Sunteți pe pagina 1din 45

EXPRIMAREA INFORMAIEI GENETICE

5.1. Transcrierea
ADN are dou funcii primare: funcia autocatalitic, reprezentat de
realizarea procesului de replicare i funcia heterocatalitic ce const n procesul
dirijrii de ctre ADN a sintezei unor molecule specifice, n esen proteine. Dac
funcia autocatalitic o ndeplinete prin natura structurii sale bicatenare, funcia
heterocatalitic a ADN este ndeplinit prin intervenia unor intermediari ntre ADN
i proteinele sintetizate cu funcii variate. Aceti intermediari sunt reprezentai de
diferitele categorii de acizi ribonucleici (ARN) celulari. Sinteza acestora este dirijat
de ctre ADN, la nivelul unor secvene specifice ale acestuia.
Procesul de sintez a diferitelor categorii de ARN celular se
numete transcriere genetic. Molecula de ARN rezultat n urma acestui proces
este identic n ceea ce privete secvena de nucleotide cu una dintre catenele ADN
(cu excepia faptului c timina este nlocuit de uracil), aceasta fiind numit caten
sens sau codogen i complementar cu cealalt care, de altfel, a servit ca matri
pentru sintez (aceasta fiind denumit catena nonsens) (fig.36).

Fig.36. Relaia dintre ARN sintetizat i catenele de ADN


La fel ca i n cazul replicrii, transcrierea genetic se realizeaz numai n
celule, existnd diferene n ceea ce privete locul transcrierii genetice la procariote
i eucariote, impuse de specificul organizrii celulare. La procariote transcrierea se
realizeaz pe matria ADN la nivelul nucleoidului, dar molecula de ARN poate fi
folosit de mainria de traducere a mesajului genetic nainte ca sinteza lui s fie
terminat. La eucariote organizarea nuclear impune ca transcrierea s se
desfoare n nucleu iar traducerea s se produc n citoplasm, dup ce moleculele
de ARN au suferit procesul de maturare i au trecut prin porii membranei nucleare.

In celule, indiferent c sunt procariote sau eucariote, exist mai multe tipuri de
ARN care sunt implicate n procesul de biosintez proteic. Acizii ribonucleici sunt
compui ribonucleotidici sintetizai prin polimerizarea a patru tipuri de ribonucleotide
(AMP, GMP, UMP i CMP)(tabelul 3), reacia fiind catalizat de transcriptaz sau
ARN-polimeraza dependent de ADN.
Cercetrile lui Chargaff (1950) au indicat c n macromoleculele de ARN
raporturile molare dintre baze variaz n limite foarte largi i nu se mai respect
principiile stabilite pentru ADN dublu catenar.
Structura primar a ARN este reprezentat de ordinea ribonucleotidelor din
monocatena sa. Lungimea diferitelor tipuri de ARN variaz ntre 75 la 10.000
nucleotide. Cele mai mici molecule de ARN sunt reprezentate de ARN de transfer
(ARNt - 80 nucleotide).
ARN-polimeraza are capacitatea de a recunoate cu mare exactitate secvene
specifice de baze azotate de pe matria de ADN, realiznd polimerizarea unor
ribonucleozid-trifosfai liberi aliniai pe matri n virtutea complementaritii
dintre bazele azotate: adeninei din matri i corespunde uracilul n catena ARN,
timinei i corespunde adenina iar guaninei i va corespunde citozina (i invers),
specific fiind faptul c nucleotidele care intr n componena ARN conin n
structura lor riboza (sunt ribonucleotide).
ARN-polimeraza catalizeaz formarea de legturi fosfodiesterice ntre
ribonucleotidele succesive. Majoritatea procariotelor conin o singur ARNpolimeraz (cel mai bine fiind studiat cea de la E.coli), n timp ce n celulele
eucariote au fost identificate trei tipuri de ARN-polimeraze, cu localizare nuclear
(fie n nucleoplasm fie la nivelul nucleolului), specializate n sinteza unui anumit
tip de ARN.
Transcrierea necesit existena matriei ADN fapt pentru care, la nivelul
unor regiuni specifice, cele dou catene ale ADN se separ (are loc o denaturare
fiziologic), iar una dintre ele (catena nonsens) servete ca matri pentru sinteza
ARN. ARN-polimeraza are capacitatea de a iniia sinteza de novo a unei catene
ARN fr a fi necesar existena unui primer; ea citete catena de ADN pe care o
copiaz n sensul 35, iar sinteza ARN se realizeaz n sensul 53. In acest mod,
ribonucleozid-trifosfaii sunt adugai pe rnd la nivelul gruprii 3OH a
ribonucleotidei anterioare, n urma reaciei de polimerizare fiind eliberate grupri
pirofosfat. Transcrierea realizat de ARN-polimeraz este, n esen, asemntoare
cu replicarea i prezint etapele de iniiere, elongare i terminare.

