se face la o temperatur cuprins ntre+20oC i +30oC. Dup ultima baie, adic
n momentul n care este atins concentraia final n crioprotector (de exemplu: etilen-glicol 1,5
M), embrionii sunt condiionai pentru congelare, fie n fiole de sticl de 1,2 ml, fie n paiete de
polipropilen de 0,25 ml (de tip paiete fine folosite la conservarea spermei). Paietele sunt
identificate individual. Exist jancuri de identificare ce permit pe de o parte nchiderea ermetic
a paietei i care poart (sunt inscripionate) toate informaiile necesare. Pentru fiecare paiet
trebuie s se menioneze: identificarea donatoarei, rasa, data colectrii, numrul de embrioni,
centrul de producie.
Procedura de umplere a paietelor comport trei compartimente lichide separate de bulele
de aer. Aceasta limiteaz orice risc de pierdere a embrionilor n momentul manipulrilor
efectuate cu umplerea sau evacuarea coninutului paietelor. Evaluarea corect a embrionilor
depinde de autor, nivel de instruire, experien, echipament etc. Dup criteriile men ionate
embrionii sunt ncadrai n mai multe categorii calitative: excelent, bun, acceptabil, inferior,
degenerat, ovocit nefecundat. n cursul examenului sub stereolup la un grosisment mai mic de
11

80, embrionul este ntors cu ajutorul unei micropipete de sticl n vederea aprecierii morfologiei
sale din toate unghiurile, unele imperfeciuni putnd scpa observaiei n anumite poziii ale
embrionului. Zona pelucid garanteaz protecia embrionului, motiv pentru care ea trebuie s fie
perfect integr, fr fisuri i perfect sferic. Gradul de dezvoltare embrionar n raport cu ziua
colectrii este principalul factor luat n considerare. Embrionii care prezint o ntrziere n
dezvoltare mai mare de 48 de ore sunt eliminai. Embrionii colectai n a aptea zi de la debutul
estrului trebuie s se gseasc n stadiul de morul compact/blastocist. Embrionii care con in 16
celule sau mai puin, nu se rein pentru transfer sau congelare, fiind ntr-o ntrziere mare a
dezvoltrii. n stadiul de morul compact, limitele celulare sunt mai puin distincte ntruct
blastomerele sunt strns legate ntre ele i dau un aspect de mure. Prezen a ctorva celule
detaate, n spaiul perivitelin nu constituie un motiv de eliminare ntruct majoritatea
blastomerelor formeaz o mas sferic fr opacitate marcant. n stadiul de blastocist, diversele
structuri (blastocel, butonul embrionar, trofoblastul) trebuie s fie vizibile i s prezinte contururi
bine delimitate. Prezena blastomerelor n spaiul perivitelin i a unor granula ii la suprafa a
celulelor pot fi observate. Aceste anomalii asociate unei ntrzieri n dezvoltare, absen ei
contururilor celulare sau unei opaciti marcante ale blastomerelor constituie criteriu de
eliminare a embrionilor. Embrionii a cror aspect este ndoielnic sunt conservai una-dou ore
apoi vor fi examinai din nou.
Excelent este considerat embrionul perfect ca aspect morfologic i corespunztor vrstei .
Embrionul bun calitativ prezint unele imperfeciuni: zona pelucid oval, dimensiuni mai mici
ale embrionului, ntrziere n dezvoltare cu o zi, puine cellule extrudate, mici. Embrionul
acceptabil este cel care este bine conturat, ns prezint unele anormaliti: un numr moderat de
celule excluse, dimensiuni mai mici, unele degenerri i ntrzierea cu o zi. Embrionul inferior
prezint diverse degradri considerabile: celule veziculate, variabilitate mare n ceea ce prive te
dimensiunile celulelor, ntrzierea n dezvoltare cu dou zile, absena compactrii. Embrionul
degenerat prezint degenerri evidente, iar ovocitele nefecundate sunt cele care prezint
structur simpl a gametului femel, fr celulele rezultate din segmentare (Seidel F.G. i
colab.,1991).

Figura 8 -

Embrioni buni pentru congelare

Conservarea i deconservarea embrionilor

Embrionii pot fi conservai cteva ore in vitro la 20 oC ntr-un mediu de conservare:
PBS adiionat cu 4 g/l albumin seric bovin, sau cu 10% ser de viel fetal decomplementat. n
acest mediu, embrionii sunt meninui pn cnd sunt transferai la receptoare. n cazul n care
transferul nu se realizeaz n 6-8 ore de la recoltare, se recomand congelarea prin refrigerare a
embrionilor, la o temperatur de 0o-4oC ntr-un mediu de conservare identic. n acest fel
embrionii pot fi conservai una-dou zile fr ca viabilitatea s fie afectat. Conservarea de lung
durat a embrionilor congelarea rmne cea mai avantajoas metod de meninere pentru un
12

interval de timp practic nelimitat a viabilitii embrionilor. Pentru aceasta, embrionii, trebuie s
fie meninui n stare solid, n azot lichid, la temperatura de circa -196 oC. La temperaturi mai
sczute de -100oC, metabolismul celular este complet blocat, singura problem mai dificil
constnd n atingerea acestor temperaturi fr a omor embrionii. n timpul congelrii, intervin
doi factori letali pentru embrioni: formarea gheii intracelulare i concentraia salin ridicat.
Pentru a prentmpina efectul negativ al acestor doi factori, metoda de rcire const n
deshidratarea parial a celulelor i evitarea ocului produs de concentraiile ridicate n sruri
prin utilizarea unui Crioprotector, n general glicerol cu o concentraie de 1,5 M (sau 10% n
volum) n mediul de congelare.
Ca ageni crioprotectori se mai pot folosi: dimetilsulfoxid (DMSO), etilenglicol, glicerol,
propilen-glicol. n prezent sunt numeroase aparate programabile (freezere) care permit realizarea
unei curbe optimale de rcire. Substanele crioprotectoare (n general polialcooli) sunt capabile
s ptrund uor n celule printr-o simpl difuziune (osmoz), ntrziind formarea cristalelor de
ghea prin coborrea punctului de nghe. Totodat, substanele criopro-tectoare limiteaz
efectele negative ale concentraiei saline ridicate, nlocuind o parte din apa intracelular atras
prin creterea presiunii osmotice extracelulare. Ali compui pot avea un rol protector fa de
membranele celulare (hidrai de carbon, polivinilpirolidon)

Figura 9 - Model de freezer

Viteza de coborre a temperaturii are importan mare n protejarea viabilitii
embrionilor. Mediul care conine embrionii (extracelular) este mai bogat n ap dect mediul
celular. Prin coborrea temperaturii, primele cristale de ghea se produc mai nti n mediul
extracelular, ceea ce va antrena o ridicare a concentraiei n soluie a fraciunii necristalizate.
Aceast concentraie salin ridicat va provoca ieirea unei pri din apa celular,
reducnd n acest fel formarea gheii intracelulare. Dac ritmul de rcire este prea rapid, apa
intracelular nu poate iei n cantitate suficient, cristalele de ghea se formeaz n cantitate
mare n interiorul celulelor i aceste cristale i mresc talia lor n timpul congelrii i
decongelrii distrugnd structurile celulare. n cazul n care ritmul de rcire este lent,
deshidratarea progresiv a celulelor antreneaz o cretere important a concentraiei n electrolii,
n mediul celular, modificnd proprietile fizico-chimice (efectul soluiei), consecin a fiind
totdeauna pierderea viabilitii celulelor.

