Sunteți pe pagina 1din 60

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III SUPORT PENTRU LUCRĂRI LE PRACTICE DE IMUNOLOGIE CAPITOLUL

SUPORT PENTRU LUCRĂRILE PRACTICE DE IMUNOLOGIE

CAPITOLUL 1. ORGANIZAREA SISTEMULUI IMUN

Imunologia este ştiinţa biomedicală ce studiază funcţia de apărare a organismului și bolile produse prin dereglarea sistemului imun:

Alergia = răspunsul imun faţă de un alergen (ex: astmul bronșic)

Autoimunitatea = răspuns anti-self (ex: screloza multiplă)

Rejecţia grefei = răspunsul imun faţă de ţesutul transplantat

Imunodeficienţa = răspunsul imun deficitar (ex: SIDA)

Imunologia clinică urmărește:

Imunosupresia = tratamentul bolilor autoimune

Imunostimularea = intervenţii imunoterapeutice (ex: vaccinuri)

Sistemul imun asigură apărarea organismului faţă de:

Agresorii externi de natură biologică: bacterii, virusuri, paraziţi, fungi, celule străine

Propriile molecule sau celule modificate, cum sunt celulele infectate şi celulele neoplazice

Celulele sistemului imun Celulele sistemului imun sunt distribuite difuz în tot organismul:

La porţile de intrare: tegumente şi mucoase – bucală, respiratorie, digestivă, genitală

În interstiţiul organelor interne: ficat, plămâni, rinichi

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

În sistemul circulator: sânge şi limfă

În cavităţile seroase: pleură, peritoneu, pericard

În sistemul nervos central

Există structuri specializate, aflate în organele limfoide, care au roluri esențiale

pentru buna funcționare a sistemului imun.

Organele limfoide sunt:

organe limfoide primare (centrale) - în care se formează leucocitele şi se maturează limfocitele: măduva hematogenă şi timusul; la adult, măduva hematogenă este sursa tuturor leucocitelor din organism organe limfoide secundare (periferice) - organele care captează agenții patogeni şi unde există un mediu favorabil interacţiunii între aceștia și limfocite:

ganglionii limfatici, splina, țesutul limfoid asociat mucoaselor MALT (mucous associated lymphoid tissue), țesutul limfoid de la nivel cutanat SALT (skin associated lymphoid tissue)

Principalele celulele efectoare ale sistemului înnăscut sunt polimorfonuclearele (în special cele neutrofile), macrofagele (MF) și celulele natural killer (NK). Macrofagele și polimorfonuclearele sunt celule fagocitare. Celulele NK au activitate împotriva celulelor proprii infectate viral și celulelor tumorale.

Limfocitele sunt celulele esențiale pentru sistemul adaptativ. Limfocitele recunosc specific antigenele pentru că au pe suprafaţă receptori cu structuri complexe. Un limfocit prezintă pe membrană un anumit tip de receptor care recunoaşte o singură structură antigenică. Nu există limfocite care să recunoască mai multe tipuri de antigene. Organismul vine în contact în timpul vieţii cu un număr foarte mare de antigene diferite, de ordinul milioanelor, astfel că este necesară existența unui număr foarte mare de subpopulații limfocitare care să aibă pe suprafaţă o varietate la fel de mare de receptori. Practic, în organism există zeci de milioane de subpopulații limfocitare, care diferă prin structura receptorilor de recunoaştere a antigenelor. O subpopulaţie de limfocite are pe suprafaţă acelaşi tip de receptor pentru antigen şi deci recunoaşte acelaşi antigen. Această subpopulaţie sau „familie” rezultă dintr-o singură celulă mamă şi se numeşte clonă de limfocite. O clonă de limfocite cuprinde un număr foarte mare de limfocite identice. Diferenţierea clonelor se face prin reorganizarea aleatorie a genelor care codifică structura proteică a receptorilor pentru antigen.

Astfel, răspunsul imun antigen specific este asigurat de: LB, LT și APC (antigen presenting cells), iar răspunsul imun antigen nespecific de: MF, neutrofile, NK.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Celulele APC se împart în:

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

profesioniste – a căror funcție principală este procesarea și prezentarea antigenelor către LT helper: MF, celule dendritice și LB ocazionale – care, în anumite condiții, sub influența unor citokine exprimă pe suprafață MHC II: fibroblaste, celule gliale, celule β pancreatice, celule epiteliale timice și tiroidiene, celule endoteliale

APC sunt celule cu rol esenţial în generarea RIU şi RIC faţă de antigenele timodependente, care sunt cele mai frecvente în natură. APC sunt singurele celule care pot recunoaște antigenele timodependente în formă nativă. APC prelucrează aceste antigene, selectează cele mai imunogene fragmente şi le prezintă limfocitelor.

Efectele sistemului imun Efectele sistemului imun sunt pozitive, prin protecţie împotriva structurilor non- self și eliminarea selfului alterat. Efectele negative sunt date de disconfortul generat de sindromul inflamator și afectarea selfului (autoimunitatea).

Inflamaţia este o reacţie nespecifică de apărare a organismului, cu caracter local sau general, în funcţie de severitatea şi de întinderea leziunilor produse de factorii patogeni. Când factorul patogen are o intensitate mică sau moderată, reacţia inflamatorie este un proces local. Dacă el are intensitate mare şi produce leziuni tisulare importante, se activează mecanismele de apărare din întregul organism şi apare reacţia sistemică postagresivă (RSPA). Reacţia inflamatorie se declanşează când agenţii patogeni au o intensitate suficient de mare pentru a produce leziuni tisulare. Din punct de vedere morfopatologic inflamaţia cuprinde fenomene alterative şi reacţionale. Fenomenele reacţionale sunt de tip vascular-exudativ şi proliferativ (de reparaţie). Starea de disconfort a pacientului este dată de vasodilataţie şi creşterea permeabilităţii capilare. În acest fel, histamina participă la formarea exudatului inflamator, manifestat prin semnele clinice: tumor, rubor, calor. Hiperemia explică două din semnele clinice de bază ale inflamaţiei: roşeaţa zonei inflamate (rubor) şi creşterea temperaturii locale (calor). Acidoza din focarul inflamator stimulează în exces terminațiile nervoase libere (TNL), declanșând senzația dureroasă (dolor).

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Tipuri de răspuns imun

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

IMUNITATEA NESPECIFICĂ ( ÎNNĂSCUTĂ)

IMUNITATEA SPECIFICĂ (DOBÂNDITĂ)

- Antigen independentă

- Fără timp de latenţă

- Nu este antigen specifică

- Nu apare memoria imunologică

- Antigen dependentă

- Cu timp de latenţă

- Antigen specifică

- Apare memoria imunologică

BARIERE FIZICE

- Piele

- Mucoasa intestinală

- Mucoasa respiratorie

-

Nu are

FACTORI SOLUBILI

- Secreţii proteice şi neproteice

-

Ig (Ac)

CELULE

-

-

-

Fagocite

Celule NK

Eozinofile

- LT

- LB

Celulele fagocitare

A.

NEUTROFILELE

Neutrofilele provin din măduva hematogenă, din celula suşă comună pentru monocite şi granulocite GM-CFU. Din seria granulocitară se diferenţiază neutrofilele (peste 90%), eozinofilele şi bazofilele. Neutrofilele trăiesc în sânge sub 24h, chiar dacă nu extravazează spre un focar inflamator. Aproximativ jumătate din ele se deplasează lent, rostogolindu-se pe endoteliul

vascular. Neutrofilele sunt celule polinucleare, cu un diametru de aproximativ 12 microni, cu o formă variabilă (datorită permanentei emiteri de pseudopode). Nucleul este multilobat și prezintă granulații citoplasmatice care conţin lizozim, NADPH oxidază, lactoferină. Neutrofilele se mai numesc polimorfonucleare neutrofile (PMN) datorită nucleului multilobat. Reprezintă 60 - 70% din totalul leucocitelor din sângele periferic. Neutrofilele sunt primele celule care ajung intr-un focar inflamator. Sunt celule cu rol foarte important în imunitatea innăscută (nespecifică). Neutrofilele străbat endoteliul capilar (diapedeză) și se deplasează în țesuturi (chemotactism) pentru a ajunge la nivelul focarului imun.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

Neutrofilele au rol important mai ales împotriva bacteriilor cu habitat extracelular, pe care le fagocitează. Markerul membranar specific pentru neutrofile este CD67.

B.

MACROFAGELE

Macrofagele (MF) provin din monocite, care se găsesc în sânge, în ţesuturi şi în cavităţile naturale ale organismului. Monocitele au originea în măduva hematogenă, dintr- un precursor comun cu PMN, sub influenţa M-CSF şi GM-CSF. Monocitele aderă de endoteliu datorită unor molecule de adeziune de pe suprafaţă. Aderarea se face numai pe anumite zone ale endoteliului, situate în vecinătatea unui focar imun. Celulele APC din focarul imun, respectiv MF şi celulele dendritice, eliberează o serie de citokine IL-1, TNF-alfa şi IFN-gama – care stimulează celulele endoteliale din vecinătate. Sub acţiunea unor citokine (IFN şi IL-2) cu rol inductor produse de limfocite, monocitele se diferențiază, transformându-se morfologic şi funcţional în MF rezidente şi apoi în MF activate. MF activate sunt capabile să îndeplinească funcţia de APC. MF tisulare au o durată de viaţă de câteva luni, până la câțiva ani.

MF sunt prezente difuz în organism, la nivelul ţesutului conjunctiv şi în apropierea membranei bazale a vaselor sangvine mici. Ele se află în număr mare în zonele unde există un aflux important de antigene: plămâni, ficat, splină şi ganglionii limfatici. Markerul membranar caracteristic pentru MF este CD14.

Transformarea monocitelor în MF presupune schimbări importante:

Dimensiunea celulelor creşte de 5-10 ori (MF au diametre de 25-50 microni).

Creşte numărul şi dimensiunea mitocondriilor şi lizozomilor, se dezvoltă aparatul Golgi.

Crește cantitatea de enzime hidrolitice (fosfatază acidă, beta-glucuronidază, catepsină, aril-sulfatază, lizozim, peroxidază, colagenază, elastază, proteaze, lipaze, fosfolipaze, muramidază etc).

Devin multinucleate prin fuzionare sau prin endomitoză.

Citoplasma emite numeroase pseudopode.

Funcțiile principale ale macrofagelor sunt:

fagocitoza – mecanism important de apărare nespecifică;

procesarea și prezentarea antigenului – rol de APC în apărarea nespecifică;

secreția de citokine și de mediatori ai inflamației – influențează atât imunitatea înnăscută, cât și pe cea adaptativă;

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

participă la procesele de reparație tisulară prin activarea fibroblaștilor;

determină moarte intra și extracelulară.

MF participă la răspunsul imun datorită funcţiei lor de APC și asigură:

Captarea Ag - MF captează în special Ag corpusculate: bacterii, virusuri, paraziţi mici, fragmente de celule self devenite antigenice; captarea este un proces imunologic nespecific, adică se face la fel, indiferent de structura Ag.

Fagocitoza Ag - pseudopodele emise de MF se unesc înglobând Ag corpusculat într- o vacuolă numită fagozom.

Prelucrarea Ag - fagozomul se uneşte cu lizozomii din citoplasma MF; Ag nativ endocitat este fragmentat de enzimele din lizozomi; din fragmentele rezultate este ales fragmentul cel mai imunogen, care se numeşte epitop.

Conservarea epitopilor - în MF se conservă o cantitate mică din epitopi, care sunt eliberaţi progresiv în următoarele zile; conservarea are rol în întreţinerea răspunsului imun mai mult timp şi în generarea unui răspuns imun mai intens printr-o stimulare mai puternică şi prelungită a limfocitelor.

Prezentarea epitopilor - epitopul selectat este cuplat cu moleculele MHC II şi este expus pe membrana MF; prin expunerea cuplului MHC II-epitop se face prezentarea epitopului spre LTH.

