Analiza Amlodipinei din comprimate

AUTORI:
ADAM MADALINA GEORGIANA - grupa 1;
TOMA DANIEL ALEXANDRU- grupa 3;
NUJUD HANNA - grupa 3.

CUPRINS

I. MONOGRAFIE FARMACOPEEA EUROPEAN - COMPRIMATE.........................1

II. MONOGRAFIE FARMACOPEEA EUROPEAN AMLODIPINA.........................
III.MONOGRAFIE

FARMACOPEEA

BRITANIC

COMPRIMATE

CU

AMLODIPINA..................................................................................................................
IV.DOZAREA AMLODIPINEI DIN COMPRIMATE PRIN METODA KINETICSPECTROFOTEMETRICA.....................
V. REZULTATE I DISCUII...........................................................................................
VI.ANEXE.
VII. BIBLIOGRAFIE..

I. MONOGRAFIE FARMACOPEEA EUROPEAN - COMPRIMATE

Comprimatele sunt preparate solide care conin doze unitare din una sau mai multe
substane active i n general sunt obinute prin comprimarea unui volum constant de
particule. Comprimatele sunt destinate administrrii pe cale oral. Unele se nghit ca
atare, altele dup ce au fost mestecate, unele se dizolv sau se disperseaz n ap nainte
de administrare i altele sunt inute n gura pn la eliberarea substanei active.
Sunt formate din una sau mai multe substane active, cu sau fr excipieni ca:
diluani, liani, ageni de dezagregare, umectani, lubrefiani, substane capabile de a
modifica comportamentul preparatului n tractul digestiv, colorani autorizai de
autoritatea competent i aromatizani.
Comprimatele sunt de regul sub form de cilindri solizi circulari, drepi, cu
suprafa plan sau convex i marginile pot fi rotunjite sau ascuite. Pot prezenta anturi,
simboluri sau alte nscrisuri. Comprimatele pot fi acoperite.
Putem diferenia mai multe categorii de comprimate pentru administrare oral, cum
ar fi:
- comprimate neacoperite,
- comprimate acoperite,
- comprimate efervescente,
- comprimate solubile,
- comprimate orodispersabile,
- comprimate gastro-rezistente,
- comprimate cu cedare modificat.

Comprimatele sunt de obicei obinute prin comprimarea unui volum constant de

particule sau agregate de particule obinute printr-o metod de granulare. n procesul de
fabricare a comprimatelor, sunt asigurate mijloacele ca ele s posede o rezisten
mecanic adecvat pentru evitarea sfrmrii sau ruperii la manipulare sau la o prelucrare
ulterioar. Acest lucru poate fi demonstrat prin analizarea Friabilitii comprimatelor
neacoperite (2.9.7) i prin Rezistena comprimatului la rupere (2.9.8). Comprimatele
masticabile trebuie s asigure o zdrobire uoar prin mestecare. Pentru comprimatele
autorizate cu subdiviziuni, trebuie s satisfac cerina autoritilor competente referitor la
faptul c, subdiviziunile s corespund fie Testului A pentru Uniformitatea coninutului
preparatelor unidoz (2.9.6), fie testului pentru Uniformitatea masei preparatelor unidoz.
Att la fabricare ct i la ambalare, depozitare i distribuie, trebuie s se asigure
mijloacele necesare de pstrare a calitii microbiologice a comprimatelor; recomandrile
privind acest aspect sunt prevzute n capitolul Calitatea microbiologic a preparatelor
farmaceutice (5.1.4).
Uniformitatea coninutului (2.9.6). Cu excepia celor prescrise altfel sau
justificate i autorizate, comprimatele cu un coninut al substanei active mai mic de 2
grame sau cele cu mai puin de 2% din totalul masei trebuie s corespund testului A
pentru Uniformitatea coninutului preparatelor unidoz. Dac preparatul are mai mult de
o substan activ n formulare, cerina se aplic doar celor care corespund condiiilor de
mai sus.
Doar dac testul pentru uniformitatea coninutului e cerut, justificat i permis
pentru comprimatele acoperite, altele dect cele acoperite prin film, atunci trebuie s
corespund cu testul A pentru Uniformitatea coninutului preparatelor unidoz indiferent
de coninutul substanei active.
Uniformitatea masei (2.9.5). Comprimatele neacoperite, cu excepia celor
justificate i autorizate de altfel i comprimatele filmate, trebuie s corespund cu testul
pentru uniformitatea masei preparatelor unidoz. Dac testul pentru uniformitatea
coninutului este cerut sau justificat i autorizat pentru toate substanele active, testul
uniformitii masei nu mai este necesar.