13

Astfel, integritatea celulelor vii dup congelare este strns legat de dinamica apei
intracelulare n timpul rcirii i deci de viteza de congelare. n cazul embrionilor, ritmul de rcire
trebuie s corespund pentru toate tipurile de celule care-l compun. Rezultatele cercetrilor
ntreprinse pentru clarificarea aspectelor referitoare la ritmul de congelare confirm faptul c
acesta trebuie s se desfoare n dou etape diferite: o congelare lent, n dou trepte: la nceput
4oC/min pn la 6 7oC i 0,3-0,6oC/min ntre 7oC i 30 35oC, apoi o congelare rapid
(brusc) de la -35oC pn la temperatura de pstrare -196oC.
Timpul de ateptare al embrionilor din momentul recoltrii i pn la nceperea congelrii, nu
trebuie s depeasc dou-trei ore. Protocolul de congelare a embrionilor bovini prevede
urmtoarele:
alegerea embrionilor - calitate excelent sau bun;
timp de la recoltare pn la nceperea congelrii: dou-trei ore;
introducerea embrionilor n mediul de congelare la temperatura laboratorului (20oC);
introducerea embrionilor n paiete identificate (mediu, bul de aer, embrioni +mediu, bul

de aer, mediu);
rcirea pn la -6oC sau -7oC cu o vitez de 4oC/minut;
inducerea cristalizrii (palier 5-10 minute);
rcirea pn la 30oC sau 35oC cu o vitez de 0,3 - 0,6oC/minut;
introducerea paietelor ce conin embrionii, direct n azot lichid i stocarea lor (-196oC).

Paietele se vor pstra n permanen n azot lichid pn n momentul transferului la femelele

receptoare. Durata stocrii embrionilor n azot lichid nu influeneaz supravieuirea ulterioar a
acestora.
Decongelarea embrionilor i nlturarea crioprotectorului
Embrionii congelai la -35oC nu sunt dect parial deshidratai, o anumit cantitate de
ghea se formeaz inevitabil n celule, n momentul imersiei n azot lichid (-196 oC). Pentru a se
evita ca prin decongelare s se produc o cretere a acestor mici cristale de ghea care s
distrug celulele, decongelarea trebuie s se fac n timp, ct mai repede posibil (circa
2000oC/minut). Pentru aceasta, paietele se scot repede din containerul cu azot lichid i se
introduc direct ntr-o baie de ap la 37oC, unde se menin circa 30 de secunde. Imediat dup
decongelare, nlturarea rapid a crioprotectorului este indispensabil supravieuirii embrionilor.
Totui, celulele care conin o concentraie ridicat de crioprotector nu trebuie s fie introduse
direct ntr-un mediu izotonic, ntruct diferena mare de presiune osmotic va provoca
ptrunderea prea rapid a apei n celul, ceea ce va risca s explodeze. De aceea, este necesar o
ndeprtare progresiv a crioprotectorului astfel nct ieirea acestuia i ptrunderea apei n
celul s fie compatibile cu permeabilitatea membranei celulare. Pentru aceasta sunt mai multe
metode care realizeaz o rehidratare lent a celulelor embrionare.
Diluia crioprotectorului pe etape const n trecerea succesiv a embrionilor prin bi cu
concentraii descrescnde n crioprotector (de ex: etilen glicol 1,5 M, apoi 1,0 M, 0,5 M i 0 M).
Meninerea embrionilor n fiecare baie este de 5-10 minute. n acest caz concentra ia mediului n
crioprotector este invers celei din perioada congelrii. Dup nlturarea lichidului de rcire,
calitatea embrionilor poate fi apreciat printr-un examen morfologic efectuat cu ajutorul unei
stereolupe (grosisment x80). n urma examenului morfologic, de regul sunt eliminai ca
necorespunztori calitativ, 10-30% dintre embrionii decongelai. Diluia crioprotectorului prin
14

folosirea unui mediu care conine sucroz are la baz accelerarea ieirii acestuia din celule.
Molecula de sucroz avnd o greutate molecular mare (344) nu ptrunde n cellule prin simpl
difuziune; prezena sa n mediu creaz o mrire a presiunii osmotice din mediul extracelular,
ceea ce va determina o difuziune accelerat a crioprotectorului din celule. Pentru aceasta,
embrionii decongelai sunt introdui direct ntr-o soluie de PBS care conine 0,25- 0,5 M
sucroz, apoi n dou-trei bi succesive de PBS nainte de examinare i transfer. Se poate realiza
retragerea crioprotectorului prin intermediul sucrozei, direct n interiorul paietei. Pentru aceasta,
n momentul introducerii embrionilor n paiete pentru congelare, alternan a diverselor medii din
paiet este: la mijloc embrionul n mediu PBS+ etilenglicol 1,5 M, nconjurat de bule de aer i
apoi la exterior PBS+sucroz 0,25 M. Dup decongelare paieta se scutur n vederea amestecrii
mediilor pe baz de etilen glicol i cele pe baz de manoz, ceea ce va permite difuzia
crioprotectorului n afara celulei n cteva minute. Embrionii sunt transfera i fr selec ie
prealabil, mpreun cu coninutul paietei direct n uterul femelelor receptoare. Aceast metod
mai necesit unele verificri.
Nivelul supravieuirii embrionilor dup decongelare este condiionat de mai muli factori:
stadiul de dezvoltare a embrionilor, calitatea embrionilor nainte de congelare, femela donatoare
etc.
Embrionii transferai n stadiul de morul realizeaz o proporie de supravie uire in
vitro mai redus (64%), comparativ cu cei transferai n stadiul de blastocist (81%). Congelarea
nu trebuie aplicat dect embrionilor de bun calitate, caz n care procentul de supravieuire dup
transfer fiind uor inferior (10%) fa de nivelul supravieuirii obinut dup transfer direct, fr
congelare. Dac embrionul este de calitate mijlocie sau mediocr naintea congelrii, pierderile
de viabilitate vor fi amplificate prin crioconservare i nivelul de supravieuire va fi mediocru.
Originea genetic a donatoarei pare a avea un rol nsemnat asupra aptitudinii embrionului de a fi
congelat. Acelai efect denumit i efectul donatoarei a fost demonstrat prin faptul c procentul
de supravieuire a embrionilor congelai n aceleai condiii poate varia de la 0 la 78% n raport
cu donatoarea. n prezent sunt testate diferite tehnici de congelare rapid a embrionilor, cu
rezultate promitoare.
Transferul embrionilor
O atenie deosebit va fi acordat seleciei femelelor receptoare, ntruct condiioneaz n
mare parte rezultatele dup transfer. Condiiile de mediu n care receptoarele sunt ntre inute
trebuie s corespund unui microclimat optim de igien i de statut sanitar. Receptoarele trebuie
s aib o activitate sexual ciclic, s fie bine dezvoltate corporal, fr afeciuni ale tractusului
genital. Alegerea receptoarelor poate porni de la viele n vrst de 18 luni cu condi ia atingerii a
cel puin 2/3 din greutatea corporal a adultului. Aprecierea curbei de cretere cu cel puin 30 de
zile naintea nceperii tratamentului sau a transferului d posibilitatea corectrii sau optimizrii
alimentaiei (dac este necesar). Transferul embrionilor se face cu foarte bune rezultate i la vaci
adulte n vrst de 3-6 ani dac funcia de reproducie s-a desfurat normal.
Examenul femelelor receptoare se completeaz cu aprecierea ultimului estru, care trebuie
s aib loc ntre parametrii fiziologici (comportament sexual, calitatea mucusului cervical, starea
de sntate a conductului vestibulo-vaginal i al orificiului vaginal al cervixului).
Pregtirea receptoarelor const ntr-o sincronizare ct mai perfect a ciclului sexual cu
cel al femelei donatoare. Se pot folosi femele receptoare, fie n clduri naturale fie n clduri
induse printr-un tratament de control al ciclurilor sexuale (vezi cele menionate anterior). O
atenie special se va acorda depistrii ciclurilor (dimineaa, prnz, seara) apoi se determin
15