Procesul de transcriere ncepe atunci cnd ARN-polimeraza se leag la


nivelul unei regiuni specifice, numit promotor, localizat la extremitatea 5' a
secvenei genice ce va fi transcris. Fenomenul debuteaz la nivelul aa numitului
punct de start al transcrierii i se desfoar pn cnd ARN-polimeraza ajunge
la nivelul unei secvene de terminare (terminator sequence) (fig.37). Aceast
aciune definete o unitate transcripional care se ntinde de la promotor la
secvena terminator i se refer de obicei la ARNm.
Fig.37. Etapele
procesului
de
transcriere

Produsul rezultat n urma transcrierii a primit denumirea de transcript


primar (sau produs primar de transcriere). La bacterii, ARNm copiaz mai multe
gene alturate (ce formeaz un operon) fiind policistronic, n timp ce la eucariote el
copiaz o singur gen, fiind monocistronic. De regul acest produs primar este
instabil, att la procariote ct i la eucariote, el suferind unele prelucrri
posttranscripionale. In cazul procariotelor, produsul primar este fie degradat
rapid, dup ce i-a ndeplinit funcia (ARNm), fie este clivat pentru a forma produi
funcionali (ARNr sau ARNt). La eucariote, produsul primar ce a copiat o gen
discontinu este prelucrat prin eliminarea secvenelor non-informaionale (intronii)
sau prin adugarea unor secvene specifice de nucleotide la extremitile moleculei.
Inainte de a prezenta etapele procesului de transcriere la procariote i
eucariote, sunt necesare cteva precizri. Atunci cnd se vorbete despre
funcionarea unei gene se nelege faptul c respectiva secven de ADN servete
ca matri pentru sinteza unei molecule de ARN. Pe lng genele ce codific sinteza
unor catene polipeptidice specifice i care sunt transcrise la ARNm, la nivelul ADN
exist numeroase alte gene a cror funcie este de a codifica molecule de ARN nemesager. Acesta este cazul genelor pentru ARNr, ARNt sau ARNsn. Despre
particularitile acestor categorii de ARN i despre funciile lor se va vorbi pe larg n
capitolul urmtor.
5.1.1. Particularitile transcrierii genetice la procariote
Cel mai studiat sistem bacterian de transcriere este cel de la E.coli i, cu toate
c exist particulariti n cazul anumitor bacterii, el a cptat un caracter de
aplicabilitate general n grupul bacteriilor. In procesul de transcriere este implicat
o unitate transcripional ce se ntinde de la nivelul promotorului pn la secvena
de terminare.
Promotorul, secven de nucleotide plasat la extremitatea 5 a genei, este
esenial pentru transcrierea acesteia dar el nu se regsete n structura ARNm. La
captul opus se gsete regiunea de terminare ce asigur ncheierea transcrierii, dar
nici ea nu este transcris i, prin urmare, nu intr n alctuirea ARNm (fig.38).

Fig.38. Structura unei uniti transcripionale de la procariote


Aa cum se poate observa n fig.38, n structura unitii transcripionale
exist situsul (punctul) de start de la nivelul cruia ncepe propriu-zis procesul de
copiere a informaiei genetice din ADN n ARN. Prima nucleotid transcris este
notat cu +1 i este plasat n dreapta punctului de start, iar prima nucleotid
netranscris (plasat n stnga punctului de start) este notat cu 1; urmtoarea
nucleotid copiat este notat cu +2 i aa mai departe.
Molecula de ARNm rezultat n urma transcrierii unei asemenea gene
conine dou categorii de regiuni: o regiune ce va fi tradus, regsindu-se ulterior
sub forma unei succesiuni de aminoacizi din structura unei proteine i alte dou
regiuni care nu vor fi traduse. Aceste secvene de nucleotide sunt localizate, pe de o
parte, la nivelul extremitii 5 a ARNm i conin semnalele necesare iniierii
procesului de traducere (secvena Shine-Dalgarno) i, pe de alt parte, la
extremitatea 3, coninnd semnalele necesare ncheierii traducerii.
Dei orice gen este alctuit din dou catene de ADN cu polaritate opus,
atunci cnd se fac referiri la aceasta se precizeaz doar extremitatea 5 i 3 de pe o
caten. Intotdeauna, captul 5 al unei gene este cel care conine promotorul, el
corespunznd cu captul 3 al catenei complementare (matri) i cu extremitatea 5
a ARNm corespunztor. Atunci cnd se dorete prezentarea schematic a unei gene,
captul 5 este plasat ntotdeauna n stnga.
Trebuie precizat faptul c nu exist obligativitatea ca toate genele s fie
transcrise utilizndu-se drept matri aceeai caten de ADN. La bacterii s-a dovedit
c, deseori, gene adiacente sunt transcrise n sens opus: sinteza ARNm se face tot n
sens 53 dar catena copiat este diferit.