Testul de dizolvare. Un test corespunztor care poate fi efectuat pentru a

demonstra cedarea adecvat a substanei/ substanelor active este de exemplu, unul din
testele descrise la Testul de dizolvare pentru formele solide (2.9.3). Cnd testul de
dizolvare este prevzut nu este obligatoriu testul de dezagregare[1].

II. MONOGRAFIE FARMACOPEEA EUROPEAN

AMLODIPINA BESILAT

C26H31ClN2O8S
[111470-99-6]

Mr 567.1

DEFINITIE
3-etil5-metil(4RS)-2-[(2-aminoetoxi)metil]-4-(2-clorofenil)-6-metil-1,4-dihidropiridina3,5-dicarboxilat benzesulfonat.
Continut: 97.0 pana la 102.0 % (substanta anhidra).
Caracteristici
Aspect: pudra alba sau aproape alba.
Solubilitate: putin solubila in apa, usor solubila in etanol, foarte putin solubila in
etanol, putin solubila in 2-propanol.
Identificare:
Metoda principala: Spectrofotometrie de absorbtie in infrarosu. Comparatie cu
amlodipina besilat CRS.
Metode secundare:
A. Examinarea cromtogramelor obtinute in testul principal pentru
substante asemanatoare in UV la 366 nm.
B. Se dizolva 5.0 mg intr-o solutie 1% V/V de acid clorhidric in metanol
100ml. Se examineaza intre 300 nm si 400 nm, solutia prezentand un
maxim de absorbtie la 360 nm. Absorbanta specifica la 360 nm este de
113 pana la 121.

TESTE
Rotatia optica:
-0.10o pana la +0.10o.
Se dizolva 0.250 g in metanol R si se dilueaza la 25 ml cu acelasi solvent.
Substante inrudite:
A. Cromatografie in strat subtire.
Solutia test (a): Se dizolva 0.140g din substanta de examinat in metanol si
se dilueaza pana la 2 ml cu acelasi solvent.
Solutia test (b): Se dilueaza 1 ml solutie test (a) pana la 10 ml cu metanol
R.
Solutia de referinta (a): Se dizolva 70 mg amlodipina besilat CRS
(solutie de referinta standard certified reference solution) in 1 ml metanol R.
Solutia de referinta (b): Se dilueaza 1 ml solutie referinta (a) pana la 10
ml cu metanol R.
Solutia de referinta (c): Se dilueaza 3 ml solutie referinta (b) pana la 100 ml cu
metanol R.
Solutia de referinta (d): Se dilueaza 1 ml solutie referinta (b) pana la 100 ml cu
metanol R.
Placuta: TLC silica gel F254 placuta R.
Faza mobila: Stratul superior al unui amestec de acid acetic glacial R, apa
distilata R si metil-isobutil cetona R (25:25:50 V/V/V).
Aplicatie: 10 microlitrii.
Revelare: peste o cale de 15 cm.
Uscare: 15 minte la 80o C.
Detectie: Se examineaza in UV la 254 nm si 366 nm.
Aplicabilitatea sistemului: Cromatograma obtinuta cu substanta de referina (a)
prezinta 2 spoturi clare, separate, cu valori Rf de 0.18 pana la 0.22.
Limite: In cromatograma obtinuta cu solutia test (a).
- Orice impuritate: orice spot, in afara celui principal, nu este mai
intens decat spotul obtinut cu solutia de referina (c) (0.3%) si
cel mult doua spoturi sunt mai intense decat spotul obtinut cu
solutia de referinta (d) (0.1%).
B. Cromatografie lichida.
Solutia test (a). Se dizolva 50 mg substanta de analizat in faza mobila si se dilueaza
pana la 50 ml cu faza mobila.
Solutia test (b). Se dilueaza 5 ml solutie test (a) pana la 100 ml cu faza mobila.
Solutia de referinta (a). Se dizolva 50 mg amlodipina besilat CRS in faza mobila si
se dilueaza pana la 50 ml cu faza mobila. Se dilueaza apoi 5 ml din solutia obtinuta pana
la 100 ml cu faza mobila.
Solutia de referinta (b). Se dilueaza 3 ml solutie test (a) pana la 100 ml cu faza
mobila si se dilueaza 5 ml din solutia obtinuta pana la 50 ml cu faza mobila.
Solutia de referinta (c). Se dizolva 5 mg substanta de analizat in 5 ml solutie de
peroxid de hidrogen concentrata R. Se incalzeste la 70o C pentru 45 minute.
5