momentul exact al nceputului estrului. naintea transferului propriu zis se face un examen
transrectal al ovarelor pentru a identifica corpul galben pe unul din ovare. Transferul embrionului
se va face n vrful cornului uterin adiacent ovarului pe suprafa a cruia este prezent corpul
galben. Rezultate bune s-au obinut i prin depunerea embrionului la circa 10 cm de la bifurca ia
coarnelor uterine n lumenul cornului uterin ipsilateral ovarului cu corp galben. nainte i imediat
dup transfer se va evita orice stres: vaccinri, tratamente antiparazitare, ecornri, lotizri,
tuberculinri, recoltri de snge etc. Se va evita schimbarea brusc a regimului alimentar: de
exemplu introducerea masei verzi primvara 4 sptmni dup transfer. Variaiile climatice
determin o cretere a mortalitii embrionilor dup transfer. n cazul folosirii embrionilor
proaspei, receptoarele se in ntr-un grajd curat i ct mai aproape de donatoare. n acest mod se
evit pierderile de timp i se amelioreaz factorii de reuit. Transferul propriu-zis al embrionilor
la femelele receptoare se realizeaz prin dou metode: chirurgical i nechirurgical.
Transferul chirurgical s-a aplicat n perioada de nceput i a constat n deschiderea
cavitii abdominale (pe linia alb sau n flanc), exteriorizarea cornului uterin i depunerea
embrionului pe cornul uterin corespunztor ovarului cu corp galben prin puncionarea peretelui
acestuia. Este o metod laborioas, costisitoare, traumatizant pentru femele, ceea ce a condus la
abandonarea ei.
Metoda actual care d cele mai concludente rezultate este cea nechirurgical. Aceast
metod folosete calea vagin-cervix, asemntor nsmnrii artificiale. Pentru transfer se
folosete un pistolet tip Cassou n care se introduce paieta cu embrionul deconservat sau proaspt
recoltat. Pentru a se evita contaminarea nveliului din material plastic al pistoletului Cassou pe
timpul traversrii conductului vestibulo-vaginal, se fixeaz un al doilea nveli din material
plastic care este secionat pe toat lungimea sa. Dup ce pistoletul ajunge n lumenul cervical,
acest nveli protector se retrage. Pentru a nvinge rezisteana cervixului (n aceast faz cervixul
fiind nchis) se folosesc uneori dilatatoare. La circa 10 cm de bifurca ie, pe cornul uterin
corespunztor ovarului ce conine corpul galben, se depune embrionul, asemntor nsmnrii
artificiale. Aceast metod este exclusiv folosit n prezent, progresul depinznd de
antrenamentul i obinuina operatorilor. Traversarea cervixului trebuie s se realizeze cu mare
precauie n vederea evitrii lezionrii mucoasei acestuia. n vederea relaxrii cervixului, a
evitrii contraciilor organelor genitale se efectueaz anestezia epidural cu 4-6 ml procain 2%,
sau alte preparate medicamentoase cu efect similar.

16

BIOTEHNICI DERIVATE SAU FINALIZATE PRIN TRANSFER DE EMBRIONI

Elaborarea unor tehnici care s concureze la utilizarea mai eficient la reproducie a
femelelor de cert valoare reprezint o necesitate de prim importan n creterea i ameliorarea
efectivelor de animale. Pentru perfecionarea continu a procesului de reproducie, n ultimul
timp, att pe plan mondial ct i n ara noastr, se aplic sau sunt n curs de implementare o serie
de biotehnici care contribuie la ameliorarea ntr-un ritm accelerat a efectivelor de animale i la
creterea numeric a acestora, cum sunt:
fecundaia in vitro;
bisecia embrionilor;
sexarea embrionilor;
sincronizarea estrului i ovulaiei n sezonul i contrasezonul de reproducie;
inducerea poliovulaiei (superovulaiei);
clonarea.
Fecundaia in vitro
Este o biotehnic de actualitate, prin intermediul creia procesele fiziologice de maturare
a gameilor femeli i de capacitare a spermatozoizilor, fecundaie i cultur a embrionilor pn la
stadiul transferului acestora n organismul femelelor receptoare, sunt dirijate i se produc, parial
sau total, n afara organismului femelei (in vitro) n diferite medii de cultur. Aceast
biotehnic, dei bazele teoretice i practice au fost puse cu circa 4-5 decenii mai nainte, a cptat
un interes mai deosebit n ultimele dou decenii. Cu toate preocuprile destul de intense n acest
domeniu, succesul nregistrat la mamiferele domestic este destul de limitat. Rezultate recente
referitoare la numrul de embrioni produi in vitro pe plan mondial sunt redate n tabelul
urmtor:
Tabel 3
Situaia mondial a transferului de embrioni produi in vitro
Regiunea
Embrioni proaspei
Embrioni congelai
Total embrioni
Asia
Japonia
1791
2851
4642
Europa
Frana
150
70
220
Ungaria
6
6
Irlanda
1487
97
1584
Italia
100
3050
3150
Olanda
1603
282
1885
Spania
3
3
Total
5140
6340
11490
Sursa: AETE*=Asociaia european a transferului de embrioni

La mamifere, fecundaia fiind intern, analiza intim a mecanismelor implicate n acest

proces biologic este delicat i costisitoare. Fecundaia in vitro constituie o biotehnic ce
permite studierea in vitro a interaciunilor dintre cei doi gamei sub rezerva reproducerii
artificiale a condiiilor identice existente ,,in vivo. Dup cum s-a studiat la capitolul
Fecundaie, elementele eseniale ale acestui interesant i complex proces, constau dintr-o serie
17

de interaciuni ntre cei doi gamei care, n final, conduc la unirea lor i la combinarea
genotipurilor.
Principalele secvene ale fecundaiei se refer la:
fixarea spermatozoizilor de zona pelucid, urmat de
strbaterea acestei membrane;
fuzionarea membranelor plasmatice ale celor doi gamei;
ncorporarea spermatozoidului n ooplasm i activarea
ovocitului;
singamia.
Nivelul relativ sczut de fecundaie nregistrat n perioada de nceput a aplicrii fecunda iei
in vitros-a datorat n special, folosirii unei temperaturi inadecvate acestei etape. S-a demonstrat
c temperatura central la mamifere este de 39oC ceea ce face ca nivelul procentului de
fecundaie nregistrat la incubarea gameilor la 37oC s fie extrem de sczut.
Tabel 4
Influena temperaturii asupra nivelului fecundaiei in vitro
Specia
Temperatura
Fecundaia
o
Taurine
37 C
7%
39oC
53%
Sursa: Chang i colab., Lenz i colab., cit. de Marquant i colab., 1991

Etapele fecundaiei in vitro sunt:

obinerea ovocitelor;
maturarea in vitro a ovocitelor;
capacitarea spermatozoizilor;
fecundarea i cultura in vitro;
transferul embrionilor rezultai.
Obinerea ovocitelor
Sursele posibile pentru ovocite sunt:
ovocite provenite prin puncia foliculilor maturi de la female cu estru spontan sau
superovulat, recoltate nainte sau imediat dup ovulaie;
ovocite obinute din foliculi imaturi, recoltate din ovarele femelelor sacrificate sau
ovariectomizate;
ovocite rezultate din oviducte, imediat dup ovulaie.
Prima i a treia surs de ovocite sunt limitate, deoarece numai un numr mic de foliculi se
matureaz i ovuleaz spontan, sau numai un numr relativ restrns de foliculi pot fi activa i prin
injectarea hormonilor gonadotropi. Ovocitele mature pot fi recoltate din foliculi maturi sau din
oviduct n primele 6 ore de la ovulaie, plasate ntr-un mediu Krebs-Ringer i incubate la 38oC,
umiditatea relativ de 100% i 5% atmosfer de CO2.
Ovocitele obinute prin puncia ovarelor provenite de la animalele sacrificate la abator sau a
ovarelor obinute prin ablaia acestora, constituie o surs important de gamei femeli, ns aceste
ovocite necesit a fi maturate ,,in vitro. Puncia foliculilor pe animalul viu permite folosirea
donatoarelor de ovocite cu potenial genetic cunoscut.
18