Procesul de transcriere genetic la procariote (ca de altfel i la eucariote) se


desfoar ntrei etape succesive: iniiere, alungire i terminare. Dintre aceste etape,
iniierea este cea mai complex (are mai multe trepte: recunoaterea promotorului,
despiralizri locale, iniierea propriu-zis a sintezei) i presupune implicarea mai
multor elemente: promotor, ARN-polimeraza i, n anumite cazuri a unor factori
suplimentari.
5.1.1.1. Iniierea transcrierii
Procesul de iniiere debuteaz la nivelul unei secvene specifice de ADN
numit promotor care interacioneaz cu enzima ARN-polimeraza.
Secvena promotor ce precede orice gen a fost izolat pe baza experimentelor
realizate laE.coli, prin amestecarea ARN-polimerazei cu ADN i apoi tratarea
amestecului cu enzime care diger ADN dar las intact regiunea la care s-a legat
ARN-polimeraz. In final, dup digestia enzimatic i ndeprtarea ARN polimerazei,
a fost determinat ordinea nucleotidelor din secvena de ADN rmas (aproximativ 5060 pb).
Examinarea unui numr mare de secvene promotor de la mai multe gene de la
procariote a evideniat anumite trsturi comune. Astfel, exist o secven TATAAT,
denumit cutia Pribnow sau regiunea 10 (centrat pe nucleotida din poziia 10,
raportat la punctul de start al transcrierii), ea fiind conservat la toate secvenele
promotor de la procariote. O a doua secven, denumit regiunea 35, este comun
procariotelor i este localizat la aproximativ 35 pb n faa (n direcia de transcriere)
situsului de start al transcrierii (este centrat pe nucleotida din poziia 35). Se
consider c ambele regiuni, -10 (TATAAT) i 35 (TTGACA) reprezint secvene
consens, adic se regsesc la majoritatea promotorilor bacterieni. Mai mult, se
apreciaz c punctul de start al transcrierii este de obicei o purin, localizat la mijlocul
tripletei CAT.
Al doilea element esenial realizrii transcrierii este reprezentat de ARNpolimeraz. Cea mai studiat enzim de acest tip este ARN-polimeraza de
la E.coli. La aceast bacterie s-a evideniat faptul c exist aproximativ 7.000
molecule de enzim per celul, viteza de sintez fiind de 40 ribonucleotide/ secund
la 37oC. Viteza de transcriere este comparabil cu cea de traducere (aproximativ 15
aminoacizi/secund), dar este cu mult mai mic dect viteza de replicare (800
nucleotide/secund).

ARN-polimeraza dependent de ADN sau transcriptaza este de fapt un


complex enzimatic cu structur cuaternar. ARN-polimerazele, indiferent de origine,
au n general aceleai trei funcii eseniale:
aleg catena purttoare de informaie
recunosc nceputul i sfritul mesajului genetic
rspund la aciunea unor factori de reglare pozitiv sau negativ.
In ceea ce privete structura chimic, ARN-polimeraza de la E.coli are o mas
molecular de 465 kDa i este alctuit din patru subuniti majore (2 subuniti i
cte o subunitate i ') la care se mai adaug o subunitate .
Holoenzima (enzima complet format din cele cinci subuniti: 2 )
poate fi separat n dou componente: miezul enzimatic sau apoenzima (2 ) i
factorul (polipeptidul ). Pentru realizarea corect a transcrierii (mai ales a
iniierii procesului) este necesar asamblarea tuturor componentelor (Zarnea, 1986).
S-a demonstrat c miezul enzimatic al ARN-polimerazei poate realiza sinteza
de ARN dar nu poate iniia n mod corect procesul de transcriere pentru care este
obligatorie asamblarea i a factorului . Dup ce procesul de transcriere a fost iniiat,
iar lungimea catenei de ARN a ajuns la 8-9 ribonucleotide, factorul se desprinde de
holoenzim, apoenzima continund singur sinteza ARN.
Iniial, ARN-polimeraza recunoate i se leag la nivelul regiunii 35,
considerat de unii autori ca fiind situsul R ("recognition"), dup care contactul cu
ADN se extinde i la regiunea 10 (situsul B, de legare strns).
Segmentul din ADN ce va fi transcris va suferi o denaturare fiziologic n
zona de start a transcrierii: la nivelul su cele dou catene complementare se separ
prin desfacerea punilor de hidrogen dintre, aproximativ, 12 pb situate ntre
regiunea 10 i punctul de start i se formeaz astfel un ochi de transcriere (bucl
de transcriere sau vezicul de transcriere = transcription bubble). Aceast
denaturare local a ADN este favorizat de faptul c regiunea 10 este bogat n AT.
Se spune n acest caz c ARN-polimeraza formeaz mpreun cu ADN un complex
promotor deschis.
De asemenea, pe lng rolul de a sintetiza efectiv sinteza ARN, ARNpolimeraza realizeaz n plus derularea duplexului n direcia de naintare a veziculei
de transcriere i respiralizarea ADN n urma acesteia. Lungimea regiunii de ADN
temporar denaturat variaz n funcie de faza de sintez a ARN, de la 12 pb la 20 pb,
dar mrimea regiunii hibride ADN-ARN (intermediar de transcriere) este mult mai
mic. Dup desfacerea localizat a legturilor de hidrogen dintre cele dou catene ale

