CRISPR-CAS9

Qu significa?
Clustered regularly-interspaced short palindromic repeats (abbreviated as
CRISPR, pronounced crisper)/ repeticiones palindrmicas cortas agrupadas y
regularmente interespaciadas

Que son?
Son loci de ADN que contienen repeticiones cortas de secuencias de bases.
Tras cada repeticin siguen segmentos cortos de "ADN espaciador" proveniente
de exposiciones previas a un virus. Se encuentran en aproximadamente el 40%
de los genomas bacterianos y en el 90% de los genomas secuenciados de las
arqueas. Con frecuencia se hallan asociados con los genes cas, que codifican
para protenas nucleasas relacionadas con los CRISPR.

Dnde se aplica y en que consiste?

Desde 2013, el sistema CRISPR/Cas se ha utilizado para la edicin de genes
(agregando, interrumpiendo o cambiando las secuencias de genes especficos)
y para la regulacin gnica en varias especies. Al administrar la protena Cas9
y los ARN gua apropiados a una clula, el genoma de esta puede cortarse en
los lugares deseados, cuyas secuencias sern complementarias a las de los
ARN gua utilizados. Esto permite la eliminacin funcional de genes o la
introduccin de mutaciones (tras la reparacin del corte realizado por la
maquinaria celular de reparacin del ADN) para estudiar sus efectos.
Modificaciones recientes del sistema CRISPR/Cas9 permiten tambin actuar
sobre la transcripcin de los genes, modificando as solo su nivel de
funcionamiento, pero no la informacin gentica.
Quiz puedan usarse los CRISPRs para construir sistemas de entrega de genes
guiados por ARN que lleguen a alterar los genomas de poblaciones enteras.

Qu tcnica se usa?
CRISPR es una regin del ADN procariota que consiste de unidades repetidas
espaciadas por secuencias variadas de origen externo, formando un mdulo
que puede llegar a tener ms de cien unidades espaciador+repeticin. Bien,
este mdulo se transcribe a ARN, y ese ARN largo luego ser procesado
(cortado) para dejar pequeos ARNs que contienen el espaciador y un cachito

de la repeticin. Este proceso lo llevan las protenas asociadas a CRISPR (Cas =

Crispr associated). Bien, pues cada uno de estos pequeos ARNs maduros se
une a un complejo de protenas Cas (el complejo se llama Cascade). Como su
secuencia es complementaria a elementos genticos externos, puede
hibridarse por complementariedad a un virus o un plsmido que vengan de
fuera. Una vez reconoce esa diana especfica, las Cas se encargan de cortarla,
rompiendo as al virus o plsmido amenazante.
Por un mecanismo de adaptacin an bastante desconocido (intervienen Cas1
y Cas3, creo recordar), este mdulo CRISPR puede incorporar nuevas
secuencias en formato espaciador+repeticin a partir de las infecciones a las
que ha sobrevivido. De este modo, crea nueva inmunidad.
En la naturaleza, se estima que poseen CRISPR-Cas (muchas veces varios
mdulos de diferentes tipos en una clula) algo s como el 40% de las bacterias
y el 90% de las arqueas.

Tenemos entonces un sistema que corta ADN de forma muy especfica,

bsicamente, que es lo interesante para ingeniera gentica.
Por qu el tipo II es tan interesante? Pues porque sustituye todo el complejo
Cascade por una nica protena, Cas9, simplificando el asunto. Cas9 se une al
ARN, detecta con l la diana y la corta, todo en uno.
De esto se derivan luego las aplicaciones que sea, la verdad es que no estoy
tan al tanto de eso, pero por ejemplo para hacer deleciones selectivas
(knockouts) en gentica sirve, y supongo que tambin para introducir otras
secuencias (knock-ins), podra revisarlo. Esto puede simplificar muchsimo el
trabajo gentico en los muy complicados eucariotas.

Cas 9
Jennifer
Doudna
and
Emmanuelle Charpentier had independently been exploring CRISPR-associated
proteins to learn how bacteria use spacers in their immune defenses.[37] They
jointly studied a simpler CRISPR system that relies on a protein called Cas9.
They found that bacteria respond to an invading phage by transcribing spacers
and palindromic DNA into a long RNA molecule. The cell then uses tracrRNA
and Cas9 to cut this long RNA molecule into pieces called crRNAs.

Cas9 is a nuclease, an enzyme specialized for cutting DNA. It has two active
cutting sites (HNH and RuvC), one for each strand of the DNA's double helix.
The team demonstrated that they could disable one or both sites while
preserving Cas9's ability to home in on its target DNA. In 2012, a group
including both Doudna and Charpentier combined tracrRNA and spacer RNA
into a "single-guide RNA" molecule that, mixed with Cas9, could find and cut
the correct DNA targets. Their study proposed that such synthetic guide RNAs
could be used for gene editing.

Referencias:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0734975014001931
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24906146
http://science.sciencemag.org/content/346/6213/1258096