Pentru recoltarea ovocitelor n astfel de condiii se mai poate folosi un endoscop, cuplat la un
sistem de aspirare, n vederea prelevrii lichidelor foliculilor cu un diametru de 2-6 mm, de la
vaci stimulate sau nu cu hormoni gonadotropi exogeni. De asemenea, puncia foliculilor, ghidat
prin ecografie transvaginal permite colectarea fluidului folicular i a complexelor ovocitecumulus. Aceast tehnic poate fi repetat de mai multe ori n cursul aceluia i ciclu, fr a afecta
fertilitatea ulterioar a femelei donatoare.
Maturarea in vitro a ovocitelor
Ovocitele prelevate din foliculii antrali, prin laparotomie sau sacrificarea femelelor, reiau
spontan meioza dac sunt plasate ntr-un mediu special de cultur, la 38oC, incubate ntr-o
atmosfer de 5% CO2. Prezena unui cumulus compact i intact n momentul cultivrii ovocitelor
favorizeaz reluarea meiozei pentru majoritatea ovocitelor. Studii de microscopie electronic au
artat c celulele cumulus-ului emit numeroase prelungiri ce traverseaz zona pelucid i
stabilesc legturi funcionale complexe cu citoplasma ovocitului. Aceste legturi, parial sunt
ntrerupte, dup 3 ore de cultur a ovocitului n mediul special, pentru ca dup 16-18 ore de
cultur, contactele dintre celulele cumulusului i ovocit s dispar complet. Ruperea membranei
nucleare se produce dup 6-12 ore de cultur i emiterea primului globul polar dup 24 de ore.
Aceste transformri nucleare, ce deosebesc maturarea in vitroa ovocitelor, modificri
observabile prin tehnici histologice, sunt nsoite de modificri citoplasmatice mult mai greu de
decelat prin mijloace actuale de investigare. S-a dovedit, prin multiple experiene, c ovocitele
cultivate n foliculul lor se matureaz asemntor celei observate ,,in vitro.
La vaci, nivelul maturrii ovocitelor n medii cu sau fr adaos de celule din granuloas,
nu variaz mult, ns prezena acestor celule permite restabilirea potenialului de dezvoltare a
ovocitelor dup fecundaia in vitro. Ovocitele obinute prin puncia foliculilor dispui mai n
profunzimea cortexului ovarian au un potenial de maturare i dezvoltare ulterioar mult mai
slabe, comparativ cu ovocitele obinute prin puncia foliculilor mari, maturi, situa i la suprafaa
ovarului.
Capacitarea spermatozoizilor
Spermatozoizii mamiferelor nu sunt capabili de fecundare a ovocitelor, din momentul
ejaculrii. Spermatozoizii trebuie s parcurg o perioad de pregtire, numit capacitare, care
are loc in vivo, n tractusul genital femel. Capacitarea este o etap pregtitoare necesar, n
urma creia spermatozoizii dobndesc capacitatea de a se fixa pe zona pelucid a ovocitului i
sufer, apoi, reacia acrozomului.
Studiile de microscopie electronic au artat c n decursul etapei de capacitare au loc
dou fenomene mai importante:
- modificri la nivelul membranelor spermatozoidului i acrozomic extern , precum, migrarea
proteinelor de acoperire cu formarea de zone libere de proteine, ceea ce permite fuziunea
membranelor plasmatice i acrozomic extern, n momentul reaciei acrozomului. Prin orificiile
create, se elimin o cantitate din colesterolul care antreneaz o diminuare a raportului
colesterol/fosfolipide, asociate unei permeabiliti membranare crescute pentru ionii de calciu. Pe
baza acestei constatri, toate mediile de capacitare folosite au n comun prezen a serului
albuminic, care este un acceptor de colesterol;
- modificarea micrii spermatozoidului care, din liniar (prin nurubare) traiectoria devine, mai
mult sau mai puin circular, micare ce se datoreaz creterii permeabilitii pentru ionii de
calciu. Amplitudinea micrilor cozii se mrete, spermatozoidul fiind calificat ca hipermobil.
19

Diversele medii i tehnici ntrebuinate pentru capacitarea spermatozoizilor ,,in vitro au n

vedere faptul de a permite spermatozoizilor s sufere toate aceste modificri i mai ales s le
menin o mobilitate ridicat.
Capacitarea spermatozoizilor s-a obinut prin incubarea acestora la 37oC, timp de unadou ore, ntr-un mediu cu o for ionic crescut, ceea ce a dus la detaarea proteinelor de
acoperire. Aplicarea acestei tehnici la sperma recoltat prin ejaculare de la taur, a permis
obinerea unui procent de fecundaie ridicat i naterea de viei normali, dup transferul
embrionilor obinui prin fecundarea gameilor n astfel de medii. Diversele studii ntreprinse pe
aceast problem, au artat c fenomenul de capacitare a spermatozoizilor ,,in vitro este mult
diferit de cea realizat in vivo. n oviduct, n condiii naturale, fecunda ia are loc n absen a
celulelor din cumulus, pe cnd in vitro ovocitele nude, n momentul contactului cu
spermatozoizii sunt fecundate ntr-o proporie foarte sczut comparativ cu ovocitele nconjurate
de celule din cumulus. Aceasta presupune c celulele din cumulus au probabil un rol n
capacitarea in vitro a spermatozoizilor. Majoritatea cercettorilor care se ocup de aspectele
fecundaei in vitro folosesc sperma congelat, cu rezultate bune. Alte medii capacitante pentru
spermatozoizi sunt cele care conin ionoforul calcic, asociat sau nu cu cafeina. Totodat, cafeina
pare a fi un agent capacitant mai apropiat de condiiile naturale, deoarece aceast substan se
gsete pe traiectul cilor genitale dup ovulaie. S-a dovedit c spermatozoizii de taur posed
receptori pentru heparin, acetia acionnd n funcie de doz i uureaz ptrunderea calciului
n spermatozoid. Se mai folosete, n mediile capacitante, lichidul folicular, care, ntre altele,
conine i heparin. Un nivel de capacitare satisfctor se obine atunci cnd se practic o
concentraie ridicat de spermatozoizi n mediu, care trebuie s fie de 3-4 miliarde
spermatozoizi/ml, cnd nivelul fecundaiei atinge 87% dintre ovocite.
Fecundaia i cultura in vitro a embrionilor
Fecundarea se realizeaz prin cultura timp de o zi ntr-un mediu special a 0,1ml suspensie de
spermatozoizi, cu concentraie ridicat, mpreun cu ovocite mature, n atmosfer de 5%CO2,
5%O2 i 90%N2. Dup 24 de ore de cultur mpreun cu spermatozoizii, ovocitele fecundate
sunt transferate ntr-un mediu special n vederea dezvoltrii ulterioare. Ovocitele se examineaz
la stereolup i sunt considerate ca fecundate atunci cnd se constat:
prezena spermatozoizilor n spaiul perivitelin;
prezena spermatozoizilor n ovoplasm;
prezena pronucleilor i apariia segmentaiei.
In vivo, dup fecundaie, embrionul ncepe dezvoltarea sa n oviduct, nainte de a ajunge n
uter (ziua 4-5 la rumegtoare), n stadiul de morul tnr. In vitro, oricare este mediul de
cultur folosit, zigoii se blocheaz n stadiul de 8 celule. Pentru mult timp, singurul mijloc de a
asigura depirea stadiului de blocaj evolutiv l-a constituit transferul tinerilor zigo i n oviductul
unei gazde intermediare (iepuroaic) i apoi transferul lor n uterul femelelor receptoare.
Experienele au dovedit c cultura zigoilor de rumegtoare pe un strat de celule tubare a permis
obinerea blastocitilor i a nou-nscuilor, dup transferul la femelele receptoare. Totodat s-a
demonstrat c prin co-cultura zigoilor cu vezicule trofoblastice permitea la circa 40% dintre
acetia s depeasc stadiul de 8 celule.
Oule fecundate in vivo, apoi cultivate in vitro pe un strat de celule prelevate din
oviduct, unde evolueaz pn la stadiul de blastocist, au un aspect morfologic normal. Totu i,
studiul histologic atent a relevant faptul c aceti blastociti, comparativ cu cei preleva i in
20