ADN ncepe sinteza ARN, prima ribonucleotid fiind, de regul, purinic (AMP sau
GTP).
Deseori, n procesul de iniiere a transcrierii, regiunea promotor este mult mai
mult dect un situs de legare pentru ARN-polimeraz. Ea conine informaia pentru
legarea, n unele cazuri, a factorilor de reglare accesorii, de tipul AMP c - CAP
(adenozin-monofosfat ciclic cataboliteactivation protein = CAP = proteina
receptoare a AMPc= CRP).
O situaie special este cea a genelor suprapuse: la bacteriofagul X174, un
genom de numai 5,3 kb nu ar putea conine 10 gene cte s-au identificat pe baza
proteinelor virale codificate, iar analiza atent a codonilor de iniiere i de terminare
a dus la concluzia c dou gene sunt complet incluse n alte dou gene (B n A i E n
D), fiind folosite dou cadre de citire diferite n aceeai secven de ADN. O alt
gen K acoper genele A i C (fig.39).

Fig.39. Evidenierea celor trei cadre de citirea diferite ale mesajului genetic la
bacteriofagulX174
5.1.1.2. Alungirea ARN
Iniierea transcrierii face s fie ataat la matri primul NTP care ofer
gruparea 3'-OH ce va fi pus n legtur de ctre ARN-polimeraza cu gruparea 5'fosfat a nucleotidului urmtor prin reacia ce poart numele de atac nucleofilic.
Subunitatea a enzimei catalizeaz formarea legturii fosfodiesterice i astfel
ncepe procesul de elongaie a monocatenei poliribonucleotidice, finalizat printr-o
molecul de ARN.
Sinteza catenei ARN, adic transcrierea genetic se realizeaz n direcia
5'3', aceasta fiind direcia de elongaie, matria de ADN fiind citit totdeauna n
direcia 3'5', astfel c matria i produsul de transcriere sunt antiparalele.
Spre deosebire de ADN-polimeraz care are numai specificitate de direcie,
ARN-polimeraza are i specificitate de secven recunoscnd promotorul genei care
trebuie s funcioneze la un moment dat.
5.1.1.3. Terminarea transcrierii

Incheierea procesului de transcriere se poate realiza la bacterii prin dou


mecanisme: unul care este determinat doar de secvena de ADN i altul care necesit
prezena unor proteine specifice. In cazul anumitor procariote, la captul unor gene
transcrise se afl secvene de nucleotide ce corespund regiunii de terminare, care
determin formarea la nivelul ARNm corespunztor a unei structuri de tip trunchi i
bucl (stem and loop).
In cazul celui ce-al doilea mecanism de terminare a transcrierii este implicat o
protein specific numit factorul rho. Aceasta se ataeaz la ARNm n curs de
formare i se deplaseaz de-a lungul moleculei n urma ARN-polimerazei. Atunci cnd
aceasta ajunge la nivelul regiunii de stopare a transcrierii, ARN-polimeraza i
ncetinete foarte mult activitatea de polimerizare astfel c factorul rho poate s
interacioneze cu ARN-polimeraza. Factorul rho are aciune helicazic specific
asupra hibrizilor ADN-ARN formai n cursul transcrierii, rezultatul final al activitii
sale fiind detaarea ARNm de matri i ncheierea transcrierii (Platt, 1986).
5.1.2. Transcrierea genelor la eucariote
Din punct de vedere chimic, sinteza ARNm la eucariote este realizat n acelai
mod ca i la procariote: cele patru categorii de ribonucleozid-trifosfai sunt asamblate
de ctre ARN-polimeraz utilizndu-se o caten de ADN drept matri. Cele mai
importante diferene provin din structura diferit a genelor de la eucariote, acestea
avnd de regul o structur discontinu (sunt alctuite din secvene informaionale
numite exoni ce alterneaz cu secvene noninformaionale numite introni).
In esen, etapele procesului de transcriere sunt aceleai ca i la procariote:
iniiere, alungire i terminare, aspecte deosebite aprnd doar n procesul de iniiere.
5.1.2.1. Iniierea transcrierii la eucariote
In celulele eucariote s-a demonstrat c exist trei tipuri de ARN-polimeraze
care realizeaz transcrierea difereniat a genelor:
ARN-polimeraza I transcrie genele pentru ARNr
ARN-polimeraza II determin sinteza ARNm
ARN-polimeraza III transcrie genele pentru ARNt i pentru alte
molecule de ARN de dimensiuni mici (ARNsn).
Aa cum s-a menionat deja, localizarea nuclear a acestor enzime este
variat: prima este localizat la nivelul nucleolului, iar celelalte dou se gsesc n

