Biologie Celulara si Histologie

Curs 5 Tehnici de biologie moleculara

si inginerie genetica

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Cuprins

The Human Genome project

Tehnici de genetica moleculara

Secventierea acizilor nucleici

PCR

Clonarea unor gene

Vectori

Transfectii

Animale transgenice; linii knock-out

Aplicatii ale ingineriei genetice

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

The human genome project

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

The human genome project

Proiect desfasurat pe durata a 13 ani: 1990 2003

Initiat de U.S. Dept. of Energy + National Institute of Health

Partener major: Wellcome Trust (UK)

Alte contributii: Japonia, Franta, Germania, China etc

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

The Human Genome Project

Obiective

Identificarea

25000)

tuturor genelor din ADN-ul uman (in total 20-

Determinarea

intregii secvente de nucleotide din ADN-ul

uman (aprox. 3 miliarde)

Crearea

unor baze de date cu aceste informatii

Perfectionarea
Transferul

de instrumente pentru analiza and

tehnologiilor catre sectorul privat

Identificarea

problemelor legale si etice care pot aparea

si propunerea de solutii

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Continutul informational al genomului uman

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Probleme speciale legate de identificarea si localizarea

genelor

Centromerii contin secvente cu grad inalt de repetitivitate,

dificil de mapat cu tehnicile actuale

Telomerele contin la randul lor secvente repetitive, de multe

ori sunt incomplete / se pierd partial la replicarea ADN-ului

Existenta multigenelor locusuri cromozomiale care contin

gene multiple, corelate functional si intricate, dificil de identificat
individual

Aprox. 93% din ADN a fost efectiv cartografiat in prezent;

studiul telomerelor si centromerilor ramane limitat de tehnologia
actuala

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Cromozomul 1

Cel mai mare dintre

cromozomii umani; contine
aprox. 8% din informatia
genetica

Boli genetice:

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Parkinson

Alzheimer

Charcot-Marie Tooth
(neuropatie ereditara)

In cancer apar frecvent

modificari ale regiunilor sale
terminale

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Cromozomii 2 si 4

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Au cea mai mica rata de recombinare

dintre cromozomii umani

Cromozomul 2 unic prin provenienta

(fuziunea a 2 cromozomi ancestrali)

Cromozomul 4:

Boala Huntington

Boala polichistica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Cromozomii 3, 5, 6

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Cromozomul 3

Cea mai scazuta rata de duplicare segmentala

Zone implicate in diferite cancere

Cromozomul 5

Redundanta informationala mare, continut genetic

scazut

Implicat in atrofia musculara spinala

Cromozomul 6

Contine cea mai mare secventa de codificare a ARN-t

(activitate transcriptionala)

Gene implicate in cancer, schizofrenie, autoimunitate

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Cromozomii 7, 8, 9

Cromozomul 7

Cromozomul 8

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Gena CFTR - implicata in fibroza chistica

Contine o gena implicata in cresterea dimensiunii

creierului la primatele mari

Cromozomul 9

Gene implicate in transsexualitate spontana (reversie

de sex mascul femela)

Gene tumorale: leucemii, melanoame familiale etc

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Cromozomii 10, 11, 12, 13

Cromozomul 10

Tumori, boli
neurologice

Cromozomul 12

Leucemii, limfoame,
alte cancere

2 gene asociate
diabetului

Gene implicate in
tulburari psihiatrice

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Cromozomul 11

Unul dintre cei mai

bogati in gene

Numarul cel mai

mare de gene ptr
receptori olfactivi

Cromozomul 13

Contine gena
cancerului de san
(de tip II)

Contine gena
asociata
retinoblastomului

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Cromozomii 14, 15, 16, 17

Cromozomul 14

Gene pentru ARNr

in bratul scurt

Cromozomul 16

Duplicare
segmentala mare

Gene implicate in
boala polichistica
renala, leucemii
acute

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Cromozomul 15

Unul din cromozomii

cu rata mare de
duplicare
segmentala

Cromozomul 17

Cea mai mare

diferenta de
structura dintre un
cromozom uman si
cromozomi similari
mamalieni

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Cromozomii 18, 19, 20, 21

Cromozomul 18

Translocarea 14-18
este una din cele
mai comune cauze
genetice de cancer
la oameni