vivo sunt alctuii dintr-un numr redus de celule, multe dintre ele pe cale de degenerare. ns
cultura embrionilor pe un strat de celule tubare, apoi uterine i adiionarea unui factor de cre tere
n mediul de cultur a permis realizarea unui nivel important de dezvoltare pn la stadiul de
blastocist ca i a unui nivel de ecloziune, comparabil cu cel realizat in vivo. Aceste experien e
demonstreaz faptul c oviductul nu ndeplinete un rol specific n trecerea de la starea de blocaj
spre stadiile ulterioare evolutive, deoarece blastocitii pot fi obinui i prin co-cultura cu celule
trofoblastice, din cumulus, ca i cu celule prelevate din oviduct.
Transferul embrionilor obinui in vitro
Se face n uterul femelelor receptoare, din aceeai specie, a crei ciclu sexual a fost
sincronizat cu vrsta embrionilor obinui in vitro. Nivelul gestaiei n urma transferului
sincron i asincron a embrionilor bovini cultivai in vitro arat c nivelul cel mai ridicat de
gestaii s-a obinut atunci cnd femelele receptoare se gsesc n ceea ce privete ciclul sexual, n
ntrziere cu una-dou zile, fa de vrsta teoretic a embrionilor.
Embrionii obinui conin un numr mai redus de celule, cu toate c morfologic apar
normali, de aceea nivelul gestaiei este mai ridicat atunci cnd receptoarele sunt din punct de
vedere al ciclului sexual n ntrziere, n raport cu vrsta teoretic a embrionului. Aceasta
evideniaz faptul c mediile de cultur folosite nu sunt adecvate integral. Nivelurile de
dezvoltare a embrionilor obinui in vitro transferai receptoarelor i a gesta iei sunt mai
sczute comparativ cu cei obinui dup transferul de embrioni in vivo.
Tabel 5
Nivelul gestaiei dup transferul sincron al embrionilor bovini dup maturare, fecundare i
cultur in vivo n condiiile transferului a cte 2 embrioni/receptoare
Sincronism ntre stadiul de
Numr de receptoare
Gestaii (%)
dezvoltare al embrionilor i
stadiul ciclului sexual al
receptoarelor
-2.5
8
63
-2.0
22
82
-1.5
17
59
-1.0
27
59
0 la +1
13
46
Pe ansamblul aplicrii acestei biotehnici, nivelurile gestaiei sunt mai slabe n raport cu
numrul ovocitelor folosite, chiar atunci cnd zigoii sunt cultivai n oviductul unei gazde
intermediare.
La bovine, folosirea pentru fecundaia in vitro a ovocitelor provenite de la femele fr
valoare genetic (recoltate de la abator) permite stabilirea unui diagnostic precoce a fertilit ii
taurilor folosii la nsmnri artificiale. ntr-adevr, s-a pus n eviden o corelaie ntre nivelul
dezvoltrii globale in vitro (numrul de blastociti/numr ovocite supuse fecundrii) i
fertilitatea taurilor in vivo (nivelul NR% la dou-trei luni).
Bisecia embrionilor
Tehnicile de micromanipulare perfecionate i simplificate n ultimul timp, au fcut
posibil microchirurgia embrionar. Micromanipulrile sunt facilitate de faptul c oule (zigo ii)
majoritii speciilor de mamifere sunt circumscrise de o zon pelucid acelular.

21

Zona pelucid ndeplinete mai mult atribuii referitoare la protec ia fizic a zigotului.
Rezistena acestei membrane permite meninerea oului n depresiunea extremitii unei
micropipete fr a afecta structura intern a oului. Aceast nsuire uureaz mult interven ia
microinstrumentelor. Prin practicarea tehnicilor de micromanipulare, n prezent se poate
interveni pe zigot pentru:
obinerea jumtilor monozigote, prin bisecie;
sexarea embrionului;
producerea de himere;
obinerea de indivizi transgenici;
producerea clonelor
Bisecia embrionilor

Bisecia embrionilor const n secionarea n dou jumti a zigoilor aflai n stadiul de morul
trzie sau de blastocist tnr (6-8 zile). Aceast biotehnic are ca baz fiziologic constatarea c
la mamifere, n mod natural, apar jumti i
uneori chiar triplet monozigote.
Ozil, 1982 a propus secionarea n dou pri egale a embrionilor de 6-8 zile, stadiu n care rolul
zonei pelucide nu mai prezint importan. El a dezvoltat un sistem de microchirurgie cu ajutorul
mai multor instrumente, folosite n aa fel nct s lezioneze ct mai pu in posibil zona pelucid
i repunerea fiecrui demiembrion n cte o zon pelucid. Rezultatele ob inute, exprimate n G
% dup transfer, au fost considerate ca excelente: 27 de produi pentru 25 de embrioni seciona i.
Numeroi autori au continuat bisecia embrionilor bovini simplificnd tehnica, ce este format
numai din dou microinstrumente.
Voelkel i colab., (1948), Baker i Shea (1985), Picard i colab.,(1985) .a. au demonstrate c nu
mai este necesar repunerea embrionului ntr-o zon pelucid naintea transferului, ceea ce a
simplificat mult metoda. Cu ajutorul a dou micromanipulatoare, unul purtnd micropipeta,
cellalt microcuitul, un operator antrenat poate obine n cteva minute doi demiembrioni,
viabili, n condiiile biseciei unice a embrionilor de bun calitate, apreciai n stadiul de morul
compact-blastocist tnr. Dup transferul celor dou jumti la femelele receptoare, nivelurile
gestaiei se situeaz ntre 50% i 65%, ns pentru majoritatea autorilor, nivelurile gemelarit ii
au fost de 50%. Nu s-au nregistrat diferene n nivelul obinerii de gemeni, indiferent dac
acetia au fost repui amndoi n cornul uterin ipsilateral ovarului cu corp galben sau repus
22

fiecare n cte un corn uterin al aceleiai receptoare. S-au obinut unele rezultate (50% gestaii)
dup transferul jumtilor de embrion conservate prin refrigerare timp de 24 de ore la 2-4oC.
Congelarea n azot lichid a jumtilor de embrion repuse n zona pelucid, a condus la obinerea
unui nivel sczut de gestaii (20%). Dac nainte de congelare embrionii sunt meninui ntr-un
mediu de cultur (2-24 de ore), nivelul gestaiilor obinute este mult mai ridicat. Rezultatele
obinute arat c embrionii buni de 40-80 de celule, sunt capabili, prin bisecie, s dea doi
demiembrioni care, transferai n uterul receptoarelor, s evolueze normal, cu toate c au de
recuperate circa jumtate din celulele embrionului iniial. Rezultate n obinerea gemenilor
monozigoi, sunt superioare cnd se lucreaz cu blastociti tineri, comparativ cu stadiul de
morul tnr. ncercarea de a obine gemeni tripli sau cvadrupli, prin secionarea embrionilor n
stadiul de 40-80 de celule nu s-a soldat cu rezultate satisfctoare, ceea ce arat c aceast
biotehnic este limitat de numrul restrns de gemeni (2) ce pot fi obinui dintr-un singur
embrion. Dac, de exemplu, considerm n medie pe donatoare 5 embrioni viabili (trei buni i
doi medii), dup transferul acestora se obin n principiu trei viei. Prin bisecia celor trei
embrioni buni i transferul fiecrei jumti la cte o receptoare, este posibil s se obin tot trei
viei (50% gestaie) sau, per total 4 viei. Ctigul de un viel presupune existena a 8 receptoare,
n loc de 5. Dac nivelurile gestaiei sunt mai sczute (50%-30%) sporul de un viel obinut pe o
donatoare superovulat este anulat. n condiiile atingerii unor rezultate normale, prin practicarea
biseciei embrionilor se pot obine, n medie, 4 viei pe donatoare n loc de trei vi ei, ceea ce
presupune un ctig de 33% a numrului descendenilor provenii de la fiecare femel
superovulat. n aceste condiii, o selecie bine dirijat, accept cu reserve pstrarea a mai mult
de un singur exemplar al unei familii clonate, din cauza reduciilor majore survenite n variana
genetic i n sporirea consangvinitii. n aceste circumstane, producerea unor familii biclonate
pentru toi indivizii distinci genetic se poate face numai prin reducerea la jumtate a numrului
unor astfel de indivizi, prin aceasta scznd nsi intensitatea seleciei. Continuarea bisecionrii
embrionilor (clonrii) erodeaz intensitatea seleciei prin reducerea progresului genetic,
mrete consangvinitatea, scderea intensitii seleciei nefiind compensat prin ctigurile
obinute n precizia seleciei sau exactitii rezultatelor ei . Biotehnica biseciei embrionilor este
totui bun pentru producerea adevrailor gemeni, necesari testrii unor preparate farmaceutice
sau a furajelor, factorul genetic fiind nlturat. Obinerea himerelor s-a realizat prin
microchirurgie, la rumegtoare i suine, constnd n amestecul de celule embrionare de la specii
diferite.
Sexarea embrionilor
Determinarea sexului embrionului nu este realizabil dect la vrsta la care se face transferul
acestuia (6-8 zile). Este considerat ca o descoperire economic de mare importan i const n
prelevarea ctorva celule care sunt investigate citogenetic, imunologic, enzimologic etc. n
vederea determinrii sexului produsului de concepie nc din acest stadiu incipient de
dezvoltare.
Metoda genetic (cariotipic) se bazeaz pe recunoaterea citologic a cromozomului y,
specific masculilor. Este vorba de o tehnic ce permite efectuarea sexrii zigoilor, pornind de la
un numr mic de celule prelevate de la zigoi i care s nu compromit dezvoltarea ulterioar a
embrionului. Recent, folosirea unei sonde molecular specifice cromozomului y la bovine, pare
s rspund tuturor ateptrilor. Unele echipe de cercetare acioneaz n direcia trierii
spermatozoizilor purttori ai cromozomului x i y , pe baza diferenei acestora n ce privete
23