nucleoplasm. Toate cele trei enzime sunt agregate macromoleculare, de cel puin
500 kD, avnd mai multe subuniti polipeptidice (8-14 subuniti). La eucariote, pe
lng ARN-polimerazele nucleare au mai fost identificate i ARN-polimeraze care
funcioneaz la nivelul organitelor citoplasmatice (mitocondrii i cloroplaste), dar
acestea sunt de dimensiuni mai mici i sunt asemntoare enzimelor bacteriene.
Nici una dintre cele trei tipuri de ARN-polimeraze de la eucariote nu
recunosc promotorul n mod direct ci prin intermediul unor factori de transcriere,
iniiindu-se astfel procesul de transcriere. Factorii de transcriere au aceleai funcii
pentru toate tipurile de ARN-polimeraze, numrul lor fiind mai mare n cazul ARNpolimerazei II; ei au fost grupai n trei categorii:
factori generali necesari pentru iniierea sintezei ARN indiferent de

tipul de promotor. Ei interacioneaz cu ARN-polimeraza formnd un


complex macromolecular localizat n jurul punctului de start i
determinnd situsul de iniiere. Factorii generali de transcriere
mpreun cu ARN-polimeraza alctuiesc aparatul de transcriere;
factori suplimentari din amonte (upstream factors) sunt proteine

de legare la ADN ce recunosc anumite secvene de nucleotide comune


mai multor promotori (elemente de consens) localizate n faa (spre
captul 5) punctului de start. Activitatea acestor factori nu este
supus unor mecanisme reglatoare, ei acionnd la nivelul oricrui
promotor ce conine situsul de legare corespunztor. Ei au efect de
cretere a eficienei iniierii i determin funcionarea promotorilor la
un nivel adecvat. Setul specific de asemenea factori necesari pentru o
exprimare optim este caracteristic fiecrui promotor;
factorii inductibili funcioneaz ntr-o manier similar factorilor

suplimentari dar ei au un rol reglator. Aceti factori sunt sintetizai


sau activai n anumite momente sau n anumite esuturi i sunt
responsabili de controlul n timp i spaiu al transcrierii.
Promotorul reprezint un alt element esenial procesului de iniiere a
transcrierii, el coninnd regiunile de recunoatere pentru ARN-polimeraz i
pentru factorii de transcriere. Promotorii ce conin situsurile pentru factorii
generali i pentru cei suplimnetari din amonte vor fi transcrii n orice tip de
celul, ei fiind responsabili de exprimarea genelor cu funcionare constitutiv.
Iniierea specific a transcrierii de ctre ARN-polimeraza II necesit
intervenia i a altor elemente de control, cum sunt factorii inductibili. Acetia pot
interaciona att cu factorii suplimentari ct i cu cei generali (interaciunea este de