Cromozomul 20

Contine gene
prionice (boala
Creutzfeld-Jacob)
Implicat in diabetul
zaharat de tip II,
obezitate, cataracta,
boala Graves

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Cromozomul 19

Gene implicate in
hipercolesterolemia
familiala si diabetul
insulino-rezistent

Cromozomul 21

Cel mai mic

cromozom

O copie
suplimentara
(trisomie) determina
sindromul Down

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Cromozomii 22, X, Y

Cromozomul 22

Cromozomul X

Cromozomul sexual feminin

Cromozomul Y

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Implicat in schizofrenie, alte boli psihiatrice

Cromozomul sexual masculin

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Exemplu cromozomul 21

http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/posters/chromosome/chooser.shtml

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Baze de date

NCBI Human Genome Sequencing Progress

University of California (Santa Cruz)

http://genome.ucsc.edu/

Ensembl Genome Browser (Wellcome Trust Sanger Institute &

EMBL-European Bioinformatics Institute

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/guide/human/

http://www.ensembl.org/

EMBL-Bank (European Molecular Biology Laboratory's

Nucleotide Sequence Database)

http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Aplicatii, beneficii din urma HGP

Medicina moleculara:

Diagnostic timpuriu al bolilor / predispozitiilor la o boala

Design rational de medicamente

Terapie genica

Farmacogenomica

Aplicatii energetice si de ingineria mediului

Aplicatii de genomica microbiana pentru a obtine biocombustibili,

sisteme de detectare a poluantilor, tehnici de purificare a mediului

Bioarheologie si antropologie

Medicina legala

Agricultura

Genetically modified foods (GMF)

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Patentarea genelor, secventelor genetice

Se poate face atunci cand:

Este identificata o noua secventa genetica

Este specificat produsul (proteina) secventei genetice respective

Este specificata functia produsului respectiv

Este dezvoltata o metoda de valorificare a produsului genei, care

poate fi utilizata de specialisti din domeniu

Patentele sunt pe o perioada de 20 de ani

Patentarea prespune si punerea la dispozitie a intregii informatii

referitoare la produsul patentat

Informatii suplimentare (argumente pro/contra, situatia legala in

USA etc):
http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/elsi/patents.shtml

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Tehnici de genetica moleculara

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Secventierea ADN

Reprezinta succesiunea de proceduri utilizate pentru identificarea

secventei de nucleotide intr-un lant de and

Metode de baza:

Secventierea chimica (Maxam Gilbert)

Bazata pe inducerea unor modificari chimice ale ADN-ului si apoi clivarea

lantului la nivelula cestor modificari

Utilizata in prezent doar in domenii restranse (studiul interactiunilor ADNproteine etc)

Metoda de terminare a lantului (Chain-termination method; metoda Sanger)

Necesita: un lant simplu de ADN (single-stranded), un primer (secventa de

ADN care serveste ca punct de plecare a polimerizarii), ADN-polimeraza si
nucleotide marcate radioactiv sau fluorescent

Fragmentele sintetizate sunt denaturate termic si separate prin

electroforeza pe gel si autoradiografie / fotografie UV

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Alte metode de secventiere

Electroforeza capilara

Dye-termination method
DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Clonare in vectori bacterieni

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Secventierea ADN
Metoda shotgun

Cromozomii sunt taiati in fragmente mai mici

Fiecare fragment este folosit ca matrita pentru crearea unor fragmente noi, care
difera de original printr-o singura baza (care urmeaza a fi identificata intr-o etapa
ulterioara)

Fragmentele dintr-un set sunt separate prin electroforeza pe gel

Markeri fluorescenti de generatie noua permit separarea fragmentelor din cadrul

aceleiasi benzi de migrare in gel

Se identifica ultima baza azotata din fiecare fragment se recreaza astfel secventa
originala de A T C G pentru fiecare fragment

Rezultatele sunt analizate de sisteme de secventiere automate, obtinandu-se o

cromatograma in 4 culori, cu varfuri corespunzatoare celor patru baze azotate

Dupa citirea bazelor, secventele scurte sunt reconstituite pe calculator si este

analizata structura lor din punctul de vedere al tipului de informatie genetica stocata.