coninutul n ADN. Aceast metod, mpreun cu fecundaia in vitro ar furniza un procedeu

ideal care s rspund necesitilor zootehnice moderne.
Metoda imunologic const n cutarea pe suprafaa celulelor masculine a antigenului de
citocompatibilitate, prin folosirea unor anticorpi monoclonali specifici pentru acest tip de
antigen.
Metoda enzimologic se bazeaz pe faptul c unele enzyme celulare sunt codificate de
ctre gene aparinnd cromozomului x. Cantitatea acestor enzime este , deci, de dou ori mai
mare n celulele femele dect n celulele mascule. Determinarea activitii acestor enzyme ntr-un
blastomer izolat a permis sexarea embrionilor ntr-o proporie ridicat.
Tehnica amplificrii ADN (PCR). Dup descoperirea posibilitilor de amplificare
enzimatic dirijate de ADN-ul celular, unii cercettori au dezvoltat o tehnic de sexare prin
amplificarea enzimatic (PCR-Polimerase Chaine Reaction) a secvenei lor specifice. Sexajul
este efectuat pe 5-10 celule prelevate prin biopsia embrionilor de bun calitate. Plecnd de la
aceste celule, determinarea sexului se sprijin pe detectarea unei secven e specifice a ADN-ului
cromozomului y printr-o sond molecular complementar. Aceast secven este amplificat de
PCR. ADN-ul amplificat este separat prin electroforez i vizualizat prin fluorescen . Avnd n
vedere tehnicile pentru sexare (evidenierea ADN specific) i sensibilitatea specific (amplificarea
ADN de ordinul a 105), biopsia trebuie s fie realizat n cele mai bune condi ii igienice i
tehnice.
Sexarea embrionilor nainte de implantare, ofer posibilitatea stabilirii raportului de sexe ntr-o
populaie, n sensul dorit de cresctori funcie de necesarul de animale de reproducie, carne,
lapte etc.
Transplantarea nucleilor i obinerea de clone
Clonajul embrionar const n producerea mai multor animale pornind de la un singur
embrion. Acestea pot fi obinute prin simpla seciune sau disociere a unui embrion, n stadiul de
preimplantare (bisecia embrionilor). Prin aceast metod s-au produs numeroase perechi de viei
gemeni, ns foarte rar s-au putut obine triplete sau gemeni cvadrupli. Teoretic, tehnica
transferului nucleului permite obinerea unui numr mare de indivizi plecnd de la un singur
embrion, avnd n vedere faptul c patrimoniul genetic al tuturor nucleilor unui embrion tnr
este identic, n sensul c poart aceeai informaie genetic. Transferul nucleilor celulelor
provenite de la acelai embrion n mai multe ovocite enucleate i activate, este urmat de evolu ia
ovocitelor spre indivizi genetic identici.
Posibilitatea obinerii de serii de animale identice genetic prezint interese multiple
pentru zootehnie. Astfel, n activitatea de selecie, folosirea unor clone, chiar limitate numeric,
ofer posibilitatea evalurii cu nalt precizie a valorii reproductorilor. Animale cu acelai
genotip, ntreinute n ferme diferite, sunt exceleni subieci de studiere a influen ei factorilor de
mediu asupra performanelor acestora. Totodat,
obinerea mai multor copii a reproductorilor foarte valoroi va contribui
la creterea i difuzabilitatea progresului genetic, ns cu reversal micorrii patrimoniului
genetic al efectivelor de animale. Pentru producie, plecnd de la rasele de carne, embrionii
provenii de la un genitor cu o excelent conformaie (caracter cu coeficient mare de
heritabilitate) vor putea fi multiplicai prin clonare i transplanta i, cu producerea unor loturi de
animale cu carcase omogene i de calitate superioar.

24

De asemenea, pe termen lung, obinerea i comercializarea embrionilor clonai n mari

serii, asociat cu maturarea in vitro vor permite scderea considerabil a transferului
embrionar.
Briggsi i King (1952) au artat c nucleii prelevai, n stadiul de blastul, la broasc i
grefai n ovocite, pot s-i continue dezvoltarea pn la stadiul de blastul, iar n 1962 Mc
Kinnel a obinut, prin aceeai metod, broate adulte.
Pentru embrionul de mamifere, n 1986 Willadsen S., la Cambridge a obinut pentru prima dat
trei miei dup transfer de nuclei, provenii de la un embrion n stadiul de 8 celule.
La taurine, s-au obinut de ctre diferite echipe de cercettori clone constituite din 8-9 vi ei.
Transferul de nuclei parcurge trei etape:
obinerea de ovocite enucleate destinate de a primi nucleii;
izolarea nucleilor embrionului donator;
reconstituirea de serii de embrioni monocelulari.
Pregtirea ovocitelor receptoare
Prima operaie const n extragerea genomului maternal al ovocitei receptoare. Pentru
aceasta, se folosesc ovocite mature care, n absena fecundaiei sau a activrii, se gsesc blocate
n stadiul de metafaz II a meiozei. Retragerea nucleului poate fi realizat prin micromanipulare,
ptrunznd cu vrful unei micropipete n interiorul celulei i aspirnd uor cromozomii. Pentru a
se evita ruperea membrane viteline a ovocitului, cum se ntmpl cel mai adesea, ovocitele sunt
pretratate cu droguri care inhib polimerizarea microfilamentelor i microfibrilelor scheletului
celular. Ovocitele prelevate in vivo, imediat dup ovulaie sau obinute prin maturare in vitro
sunt debarasate de celulele lor periovocitare printr-un tratament enzimatic cu hialuronidaz i
apoi incubate n prezena cytochalasinei B (5-7 g/ml). Dup denudare, fiecare ovocit este
enucleat, prin imobilizare n depresiunea unei micropipete, apoi cu cea de-a doua micropipet se
puncioneaz zona pelucid, se aspir globulul polar mpreun cu o fraciune de citoplasm
adiacent, coninnd cromozomii metafazici.
Izolarea nucleilor embrionului donator
Embrionul, selecionat ca donator de nuclei, este prelevat n stadiul de morul, cnd
posed 16-64 de celule, funcie de specie i vrsta acestuia. n acest stadiu evolutiv, punerea n
micare a genomului embrionar deja s-a produs. Se folosesc i embrioni congela i i care se
gsesc n stadiul de morul.
Embrionul donator este debarasat cu mult atenie de zona pelucid, folosind o soluie de
tyrode acid. n acest stadiu, celulele au nceput deja s stabileasc ntre ele rela ii func ionale (de
exemplu gapjonc ion). Pentru disociere, embrionul este incubat timp de treizeci de minute, ntrun mediu lipsit de ioni de calciu, dup care blastomerele pot fi separate, fr leziuni, prin
intermediul unor micropipete.
Reconstituirea embrionilor
Dup separarea blastomerelor, n cel mai scurt timp se introduce fiecare blastomer n
interiorul zonei pelucide a ovocitei receptoare, enucleate n prealabil.
Dup introducerea blastomerului sub zona pelucid, fuziunea membranelor celulei donatoare i
ovocitul receptor se realizeaz prin electrofuziune. Pentru aceasta, ovocitul se plaseaz ntre doi
electrozi i este supus la unul sau mai multe impulsuri foarte scurte de current continuu. Stimulii
electrici provoac pori membranari, destabiliznd straturile de fosfolipide juxtapuse, iar
25