tip protein-protein) precum i cu secvene de nucleotide localizate n faa


punctului de start al transcrierii.
Secvenele de nucleotide ce alctuiesc promotorul (aproximativ 200 pb) sunt
definite operaional pe baza localizrii lor (n vecintatea punctului de start) i a
necesitilor pentru iniiere. Analizele efectuate asupra unor promotori tipici au
evideniat faptul c acetia conin trei secvene specifice de nucleotide, centrate la
nivelul nucleotidelor din poziiile 30, -75 i 90, toate fiind necesare pentru iniierea
optim a procesului de transcriere (Lewin, 1997).
Prima secven dintre cele menionate (centrat pe nucleotida din poziia
30, raportat la situsul de start) este denumit cutia Hogness, cuprinde o secven de
7 nucleotide TATAAAA i este echivalent cutiei Pribnow de la procariote (Young,
1991). Aceast secven este esenial pentru iniierea transcrierii ea fiind regsit,
cu aceeai succesiune de nucleotide, la majoritatea genelor de la eucariote. Din acest
motiv, aceast secven, ca de altfel i secvenele 75 i 90, au fost denumite
secvene consens, avnd caracter de generalitate. La nivelul cutiei TATA se leag
direct factorul TBP, iar aceast secven mpreun cu regiunea iniiator din
imediata vecintate a punctului de start sunt responsabile de asigurarea startului
corect al transcrierii de ctre ARN-polimeraza II.
A doua secven, centrat pe nucleotida din poziia 75, se numete cutia
CAAT ea fiind, de asemenea, o secven consens (5 GGCCCAATCT 3).
Sensibilitatea la mutaii a acestei secvene sugereaz faptul c ea joac un rol
important n determinarea puterii unui promotor.
Pe lng cele dou secvene menionate, n zona 90 a majoritii
promotorilor se gsete aa numita cutie GC, cu secvena consens GGGCGG.
Deseori, la nivelul multor promotori exist copii multiple ale acestei secvene, ele
putnd funciona n ambele orientri.
In afar de promotor, n iniierea procesului de transcriere mai sunt
implicate i alte secvene de ADN ce stimuleaz declanarea transcrierii dar acestea
sunt localizate la o distan considerabil n raport cu punctul de start (fie spre
captul 5 fie 3 al regiunii de ADN luat n discuie). Asemenea secvene,
considerate a constitui un alt tip de elemente necesare transcrierii au primit
denumirea de elemente activatoare sau secvene de tip enhancer (termenul din
limba englez fiind de foarte multe ori preferat chiar i n lucrrile de specialitate
din limba romn).

5.1.2.2. Alungirea catenei de ARN


Dup ce primele ribonucleotide au fost ataate la matria de ADN de ctre
ARN-polimeraza corespunztoare, continuarea sintezei catenei de ARN se
realizeaz la fel ca i la bacterii: citirea mesajului genetic se face n sensul 35 iar
sinteza catenei de ARN se realizeaz n sensul 53.
5.1.2.3. Terminarea transcrierii la eucariote
Dac la procariote aspectele legate de ncheierea transcrierii sunt relativ
clare, la eucariote lucrurile nu stau la fel. Astfel, nu se cunoate cum are loc acest
proces n cazul genelor eucariote nefiind identificate semnalele de terminare a
transcrierii.
Experimentele efectuate cu ARN-polimeraza II au evideniat c aceast
enzim, atunci cnd ajunge n regiunea 3 a genei transcrise, determin sinteza unei
secvene AAUAAA (conform matriei de ADN) dar, se pare c sinteza ARN continu
i dup aceast secven. In final, o enzim special taie produsul de transcriere la o
scurt distan dup secvena AAUAAA, dup care, o alt enzim independent de
matri (poliA polimeraza), adaug o serie de nucleotide cu adenin (aproximativ
200), utiliznd ca surs de nucleotide ATP, formnd coada poliA (poliadenilat) la
nivelul creia se leag proteine specifice. Deoarece coada poli A lipsete n cazul
ARNm pentru histone, nseamn c aceasta nu este esenial pentru transcriere. Se
pare c aceast secven, adugat dup ce procesul de transcriere s-a ncheiat, ar fi
implicat n asigurarea stabilitii moleculei de ARN n celul (Ross, 1995).
La eucariote s-a evideniat faptul c produsul de transcriere este supus
unor prelucrri postranscripionale: adugarea cozii poliA; adugarea secvenei
cap; modificarea chimic unor nucleotide; eliminarea intronilor i asamblarea
exonilor (fig.40).
Fig.40. Prelucrrile post-transcripionale al
moleculelor de ARNm de la eucariote

De exemplu, imediat ce sinteza ARN ncepe, la captul 5 al transcriptului


primar se adaug secvena 7-metil-guanozintrifosfat care constituie ceea ce englezii
denumesc cap (acoperire). Semnificaia acestui situs pare a fi legat de protejarea
extremitii 5 a ARNm de atacul exonucleazic i de iniierea procesului de
traducere. In plus, produsul primar de transcriere de la eucariote sufer modificri
importante datorate faptului c genele copiate au structur discontinu (procesul de
splicing). Pot avea loc, de asemenea, modificri chimice ale unor baze azotate prin
procese de metilare.
Moleculele de ARN pot forma configuraii secundare i teriare noi datorit
mperecherii bazelor azotate din unele zone cu cele complementare localizate n alte
zone ale catenei, ceea ce duce la alternane de regiuni mono- i bicatenare n
moleculele respective.