Succesiunea de evenimente care determină răspunsul celulelor fagocitare în infecţii:

aderarea vasculară –˃ diapedeza ˃ chemotaxia ˃ activarea ˃ fagocitoza şi moartea celulară

C. CELULELE KILLER NESPECIFICE

NK (natural killer) şi LAK (celule killer activate de limfokine)

K

MF activate

Eozinofilele

CELULELE NK NK fac parte din grupul mai numeros al limfocitelor mari, numite şi non-B non-T. Limfocitele non-B non-T au morfologie de LGL (large granular lymphocytes). NK au mai multă citoplasmă decât limfocitele mici.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

NK au rol în imunitatea înnăscută sau nespecifică. Ele intervin în primele momente ale unei infecţii virale şi elimină o parte dintre celulele self infectate. În acest mod ele oferă organismului răgazul pentru proliferarea clonelor de LB şi LT Ag-specifice, care vor eradica infecţia. De asemenea, celulele NK recunosc şi distrug celulele tumorale. Recunoaştererea celulei ţintă este imunologic nespecifică. Markerii membranari caracteristici pentru NK sunt CD56 şi CD16. Celulele NK activate de IL-2 şi IFN-gama se transformă în LAK (Limfokine Activated Killer).

Recunoaşterea celulei ţintă de către NK NK recunosc celula ţintă nespecific, prin mai multe mecanisme:

recunoaşterea nespecifică mediată prin IgG: NK prezintă pe suprafaţă receptori FcR, prin care recunosc şi distrug celulele opsonizate cu IgG.

recunoaşterea prin receptori de tip lectinic: pe suprafaţa celulelor infectate viral apar structuri glicoproteice cu greutate moleculară mare. Aceste structuri sunt recunoscute prin receptori cu structură lectinică de pe membrana NK.

recunoaşterea directă prin NK-R: se presupune că pe suprafaţa NK se află receptori NK-R care recunosc o structură prezentă fiziologic pe membrana tuturor celulelor somatice din organism. La celulele sănătoase aceste structuri ţintă sunt mascate de moleculele MHC I. Probabil că la celulele infectate viral sau malignizate scade expresia membranară a MHC I şi se demască ligandul membranar pentru NK, care se ataşează de celule şi le distruge.

Distrugerea celulei ţintă prin citotoxicitate extracelulară LTC şi NK realizează liza celulei ţintă prin mecanisme asemănătoare, prin eliberarea unor mediatori care produc leziuni ale membranei şi apoptoză. Mediatorii sunt conţinuţi în granulaţiile vizibile în LTC activate şi în NK. Cei mai importanţi mediatori citotoxici sunt:

perforina, limfotoxina, granzimele şi TNF.

CELULELE KILLER Celulele K sunt celule nedefinite morfologic, care au receptor de tip Fc pentru IgG (de foarte mare afinitate) și recunosc ţintele ”împachetate” în anticorpi. Activarea celulelor NK și K nu produce memorie imună. Nu există diferențe între răspunsul imun primar şi secundar. Celulele K interacţionează cu celula țintă prin intermediul receptorilor Fcγ. Celula tumorală ”tapetată” cu IgG este astfel uşor recunoscută de celulele K. Ele se activeazã şi lizează celula ţintă.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

D. CELULELE DENDRITICE

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

Celulele dendritice sunt specializate în prezentarea antigenelor. Se caracterizează printr-o structură arborescentă, cu un corp celular cu puţină citoplasmă perinucleară şi numeroase prelungiri ramificate care pătrund printre celulele din jur. Aceste pseudopode au un aspect caracteristic care a făcut să fie comparate cu dendritele neuronilor. Datorită lungimii lor, pseudopodele celulelor dendritice permit supravegherea unor spaţii întinse de ţesut cu ajutorul unui număr relativ mic de celule. Celulele dendritice au rol de APC pentru că pot să capteze şi să prezinte antigenele. Ele au pe suprafaţă principalii receptori implicaţi în funcţia de APC: CR (receptori pentru

fragmentul C3b al complementului), FcR şi pot să sintetizeze moleculele MHC II. Celulele dendritice îndeplinesc în cadrul răspunsului imun următoarele funcţii:

captează antigenele de la porţile de intrare

transportă antigenele spre organele limfoide secundare - ganglioni limfatici şi splină

prezintă în organele limfoide secundare antigenele spre LB şi LT

Pe parcursul desfăşurării funcţiei lor imunologice, clasele de celule dendritice se transformă una în alta. Se consideră în prezent că o celulă dendritică îşi schimbă

morfologia în funcţie de teritoriul unde se găseşte. Exista 4 tipuri principale de celule dendritice:

celulele Langerhans

celule dendritice interstițiale

celulele dendritice foliculare

celulele dendritice limfoide

Hematopoieza Hematopoieza este procesul prin care iau naştere celulele sangvine mature, funcţionale, iniţiat în viaţa intrauterină şi cantonat în final la nivelul măduvei osoase.

Necesită celule de origine şi micromediul hematopoietic. Celule hematopoietice (de origine) – se împart în 3 grupe: celule stem pluripotente (CSP), celule progenitoare hematopoietice și celule hematopoietice ale seriilor sangvine. În luna a 5-a fetală, în două săptămâni, cavităţile osoase sunt populate cu celule stromale. Celulele hematopoietice migrate din ficat traversează pereţii vaselor sinusoidale şi formează parenchimul hematopoietic. Componentele micromediului hematopoietic sunt: celulele stromale mezenchimale, reţeaua matriceală extracelulară și factorii de creştere produşi de celulele stromale:

Factori de stimulare ai coloniilor granulo-monocitare (GM-CSF)

Factori de stimulare ai coloniilor de macrofage (M-CSF)

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

Factori de stimulare ai coloniilor granulocitare (G-CSF)

Eritropoietina, trombopoietina

Citokine: interleukinele

Micromediul din timus. Timusul este un organ limfoepitelial care are în cortex limfocite, celule epiteliale, macrofage. Nidarea limfocitelor T se face prin atragerea în afara vaselor de către ß2-microglobuline şi dirijarea către zona cu celule epiteliale. Diferenţierea şi maturarea se fac în zona epitelială. Migrarea celulelor mature se realizează către zona medulară. Migrarea celulelor stem. În viaţa intrauterină migrează din sacul vitelin în ficat, din ficat în măduva osoasă, timus splină, ganglioni limfatici. La adult CSP se găsesc în sângele circulant şi măduva osoasă. Migrarea este explicată de:

intervenţia CSP în sectoarele medulare intens solicitate

căutarea de noi teritorii hematopoietice

menţinerea unei rezerve de CSP în sânge atunci când măduva este lezată

La naştere singurul organ hematoformator devine măduva osoasă. În jurul vârstei de 4 ani – măduva roşie din diafizele oaselor lungi dispare treptat fiind înlocuită cu celule adipoase. La 18 ani – ţesut hematopoietic se găseşte în vertebre,

stern, coaste, oasele craniene, pelvine, partea proximală a epifizelor oaselor lungi.

Țesutul limfatic. Țesutul limfatic este strâns legat de formarea măduvei osoase. Apare în plexul limfatic în săptămâna a 9-a şi în glandele limfatice în săptămâna a 11-a. La nivelul splinei – în perioada de declin a mielopoiezei apare limfopoieza. Timusul devine organ limfopoietic în săptămâna a 9-a. Aici vin celulele stem din ficat, splină și măduva osoasă. După naştere, ţesutul limfatic rămâne prezent în măduva osoasă, dar devine mult mai extins în ganglionii limfatici, plăcile Peyer și timus.

Teorii asupra procesului de “angajare” a celulelor stem:

1) Teoria stochastică – angajarea celulară survine la întâmplare, factorii de reglare acţionează doar în etapele tardive ale hematopoiezei. 2) Teoria micromediului inductor – direcţionarea celulei stem depinde de structura micromediului medular din acel moment. 3) Teoria umorală – angajarea depinde de factori umorali care se întrec între ei pentru fixarea pe receptorii celulelor stem.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

Modul de recoltare, prelucrare, transport și stocare a probelor de sânge

(după Synevo – servicii medicale de laborator)

Pregatirea pacientului

1.

Recoltarea probelor se face cu pacientul în condiții bazale, înaintea oricărei proceduri diagnostice sau terapeutice (ideal între orele 7 și 9 dimineața, în condiții ”à jeun” – pe nemâncate); pentru evaluarea metabolismului lipidic se recomandă ca recoltarea să se efectueze după 12 ore de la ultima masă.

2.

Când probele de sânge nu sunt recoltate în condiții bazale, trebuie ținut seama de efectele adiționale pe care le pot produce efortul fizic (chiar și efortul fizic moderat poate determina o creștere a c% de glucoză, acid lactic, proteine serice, CK), precum și a stării emoționale sau ritmului circadian care poate afecta anumiți parametri.

3.

Pacientul stă într-o poziție comodă (în poziție șezândă sau în decubit dorsal).

4.

Datele demografice ale pacientului trebuie să fie corect scrise pe formularul de înregistrare de la punctul de recoltare a sângelui și recipientul de recoltare corect etichetat.

Recoltarea sângelui venos Sângele este recoltat prin puncție venoasă, la nivelul fosei antecubitale, cu ajutorul unui sistem vacuum: tubul este vidat în momentul imediat anterior recoltării, eliminându- se riscul pierderii de vid; proporția de sânge recoltat-aditiv rămâne constantă, fapt ce conduce la rezultate corecte. Probele de sânge sunt recoltate cu sistemul holder-vacutainer:

de s â nge sunt recoltate cu sistemul holder-vacutainer: Î naintea recolt ă rii s â

Înaintea recoltării sângelui, se desface acul prin răsucirea capacului sigilat. Se

înlătură capacul și se expune partea filetată (1), având grijă să nu se îndepărteze teaca sterilă în care se găsește acul (2). Se asamblează acul la holder (3). Toate tuburile (4) pot fi acum umplute unul dualtul, în concordanță cu instrucțiunile de mai jos:

a. Se aplică un garou pe antebrațul pacientului și se înțeapă pielea din plica cotului, cu ajutorul degetului mare și al indexului mâinii drepte.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

b. Se inverseapoziția mâinilor cât mai curând posibil după ce acul a penetrat vena; se apasă vacutainerul cu degetul mare al mainii drepte, indexul și degetele mijlocii, susținându-l.

c. Sângele este atras de vacuumul din vacutainer și curge în tub cu viteză proprie; se elibereagaroul din jurul brațului pacientului imediat ce sângele a aparut în vacutainer, cu ajutorul mainii stângi, susținând în continuare holderul.

d. Se retrage vacutainerul cu mâna dreaptă, apăsând ușor cu degetul mare pe una dintre marginile holderului.

e. Pentru a asigura optima omogenizare a sângelui cu anticoagulantul, se efectuea8-10 mișcări de inversiune a tubului.

f. Daca se recoltează mai mult de un vacutainer, se inseră cel de-al doilea tub și se repetă pașii descriși anterior.

de un vacutainer, se inser ă cel de-al doilea tub ș i se repet ă pa
de un vacutainer, se inser ă cel de-al doilea tub ș i se repet ă pa
de un vacutainer, se inser ă cel de-al doilea tub ș i se repet ă pa
de un vacutainer, se inser ă cel de-al doilea tub ș i se repet ă pa
de un vacutainer, se inser ă cel de-al doilea tub ș i se repet ă pa
de un vacutainer, se inser ă cel de-al doilea tub ș i se repet ă pa

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

Indiferent de sistemul de recoltare folosit, se respectă următoarele manevre:

- se utilizează mănuși sterile, de unică folosință pentru fiecare pacient căruia i se recoltează probe;

- se evită puncționarea în zonele în care există leziuni cutanate;

- se dezinfectează zona aleasă pentru puncționare cu ajutorul unui tampon steril

îmbibat în soluție apoasă de izopropanol 70%, prin mișcări circulare, din interior spre

exterior, pentru a îndepărta contaminanții;

- după tamponare, se lasă să se usuce zona înainte de a trece la puncționare (dacă

zona este umedă, poate fi indusă hemoliza probei);

- la sfârșitul puncționării, se aplică imediat un tampon compresiv pentru a asigura

hemostaza și a evita formarea hematomului (durata recomandată a compresiei este de 5 mininute);

- la sfârșit se acoperă zona cu un pansament steril;

- acul de puncție nu va fi reintrodus în teacă (pentru a evita înțeparea), îndoit sau

iat, ci va fi depus într-un container de plastic rezistent la reziduuri înțepătoare sau

tăietoare.