Coloana:
-

Marime: 1 = 0.15 m, diametru = 3.9 mm.

Faza stationara: octadecilsilil silica gel pentru cromatograife R.

Faza mobila: Amestec 15 parti acetonitril R, 35 parti metanol R, si 50 parti

solutie preparata astfel: se dizolva 7 ml trietilamina R in 1 litru apa distilata si se
ajusteaza pH-ul 3 0.1 cu acid fosforic R.
Flux: 1 ml/min.
Detectie: Spectrofotometru la 237 nm.
Injectie: 10 microlitrii solutie test (a) si solutie referinta (b) si (c).
Timp: De trei ori timpul de retentie al amlodipinei.
Retentie relativa cu referire la amlodipina (timp de retentie aproximativ 7 minute):
impuritate D = aproximativ 0.5.
Aplicabilitatea sistemului: referinta (c):
- Cel putin 4.5 intre peak-urile corespunzatoare amlodipinei
-

respectiv impuritatilor
Factor de corectie: pentru calculul continutului se multiplica

aria de sub peak-ul corespunzator impuritatii cu 2.

Impuritate D: nu mai mult decat aria de sub curba peak-ului

principal in cromatograma obtinuta cu solutia de referinta (b).

Impuritati totale: nu mai mult decat aria de sub peak-ul
principal din cromatograma obtinuta cu solutia de referinta (b);

se ignora orice peak datorat benzenului sulfonat.

Limita de ignorare: de 0.1 ori aria de sub peak-ul principal din
cromatograma obtinuta cu solutia de refrinta (b).

Continut de apa: maxim 0.5%, determinat pe 3.000 g substanta.

Cenusa de sulf: maxim 0.2% determinat pe 1.0 g substanta.
Dozare:
Cromatografie lichida ca cea descrisa in testul substantelor inrudite cu
urmatoarele modificari:
Injectie: solutie test (b), solutie de referinta (a).
Se calculeaza concentratie de amlodipina besilat din ariile de sub peak-uri si
din continutul declarat de C26H31ClN2O8S din amlodipina besilat CRS.
Depozitare.
In flacoane inchise etans si ferite de lumina soarelui.