Evidenierea transcrierii genetice la eucariote se poate realiza cu uridin


tritiat, precursor al uracilului. Cele mai adecvate structuri cromosomale la nivelul
crora poate fi decelat autoradiografic transcrierea genetic sunt pufele i inelele
Balbiani de la nivelul cromosomilor politeni precum i buclele laterale ale
cromosomilor lampbrush.
5.1.3. Categorii de ARN celular
Att n celulele bacteriene ct i n cele eucariote exist mai multe categorii
de ARN: ARN mesager (ARNm); ARN solubil sau de transfer (ARNt) i ARN
ribosomal (ARNr). La acestea, n cazul eucariotelor, se mai adaug ARN nuclear
heterogen, ARN cromosomal i ARNsn (small nuclear= nuclear mic). Majoritatea
moleculelor de ARN rezultate n urma transcrierii sunt supuse unor modificri
specifice n urma crora, moleculele respective devin biologic active. Formarea
moleculelor de ARN matur implic adiia, deleia sau modificarea unor nucleotide.
5.1.3.1. ARN mesager (ARNm)
ARNm este singurul tip de ARN celular tradus n structura proteinelor, el
reprezentnd circa 5% din ARN total. ARNm este n acelai timp singura categorie
de ARN celular care prezint o structur integral monocatenar, cel puin n
momentul traducerii mesajului genetic la nivelul ribosomilor.
Fiind purttoare de mesaj genetic, moleculele de ARNm au lungimi variabile
deoarece i mrimea genelor de la care preiau informaia sunt variate ca
dimensiune. De aceea, constanta de sedimentare a diferitelor molecule de ARNm
variaz foarte mult, de la 8S la 54S. Una din cele mai mari molecule de ARNm este
cea care determin sinteza fibroinei din fibra de mtase de laBombyx mori.
ARNm a fost descoperit de ctre Volkin i Astrahan n 1958 n urma unor
experimente efectuate cu o tulpin E.coli infectat cu fagul X174. Cultura a fost
meninut timp de 3 minute pe mediu de cultur ce coninea 32P, timp n care a avut
loc sinteza unui mesager fagic. Bacteriile au fost apoi centrifugate i s-au extras
acizii nucleici. Acest extract a fost apoi tratat cu DN-az (enzim care distruge
exclusiv ADN, nu i ARN). Ulterior, prin ultracentrifugare n gradient de densitate
de zaharoz s-au evideniat mai multe benzi care prezint viteze de sedimentare
diferite. Aceste benzi corespund mai multor categorii de ARN. Apar astfel benzi
mari a cror densitate optic a permis atribuirea lor particulelor ribosomale 50S i

30S; la acestea radioactivitatea era foarte redus. Intensitatea maxim a


radioactivitii a fost asociat cu banda ce a prezentat constanta de sedimentare
20S; banda reprezint o mic fraciune de ARN celular, sintetizat rapid n decursul
celor 3 minute de meninere a bacteriilor n mediu cu 32P. Analiza cromatografic a
secvenelor de nucleotide a acestei fraciuni ARN, realizat dup o hidroliz uoar
a macromoleculelor respective, a relevat c acest ARN este complementar cu ADN
fagic. Rezultatele ulterioare au artat c acesta reprezint ARNm pentru proteinele
fagice.
La procariote, ARNm este policistronic pentru c el copiaz informaia
genetic necesar sintezei mai multor catene polipeptidice implicate, de obicei, n
aceeai cale metabolic. Spre exemplu, la E.coli calea metabolic de sintez a histidinei
presupune participarea a 10 enzime diferite codificate de 10 gene care sunt copiate
ntr-o singur molecul de ARNm. Utilizarea ARNm policistronic la procariote
reprezint o cale economic de a regla sinteza unor proteine n mod coordonat, cu
ajutorul unui singur semnal de reglare.
Durata de via a unei molecule de ARNm variaz n funcie de tipul ce
celul n care se gsete. Stabilitatea moleculelor de ARNm presupune rezistena
acestora fa de aciunea nucleazelor citoplasmatice. Degradarea ARNm se
datoreaz fie aciunii unor exonucleaze (care acioneaz asupra moleculelor
ncepnd cu extremitatea 3) sau a unor endonucleaze care recunosc i cliveaz
anumite secvene specifice de ribonucleotide localizate n interiorul moleculei de
ARNm.
Protejarea ARNm bacterian de aciunea exonucleazelor citoplasmatice este
realizat de o secven de nucleotide localizat la captul 3 i care determin
formarea unei structuri de tip trunchi i bucl. In cazul ARNm de la eucariote
lucrurile nu sunt foarte clare dar se pare c secvena cap de la extremitatea 5 i
coada poliA de la extremitatea 3 ar asigura stabilitatea moleculelor respective, n
timp ce unele secvene interne bogate n AU ar determina instabilitatea moleculelor
de ARNm (Brawerman, 1990).
La procariote moleculele de ARNm sunt meninute funcionale doar 2-4
minute deoarece, dup ce au fost utilizate pentru traducere, ele sunt degradate de
ctre RN-aze. Se evit n acest fel alterrile structurale i implicit ale mesajului
coninut de ele, fenomenul fiind o consecin a adaptrii rapide a metabolismului
bacterian la condiiile de mediu. De asemenea, se permite activarea i represia unui
mare numr de gene ntr-un timp foarte scurt. Fenomenul de degradare rapid a
ARNm explic proporia foarte mic de ARNm din celule fa de alte categorii de