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Exemplu (principiu de baza)

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

PCR = polymerase chain reaction

Reactie de copiere si amplificare a informatiei ADN

Necesita:

Fragmentul de ADN-ul care se doreste a fi amplificat

Primeri = secvente de nucleotide complementare celor doua capete ale

lantului de ADN

ADN-polimeraza

Nucleotide

Buffer, ioni divalenti

Utilizare:

Secventializarea ADN-ului (citirea informatiei genetice)

Clonari

Scopuri diagnostice

Crearea de plasmide, vectori pentru utilizarea in ingineria genetica

Scopuri criminalistice

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

PCR

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro15.swf

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Clonari de gene

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Clonari de gene

Clonare moleculara = izolarea unei anumite portiuni de ADN si

realizarea de copii multiple ale acesteia

http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro10.swf
DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Vectori
Sunt

molecule de ADN utilizate pentru transferarea de

material genetic strain intr-o celula

Tipuri

de vectori:

Plasmide
Bacteriofagi, alte virusuri
Cromozomi artificiali

Transferul

de material genetic intr-o celula =

Transfectie

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Plasmide

Fragmente de ADN dublu

spiralat, de obicei circulare

Capabile de autoreplicare

Se pot integra sau nu in

genomul celulei gazda

Origine bacteriana / sinteza in

vitro

Utilizare in transfectii, terapie

genica
Wikimedia Commons

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120082/bio35.swf
DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Vectori virali

Bacteriofagi virusuri care infecteaza bacterii

Retrovirusuri se integreaza in genom, se replica o data cu

celula gazda

Lentivirusuri (subclasa a Retrovirusurilor)

Adenovirusuri nu se integreaza in genom, nu se replica o

data cu celula gazda (utilizare limitata; genereaza un raspuns
imun puternic utilizare in crearea de vaccinuri)

CONDITII DE UTILIZARE:
Nepatogene pentru oameni / manipulate genetic pentru a nu fi patogene
Toxicitate redusa pentru celulele pe care le infecteaza
Stabilitate sa nu prezinte mutatii frecvente
Specificitate pentru o anumita linie celulara

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Vectori virali
Bacteriofag

Vector lentiviral
Wikimedia Commons
Wikimedia Commons

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Cromozomi artificiali
Cromozomi

de drojdie (YAC yeast artificial

chromosome)

Cromozomi

bacterieni (BAC)

Cromozomi

umani (HAC) functioneaza ca un

cromozom suplimentar (47), sunt multiplicati la
diviziunea celulara; pot fi utilizati pentru introducerea
in celula de gene noi

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Transfectii

Reprezinta transferul intr-o celula de material genetic strain, cu

ajutorul unui vector

Metode:

Utilizarea unor plasmide + a unei modalitati de destabilizare temporara a

membranei celulare, pentru a permite intrarea ADN-ului plasmidic in celula

Metoda fosfatului de calciu (istorica; functioneaza!)

Utilizare de lipozomi in care este inclus plasmidul, si care fuzioneaza cu membranele
celulare
Utilizare de polimeri cationici de care se ataseaza ADN-ul, care ulterior sunt introdusi in
celule prin endocitoza
Electroporare, ultrasonoporare, magnetoporare, soc termic etc.