IMPURITATI

III. MONOGRAFIE FARMACOPEEA BRITANIC

COMPRIMATE CU AMLODIPINA

IV. DOZAREA AMLODIPINEI DIN COMPRIMATE PRIN METODA CINETICSPECTROFOTEMETRICA

O metoda spectrofotometrica simpla si sensibila fost creata si validata pentru

dozearea amlodipinei besilat (AML). Metoda este bazata pe condensarea AML cu 7cloro-4-nitro-2.1.3-benzoxadiazol in tampon alcalin (pH 8.6) ce are ca rezultat un compus
intens colorat. Intensitatea culorii a fost masurata spectrofotometric cu un maxim de
absorbtie la 470 nm. Factorii ce afecteaza reactia au fost studiati si conditiile de reactie au
fost optimizate. Stoechiometria reactiei a fost determinata si reactia generala a fost
postulata. In plus, enegia de activare si rata specifica constanta a reactiei (la 70 o C) au fost
determinate ca 6.74 kcal mole-1 si respectiv 3.58 s-1. Metodele bazate pe rata initiala si pe
timpul fix au fost folosite pentru a construi si calibra grafcele determinarii concentratiei
de AML. In conditii optime de reactie, limitele de detectie si de cuantificare au fost 0.35
si respectiv 1.05 g/mL. Precizia metodei a fost satisfacatoare; deviatia standard relativa
a fost de 0.85-1.76%. Metoda propusa a fost aplicata cu succes analizei de AML in forma
ei pura si din tablete cu acuratete buna; procentajele de recuperare au fost de la 99.55
1.69% pana la 100.65% 1.48%. Rezultatele au fost comparate cu cele ale metodei
standard.
1. Introducere
Amlodipina besilate (AML), 3- etil 5-metil (4RS)-2-[(2-aminoetoxi)metil]-4-(2clorofenil)-6-metil-1,4-dihidropiridina-3,5-dicarboxilat benzesulfonat, este un blocant al
canalelor de calciu cu efect potent si de lunga durata. Este folosit la scara larga pentru
tratamentul hipertensiunii si al anginei stabile si variate. Este mai eficienta decat blocantele in tratamentul anginei pentru ca previne si reverseaza spasmele coronariene
rezultand in cresterea fluxului sangvin si a oxigenarii miocardice. Mai mult, inhiba
selectiv proliferarea celulelor muschiului neted arterial prevenind ingrosarea arterelor.
Amlodipina este prezenta ca monografie in BP, USP si EUP.
Din cauza importantei terapeutice a AML, au aparut multe metode de dozare a
10

concentratie fie din forme farmaceutice fie din fluide biologice. Aceste metode includ
HPLC, HPTLC, gaz-cromatografia, electroforeza capilara, analiza injectiei de flux,
voltametrie anodica si imunodozare enzimatica. Spectrofotometria este aleasa pentru
simplicitatea ei si este considerata una din cele mai usor de folosit metode de dozare.
Unele metode de dozare spectrofotometrica au fost aplicate dozarii AML, chiar daca ele
implica procese complicate sau aparatura avansata, ceea ce face ca metodele sa nu fie
aplicabile in toate laboratoarele. In comparatie cu metodele HPLC, metoda propusa este
simpla, ieftina si la fel de sensibila ca si unele metode HPLC sau HPTLC si mai sensibila
si selectiva decat metodele spectrofotometrice. De aceea, era nevoie de o metoda de
dozare noua. Spectrofotometria kinetica este din ce in ce mai cautata in analiza
farmaceutica. Aplicatiile metodelor specrofotometriei kinetice ofera avantaje precum
selectivitate crescuta, evita interferenta fundalului colorat sau turbidiscent si posibila
evitare a interferentelor altor compusi presenti in produsul comercial daca acestia sunt
rezistenti la conditiile de reactie ale metodelor propuse. Pana acum, nu au fost elaborate
metode de dozare kinetic-spectrofotometric pentru AML. Pentru acest motiv, scopul
acestui studiu este elaborarea unei metode kinetic-spectrofotometrice pentru dozarea
AML din comprimate folosind 7-cloro-4-nitro2,1,3-benzoxadiazol (NBD-Cl), agent
selectiv pentru aminele primare si secundare. Aceasta metoda este bazata pe reactia de
condensare a aAML cu NBD-Cl in mediu tampon alcalin cu producerea unei coloratii
intense su maxim de absorbtie la 470 nm. Rata de colorare este masurata
spectrofotometric si utilizata in metoda de dozare propusa.