Aditivi utilizați Pentru a împiedica procesul de coagulare a sângelui integral, unele vacutainere conțin substanțe anticoagulante; anticoagularea se produce fie prin legarea Ca 2+ (EDTA, citrat de dextroză), fie prin inhibarea trombinei (heparinat de litiu sau sodiu, hirudină). Pentru a nu exista nicio confuzie în identificarea tubului de recoltare, capacele

vacutainerelor sunt colorate diferit, în funcție de aditivul folosit. Codurile de culoare pentru substanțele anticoagulante sunt descrise în ISO/DIS 6710:

1. Capac mov/roz - folosește ca anticoagulant EDTA și are utilitate în hematologie, biologie moleculară, unele teste imunochimice (ex. ACTH).

2. Capac bleu/verde - conține Citrat 9+1 și se folosește pentru analiza coagulării.

3. Capac negru/mov - conține Citrat 4+1 și se folosește pentru VSH.

4. Capac verde/portocaliu - conține Heparinat și se utilizează plasmă pentru testele de biochimie.

5. Capac roșu/incolor - este un tub fără anticoagulant. Serul este folosit pentru testele de chimie, imunologie și serologie.

Unele vacutainere destinate obținerii serului conțin un activator de coagulare (care accelerează formarea cheagului) și un gel separator, care permite menținerea serului după centrifugare în tuburile primare, în cursul fazei preanalitice (transport către laborator), analitice și postanalitice (stocarea probelor în laborator).

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Ordinea recoltării tuburilor

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

În cazul în care este nevoie să se obțină mai multe probe dintr-o singură flebotomie (puncție venoasă), se recomandă să se respecte următoarea ordine de recoltare a tuburilor:

1. recipientele pentru hemocultură;

2. tuburile fără aditivi;

3. tuburile ce conțin citrat;

4. tuburile ce conțin heparină;

5. tuburile ce conțin EDTA.

Volumul optim de probă Una din erorile cel mai des întâlnite este trimiterea la laborator a unei cantități insuficiente de probă. Pentru a vă asigura că există un volum adecvat de probă, se recoltează întotdeauna sânge într-o cantitate de 2 ori și jumătate mai mare decât volumul necesar efectuării unui anumit test (la fiecare test este precizat volumul minim de ser sau plasmă necesar procesului analitic). În același timp, trebuie să se evite recoltarea excesivă de sânge, în special la vârstnici, copii mici, pacienți internați în secțiile de terapie intensivă. În cazurile frecvente, în care pacienților le sunt indicate mai multe teste, se ține cont de următoarele volume de sânge recomandate în cazul folosirii analizoarelor automate actuale:

- 4-5 mL sânge pentru efectuarea unui profil de investigații biochimice uzuale;

- 1 mL sânge pentru efectuarea a 3-4 teste de imunochimie.

Obținerea sângelui pentru imunofenotipări

Urmărește determinarea populațiilor și subpopulațiilor celulare

Se recoltează 2-3 mL sânge venos într-o eprubetă sterilă, pe anticoagulant (heparină)

Sângele se prelucrează în maxim 6 ore de la recoltare

Metoda folosită - citometrie în flux. Valori de referință și comunicarea rezultatelor Buletinul final va conține intervalele de referință pentru subseturile limfocitare adecvate vârstei pacientului împreună cu o interpretare a rezultatelor obținute. Trebuie cunoscut faptul că numărul absolut al populațiilor limfocitare este influențat de o serie de factori biologici, inclusiv hormoni, temperatură și mediul înconjurător. Studiile legate de variațiile circadiane au demonstrat o creștere progresivă a numărului de celule CD4+ în cursul zilei, în timp ce limfocitele CD8+ și limfocitele B CD19+ cresc doar în prima parte a zilei, fără a se modifica în cursul după-amiezei.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

Din acest motiv, atunci când se efectuează o monitorizare seriată a populațiilor limfocitare se recomandă ca probele de sânge să se recolteze în același moment al zilei.

Obţinerea sângelui pentru determinarea activității funcţionale a Ly, Mo, Gran

Se recoltează venos sânge venos pe anticoagulant (heparină)

Se prelucrează în maxim 4 ore

Determinarea activității funcționale a leucocitelor este indicată în urmărirea infecției HIV, cu monitorizarea serială a numărului de celule T CD4+ pentru evaluarea progresiei bolii, stabilirea indicației de terapie antiretrovirală și de tratament profilactic al infecțiilor oportuniste, precum și evaluarea răspunsului la terapie. Este foarte importantă determinarea cât mai precisă a numărului absolut de celule CD4+, acest lucru realizându-se prin utilizarea unui număr cunoscut de microsfere (TruCount beads) la care se adaugă un volum cunoscut de probă.

Obținerea sângelui pentru tipizarea HLA (MHC)

Complexul HLA este plasat pe brațul scurt al cromozomului autozom 6.

Se recoltează 8,5mL sânge venos periferic în vacutainer ce conţine citrat de dextroză (ACD). Sângele se prelucrează în maxim 4 ore de la recoltare.

 

Kit-urile specifice permit tipizarea de rezoluție înaltă a alelelor într-un singur test.

Metoda SSP (Sequence Specific Primers) se bazează pe tehnologia PCR care folosește

primeri specifici pentru tipizarea ADN din țesuturi.

 
Fiecare kit de primeri specifici const ă î ntr-un panel de primeri, fiecare con ț

Fiecare kit de primeri specifici constă într-un panel de primeri, fiecare conținând o

pereche specific ă de primeri (specifici pentru o alel ă sau un grup de alele)

pereche specifică de primeri (specifici pentru o alelă sau un grup de alele) cât și o pereche

de primeri de control specifici pentru secvențele non-alelice prezente în toate probele.

 
 

Acest

control

acționează

ca

un

control

PCR

intern

pentru

a

verifica

eficiența

amplificării PCR.

 

HLA = Human Leukocyte Antigen = antigene de histocompatibilitate = MHC = Major

Histocompatibility Complex = complexul major de histocompatibilitate

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

MHC este format din molecule solubile sau aflate pe diferite suprafețe celulare, cu roluri importante în funcționarea normală a sistemului imun. Complexul major de histocompatibilitate este implicat în imunitatea adaptativă (specifică) având un rol esențial în discriminarea între self și nonself. De asemenea, intervine și în imunitatea nespecifică. Complexul major de histocompatibilitate mai este cunoscut sub numele de sistemul HLA (human leukocyte antigen).

Există 2 clase principale:

Moleculele MHC I sunt glicoproteine aflate pe suprafața aproape tuturor celulelor nucleate și a trombocitelor. Au rolul de a prezenta antigenele peptidice interne limfocitelor T citotoxice. Neuronii și spermatozoizii nu prezintă molecule MHC I pe membrane. Limfocitele au pe suprafață numeroase molecule ale complexului major de histocompatibilitate de tip I - până la 10 5 receptori/celulă.

Moleculele MHC II se găsesc pe suprafața celulelor prezentatoare de antigen (în special macrofage, monocite, celule dendritice și limfocite B). Au rolul de a prezenta antigenele procesate de către aceste celule limfocitelor T helper. Numărul moleculelor MHC II aflate pe suprafața monocitelor și macrofagelor neactivate este redus. Stimularea antigenică determină creșterea semnificativă a expresiei acestor receptori pe membrană.

Funcțiile MHC I și MHC II Moleculele MHC I și MHC II au un rol esențial în recunoașterea antigenului de către limfocitele T. Aceste limfocite sunt implicate în generarea atât a raspunsului imun umoral cât și a celui celular. Spre deosebire de limfocitele B, limfocitele T nu pot recunoaște decât acele antigene prezentate în combinații cu moleculele MHC (mecanism de restricție MHC).

Limfocitele T helper recunosc doar antigene exogene prezentate împreuna cu MHC II, iar limfocitele T citotoxice recunosc antigene endogene prezentate împreună cu MHC I.

Moleculele MHC se asociază cu fragmente peptidice care au fost procesate anterior în diferite compartimente ale celulei:

MHC I se leagă de peptide derivate din antigene endogene, care au fost procesate în citoplasma celulei: proteine normale celulare, tumorale, virale, proteine care provin din bacterii cu habitat intracelular.

MHC II formează complexe cu peptidele rezultate în urma procesării antigenelor exogene, care au fost internalizate prin fagocitoză de către celule specializate (mai ales macrofage și celule dendritice).

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

Toate celulele care prezintă pe suprafață receptori MHC I pot prezenta antigene endogene limfocitelor T citotoxice. Această prezentare determină activarea limfocitelor T citotoxice, cu declanșarea raspunsului imun celular, care are drept finalitate eliminarea acestor celule neoplazice sau infectate cu germeni intracelulari. Astfel, celulele care prezintă antigene prin intermediul MHC I catre LT citotoxice sunt de fapt celule țintă pentru acestea din urmă. Antigenele exogene pot fi procesate și prezentate limfocitelor T helper doar de către celule specializate care au pe suprafață molecule MHC II (celule prezentatoare de antigen).

Obţinerea serului

- Se recoltează 8-10mL sânge venos într-o eprubetă de centrifugă

- Se introduce proba la 37 0 C timp de 15 min, până la completa coagulare

- Se decantează serul într-o altă eprubetă de centrifugă

- Serul rezultat se centrifughează 5 min la 3000 rpm

- Serul poate fi păstrat timp de 1-2 ani la -20 0 C

Utilizarea antibioticelor (Ab) şi antimicoticelor (Am) în mediul de cultură

Antibiograma presupune testarea sensibilității unei tulpini bacteriene izolate dintr- un produs patologic față de diverse antibiotice. Astfel se caracterizează capacitatea acestora de a opri dezvoltarea microbiană și oferă informații pentru selectarea celui sau celor mai active antibiotice față de microorganismul testat. Antibiograma se face după stabilirea diagnosticului etiologic, prin izolarea în cultură pură și prin identificarea agentului patogen. Tratamentul se realizează în funcție de rezultatele date de antibiogramă, alegând antibioticul cel mai eficace, adică față de care bacteria izolată are cea mai mare sensibilitate. Principiul antibiogramei constă în capacitatea Ab de a împiedica multiplicarea bacteriană, fenomen cunoscut ca efect bacteriostatic. Unele Ab au în anumite concentrații și proprietatea de a omorî bacteriile: efect bactericid.

Metode folosite pentru testarea sensibilității in vitro la antibiotice Metoda difuzimetrică Kirby Bauer (clasică): aceasta se efectuează pe medii solide, în plăci Petri, pe care s-a însămânțat în pânză cultura bacteriană; apoi pe suprafața mediului se dispun discuri cu antibiotice astfel că în jurul acestora se va realiza un gradient de concentrație prin difuziunea locală a antibioticului (în imediata vecinătate a discului obținându-se o c% mai mare de antibiotic care descrește pe măsura îndepărtării de acesta).

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

G

gentamicina (mycoplasme, bacterii G+/-), amphotericina B (fungi).

Se utilizează penicilina

(bacterii

G+),

streptomicina

sulfat

(bacterii

G+/-),

Metoda cu antibiotic încorporat în mediu semisolid (modernă): permite determinarea sensibilităţii microbiene la un set de agenți antibacterieni/ antifungici, încorporate într-un mediu semisolid. Este alcătuită din 16 perechi de godeuri, din care 2/4 nu conţin antibiotice/antifungice şi sunt martori de creştere. Celelalte perechi de godeuri conţin diferite antibiotice în câte două concentraţii (c = concentrație mai mica şi C = concentrație mai mare) pentru a putea eticheta fiecare tulpină testată ca fiind sensibilă, intermediară sau rezistentă. Din tulpina de testat este preparată o suspensie care este transferată în mediul de cultură cu care este inoculată galeria. Rezultatele se citesc vizual sau automat dupa 24-48 ore de incubare la 37C. Interpretarea rezultatelor:

Rezistența la un anumit antibiotic este evidențiată prin virajul culorii spre roșu în godeurile unde microbii au crescut fără a fi deloc inhibați.

Rezistența intermediară la antibiotic este evidențiată prin culoarea portocalie din godeurile respective, unde microorganismele au fost inhibate doar la concentraţia crescută a antibioticului.