membranele fuzionate permit astfel nucleului donator s ptrund n noul su mediu

citoplasmatic. Pe de alt parte, stimularea electric activeaz ovocitul receptor, prin declan area
mecanismelor de reprogramare a nucleului transplantat. Electrofuziunea se realizeaz ntr-un
mediu izotonic i se observ n urmtoarele treizeci de minute de la stimulare i estimat, fie prin
umflarea nucleului donatorn noul su mediu citoplasmatic, fie prin terminarea diviziunii celulare
i apariia stadiului de dou celule.
n prezent, unul din factorii limitani n aplicarea acestei biotehnici l reprezint numrul
relativ redus de ovocite receptoare. Creterea numrului de ovocite ,,receptoare se poate
obine prin maturarea in vitro a acestora, pornind de la ovarele recuperate n abator de la
femelele sacrificate. Tot n plan practic, este de mare interes posibilitatea congelrii acestor
ovocite, astfel nct s se dispun n orice moment de necesarul de ovocite receptoare. Un alt
factor limitant este reprezentat de numrul relativ redus de celule ale embrionilor de la care
urmeaz s se transfere nucleii. Cu toate dificultile pe care le ridic, clonajul embrionilor
creeaz o nou cale n optimizarea reproducerii animalelor.
Transgeneza
Ameliorarea efectivelor de animale s-a bazat, tradiional, pe progresele nregistrate n
selecia genetic, dirijarea reproduciei, echilibrul raiilor de hran, etc. Tehnicile geneticii
moleculare ofer, n prezent, noi posibiliti care ncep a fi exploatate eficient. Astfel, sondele
moleculare vor permite cunoaterea patrimoniului genetic al animalelor iar multiplele combina ii
rezultate din mutaie i asocierea secvenelor de ADN ofer multe posibilit i de reprogramare a
unei celule sau a unui organism ntreg. Astfel, dac o gen izolat este introdus ntr-o celul,
aceasta va sintetiza o nou protein i caracteristicile acestei celule vor putea fi astfel modificate.
De asemenea, dac o gen izolat este introdus ntr-un organism ntreg, nsuirile genetice ale
acestuia vor fi modificate. Aceast operaie poart numele de transgenez. Gena strin,
introdus n noul organism, va fi transmis la descendeni obinndu-se n acest fel o linie de
animale care au nsuiri biologice noi.
Este posibil, prin transgenez, obinerea de noi animale, perspectivele deschise de
aceast nou biotehnic fiind considerabile. Obinerea de animale transgenice include mai multe
etape:
izolarea sau construcia genei de transferat;
colectarea embrionilor;
introducerea genei n embrioni;
transferul embrionului la o femel receptoare;
identificarea transgenei la nou-nscui;
msurarea expresiei transgenei;
stabilirea de linii homozigote, pornind de la animale transgenice fondatoare.
Izolarea sau construcia genelor se face prin tehnici genetice adecvate care permit att
izolarea ct i mutarea dup voin a oricrei gene. O gen funcional material sau reconstruit
conine totdeauna aceleai elemente: regiunea regulatore, regiunea codant i terminatorul.
Astfel, regiunile care particip la reglarea transcripiei genei se situeaz n amonte de zona
codant.

26

Colecia de embrioni
Transgeneza fiind o operaie cu randament sczut, sunt necesari mai muli embrioni pentru a
economisi la maximum femele donatoare. Embrionii pot fi obinui n mai multe moduri:
prelevnd ovare de la femelele sacrificate la abator;
prin maturarea ovocitelor in vitro;
prin practicarea fecundaiei in vitro.
Introducerea genei n embrion se poate realiza prin microinjecie, prin folosirea de vectori
retrovirali sau prin folosirea celulelor ES (Embryo stem cels).
Microinjecia const n injectarea direct a soluiei de ADN n pronucleul mascul, care este mai
mare, mai apropiat de periferia zigotului n momentul injeciei. Un obstacol important la
injectare este dat de opacitatea oulor, ceea ce face dificil vizualizarea celor doi pronuclei.
Virusurile, nainte de a folosi mecanismul celular pentru replicarea lor, sunt ,,a priori excelen i
vectori pentru a introduce gene strine ntr-o celul. Retrovirusurile se ncorporeaz n genomul
gazd, n general, ntr-o singur copie i fr rearanjare, deci sunt extrem de utile pentru
introducerea genei strine n celulele somatice n cultur i apoi se reintroduc aceste celule n
individ.
Utilizarea celulelor ES, const n izolarea celulelor unui embrion precoce i cultivarea lor n
condiii n care celulele nu se difereniaz. Cnd aceste celule ES sunt reintroduse ntr-un
embrion precoce particip la dezvoltarea embrionului, dnd natere la animale himere. O gen
strin poate fi introdus, prin procedee clasice de transfer, n celule ES, n cultur. Aceste celule
reintroduse n embrion constituie vectorul transgenei. Animalele himere transgenice care rezult
sunt mozaicate. Descendenii lor motenesc sau nu transgena numai dac celulele germinale
parentale conin sau nu transgena.
Transgenele introduse, prin una din aceste metode, se inser n genomul gazd n poziii
imprevizibile. Introducerea transgenelor se mai poate realiza i prin alte
mijloace. Unul dintre aceste mijloace const n a pune n contact ADN-ul i spermatozoizii i a
proceda apoi la o fecundaie in vitrosau in vivo. O alt cale prin care gena strin poate fi
transferat n celule n cultur, cu o eficacitate nalt, este electroporaia. Tehnica aceasta const
n a supune celulele incubate n prezena ADN, la cmpuri electrice care destabilizeaz
membrana i creeaz pori prin care ADN-ul ptrunde n celule. Aceast tehnic se folose te i
pentru spermatozoizii i embrionii
de mamifere.
Detectarea transgenelor se face prin metode clasice ale geneticii moleculare. Ele constau
n a hibrida un fragment de ADN complementar genei, radioactivat, cu ADN-ul celular total.
Detecia produilor transgenici const n a evalua expresia transgenelor prin msurarea cantit ii
de ARN corespondent. Proteinele derivate din transgene pot fi msurate n snge, dac sunt
secretate, cu ajutorul testului RIA (radioimunoanaliz). Aceste metode permit s se determine n
care organ, tip celular i moment al dezvoltrii, transgena se exprim. Tansgeneza a fost
ncercat pe multe specii de animale, cu anumite succese. Randamentul biotehnicii, evaluat n
numr de celule
transgenice obinute, raportat la numrul embrionilor microinjectai, variaz mult cu colectivele
de cercettori
Prin transgenez s-a ncercat obinerea de animale cu un ritm de
cretere accelerat, cu o producie de lapte mai mare i cu un coninut n protein mai
ridicat, cu o producie de carne mai bun, cantitativ i calitativ, rezistente la diverse maladii etc.
Cu toate rezultatele ncurajatoare obinute la diverse specii, aceast biotehnic se gsete doar la
27