Utilizarea de vectori virali:

Transfer mai simplu; are loc infectia celulelor care vin in contact cu virusul modificat
genetic, infectie care se propaga rapid in toata cultura de celule

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Animale transgenice

Crearea, in scopuri de
cercetare, a unor linii de
animale de laborator (soareci,
sobolani etc), ce prezinta o
anumita mutatie a unei gene

Utilitate:

Modele pentru anumite boli

Studierea implicarii anumitor gene
in anumite lanturi de control, in
aparitia anumitor maladii

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Expert Reviews in Molecular Medicine, Vol. 5; 7 April 2003

Generation of YAC-transgenic mice
Kenneth R. Peterson

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Linii knock-out

Linii de organisme modificate genetic

(de obicei soareci), la care una sau
mai multe gene au fost blocate de la
expresie

Utilizate in studiul patogeniei unor boli

Wikimedia Commons

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Wikimedia Commons
Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Aplicatii ale ingineriei genetice

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Aplicatii ale ingineriei genetice

Screening genetic

Vaccinuri

Sinteza de proteine in vitro (ex: insulina!)

Terapie genica

GMF/O

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Screening genetic

Analiza informatiei genetice din ADN-ul unei persoane

Aplicatii:

Screening al purtatorilor (identificarea persoanelor care poseda o

gena din doua necesare transmiterii unei boli genetice)

Diagnostic prenatal

Teste in perioada presimptomatica la persoanele cu risc pentru boli

genetice (Coree Huntington, Alzheimer, cancer de san, etc)

Medicina legala

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Terapie genica

Introducerea in genom a unei gene normale (clonata), care sa

inlocuiasca gena cu defect cauzatoare a unei boli genetice

Cum se introduce gena?

Vectori:

Retrovirusuri
Adenovirusuri
Virusuri herpes simplex

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Terapia genica

Probleme actuale de rezolvat:

Durata scurta a efectului in prezent, integrarea genei in genom

este de scurta durata, fiind necesare sedinte multiple de terapie

Controlul raspunsului imun declansat de prima sedinta de terapie,

accentuat la repetarea sedintei

Probleme speciale legate de vectorii virali efecte adverse nedorite

(raspuns inflamator, toxicitate, declansarea raspunsului imun,
posibilitatea redobandirii virulentei odata incorporat in genomul
gazdei)

Bolile multigenice dificultati in identificarea tuturor genelor

implicate, ale tipului de intricare functionala; dificultati in inlocuirea
tuturor regiunilor de genom implicate

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Terapia genica

Rezultate semnificative in prezent:

2008: UCL Institute of Ophthalmology and Moorfields Eye Hospital NIHR Biomedical
Research Centre ameliorarea vederii in urma terapiei genice a unei forme ereditare de
cecitate

2007: University of Texas M. D. Anderson Cancer Center and the University of Texas
Southwestern Medical Center - un studiu pe soareci, cu o combinatie de terapie genica +
tehnici nanotehnologice de introducere a genelor au indus scaderea semnificativa a
volumului unor tumori pulmonare

2006: National Cancer Institute (NCI) au obtinut limfocite modificate genetic care ataca
cu succes celule tumorale de melanom malign

2006: tratarea cu succes prin terapie genica a unor pacienti suferind de sindroame
mieloide

2005: tratata cu succes surditatea datorata distrugerii celulelor cohleare, la hamsteri, prin
introducerea unei gene care a determinat cresterea de noi celule cohleare

Alte rezultate promitatoare deocamdata neconfirmate prin studii pe animale de laborator

sau studii clinice: tratamentul Coreei Huntington, bolii Parkinson, talasemiei, fibrozei
chistice, anumitor forme de cancer, leucemii, sicklemie etc

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara

Farmacogenomica

Studiul felului in care bagajul genetic al unui individ afecteaza

raspunsul organismului la medicamente

http://www.freewebs.com/pharmacogenomics/impactonyou.htm

Informatii suplimentare: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/pharm.html

DBB Masterat Inginerie Medicala si Clinica

Biologie Celulara si Histologie 5. Biologie moleculara