2. Experiment
11

1. Aparatura
Spectrofotometrul UV, UV-1601 PC (Shimadzu, Japonia), cu cuve de cuartz de 1
cm a fost folosit pentru toate masuratorile. Super-agitator (Lab-line Intruments, Inc.,
USA). Baie de apa controlata termostatic de tip MLW (memmert GmbH, Co. Schwa
bach, Germania).
2. Reactivi, substante si comprimate
Amlodipina besilat (AML: Hetero Drugs Ltd., Hyderabad, India), a fost folosita
asa cum asa cum a fost primita (puritate 99.2-100.2%). NBD-Cl (Merck, Darmstadt,
Germania) folosit a fost de 0.08% in metanol si preparat zilnic. Urmatoarele comprimate
au fost folosite in studiu: Regcor comprimate (EgyptianInternationalPharmaceutical
IndustriesCo.,Cairo,

Egypt)

si

comprimate

Alkapress

andAlkapresstablets(AlkanPharma,Cairo, Egypt), cu continut declarat de 5 mg AML pe

comprimat. Toti reactivii folositi au fost reactivi de puritate analitica, iar apa a fost dublu
distilata.

3. Prepararea reactivilor
3.1. Solutia standard stoc
25 mg cantarite cu acuratete de AML se dizolva in 10 mL metananol, intr-un
balon cotat de 50 mL. Se aduce balonl la semn cu metanol pentru a obtine o solutie
standard de 0.5 mg/mL AML. Solutia s-a dovedit stabila pentru cel putin o saptamana
tinuta la refrigerare.
3.2. Solutiile comprimatelor
20 de comprimate din fiecare formulare au fost cantarita si triturate. O cantitate de
pudra ce corespunde la 25 mg AML a fost transferata intr-un balon de 50 mL si dizolvat
in 25 mL metanol. Dupa omogenizare 5 minute, s-a adus la semn cu metanol, s-a agitat
puternic 10 minute apoi s-a filtrat.

12

3.3. Solutia tampon

Soluti tampon Teorell-Stenhagen de pH 8.6 au fost preparate cu apa distilata
proaspat fiarta si racita. Tampon consta in acid fosforic, acid citric si solutie de hidroxid
de sodiu 1M, ajustate la pH 8.6 cu acid hidrocloric 0.1M.
4. Proceduri analitice generale
Un mililitru din solutia de referinta a fost transferat in eprubeta test, apoi un
mililitru Torell-Stenhagen si 1 mL NBD-Cl. Reactia a fost lasata sa aiba loc la 70 o C pe
baie de apa. Apoi, eprubetele au fost racite in baie de gheata si s-a adaugat 0.2 mL de acid
sulfuric concentrat dupa care s-a amestecat puternic. Continutul s-a transferat cantitativ in
eprubete gradate de 10 mL si diluate la semn cu metanol. Absorbantele solutiilor rezultate
au fost masurate la 470 nm avand ca martor solutii similare fara NBD-Cl.
5. Determinarea raportului molar al reactiei
A fost folosita metoda variatiei continue. Au fost preparate solutii echimolare de
AML si NBD-Cl. Concentratiile acestor solutii au fost de 5 x 10 -3 M in metanol. Serii de
10 mL din solutia de AML si din solutia de NBD-Cl au fost amestecate in diferite
proportii (0:10, 1:9, ... ..., 9:1, 10:1) in eprubete. S-a adugat apoi 1 mL de tampon TorellStenhagen in fiecare eprubeta. Reactiil au fost lasate sa aiba loc la 70 o C pentru 35 de
minute, au fost racite pe baie de gheata si s-a adaugat 0.2 mL acid sulfuric concentrat.
Continutl eprubetelor s-a transferat in eprubete gradate de 10 mL si aduse la semn cu
metanol. Absorbantele au fost masurate la 470 nm contra probe blank fara NBD-Cl.