În godeurile în care microorganismele nu au crescut deloc, nici la concentraţia scăzută, nici la cea crescută a antibioticelor, culoarea virează spre glaben și arată sensibilitatea microbului față de Ab respectiv.

Tehnici de biologie moleculară Reacţia de amplificare enzimatică – PCR Reacţia PCR (Polymerase Chain Reaction) este o metodă de amplificare enzimatică in vitro a unei anumite secvenţe de ADN. În prezent a fost dezvoltată o adevarată tehnologie PCR care este folosită într-o varietate foarte mare de domenii: biologie moleculară, ştiinţele mediului, criminalistică, ştiinţe medicale, biotehnologie, microbiologie, industria alimentară, epidemiologie etc. Tehnica PCR imită replicarea ADN in vivo.

Variante tehnice şi aplicații ale tehnologiei PCR

diagnosticul unor boli monogenice, precum şi detectarea de noi tipuri de mutaţii în gene importante în anumite boli

diagnosticul unor boli infecţioase: permite detectarea particulelor infecţioase bacteriene şi virale aflate într-o proporţie mică, chiar pentru specii ce se cultivă dificil in vitro, pentru patogeni cu variabilitate antigenică mare şi pentru

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

patogeni ce au perioadă mare de latenţă; astfel, pot fi identificaţi indivizii umani pozitivi înainte de seroconversie

studii privind mecanismele genetice ce acompaniază procesele maligne (detectarea secvenţei şi ţesutului în care se exprimă anumite oncogene în diverse procese maligne)

studii de taxonomie, sistematică şi filogenie moleculară: obţinerea rapidă a unei cantităţi mari din secvenţe ADN cu valoare taxonomică şi/sau filogenetică

biologia populaţiilor, inclusiv la organisme mici: tehnologia PCR permite secvenţierea rapidă a unor molecule de ADN de la foarte mulţi indivizi, fără a necesita în prealabil clonarea acestora

studii de antropologie: tehnica PCR permite în prezent recupe-rarea şi analiza unor secvenţe ADN din fosile

medicină legală: cu ajutorul reacţiilor PCR pot fi în prezent analizate la nivel molecular o serie întreagă de probe biologice

Materiale necesare

Tuburi PCR de 0,2/0,5 mL

Vârfuri pentru pipete automate

Materialele trebuie să fie noi și sterile

Tehnica de lucru Se realizează prin combinarea unei probe de ADN cu primeri oligonucleotidici, deoxiribonucleotidtrifosfați (dNTP) și o ADN-polimerază termosensibilă (Taq-polimeraza), într-un tampon corespunzător. Prin încălzirea și răcirea repetată a amestecului (30-40 cicluri), se obține nivelul de amplificare dorit. Treptele de temperatură ale unei racţii PCR standard Denaturarea iniţială Pentru ca o reacţie PCR să se desfăşoare eficient, este foarte important ca moleculele ADN matriţă să fie denaturate iniţial complet. Acest lucru poate fi realizat prin încălzirea iniţială a amestecului de reacţie 2 min la 94-95 o C. Treapta de denaturare din cadrul fiecărui ciclu De obicei, este suficientă o denaturare de 20-30 sec la 94-95 o C, dar aceasta trebuie adaptată funcţie de termocycler şi de tuburile folosite (de ex., dacă se lucrează în tuburi de 500 μL sunt necesari timpi mai lungi decât dacă se lucrează în tuburi de 200 μL). Ataşarea primerilor În marea majoritate a experimentelor, temperatura de ataşare a primerilor trebuie determinată şi optimizată empiric. Alegerea acestei temperaturi reprezintă unul din factorii critici pentru asigurarea unei înalte specificităţi a reacţiei PCR. Dacă

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

temperatura de ataşare este mult prea înaltă, nu are loc ataşarea primerilor, iar dacă temperatura este prea scăzută, atunci creşte probabilitatea ataşărilor nespecifice. Polimerizarea propriu-zisă Taq-ADN polimerizează aproximativ 60 baze per secundă la 72 o C. În fiecare ciclu, o perioadă de polimerizare de 45 sec este suficientă pentru amplificarea unor fragmente de până la 1 kbp. Pentru amplificarea unor fragmente mai mari de 1 kbp, timpul se calculează în multiplii de 45 sec, urmat de ajustări pentru diverse matriţe. Pentru a obţine o cantitate cât mai mare de amplicon, se poate varia timpul de polimerizare, astfel:

pentru primele 10 cicluri se foloseşte un timp constant de polimerizare (de ex. 45 sec pentru 1 kbp)

pentru următoarele 20 de cicluri se creşte timpul de polimerizare cu 2-5 sec per ciclu (de ex. 50 sec pentru ciclul 11, 55 sec pentru ciclul 12 etc.).

O

asemenea mărire progresivă a timpului de polimerizare oferă enzimei mai mult

timp pentru polimerizare, pentru că pe măsură ce reacţia PCR avansează, în amestecul de reacţie se găseşte din ce în ce mai multă matriţă şi din ce în ce mai puţină enzimă activă (randamentul enzimei scade datorită expunerii prelungite la temperaturi înalte). Numărul de cicluri Într-o reacţie PCR obişnuită, mai puţin de 10 molecule de matriţă pot fi amplificate

în mai puţin de 40 cicluri, obţinându-se un produs (amplicon) detectabil în electroforeză în gel de agaroză. La o creştere mult prea mare a numărului de cicluri, se pot acumula produşi de reacţie nespecifici. Polimerizarea (extensia) finală

În multe reacţii, după ultimul ciclu de amplificare, tuburile de reacţie se țin 5-15 min

la 72 o C pentru a realiza polimerizarea completă a produşilor parţiali, precum şi renaturarea moleculelor monocatenare.

PCR în mutageneza situs-specifică Pornind de la faptul ca primerii folosiţi într-o reacţie PCR sunt incluşi în produsele PCR (ampliconi), au fost dezvoltate o serie întreagă de variante tehnice ale acestei reacţii. Astfel, în experimentele de mutageneză situs-specifică, modificările dorite pot fi introduse în ampliconi pe calea primerilor, fie că este vorba de inserţii sau de deleţii. În toate aceste cazuri se utilizează o tehnologie PCR în care reacţia de amplificare este împărţită în 2 reacţii PCR separate în care sunt amplificate cele 2 secvenţe ADN aflate de o parte şi de alta a situsului de modificat. În aceste 2 etape se folosesc perechi de primeri constituite dintr- un primer extern (pentru capătul moleculei ADN iniţiale) şi un primer intern (primerii interni sunt complementari situsului de modificat şi conţin în secvenţă modificarea dorită). Prin folosirea unor asemenea primeri, ampliconii rezultaţi conţin deja modificarea dorită, precum şi o zonă de complementaritate inter-ampliconi.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

După această etapă se realizează îndepartarea primerilor interni, amestecarea celor 2 produse PCR, denaturarea termică a moleculelor urmată de renaturarea acestora în condiţii de stringenţă. Se adaugă primeri exteriori şi se realizează o noua reacţie PCR, al cărei rezultat va fi reprezentat de molecule ADN identice cu matriţa inițială, conţinând însă şi modificarea dorită. Spre deosebire de tehnicile clasice de mutageneză, şi chiar de experimentele de mutageneză cu ajutorul transposonilor, asemenea variante tehnice de PCR permit o rezoluţie şi o acurateţe mult mai mare în obţinerea de molecule ADN modificate. În marea majoritate a cazurilor, aplicaţiile practice vizează analiza corelaţiilor dintre secvenţa de nucleotide a unor molecule ADN şi realizarea anumitor funcţii.

Prelucrarea rezultatelor

Probele obținute se analizează prin electroforeză în gel de agaroză 1%

După migrare, gelul se examinează la UV

ARN-ul, în mod normal, migrează în fața ADN-ului

CAPITOLUL 2. RELAŢIA AG-AC ŞI MECANISME DE RĂSPUNS IMUN

Imunoglobulinele sunt glicoproteine specializate în recunoaşterea moleculelor non- self. Se găsesc sub două forme, circulantă şi de membrană:

Forma circulantă este reprezentată de moleculele de anticorpi, care se găsesc în plasmă, lichidul interstiţial şi secreţii. Anticorpii sunt sintetizați de plasmocite, celule care provin din LB activate în urma contactului cu antigenul.

Forma membranară este reprezentată de monomeri de imunoglobuline, fixaţi pe suprafaţa LB. Aceste molecule intră în alcătuirea receptorilor pentru antigen ai limfocitelor B (B-cell receptors - BCR). Au rol de de activare a LB. Imunoglobulinele solubile sunt proteine care migrează pe electroforeză în principal în fracţiunea gamaglobulinelor. Imunoglobulinele nu migrează exclusiv în fracţiunea γ. Există clase importante de imunoglobuline care se regăsesc în fracţiunile α şi β ale electroforezei.

Cele mai multe antigene cu care organismul vine în contact au o structură complexă. În general, pentru un anumit antigen, sistemul imun va genera mai multe tipuri de anticorpi, care vor recunoaşte diferiţi epitopi. Fiecare anticorp recunoaşte specific un anumit epitop, de care se leagă cu o porţiune care are structură complementară cu a epitopului. Această porţiune se numeşte paratop, situs de legare sau situs combinativ.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Funcţiile anticorpilor

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

Anticorpii au un rol esenţial în îndepărtarea antigenelor solubile şi în distrugerea antigenelor corpusculate. Nu toate clasele de anticorpi prezintă aceleaşi proprietăţi funcţionale.

În cele mai multe cazuri, simpla legare a anticorpilor de antigene nu determină distrugerea bacteriilor sau îndepărtarea antigenelor moleculare. Legarea anticorpului de antigen se realizează prin intermediul fragmentului Fab, în timp ce fragmentul Fc este responsabil de funcţiile biologice. Acest fragment are capacitatea de a activa molecule efectoare ale sistemului imun şi de a fi recunoscut de către celule imunocompetente.

Funcţiile principale ale anticorpilor sunt:

opsonizarea – favorizează fagocitoza Ag de către MF şi PMN. Aceste celule prezintă pe suprafaţa receptori pentru fragmentul Fc, numiţi FcR. Aceşti receptori permit legarea complexelor antigen/anticorp pe suprafaţa MF şi neutrofilelor. Legarea mai multor complexe imune pe suprafaţa fagocitelor determină iniţierea unui semnal de transducţie intracelulară care are drept rezultat fagocitoza acestora. Fagocitoza este un proces complex, prin care agentul patogen este internalizat şi devine ţinta unor mecanisme de distrugere care determină liza patogenului.

activarea complementului pe calea clasică este o proprietate pe care o posedă moleculele de IgM şi cele mai multe subclase de IgG.

citotoxicitatea mediată celular dependentă de anticorpi (ADCC) permite distrugerea celulelor proprii ale organismului care au fost infectate viral sau cu bacterii intracelulare. Celulele infectate viral produc proteine virale care servesc replicării virusului. Unele dintre aceste molecule sunt expuse pe suprafaţa celulei respective. Moleculele virale sunt recunoscute ca non-self, ceea ce declanşează un răspuns imun umoral, cu producerea de anticorpi care se fixează pe aceste molecule de suprafaţă. Celulele natural killer (NK), care au un rol important în răspunsul imun celular, prezintă receptori pentru fragmentul Fc. Astfel, anticorpii direcţionează celulele NK spre celulele infectate viral, cu liza acestora din urmă.

Structura anticorpilor

Similar altor molecule proteice, imunoglobulinele au o organizare spaţială complexă, caracterizată prin structură primară, secundară, terţiară și cuaternară. Toate imunoglobulinele au o structură asemănătoare, reprezentată de o unitate tetracatenară. Planul de organizare al domeniilor imunoglobulinelor se regăseşte în multe alte proteine,

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

de exemplu la unii receptori de suprafaţă. Proteinele care conţin cel puţin un domeniu imunoglobulinic constituie superfamilia imunoglobulinelor. Toate tipurile de anticorpi au structură comună, fiind alcătuiţi din 4 lanţuri peptidice: două lanţuri identice uşoare (L) şi două lanţuri identice grele (H). Fiecare lanţ uşor este legat de un lanţ greu printr-o punte disulfidică şi prin diferite alte legături noncovalente. Astfel se formează un heterodimer H - L. Heterodimerii sunt legaţi între ei de asemenea prin punţi disulfidice şi legături noncovalente. Numărul de legături disulfidice şi aşezarea acestora diferă în funcţie de familia de imunoglobuline.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Structura imunoglobulinelor este strâns legată de funcţiile pe care acestea trebuie să le îndeplinească. Pe de o parte, anticorpii se leagă în mod specific de antigene, iar pe de altă parte pot forma legături cu o varietate de molecule efectoare şi celule.