perioada de nceput, necesitnd multe ajustri, astfel nct randamentul obinut s micoreze
preul de cost al produsului transgenic i care s fie conform cu normele sanitare i sanitarveterinare internaionale etc.
IMPORTANA TRANSFERULUI DE EMBRIONI
Importana transferului de embrioni poate fi zooeconomic i tiinific.
Importana zooeconomic
Lucrrile de selecie i ameliorare a efectivelor de animale sunt limitate de numrul redus
de produi care se obin de la o femel n cursul vieii sexuale i de intervalul dintre genera ii.
Asupra animalelor valoroase, ambii factori sunt frenatori, treptele ameliorrii numrndu-se n
generaii succesive. Transferul de embrioni d posibilitatea folosirii cu eficien crescut a
rezervelor de ovocite de la animalele de nalt valoare zootehnic numite donatoare, prin
provocarea maturrii i eliberrii mai multor gamei femeli (poliovulaie) cu obinerea unui
numr mai mare de produi de la aceeai femel prin transferul embrionilor n uterul femelelor
receptoare. Astfel, n decursul vieii sexuale este valorificat doar o infim parte din rezerva de
ovocite cu care femela ajunge la maturitatea sexual. De exemplu, vaca ncepe perioada genital
cu o rezerv de circa 150000 de ovocite (n ambele ovare), rezerv care diminu la circa 21000 la
vrsta de 2-3 ani i la circa 2500 la 12-14 ani. Numrul de ovocite eliberate n ntreaga via
sexual nu depete 50, din care n condiii normale rezult maxim 10- 12 vi ei. O scroaf poate
produce ntr-un ciclu pn la 50 de ovule din care se vor dezvolta 10-15 purcei. Prin asigurarea
numrului corespunztor de animale primitoare, de la vacile donatoare se pot obine, n medie 34 viei pe an, fiind cunoscute cazuri cnd n condiii de supraovulaie, de la o vac donatoare s-au
obinut 30-35 viei.
Transferul de embrioni se practic i pentru scurtarea intervalului dintre generaii. Prin
instalarea gestaiei, femela intr n repaus productive (sub raportul procreerii) pe ntreaga durat
a gestaiei. n cazul practicrii transferului de embrioni, produii de concep ie sunt transfera i n
alte organisme, ceea ce d posibilitatea obinerii de noi produi de la aceea i femel n intervalul
de timp n care n mod normal, ar fi trebuit s fie gestant.
Mai mult, n prezent se pot obine gamei i de la tineretul femel prepuber prin
provocarea prin mijloace hormonale a maturrii i expulzrii ovocitelor, care vor fi apoi
transferate n uterul femelelor receptoare. Scurtndu-se mult intervalul dintre genera ii, se
accelereaz ameliorarea efectivelor de animale.
Transferul de embrioni reduce considerabil costurile de transport, carantin i eventualele
restricii sanitar-veterinare n comerul cu animale, prin conservarea prin congelare a embrionilor.
Totodat, prin practicarea transferului de embrioni, se pot obine produi de la femelele valoroase
dar cu diverse afeciuni genitale incompatibile cu meninerea gestaiei sau cu parturiia.
Prin apelarea la transferul de embrioni se pot obine gemeni de la taurinele de carne, prin
transferarea unui embrion suplimentar obinut de la femelele dintr-o ras convenabil. De
asemenea, prin transferul de embrioni se reduce intervalul de timp necesar crerii de noi rase de
animale cu nsuiri morfo-productive performante care pot forma linii de femele consangvine n
vederea folosirii lor la ncruciri industriale.
n sintez, n practica de producie, transferul de embrioni se aplic pentru rezolvarea
urmtoarelor probleme:
28

- reproducerea accelerat a animalelor de prsil, de calitate superioar, a raselor rare, a

animalelor din rezerva genetic a purttoarelor unor nsuiri valoroase (producii ridicate,
capacitate de utilizare intens a furajelor, prolificitate mare, longevitate productiv, rezisten la
anumii factori nefavorabili etc.);
- obinerea unui numr mare de descendeni de la femelele cu producii ridicate i cu durat
prelungit de exploatare, n vederea crerii de familii cu aceste nsuiri;
- raionalizarea importului i exportului animalelor valoroase, ca urmare a transportului
embrionilor congelai, nlturndu-se astfel barierele sanitar-veterinare i nlesnirea aclimatizrii
materialului importat, dezvoltarea lui embrionar avnd loc n organismul primitoarelor;
- obinerea de embrioni liberi de leucoz cu posibilitatea transferului acestora femelelor leuconegative;
- crearea unor bnci de embrioni n vederea pstrrii raionale a rezervelor genetice, ceea ce este
mai economic dect ntreinerea unor efective numeroase din rezerva genetic.
Importana tiinific
Transferul de embrioni reprezint o biotehnologie prin intermediul creia se poate
efectua, n condiii optime, un aprofundat studiu tiinific al proceselor intime legate de
fecundaie i de influenele matern i patern asupra produsului de concepie. Totodat, poate fi
studiat dezvoltarea embrionar la animale, diversele abateri de la dezvoltarea normal, cauzele
i factorii care genereaz mortalitatea embrionar.
Produii obinui prin transferul de embrioni permit studierea influenelor factorilor
genetici i ai mediului extern asupra dezvoltrii embrionilor, ereditatea grupelor sanguine,
obinerea de animale mosaic de gene, a concentrrii mai multor caractere pe acelai individ, a
instituirii unei profilaxii i terapeutici genetice pentru unele boli de metabolism. Pe aceeai linie,
transferul de embrioni reprezint baza unei noi generaii de biotehnici care deriv din aceasta sau
i sunt asociate: bisecia embrionilor, sexajul, fecundaia in vitro clonarea, transferul de gene,
iar ingineria genetic folosete ca verig important, n metodologie, aceast biotehnologie.
Micromanipularea i microchirurgia ovocitelor i a embrionilor permit desfurarea unei
cercetri tiinifice interesante, i obinerea din punct de vedere practic a unor nalte performan e
n reuita transferului de embrioni, prin transferul jumtilor de embrioni.
Sexul embrionului poate fi precizat cu mult acuratee, baza investigaiei fiind dat de
transferul embrionilor.
Reproducerea, fr contribuia genetic a partenerului, se poate realiza prin ginogenez,
fiind deja obinui primii oareci homozigoi. Aspecte similare ridic androgeneza n care se
poate induce bispermia, adic ptrunderea n ovul a doi spermatozoizi, cu retragerea ulterioar a
pronucleului femel i n consecin diviziunea va continua numai n zona masculin.

29

PERSPECTIVELE TRANSFERULUI DE EMBRIONI

Transferul de embrioni va capata o extindere mai mare, deoarece cu ajutorul lui pot fi
studiate procese biologice, cum ar fi: limitele de hranire si adapostire a produsilor de conceptie
in uter, relatiile dintre embrion-uter-ovar, influenta unor factori genetici si nutritionali asupra
produsului de conceptie, crearea de linii consangvine, de rase noi.
Biotehnologiile finalizate prin transfer de embrioni cuprind totalitatea metodelor si
tehnicilor rezultate din integrarea stiintelor biologice, biochimiei, biofizicii, informaticii, in
scopul manipularii genetice a unui embrion, celule embrionare, nucleu, gene, etc. In cadrul
acestora se disting o serie de tehnici ca: fecundatia 'in vitro", diagnosticul timpuriu al sexului,
manipularea genetica.
Biotehnica transferului de embrioni a creat posibilitatea obtinerii ovulelor si a
embrionilor in stadiile de dezvoltare dorite, pe care apoi se pot efectua diferite manipulari
genetice. Cu ajutorul unui microscop micromanipulator si a unor microinstrumente specifice se
pot efectua diferite manopere microchirurgicale, cum ar fi:

extractiile de celule embrionare, pronuclei. fragmente de nuclei;

sectionarea embrionului si repunerea jumatatilor rezultate in alte membrane pelucide;
obtinerea de himere, de clone;
transferul de gene, grupuri de gene, nuclei diploizi

30

BIBLIOGRAFIE

AUGHTRY, S.D., EMBRYO TRANSFER, 1987

CPRI RODICA, BIOCHIMIE ANIMAL.

EDITURA

MIRTON,

TIMIOARA, 2000
MARIOARA NICULA,

EDITURA

MIRTON,

TIMIOARA, 2004
N. PCAL, BIOTEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA VAC,

EDITURA MARINEASA, TIMIOARA, 2004

N. PCAL, TRANSFERUL DE EMBRIONI LA MAMIFERE, EDITURA

MARINEASA, TIMIOARA, 2004

TMA, V. ERBAN, M., MARIA COTRU, BIOCHIMIE MEDICAL

FIZIOLOGIE

ANIMAL,

VETERINAR, EDITURA DIDACTIC I PEDAGOGIC, BUCURETI, 1981

www.ince.ro
www.malex.sapte.ro
www.zooland.ro

31