6. Energia de activare a reactiei kinetice dintre AML si NBD-Cl

Timpul de reactie dintre AML si NBD-Cl a fost masurat la diferite temperaturi:
25, 40, 60, 70 si 80o C folosind 20 g/mL AML si 1 g/mL NBD-Cl la pH 8.6. S-au
stabilit curbele absorbanta-timp pentru a stabili rata initiala. S-au stabilit apoi curbe 1/T
raportat la log k pentru a determina panta curbei (energia de activare a reactiei).
7. Adunarea datelor si procesarea lor
13

Datele kinetice au fost adunate si transformate in programul Slide Write Plus,

versiunea 5.011 (Advanced GraphicsSoftware,Inc.,CA,USA), pentru elaborare curbelor,
analizei de regresie si a calcularii statistice. Rata initiala (V) a reactiei la diferite
concentratii a fost obtinuta din panta tangentei la curba absorbanta-timp. Curba de
calibrare a fost construita prin plotarea log V versus log c (concentratia AML).
Limitele de detectie (LOD) si limitele cuantificarii (LOQ) au fost determinate
folosid formula: LOD=kSDa/b, unde k=3.3 pentru LOD si 10 pentru LOQ, SDa este
deviatia standard, iar b este panta.
3. Rezultate si discutii
3.1. Conditii optime pentru reactia AML cu NBD-Cl
NBD-Cl

fost

initial utilizat ca reactiv

fluorigenic
determinarea

in
unor

amine. Mai mult a fost

folosit

ca

cromogenic

reactiv
pentru

determinarea
colorimetrica a multor
amne farmaceutice. In
studiul prezent, reactia
AML cu NBD-Cl a
produs

coloratie

intensa a compusului
rezultat cu absorbtie maxima la 470 nm (fig.1).

14

S-a observat ca formarea

compusului colorat creste in
timp, de aceea s-a considerat
utila elaborarea unei metode
kinetice pentru determinarea
concentratiei
Urmatorul

de
paragraf

AML.
descrie

conditiile sub care reactia AML

cu

NBD-Cl

indeplineste

conditiile

analizei

spectrofotometrice.
Datorita componentei clorura din NBD-Cl, reactivul a trebuit sa fie preparat zilnic.
Efectul concentratiei NBD-Cl asupra reactiei a fost studiat la temperatura camerei si
departe de lumina naturala sua artificiala. Dupa cum se observa in figura 2, reactia AML
cu NBD-Cl este dependenta de concentratia de NBD-Cl. Cea mai mare absorbanta a fost
atinsa cu o concentratie de reactiv NBD-Cl in solutie finala de 0.06 si 0.010%. De aceea,
concentratia de 0.008% a fost selectata pentru restul experimentelor.
Pentru a genera nucleofile din
AML s-au folosit mai multe variante
de tampon la diferite valori de pH (710). Cele mai bune rezultate au fost
obtinute folosind un tampon Torellstenhagen pH 8.6 (fig. 3.). La valori
mai mari de pH, la adaugarea NBDCl s-a constatat aparitia unui coloid
alb care precipita, citiri mari de proba
blank si sensivitate scazuta.
Efectul

temperaturii

asupra

reactiei a fost studiat prin efectuarea

reactiei

la

diferite

valori

de
15

temperatura, iar rezultatele au aratat ca cele mai bune citiri au fost pentru probele
efectuate la 70o C (fig. 4.). La temperaturi mai mari s-au observat scaderii in valorile
absorbantei. Acest fapt a fost atribuit instabilitatii complexului AML-NBD la temperaturi
mari. NBD-Cl este hidrolizat in mediu alcalin cu obtinerea de NBD-OH care are o
intensitate de absorbtie la 470 nm. De aceea a fost necesar acidularea amestecului la pH 2
pentru a scade absorbanta probei blank. Pentru a alege cel mai potrivit acid pentru
acidulare s-au efectuat teste cu acid sulfuri, hidrocloric, pecloric, nitric, fosforic si acetic.
Cele mai bune rezultate au fost obtinute folosind acidul sulfuric.
Pentru a alege cel mai bun solvent pentru dilutii s-au facut teste cu solventi de
diferite polaritati: apa, metanol, etanol, acetonitril si acetona. Metanol a fost gasit ca fiind
cel mai bun solvent, oferind intensitatea maxima de absorbtie si a fost selectat pentru
experimentele urmatoare.
3.2. Stoechiometria si mecanismul de reactie.
Stoechiometria reactiei dintre AML si NBD-Cl a fost determinata folosind metoda
Job. Raportul dintre AML:NBD-Cl a fost gasit ca fiin 1:1 chiar daca sunt 2 grupari amino
care reactioneaza cu reactivul NBD-Cl. Datorita afinitaitii mai mari a grupei amino
principale pentru NBD-Cl, s-a decis ca reactia avanseaza conform fig. 5.
3.3. Cinetica reactiei
Folosind conditiile optime descrise mai sus, au fost generate curbele absorbanta-timp
alea reactiei. Ratele initiale au fost stabilite prin panta tangentei la curba absorbanta-timp
(fig. 6|). Ordinul reactiei a fost stabilit prin studierea reactiei la diferite concentratii de
NBD-Cl si o concentratie fixa de AML. Curba ratei initiale pe absorbanta intiala a fist
lineara si trecea prin origine, indicand o reactie de ordinul I. Cu toate acestea, in conditii
optime experimentale, s-a folosit un mic exces relativ de NBD-Cl ceea ce a atras o
cinetica de pseudo ordin I.