Papaina este o enzimă care scindează molecula de imunoglobulină în trei fragmente:

două fragmente identice care au capacitatea de a lega antigene. Acestea au fost denumite Fab - antigen binding. Aceste fragmente sunt alcătuite dintr-un lanţ uşor L şi capătul N-terminal al unui lanţ greu H, legate prin punţi disulfurice. Fragmentele Fab conţin regiunea variabilă V. Existenţa a două situsuri de legare permite anticorpului să lege două molecule de antigen.

un fragment Fc - fragment cristalizabil, care nu prezintă capacitatea de legare a antigenelor. Acest fragment este alcătuit din resturile lanţurilor H. Fragmentul Fc este diferit în funcţie de familia de imunoglobuline.

Există două tipuri de lanţuri uşoare L: λ şi κ. Nu există diferenţe funcţionale între anticorpii care au lanţuri λ faţă de cei cu lanţuri κ, iar motivul pentru care există această variaţie nu este cunoscut. Aceste două tipuri de lanţuri intră în alcătuirea tuturor claselor majore de imunoglobuline. În schimb, diferenţele structurale existente între lanţurile grele H sunt definitorii pentru încadrarea imunoglobulinelor în anumite clase şi influenţează semnificativ funcţia acestora. Există 5 izotipuri majore de lanţuri grele H: γ, µ, α, δ, ε. Pe baza deosebirilor existente în structura lanţurilor H au fost descrise 5 clase de imunoglobuline: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE.

Situsul combinativ Primii 100 de aminoacizi ai capetelor N-terminale ale lanţurilor H şi L prezintă o variabilitate marcată între anticorpi cu specificitate diferită. Aceste segmente sunt denumite regiunile V: VL pentru lanţurile uşoare şi VH pentru lanţurile grele. Specificitatea diferită a anticorpilor este datorată acestei regiuni variabile.

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

Asocierea dintre VH şi VL crează o zonă hipervariabilă, care este locul de legare a antigenelor. Aceasta a fost denumită situs combinativ sau situs de legare a antigenului. În interiorul regiunii variabile, există anumite poziţii care sunt relativ constante de la moleculă la moleculă şi zone care foarte rar sunt ocupate de acelaşi aminoacid. Aceste poziţii numite hipervariabile constituie locul de legare cu antigenul şi au fost denumite regiuni determinante ale complementarităţii (CDR - Complementary Determining Regions). Sistemul imun este capabil să producă anticorpi împotriva unei repertoriu vast de antigene prin generarea de imunoglobuline care prezintă CDR specifice pentru fiecare antigen.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Situsul combinativ pentru antigen este o cavitate mică formată prin plicaturarea domeniilor VH şi VL. Antigenul intră în această cavitate şi angajează legături cu domeniile V prin complementaritate, pe principiul cheie-broască. Secvenţele de aminoacizi care nu stabilesc legături cu antigenul formează regiunea suport FR (framework region).

Cu excepţia regiunilor variabile, structura imunoglobulinelor este relativ constantă pentru moleculele din această clasă.

Clasele de imunoglobuline

Imunoglobulinele G

Imunoglobulinele G (IgG) sunt distribuite egal în sectorul intravascular şi interstiţial. Moleculele de IgG sunt formate din două lanţuri grele γ şi două lanţuri uşoare κ sau λ. Există 4 subclase de IgG, pe baza diferenţelor existente la nivelul lanţurilor γ: IgG1, IgG2, IgG3 şi IgG4.

Au concentraţia plasmatică cea mai mare

Realizează imunizarea pasivă umorală a nou-născuţilor în primele luni de viaţă

Fixează complementul (IgG4)

Reprezintă peste 75% din totalul Ig circulante

Apar în RIU secundar

Sinteza lor este indusă de IL-4

Imunoglobulinele M Imunoglobulinele M (IgM) reprezintă între 5 şi 10% din totalul imunoglobulinelor serice. Forma monomerică de IgM se află pe suprafaţa limfocitelor B şi intră în structura BCR.

Plasmocitele secretă IgM circulant ca pentameri. Monomerii sunt aranjaţi astfel încât fragmentele Fc se află în centru iar cele 10 situsuri de legare al antigenului se află la

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

periferia moleculei. Fiecare pentamer este format prin legarea monomerilor prin legături disulfurice, legături care se constituie între anumite zone ale lanţurilor grele, situate înspre capătul C-terminal. În plus, molecula de IgM conţine un lanţ suplimentar polipeptidic numit lanţul J (joining), care este necesar pentru polimerizarea monomerilor.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Prima Ig produsă de fetus şi de către LB

IgM sunt mai eficiente decât IgG în activarea complementului

Participă la apărarea contra bacteriilor și virusurilor

Apare în RIU primar

Sinteza este stimulată de IL-2

Imunoglobulinele A (IgA) IgA este clasa de imunoglobuline predominantă în secreţii: lapte matern, salivă, lacrimi, mucusul tracturilor digestiv, bronşic şi genitourinar. În ser, IgA reprezintă 10-15% din totalul Ig. În sânge, IgA circulă în principal sub forma de monomeri. În secreţiile mucoase, IgA exista aproape exclusiv sub formă de dimeri (IgAs). Moleculele de IgAs conţin un lanţ polipeptidic J şi o componentă secretorie, de asemenea de natură peptidică. Lanţul polipeptidic J este identic cu cel care se găseşte în pentamerii de imunoglobulină M. Componenta secretorie este sintetizată de celulele epiteliale. Mecanismele de protecţie ale IgAs la nivelul mucoasei:

împiedicarea colonizării bacterene

neutralizarea particulelor virale

neutralizarea enzimelor şi toxinelor

acţiune sinergică cu factori ai sistemului de apărare înnăscut: lactoferina,

peroxidază, lizozim IgAs au un rol important în menţinerea relaţiei simbiotice cu bacteriile comensale

din

antigenele exprimate de bacteriile comensale şi care împiedică trecerea acestora prin mucoasă.

orală. Există un repertoriu larg de IgAs care conţine anticorpi pentru

cavitatea

Imunoglobulinele E (IgE) IgE este o clasă de imunoglobuline cu efecte biologice importante, cu toate că se găseşte în cantităţi reduse în plasmă – 0,3 micrograme/mL. Lanţul greu epsilon este format din cinci domenii, unul variabil şi patru constante. Molecula de IgE nu are o zonă balama şi din această cauză este foarte rigidă.

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

Au rol în apărarea antiparazitară și intervin în reacţia de hipersensibilitate de tip 1, care este responsabilă pentru o varietate de afecţiuni alergice, de la rinită alergică, urticarie, astm bronşic, până la şoc anafilactic.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

IgE sunt anticorpi citofili, adică după ce sunt sintetizaţi nu rămân în lichidul extracelular, ci se ataşează prin receptori specifici pe suprafaţa mastocitelor şi bazofilelor. Mastocitele şi bazofilele posedă un bogat echipament enzimatic şi de mediatori ai inflamaţiei, care se află în granulaţiile citoplasmatice. Legarea antigenului de imunoglobulinele E care se află pe suprafaţa acestor celule declanşează degranularea şi eliberarea mediatorilor inflamaţiei în ţesuturi, cu apariţia manifestărilor alergice.

Genele imunoglobulinelor Localizarea cromozomială a genelor pentru Ig:

Sinteza lanţurilor grele este codificată de gene plasate pe cromozomul autozom 14, brațul lung q, regiunea 32

Sinteza lanţurilor uşoare este codificată de gene plasate pe cromozomul autozom 2, brațul scurt p, regiunile 11-12

Antigenele

Sistemul imun are capacitatea fundamentală de a deosebi structurile proprii ale organismului (self) de cele străine (non-self). Structurile non-self sunt eliminate prin mecanismele apărării imune. Termenul de non-self nu implică obligatoriu originea exogenă a substanței respective. Există molecule sau celule proprii ale organismului, care au făcut parte din self, dar au suferit modificări și au devenit non-self. Antigenul este o substanţă recunoscută ca non-self de către sistemul imun al organismului. In definiția clasică, termenul de antigen desemna orice substanță de origine exogenă capabilă să inducă formarea de anticorpi și să reacționeze în mod specific cu aceștia. Această definiție a fost considerată prea restrictivă, pe măsură ce s-a observat că există antigene de origine endogenă sau antigene care nu induc sinteza de anticorpi, deși sunt recunoscute de sistemul imun. Într-o definiție folosită în prezent, termenul de antigen denumește o substanță de origine endogenă sau exogenă capabilă să determine un răspuns imun și să reacționeze specific cu moleculele rezultate în urma declanșării acestuia (anticorpi sau receptori celulari).

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

Această definiție subliniază cele două proprietăți fundamentale ale antigenului:

imunogenitatea (capacitatea de a induce un răspuns imun) și specificitatea (capacitatea de a reacționa specific cu produsele sistemului imun activat).

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Imunogenele sunt antigene complete, având atât capacitatea de a declanșa răspuns imun umoral sau celular, cât și de a se lega de produsele rezultate. Antigenele incomplete (numite și haptene) sunt capabile să reacționeze cu anticorpii sau receptorii de membrană, dar nu pot declanșa un răspuns imun, decât dacă sunt cuplate cu o altă moleculă (numită carrier). Au fost descoperite antigene care, deși îndeplinesc caracteristicile fundamentale de imunogenitate, nu produc răspuns imun umoral sau celular. Acestea au fost denumite tolerogene, iar semnificația lor imunologică este diferită. Spre desebire de haptene, pe care le putem aprecia ca fiind „indiferente” sistemului imun, tolerogenele activează anumite mecanisme de inhibiție activă a sistemului imun.

Clasificarea antigenelor în funcţie de origine

Majoritatea antigenelor sunt exogene: bacteriile, paraziţii, unele substanţe chimice industriale, alergenele ca polenul, praful de casă, alergenele alimentare. O altă categorie importantă este reprezentată de antigenele endogene:

autoantigenele, antigenele virale şi antigenele tumorale. Autoantigenele sunt antigene proprii care în mod normal sunt sechestrate prin bariere anatomice. Aceste antigene sunt situate în aşa-numitele „situsuri imunologice privilegiate”, protejate prin bariere hemato-tisulare cu permeabilitate scăzută pentru substanţele hidrosolubile. În mod normal autoantigenele nu vin niciodată în contact cu celulele sistemului imun şi nu induc un răspuns imun. Exemple de astfel de autoantigene sunt: sperma, cristalinul, ţesutul cerebral şi unele structuri din celulele miocardice. Pentru că autoantigenele nu sunt cunoscute de către sistemul limforeticular, pentru ele nu există toleranţă imună înnăscută, ca pentru celelalte structuri self cu care limfocitele vin în contact în cursul traficului lor prin organism. În condiții patologice se produce desechestrarea acestor autoantigene. Autoantigenele vin în contact cu sistemul imun şi se produce un răspuns imun faţă de ele, deci faţă de nişte structuri self. Aceste răspunsuri imune autoreactive dau o patologie autoimună. Antigenele virale fac parte din categoria antigenelor endogene pentru că virusurile îşi includ genomul în genomul gazdei. Celula gazdă sintetizează proteinele virale antigenice pe aceleaşi căi metabolice ca proteinele proprii. Antigenele tumorale se găsesc pe membranele şi în citoplasma celulelor canceroase. Ele nu se găsesc pe membranele sau în citoplasma celulelor normale din care a derivat tumora. Orice organism normal produce un număr mic de celule canceroase, care sunt

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

distruse rapid de sistemul imun. Prevenirea apariţiei tumorilor se face prin distrugerea celulelor tumorale izolate, în cadrul unui proces de imunosupraveghere. Dacă o celulă neoplazică izolată reuşeşte să se dividă şi apare o tumoră constituită, răspunsul imun împotriva tumorii seamănă cu cel din respingere a grefelor. În ambele situaţii acţionează în special mecanismele răspunsului imun celular.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Superantigenele sunt o categorie specială de antigene, care prezintă particularitatea că nu sunt fagocitate de macrofage. Au rol în activarea mai multor limfocite prin capacitatea lor de a se fixa pe exteriorul celulei, de MHC II de pe macrofag și de lanțul β al receptorului pentru antigen de pe limfocitul T (TCR T cell receptor).

Din punct de vedere al necesităţii participării limfocitelor T helper în cadrul RIU, antigenele se împart în:

timoindependente - antigene care pot declanşa RIU în absenţa LT helper (mai ales antigenele polizaharidice bacteriene). Răspunsul este rapid, fapt important în infecţiile cu microorganisme agresive (ex: pneumococul). Dezavantajul este că aceşti anticorpi nu sunt la fel de funcţionali ca cei rezultaţi prin participarea LT helper şi nu există mecanismul de comutare izotipică, care permite sinteza a diferite clase de imunoglobuline. În plus, nu se formează limfocite B cu memorie.

timodependente - reprezintă majoritatea antigenelor. Răspunsul imun declanşat de aceste antigene este mai puţin rapid, dar mai versatil şi mai eficient. În plus, apar limfocite B cu memorie, care permit un răspuns mult mai rapid și intens la un nou contact cu antigenul (răspunsul imun umoral secundar).

Antigenele cu care organismul vine în contact pot fi solubile sau corpusculate:

Antigenele solubile sunt molecule recunoscute ca non-self. De obicei antigenele solubile sunt proteine cu greutate moleculară mare. Uneori antigenele solubile sunt polizaharide, acizi nucleici sau glicolipide. Antigenele corpusculate sunt structuri non-self mai complexe: virusuri, bacterii, protozoare, celule străine, celule infectate, celule neoplazice. De fapt, antigenele corpusculate sunt formate dintr-un număr foarte mare de molecule antigenice. Dintre ele, cele mai importante pentru recunoaşterea şi distrugerea antigenului corpusculat sunt antigenele de suprafaţă.

Sistemul complement Sistemul complement este un sistem multienzimatic care participă la răspunsul imun şi la reacţia inflamatorie. În acest fel el face legătura între apărarea specifică şi nespecifică. Factorii sistemului sunt sintetizaţi în principal în ficat. Ca şi sistemul coagulării, complementul funcţionează pe principiul cascadei.

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

Factorii complementului se găsesc permanent în plasmă. Ei extravazează în focarul inflamator datorită permeabilităţii capilare crescute. În circulaţie factorii sistemului complement se găsesc sub formă de profactor (enzimă inactivă sau zimogen). Profactorii se activează succesiv prin procese de proteoliză limitată. Factorii C 2 , C 3 , C 4 şi C 5 sunt clivaţi în câte două fragmente notate cu “a” şi “b”. Fragmentele “a” sunt mai mici. Ele rămân solubile în lichidul interstiţial şi au efecte de tip proinflamator. Fragmentele “b” sunt mai mari. Ele intervin în distrugerea antigenelor corpusculate şi în epurarea antigenelor solubile.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Componentele sistemului complement:

C3a, C5a = anafilatoxinele

C5b = factorul chemotatic

C3b = factorul opsonizant

MAC = complexul litic terminal

= factorul opsonizant  MAC = complexul litic terminal Anafilatoxinele sau fa ctorii anafilactici acţionează

Anafilatoxinele sau factorii anafilactici acţionează asupra mastocitelor tisulare şi bazofilelor atrase în focarul inflamator prin chemotactism. Din aceste celule se eliberează mediatorii preformaţi, dintre care cel mai important este histamina şi mediatorii neoformaţi: factorul de activare plachetară (PAF), prostaglandine, leucotriene, tromboxan. Factorii chemotactici au o acţiune puternică asupra leucocitelor şi macrofagelor. Factorii opsonizanţi se ataşează imunologic nespecific de membranele non-self şi de complexele imune. Acest proces stimulează fagocitoza bacteriilor şi a complexelor imune. Complexul litic terminal sau Membranary Attack Complex (MAC) se ataşează pe membrana celulei ţintă, o perforează şi produce liza osmotică a celulei ţintă sau a bacteriei acoperite de Ac.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Colaborarea între anticorpi şi complement duce la îndepărtarea sau distrugerea antigenelor prin intermediul a trei mecanisme principale:

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

anticorpii se fixează pe membrana bacteriilor şi determină activarea complementului. Sistemul complement este un sistem enzimatic care se activează în cascadă şi care determină liza osmotică a antigenelor corpusculate prin perforarea membranei.

activarea locală a sistemului complement de către anticorpi determină apariţia unor cantităţi crescute de molecule de C3b. Acestea au la rândul lor capacitatea de opsoniza antigene şi promovează fagocitoza.

eritrocitele prezintă receptori pentru C3b. Molecule de C3b au capacitatea de a se ataşa de complexele imune. Complexele imune care nu pot fi fagocitate local sunt transportate de către eritrocite la ficat sau splină, unde macrofagele locale fagocitează complexele imune fără a distruge eritrocitele care au avut rol de transport.

Desfăşurarea răspunsului imun umoral

Răspunsul imun umoral (RIU) pentru antigenele timodependente se produce printr-

o cooperare celulară la care participă patru tipuri de celule: APC, LTH (helper), LTS (supresoare), LB. Cooperarea celulară este bidirecţională. Cooperarea dinspre APC spre LB are ca efecte:

Selecţia şi activarea clonelor de LB şi LT antigen-specifice

Expansiunea clonală a limfocitelor antigen-specifice

Producţia unei cantităţi adecvate de imunoglobuline pentru neutralizarea şi distrugerea antigenelor

Secvenţa de retrocontrol, de la LB spre APC, limitează intensitatea RIU la un minim necesar pentru o apărare eficientă.

Caracteristicile RIU primar si secundar

RIU primar este declanşat de primul contact cu un anumit antigen. LB virgine sunt recrutate în organele limfoide periferice şi se înmulţesc în foliculii limfatici, în aşa-numiţii centri germinativi primari, care sunt activi cam trei săptămâni. RIU primar are o serie de caracteristici:

Producţie de IgM, stimulată de IL-2, în titruri mici sau moderate

Latenţă de 4-5 zile de la contactul antigenic până la decelarea Ac specifici

IgM au o afinitate scăzută de legare a antigenului

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

RIU secundar apare la al doilea contact cu un anumit antigen şi continuă la următoarele contacte. După contactul cu antigenul, RIU secundar începe mult mai rapid decât RIU primar (în 2-3 zile), iar panta de creştere a titrului de anticorpi este foarte abruptă. Se formează LB de memorie. Cooperarea celulară şi proliferarea clonală se produc în centrii germinativi din foliculii limfatici secundari. După îndepărtarea din organism a antigenului, în circulaţie rămân doar anticorpii, cu titrul mult mai mare decât al anticorpilor din RIU primar. Anticorpii sunt IgG cu titru mare care persistă mult, timp de mai mulţi ani. Frecvent aceştia conferă protecţie pentru toată viaţa faţă de antigenul corespunzător, ca în cazul anticorpilor antirujeolici, antirubeolici şi cei contra toxinei eritrogene a streptococului.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Majoritatea Ag care declanșează RIU sunt Ag T-dependente, care induc activarea, proliferarea și diferențierea LB antigen specifice, prin cooperarea cu LTh și secreția de citokine. Factorii de transcriere induc expresia anumitor gene, ducând la proliferare și diferențiere celulară.

Desfăşurarea răspunsului imun celular

RIC are rol de apărare în trei condiţii patologice:

eliminarea celulelor infectate cu microorganisme cu dezvoltare intracelulară:

virusuri, bacterii (mycobacterii, Listeria, Brucella, Legionella)

supravegherea şi distrugerea celulelor canceroase

rejecţia grefelor

RIC este implicat în recunoaşterea şi distrugerea:

celulelor singenice devenite Ag: celulele infectate sau neoplazice

celulelor alogenice apărute prin grefă sau transplant

Recunoaşterea şi distrugerea celulelor antigenice se face prin două tipuri de celule:

LTC (LT citotoxice) şi celulele NK (natural killer). Acestea recunosc celulele non-self prin mecanisme diferite, dar le distrug printr-un mecanism comun, numit citotoxicitate extracelulară sau citotoxicitate mediată celular. La contactul cu celula ţintă, LTC şi NK eliberează nişte mediatori care:

lezează membranele celulelor non-self, ducând la liza osmotică a celulelor

alterează nucleul celulelor ţintă, producând apoptoza lor

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

Recunoaşterea celulei ţintă de către LTC LTC recunosc specific celulele ţintă, pentru că acestea prezintă pe suprafaţă Ag cuplate cu moleculele MHC I. Normal celulele organismului prezintă diverse fragmente polipeptidice rezultate din proteinele celulare degradate în cursul procesului de regenerare fiziologică sau din proteinele cu structură defectuoasă, pe care celula le distruge. Asamblarea MHC I cu aceste fragmente se face în RER, iar după aceea complexul rezultat este expus pe membrană. Celulele sistemului imun, în special LT, nu reacţionează faţă de fragmentele peptidice self, deoarece încă din timpul maturaţiei intratimice au fost distruse clonele de LT care recunosc autoAg. Celula infectată viral sau care a devenit neoplazică prezintă pe suprafaţă în complex cu moleculele MHC I diverse Ag virale sau neoplazice, faţă de care LTC reacţionează. Fragmentele din primele celule ţintă distruse de LTC sunt fagocitate de MF, care devin APC şi prezintă polipeptidele non-self pe suprafaţă în complex cu moleculele MHC II. Sunt stimulate LTH. Secretă IL2 şi stimulează astfel chemotactismul, proliferarea şi activarea de noi LTC. LTC au pe suprafaţă CD25, receptorul pentru IL2.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Din punct de vedere funcţional, limfocitele T se împart în:

Limfocite T citotoxice (LTC) – au pe suprafaţă receptorul specific CD8. Recunosc peptidele antigenice rezultate din degradarea agenţilor patogeni intracelulari,

peptide care sunt prezentate către LT citotoxice împreună cu moleculele complexului major de histocompatibilitate de tip I (MHC I). Rolul acestor limfocite este de a distruge celulele ţintă infectate.

Limfocitele T helper (LTH) – prezintă pe suprafaţă receptori CD4. Pot să

recunoască peptide antigenice care rezultă în urma prelucrării agenţilor patogeni extracelulari, peptide prezentate împreună cu molecule MHC II. Limfocitele T supresoare – reprezintă o subpopulaţie de limfocite T a cărei existenţă este controversată. Aceste limfocite au efecte inhibitorii în cadrul răspunsului imun.

Concluziile mecanismelor de reacţie imună

Celulele T şi B recunosc diferit Ag

Ag trebuie prelucrat înainte de a fi prezentat celulelor T

Procesarea Ag generează peptide antigenice

Mecanismul de procesare a Ag depinde de compartimentul în care se replică agentul patogen

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Principalele reacţii Ag-Ac şi aplicaţiile acestora

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

1. Testul pentru determinarea Ac antistreptolizina O reacţia ASLO

Testul permite stabilirea diagnosticului anginei streptococice sau de infecţie streptococică, ca şi a celui de reumatism articular acut (RAA)

Menţinerea titrului ASLO ridicat chiar şi la câteva luni după puseul reumatismal permite stabilirea diagnosticului retrospectiv al bolii.

Principiul metodei:

Reactivul folosit: suspensie de particule latex de polistiren încărcate cu streptolizina O stabilizată.

Reactivul a fost astfel preparat încât, în prezenţa unui titru ASLO normal de 200 U.I/mL sau mai crescut, să dea o aglutinare vizibilă a particulelor latex, fără diluarea serului. Reactivi:

1 flacon cu reactiv latex de 5mL

1 flacon control pozitiv de 1mL

1 flacon control negative de 1mL

1 plăcuţă pe care se efectuează reacţia

Interpretarea testului:

Reacţia ASLO negativă: obţinerea unei suspensii lăptoase, fără aglutinare, ca cea observată la controlul negativ

Reacţia ASLO pozitivă: obţinerea unei aglutinări observată în cercul probei asemănătoare cu cea observată la controlul pozitiv Valori crescute:

> 200 U.I.: la pacienţii care au avut în ultimele trei luni o angină streptococică sau alte infecţii streptococice

> 300 U.I.: în glomerulonefrita acută poststreptococică, scarlatină

600-2500 U.I.: în RAA

2. Testul pentru identificarea proteinei C reactive Testul este utilizat pentru identificarea CRP în ser în vederea diagnosticării unor

afecţiuni inflamatorii sau pentru monitorizarea inflamaţiei.