16

3.4. Energia de activare

Energia de activare, energia minima cinetica pe care o molecula trebuie sa o detina
pentru a intra intr-o reactie se poate stabili folosind ecuatia Arrhenius: V k
AeEa=RT, unde V este rata reactiei, A este o constanta numita factor de frecventa, Ea este
energia de activare, T este temperatura absoluta, R este constanta gazoasa.
Energia de activare a areactiei AML BD-Cl a fost determinata prin studierea
reactiei la diferite temperaturi folosind concentratii fixe de reactivi. Curbele absorbtietimp la acest temperaturi au fost construite pentru a determina rata initiala, apoi s-a
contruit 1/T versus log k pentru a determina panta curbei; -Ea/2.303 R (fig. 7). Energia de
activare a fost gasita ca fiind 6.74 kcal mol -1. Aceasta energie de activare joasa a explicat
faptul ca reactia de substitutie nucleofilica dintre AML si NBD-Cl poate avea loc in
conditii blande si ca NBD-Cl este un reactiv viabil.
3.5. Metode de cuantificae
3.5.1.

Metoda ratei initiale

Rata initala a reactiei urmeaza o cinetica de pseudo ordin I, si respecta ecuatia: V

DA=Dt K0Cn, unde V este rata reactiei, A este absorbanta, t este timpul masuratorii, K
este constanta de ordin, C este concentratia AML, iar n este ordinul reactiei. Forma

17

logaritmica a ecuatiei este LogV logDA=Dt logK0 + nlogC. Analiza de regresie a

fost folosita pentru a evalua panta si corela coeficientii. Parametrii analitici si rezultatele
analizei de progresie sunt dati in Tabelul 1. Rata specifica constanta a reactiei cinetice a
fost determinata ca fiind 214.88min-1 sau 3.58s-1. Valoarea lui in ecuatia progresiei este
0.9623 confirmand ca reactia AML cu NBD-Cl este de ordin I raportat la concentratia
AML. Limita de detectie (LOD) si limita de cuantificare (LOQ) au fost gasite ca fiind
0.35 si respectiv 1.05 g/mL. Aceste valori mici confirma sensivitatea buna a metodei
ratei initialesi in consecinta abilitatea metodei de a determina cantitati mici de AML.
3.5.2.

Metoda timpului fix

In aceasta metoda absorbanta diferitelor solutii cu diferite cantitati de AML au fost

masurate la momente fixe de timp. Calibrarea curbelor de absorbanta versus concentratia
de AML au stabilit momente fixe ale reactiei. Ecuatiile de regresie, corelatia
coeficientilor, LOD si LOQ sunt date in Tabelul 2. Cele mai joase limite de cuantificare
au fost gasite ca fiind in momentele 25, 30 si 35 min. Totusi, momentul 5 min. a aratat un
domeniu mai larg de cuantificare a concentratiei. Conform ghidurilor ICH, limita de
detectie nu este necesara pentru procedurile analitice, de aceea s-a utilizat momentul 5
min. pentru determinarea AML.
18

3.5.3.

Validarea metodelor propuse

3.5.3.1. Acuratete si precizie.

Acuratetea

si

precizia

metodei

cinetic-

spectrofotometrice propuse au fost determinate la 3 nivele de concentratie de AML

analizand 5 probe replicat din fiecare concentratie prin ambele metode descrise mai sus.
Deviatiile relative standard pentru rezultate au variat de la 1.04% pana la 1.76% si 0.85%
pana la 1.42% pentru metodele ratei initiale si ale timpului fix din metoda
spectrofotometrica propusa. Acest lucru demonstreaza reproductibilitate mare a
rezultatelor si precizia metodelor. Aceste caracteristici sunt potrivite pentru analiza AML
din comprimate farmaceutice.
3.5.4.

Recuperearea analitica si interferente

Acuratetea metodei a fost testata si prin experimente de recuperare folosind metoda

aditiei standard. Cantitati cunoscute de AML pura au fost adaugate peste comprimate preanalizate si apoi determinate prin metoda propusa. Rezultatele au variat intre 98.6% si
99.4%, iar deviatiile au variat intre 0.79-1.33%. Aceste rezultate au dovedit acuratetea
metodeleor propuse si absenta interferentelor din partea excipientilor. Merita notat faptul
ca metoda spectrofotometrica propusa a fost efectuata in domeniul vizibil si nu in
domeniul UV unde pot aparea interferente de la excipienti.
3.5.5.

Robustete

Robustetea a fost testata prin evaluarea influentei variatiei mici ale parametrilor
experimentali asupra performantei analitice a metodei. In aceste experimente un
parametru a fost schimbat in timp ce restul au fost pastrate constante si au fost calculate
rezultatele de fiecare data. S-a dovedit ca niciunul dintre parametrii nu a schimbat notabil
performantele metodei. Acest lucru este un indicator al performantei metodei si al
dependabilitatii ei la aplicatii de rutina. S-au efectuat analizei prin metoda propusa si in
laboratoare diferite cu aparate diferite, iar deviatiile standard nu au depasit 2.32%.
3.6. Aplicatia metodei propuse
Cele doua metode al spectrofotometriei cinetice au fost folosite pentru comprimate
farmaceutice cu AML din comert. Rezultatele obtinute prin metoda propusa au fost
comparate cu cele obtinute din metoda de referinta, cu privinta la acuratete si precizie. S19

au efectuat teste t- si F- dar rezultatele nu au aratat diferente notabile intre cele doua
metode afisand un grad de incredere de 95%. Acest lucru arata precizie si acuratete
similara in analiza AML din comprimate.
4. Concluzie
O metoda spectrofotometrica cinetica, simpla si sensibila pentru determinarea
AML a fost elaborata si validata cu succes. Metoda este bazata pe reactia de condensare a
AML cu NBD-Cl. Metodele ratei intiale si al timpului fix pentru metoda
spectrofotometrica pot fi utilizate cu usurinta pentru determinarea cantitatii de AML pura
din comprimate. De asemenea, energia de activare a reactiei a fost determinata. Metoda
propusa este destul de sensibila pentru determinarea cantitatilor mici de AML si
comparabila cu metoda de referinta din punct de vedere al acuratetei si preciziei. Metoda
propusa, pentru ca vizeaza o citire in mediul vizibil este mai selectiva decat metoda de
referinta care implica masuratori in UV. Aceste avantaje incurajeaza aplicarea metodei
propuse in analiza de rutina a AML in laboratoarele de control analitic ca alternativa la
metodele existente.

20

V. Rezultate si discuii

Lucrarea prezentata are ca tem descrierea comprimatelor de Amlodipina.

21

Bibliografie
1. Farmacopeea European 5.0 vol 1, 01/2005, pag.
2. Farmacopeea European 5.0 vol 2, pag.
3. Farmacopeea Britanic, n vigoare cu ediia a 7-a a Farmacopeei Europene i
Suplimentele
4. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2095177912000421