Principiul metodei:

Reactivul CRP este o suspensie de particule latex de polistiren, marcate cu o fracţiune de gamaglobulină a serului anti-uman CRP specific. Când CRP este prezentă în probă, se observă o aglutinare ce indică un conţinut de 6 mg/L.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Reactivi:

1 flacon cu reactiv latex de 5 mL

1 flacon cu control pozitiv de 1 mL

1 flacon cu control negativ de 1 mL

1 plăcuţă pe care se efectuează reacţia

Interpretarea rezultatelor:

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

CRP nu este prezentă în sensul pacienţilor aparent sănătoşi

Valori crescute:

infecţii bacteriene: pneumonii

infarct miocardic, afecţiuni maligne, LES, stări post-operatorii

febră reumatică, afecțiuni reumatice diverse, colagenoze, TBC activă

3. Testul RPR Carbon VDRL

Reactivul RPR Carbon este o suspensie stabilizată cu cristale de colesterol marcate cu cardiolipin lecitină şi particule de mangal (pentru îmbunătăţirea interpretării rezultatelor). Reactivul are rol de Ag faţă de Ac prezenţi în organismal persoanelor infectate cu Treponema pallidum.

Modul de lucru :

Se aduc reactivii şi probele la temperatura camerei, înainte de folosire

Se agită uşor reactivul pentru dispersarea particulelor

Se pune câte o picătură din controlul pozitiv şi negativ în câte un cerculeţ al plăcuţei

Se pune câte o picătură (50 l) de ser nediluat din fiecare probă în câte unul din cercurile plăcuţei

Se adaugă o picătură de reactiv RPR Carbon, ori se pipetează 20 l de reactiv în fiecare cerculeţ folosit

Se amestecă ambele picături, fără să se disperseze pe toată suprafaţa cercului

Se roteşte plăcuţa manual ori cu un rotor mecanic de 80-100 rpm, 8 min

Se citeşte prezenţa aglutinării vizibile cu ochiul liber. O aglutinare nespecifică poate apare dacă testul este citit mai târziu de 8 min

Interpretarea rezultatului:

Rezultat pozitiv: prezenţa unor nori cenuşii pe albul plăcuţei

Rezultat negativ: lipsa unei reacţii de floculare uniforme şi a unei culori cenuşii

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III 4. Testul pentru identificarea AgHBs — Testul pentru

4. Testul pentru identificarea AgHBs

Testul pentru identificarea AgHBs este un test rapid, care se efectuează din ser, este util în diagnosticul infecţiei cu virusul hepatitic B.

Rezultatul testului poate fi citit vizual, fără niciun instrument.

Testul se bazează pe principiul determinării semicantitative a AgHBs din ser, cu ajutorul metodei imunoenzimatice de tip “sandwich”. Anticorpii monoclonali şi policlonali sunt folosiţi pentru identificarea AgHBs cu o înaltă sensibilitate. Testul durează circa 15 min.

Principiul metodei:

25 de plăcuţe imunocromatografice

Reactivul 1 = enzima conjugată

Reactivul 2 = soluţia de spălare

Reactivul 3 = soluţia revelatoare

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Interpretarea rezultatelor:

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

Negativ: sunt vizibile doar cele 3 spoturi mici

Intens pozitiv: toate cele 3 spoturi mici şi spotul mare sunt vizibile, iar spotul mare este intens colorat

Slab pozitiv: apar cele 3 spoturi mici şi spotul central, dar spotul mare nu foarte intens colorat

Neconcludent: când spotul central este vizibil, dar cele mici nu sau când nu apare niciun spot; se repetă testul

5. Testul COOMBS

Test de diagnostic pentru anemiile hemolitice autoimune

Constă în reacția de hemaglutinare

Testul DIRECT: detectează Ac anti-eritrocitari (AAc) fixați deja pe Ag de pe eritrocitele bolnavului

Eritocitele se pun în contact cu ser anti-Ig, care determină aglutinare în urma cuplării anti-Ig-AAc

Testul INDIRECT: detectează Ac anti-eritrocitari (AAc) circulanți

Serul cu AAc provenit de la bolnav este pus în contact cu eritrocite normale care au pe suprafață Ag eritrocitare

Are loc cuplarea AAc de Ag

Adăugarea de ser anti-Ig determină aglutinarea eritrocitelor

— Are loc cuplarea AAc de Ag — Adăugarea de ser anti -Ig dete rmină aglutinarea

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

CAPITOLUL 3. TERAPII IMUNOSTIMULATOARE

IMUNIZAREA ORGANISMULUI Imunizarea organismului presupune ansamblul de măsuri prin care se oferă protecție specifică împotriva patogenilor frecvenţi şi agresivi. Edward Jenner a descoperit vaccinul împotriva variolei (vărsatului de vânt) în anul

1700.

Imunizarea naturală activă constă în apariţia unui răspuns imun specific şi protector după o boală infecţioasă, în urma contactului natural cu agentul patogen. Ea se realizează prin mecanismul memoriei imunologice şi reprezintă o achiziţie a sistemului imun. Boala infecţioasă poate îmbrăca forme severe, uneori mortale, motiv pentru care imunizarea naturală nu este întotdeauna o variantă benefică de imunizare. De aceea cercetătorii au căutat încă de acum 200 de ani metode artificiale de imunizare.

Imunizarea naturală pasivă constă în moştenirea de către nou născut a unui titru de anticorpi protectori de la mamă, faţă de bolile infecţioase pentru care mama este imunizată. Aceşti anticorpi sunt de tip IgG şi traversează placenta în timpul vieţii intrauterine. După naştere ei continuă să ajungă la copil prin intermediul laptelui matern. Astfel copilul este protejat în primele luni de viaţă de o serie de boli infecţioase. Însă titrul acestor anticorpi scade progresiv, astfel încât după vârsta de 5-6 luni copilul nu mai este protejat.

Imunizarea artificială activă constă în inducerea memoriei imunologice prin introducerea în organism a unor agenţi infecţioşi sau a unor antigene ale acestora prin intermediul vaccinurilor. Acestea nu sunt capabile să producă boala, dar pot induce un răpuns imun protector, similar cu cel obţinut după boală.

Imunizarea artificială pasivă constă în introducerea în organism a unor anticorpi specifici preformaţi, prin intermediul serurilor sau imunoglobulinelor. Imunizarea pasivă nu induce un răpuns imun din partea organismului, nu declanşază mecanismele memoriei imunologice şi asigură o protecţie de scurtă durată.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

IMUNOPROFILAXIA ACTIVĂ PRIN VACCINARE Imunizarea activă determină protecţie pe termen lung şi memorie imunologică. Profilaxia asigurată prin vaccinare se numeşte imunizare activă şi este durabilă în timp.

Ea nu trebuie confundată cu imunizarea pasivă realizată prin administrarea de seruri hiperimune sau imunoglobuline specifice, care asigură o protecţie imediată dar de scurtă durată, de circa 3-4 săptămâni.

Vaccinul este un preparat care conţine fracţiuni antigenice din structura unui agent infecţios. El este capabil să inducă la individul vaccinat un răspuns imun protector împotriva respectivului agent infecţios. Acesta se instalează după un interval de timp necesar sintezei de anticorpi în urma vaccinării. Apariţia unui răspuns imun în cursul vaccinării nu este suficientă pentru protecţie. Acesta trebuie să aibă o anumită intensitate şi este necesară apariţia memoriei imunologice, asigurată de limfocitele T şi B de memorie.

Tipuri de vaccinuri:

Germeni vii atenuați (vaccinuri vii – bacteriene sau virale)

Germeni morți

Fracțiuni de germeni

Toxoizi (toxine secretate și detoxifiate)

Recombinanți de determinanți antigenici

Vaccinurile vii sunt utilizate pentru imunizarea împotriva unor infecţii virale:

rujeolă (pojar), rubeolă, oreion, varicella, poliomielită, hepatită A.

Pentru că pot determina simptome de boală majore, vaccinurile vii sunt atenuate prin cultivarea agentului patogen pentru perioade îndelungate în condiţii anormale de cultură. Se vor selecta mutanţi care sunt adaptaţi supravieţuirii în cultura anormală, dar au patogenitate mai redusă în organism. Un exemplu este vaccinul împotriva Mycobaterium (BCG bacilul Calmette Guerin). Acesta a fost obţinut prin creşterea Mycobaterium bovis pe un mediu cu o concentraţie crescută de bilă.

Pentru că au capacitate mare de replicare, microorganismele determină un răspuns imun intens și prelungit, cu un titru înalt de anticorpi şi formarea de celule de memorie. Astfel, în cele mai multe cazuri, vaccinurile atenuate necesită doar o singură imunizare. În plus, în cazul vaccinurilor cu microorganisme intracelulare se declanșează și un răspuns imun celular.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

Principalul dezavantaj al vaccinurilor atenuate este reprezentat de posibilitatea ca agentul patogen respectiv să revină la patogenitatea iniţială. Administrarea vaccinurilor vii atenuate este uneori urmată de reacţii adverse care mimează infecţia naturală cu agentul infecţios conţinut în vaccin. Sunt contraindicate la pacienţii imunodeprimaţi pentru că pot determina reacții adverse severe şi la gravide, din cauza posibilului efect teratogen.

Vaccinurile inactivate conţin virusuri sau bacterii lipsite total de putere patogenă. Induc, după administrări repetate, o imunizare activă. Pot fi utilizate la gravide şi imunodeprimați. Vaccinurile inactivate determină inducerea unui răspuns predominant umoral.

Există mai multe tipuri de asemenea vaccinuri:

Vaccinurile complete sau corpusculare, care conţin bacteria sau virusul în întregime. Ele sunt inactivate prin diverse procedee: formol, căldură, betapropio-lactonă. Microorganismele astfel inactivate sunt incapabile să se replice în interiorul gazdei.

Vaccinurile macromoleculare conţin fragmente antigenice sau subunităţi din structura virusului sau bacteriei: toxine detoxifiate (anatoxine), antigene capsulare (polizaharidice), antigene de membrană (proteice).

Vaccinurile preparate prin recombinare genetică, cum ar fi vaccinul contra hepatitei B (Engerix B). Vaccinurile obţinute prin inginerie genetică sunt atenuate ireversibil prin îndepărtarea selectivă a genelor care sunt responsabile pentru virulenţa agentului respectiv.

cu

toxoizi): antidifteric, antitetanic, antiholeric, polivaccinuri de tip Polidin (stimularea

imunităţii pentru strepto, staphylo şi meningococ).

Vaccinurile

obținute

prin

inactivarea

toxinelor

bacteriene

(vaccinuri

Imunizarea

). Vaccinurile obținute prin inactivarea toxinelor bacteriene (vaccinuri Imunizarea pasivă prin © 201 5-2016 38

pasivă

prin

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

seruri şi prin imunoglobuline Serurile hiperimune conţin anticorpi specifici preformaţi care acţionează imediat după administrare. Ele pot fi seruri: heterologe şi homologe.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Serurile heterologe

Sunt recoltate de la animale (cai) în prealabil imunizate activ, care posedă deci titruri mari de anticorpi specifici.

Din cauza riscului de accidente anafilactice ele sunt din ce în ce mai puţin utilizate, fiind înlocuite cu Ig umane specifice.

Se administrează în scop profilactic, imediat după un presupus contact cu agentul infecţios (plagă tetanigenă, plagă rabigenă).

Serurile homologe (umane): provin de la convalescenţi. Ele au fost abandonate din cauza riscului transmiterii unor virusuri, ca HIV şi virusurile hepatitice.

Imunoglobulinele umane se recoltează de la populaţia adultă şi sunt de 2 tipuri:

gamaglobuline standard (administrate în deficitele imune primitive cu hipogamaglobulinemie, infecţii bacteriene severe recidivante la copiii infectaţi HIV, leucemie limfoidă cronică și pentru profilaxia rujeolei sau a hepatitei A după un contact infectant)

gamaglobuline specifice (se utilizează Ig antitetanice, antirabice, antihepatită B, antivariceloase)

Durata răspunsului imun post contact natural sau vaccinare

Pentru toată viața – rujeola, rubeola, oreionul, varicela

Pentru 10 ani HVB, antitetanic

Pentru câteva luni - holera

Imunoprofilaxia secundară

DTP diftero-tetanic-pertussis luna a 2-a de viață și 3 rapeluri la 4, 6, 12 luni

HVB – administrat la naștere, lunile 2 și 6

VPI (antipolio) luna a 2-a de viață, cu rapel

BCG (antituberculos) – în primul an de viață

Momentul administrării vaccinurilor

Profilactic pre-expunere

Terapeutic post-expunere

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Calea de administrare a vaccinurilor

Injectabil i.m, s.c, i.d - rapel

Reacții adverse la imunizare

Sindrom febril

Stare generală alterată

Artralgii

Tulburări neurologice

Reacții alergice

Sindrom inflamator rubor, edem, durere

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

CAPITOLUL 4. PROVOCĂRILE SISTEMULUI IMUNITAR

Organismul uman trebuie să facă față prin intermediul sistemului imunitar unor provocări majore permanente. Supraviețuirea este condiționată de răspunsul la aceste provocări, cele mai importante fiind:

Relația cu microorganismele înconjurătoare

Interacțiunea cu alte molecule provenite din mediul extern sau intern

Apariția de celule anormale în țesuturile proprii

Relația cu microorganismele înconjurătoare În decursul vieții, organismul uman poate veni în contact cu:

Virusuri (dimensiuni între 5 – 500 nm)

Bacterii (dimensiuni între 500 – 10 000 nm)

Fungi (dimensiuni între 2 – 20 000 µm)

Paraziți (dimensiuni între 1 mm – 20 m)

Între acestea și organism putem deosebi următoarele tipuri de relații posibile:

Comensalism – microorganismele beneficiază de pe urma interacțiunii, fără a produce efecte negative sau pozitive asupra gazdei

Simbioză – gazda și microorganismele beneficiază în urma interacțiunii

Oportunism – microorganismele sunt puţin virulente şi devin patogene numai când apărarea organismului este deficitară

Patogenitate microorganismele au capacitatea să depășească barierele fizice ale gazdei și sistemele de apărare locale și pătrund în mediul intern, unde se multiplică și produc distrugeri tisulare.

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

În prezent este recunoscut rolul extrem de important al florei bacteriene care

colonizează tegumentele și mai ales mucoasele, în special cea digestivă. Tegumentele și mucoasele reprezintă principalele porți potențiale de intrare pentru agenții patogeni. Numărul de bacterii aflate la nivelul mucoaselor tubului digestiv este de aproximativ 10 14 , fiind de 10 ori mai mare decât numărul total al celulelor din organismul uman. Supraviețuirea nu ar fi posibilă timp îndelungat în absența acestor specii bacteriene, care au multiple roluri:

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Împiedică multiplicarea altor specii patogene

Contribuie la dezvoltarea arhitecturii locale intestinale

Stimulează permanent sistemul imunitar

Asigură gazdei unele micronutriente esențiale, cum ar fi anumite vitamine

Metabolizează componente alimentare nedigerabile

Una dintre cele mai importante provocări ale sistemului imunitar este aceea de a recunoaște microorganismele cu potențial patogen, menținând în același timp o relație de echilibru cu flora bacteriană aflată la nivelul porților de intrare.

Interacțiunea cu alte molecule provenite din mediul extern sau intern

În afara microorganismelor patogene, o serie de molecule mici (cu masă sub 900

Daltoni), peptide sau proteine pot produce leziuni tisulare sau pot întrerupe anumite căi de

comunicare intercelulare sau intracelulare, cu consecințe ce pot merge până la deces:

Toxine – sunt substanțe cu origine bacteriană, fungică, vegetală sau animală; majoritatea toxinelor are structură proteică

Prioni – sunt proteine infecțioase, de origine endogenă sau exogenă, cu structură tridimensională anormală, care determină leziuni neuronale

Diverse medicamente sau alte substanțe cu origine exogenă

Diverse

proteine

cu

origine

endogenă,

generate

în

timpul

anumitor

procese patologice

Apariția de celule anormale la nivelul țesuturilor

La nivelul diverselor țesuturi pot apărea următoarele tipuri de celule cu caracteristici deosebite față de cele tisulare normale: celule neoplazice și celule aduse prin transplant.

O trăsătură esențială a celulelor neoplazice este capacitatea de proliferare

necontrolată, care apare ca urmare a acumulării anumitor mutații la nivelul codului

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

genetic. Modificările la nivel ADN apar frecvent – se consideră că, în medie, fiecare celulă din organismul uman suferă zilnic aproximativ 25.000 de mutații. La nivel intracelular există multiple mecanisme de control anti-neoplazic. Astfel, aproape toate aceste mutații zilnice sunt reparate rapid prin mecanisme enzimatice intranucleare. În cazul în care modificările sunt multiple și este depășită capacitatea de reparare, sunt activate alte mecanisme intracelulare, care determină declanșarea apoptozei, eliminând astfel posibilitatea de transformare în celulă neoplazică. În schimb, mutațiile situate la nivelul mecanismelor de reparare și mai ales cele din cadrul mecanismelor care controlează apoptoza se asociază cu un risc major de transformare neoplazică. În cazul apariției celulelor canceroase, sistemul imunitar local trebuie să le recunoască și să le elimine rapid, evitând astfel proliferarea și procesul de metastazare. Recunoașterea celulelor tumorale se bazează pe faptul că acestea sunt rezultate în urma unor procese de mutație și au caracteristici noi, cu structuri diferite față de celulele normale. Acest proces de recunoaștere a celulelor cu caracteristici diferite față de normal reprezintă o altă provocare importantă pentru sistemul imunitar. În mod similar, celulele aduse prin transplant sunt recunoscute ca având caracteristici diferite față de structurile tisulare proprii și vor fi eliminate prin mecanisme diverse. În această situație activarea sistemului imunitar are un impact negativ, iar în practică sunt folosite metode de imunosupresie pentru a evita eșecul procesului de transplant.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

Mecanisme nespecifice de recunoaștere antigenică

Una dintre cele mai importante provocări ale sistemului imunitar este reprezentată de rata de replicare a multor agenți infecțioși. Unele specii bacteriene își pot dubla numărul la fiecare 20 - 30 de minute, ceea ce înseamnă generarea a 100 de trilioane de bacterii în prima zi de infecție. De asemenea, în unele infecții virale, fiecare celulă infectată poate genera câteva mii de virioni în decurs de câteva ore. În lipsa unui răspuns imunitar rapid decesul se poate produce în câteva zile. Sistemul imunitar este format din componenta înnăscută (nespecifică) și componenta adaptativă (specifică). Sistemul imunitar adaptativ este foarte eficient în combaterea infecțiilor virale sau bacteriene, care se asociază de obicei cu o rată mare de replicare. În plus, sistemul imun adaptativ poate recunoaște orice structură antigenică cu care vine în contact. Din păcate, activarea sistemului imun specific are un timp semnificativ de latență, fiind necesare de obicei peste 10 zile pentru ca acest tip de răspuns să fie eficient. În acest interval, apărarea este asigurată de sistemul imun nespecific, care se bazează pe o serie de structuri, factori solubili și celule preformate. O condiție esențială pentru eficiența sistemului imun nespecific în cazul infecțiilor în care agentul patogen are o rată de replicare mare este capacitatea de recunoaștere rapidă a

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

acestuia. Sistemul de recunoaștere nespecifică se bazează pe existența pe membrana anumitor celule imunitare a unui grup de receptori cunoscuți sub acronimul PRRs (pattern recognition receptors). Acești receptori au o variabilitate limitată, putând recunoaște structuri moleculare înalt conservate, care intră în structura celor mai multe tipuri de

agenți patogeni. Aceste structuri moleculare nu intră în alcătuirea celulelor sau țesuturilor umane și sunt cunoscute sub denumirea de PAMPs (pathogen associated molecular patterns). Receptori din grupul PRRs pot recunoaște și molecule rezultate în urma proceselor de distrugere tisulară, cauzate de procese non-infecțioase. Aceste molecule au fost denumite DAMPs (damage associated molecular patterns). Astfel, activarea PRRs determină activarea sistemului imunitar, indiferent dacă leziunea inițială a fost cauzată de un agent patogen sau de un agent fizic sau chimic. Cele mai importante caracteristici ale PRRs sunt:

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

• recunosc molecule care intra în alcătuirea mai multor specii de agenți patogeni

se leagă de componente esențiale din structura microorganismelor, necesare pentru supraviețuirea acestora

nu recunosc structuri moleculare specifice mamiferelor

Receptorii din grupul PRRs

Se clasifică astfel:

solubili: proteinele care intră în alcătuirea complementului, anticorpii naturali

membranari: receptorii Toll-like, receptorul manozei, receptorii formil peptid

intracitoplasmatici: receptorii NOD-like, receptorii RIG-like

Receptorii solubili PRRs Sunt molecule cu structură proteică, care se găsesc în sânge și alte lichide biologice, care se atașează de PAMPs aflate pe suprafața agenților patogeni. Cele mai importante roluri ale acestora sunt:

distrugerea membranelor bacteriene

• recrutarea de leucocite în țesuturile infectate

opsonizare marcarea Ag pentru distrugere sau eliminare ulterioară

1. Sistemul complement

Sistemul complement este alcătuit din peste 30 de proteine solubile, care se activează enzimatic în cascadă. Produșii rezultați în urma activării sistemului complement au efecte proinflamatorii și antimicrobiene. Există 3 căi majore de activare: calea clasică,

calea alternă și calea lectinică.

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară

2. Anticorpii naturali

Anticorpii naturali sunt proteine cu structură asemănătoare anticorpilor sintetizați de către sistemul imun specific. Anticorpii naturali au însă o variabilitate limitată și se leagă de obicei de antigene cu structură glucidică sau lipidică. De obicei, afinitatea cu care se leagă de aceste antigene este redusă și sunt îndreptați împotriva structurilor intracelulare sau aflate în interiorul agenților patogeni. Acești anticorpi sunt produși înainte de contactul cu antigenul și fac parte în general din clasa IgM, care este cea mai eficientă activatoare a complementului.

Disciplina de Fiziopatologie și Imunologie Anul de studii: III

PRRs transmembranari Acești receptori se găsesc pe suprafața membranelor celulelor imunitare sau pe membranele anumitor vezicule intracitoplasmatice (endozomi sau fagolizozomi). După contactul cu antigenele, transmit semnale activatoare, având drept rezultat activarea unor programe defensive intracelulare.

1. Receptorii Toll-like

Receptorii Toll-like au structură proteică și se găsesc mai ales pe suprafața celulelor santinelă care au rol de a supraveghea permanent țesuturile și de a identifica rapid potențialii agenți patogeni. Acest rol este îndeplinit de macrofage și celule dendritice.

Până în prezent au fost identificate 10 tipuri de receptori Toll-like. Cele mai multe celule din organismul uman prezintă pe suprafață cel puțin un tip.

2. Receptorul manozei

Acest receptor se găsește în special pe suprafața macrofagelor și celulelor dendritice. Se poate lega de anumite grupări de tip carbohidrat (cum ar fi manoza, fucoza, N-acetil glucozamina) care se găsesc atașate pe proteinele membranare ale anumitor microorganisme. Aceste resturi de tip carbohidrat nu se găsesc pe suprafața celulelor umane, fiind caracteristice doar anumitor specii bacteriene. Activarea acestui receptor facilitează fagocitoza microorganismelor.

3. Receptorii formil peptid

Receptorii formil peptid se găsesc pe suprafața macrofagelor și neutrofilelor și pot recunoaște anumite resturi de aminoacizi caracteristice bacteriilor. Legarea receptorilor formil peptid de aceste resturi moleculare semnalizează macrofagelor și neutrofilelor prezența bacteriilor în țesutul respectiv. Activarea acestor receptori determină în principal stimularea chemotactismului celulelor fagocitare.

Receptorii intracitoplasmatici

UMF ”Carol Davila” București Facultatea de Medicină Dentară