ARN (de exemplu, ARNr) dei numrul cistronilor transcrii la ARNm este
aproximativ de 1000 de ori mai mare dect al celor ribosomali.
La eucariote durata de via a unei celule este mai mare dect la procariote i
deci ARNm este mai stabil. Aceasta se datoreaz faptului c, la organismele
pluricelulare celulele se gsesc ntr-un mediu intern mult mai stabil n privina
parametrilor si.
Exist o serie de exemple de molecule de ARNm cu durat mai mare de via
dect cea specific: de exemplu, ARNm din celulele de Bacillus cereus ce sporuleaz
triete aproximativ 6 ore; ARNm necesar pentru sinteza hemoglobinei la
mamifere este sintetizat pe baza mesajului din ADN al reticulocitelor din stadiul
nucleat i pstrat pentru mai multe zile n eritrocitele anucleate n care are loc
sinteza hemoglobinei. In cazul oulor i seminelor care au stadiu de dorman
(inactivitate), ARNm este meninut ntr-o form stabil luni i chiar ani. Moleculele
de ARNm cu durat lung de via care pot fi pstrate perioade lungi de timp
nainte de a fi traduse sunt protejate fa de atacul ribonucleazelor prin asocierea
lor cu proteine, asocieri care se denumesc informosomi sau informomere.
Din punct de vedere structural, ARNm prezint trei regiuni distincte:
secvena leader de la captul 5 al moleculei; secvena codificatoare i regiunea 3
terminal. Regiunea leader este important pentru iniierea traducerii dar nici
una dintre nucleotide nu particip la decodificare (aceast secven nu este tradus).
Secvena codificatoare determin structura primar a unei catene polipeptidice
(constituie matria pentru sinteza unei catene polipeptidice) n timp ce regiunea
terminal conine nucleotide care nu vor fi traduse, rolul su fiind legat de
asigurarea stabilitii moleculei de ARNm.
La nivelul ARNm de la procariote exist o secven particular de baze
numit situs de legare la ribosom sau secven Shine-Dalgarno care prezint
complementaritate cu o secven de la captul 3 al ARNr 16S din subunitatea mic a
ribosomilor. De asemenea, la nivelul ARNm policistronic se gsesc, de obicei, secvene
de spaiere (spacer sequences) lungi de 10 pb, care separ secvenele codificatoare
pentru fiecare polipeptid (Watson i colab., 1993).
La eucariote de regul ARNm este monocistronic, el este sintetizat sub forma
unui precursor numit pre-ARNm sau ARN premesager care este supus prelucrrilor
posttranscripionale n urma crora se obine ARNm matur. Acesta trece n
citoplasm unde se asociaz cu ribosomii cu care formeaz polisomi sau
poliribosomi. Lungimea ARN matur nu corespunde secvenei genelor numai preARNm este corespunztor cu aceasta, deoarece n cadrul prelucrrilor

posttranscripionale, anumite poriuni necodificatoare sunt eliminate (introni) fiind


pstrate numai regiunile informaionale (exoni) care vor fi traduse. Rezult c
ARNm matur este reasamblat prin unirea exonilor.
La procariote, cu excepia arhebacteriilor, ARNm matur corespunde ca
lungime secvenei genice pe care a transcris-o, fenomen denumit colinearitate.
5.1.3.2. ARN ribosomal (ARNr)
ARNr reprezint aproximativ 80-85% din cantitatea total de ARN celular,
intrnd n structura ribosomilor. Ribosomii sunt particule nucleoproteice
citoplasmatice implicate n sinteza proteinelor, respectiv n traducerea mesajului
genetic dintr-o secven de ribonucleotide din ARNm ntr-o secven de aminoacizi
din catena polipeptidic. In cadrul acestui proces se realizeaz al treilea transfer
informaional la nivel molecular, de la ARNm la proteine.
Ribosomii conin 40-60% ARN, restul fiind reprezentat de proteine bazice
ribosomale. In ribosomii bacteriilor exist aproximativ 55 tipuri de proteine n timp
ce ribosomii de la eucariote conin 75-80 tipuri de proteine ribosomale. In medie,
diametrul unei particule ribosomale mature este de 12-23nm.
Ribosomii procariotelor prezint o constant de sedimentare de 70S.
Particula ribosomal este format din dou subuniti: subunitatea mic de 30S i
subunitatea mare de 50S. Aceast subunitate are o form globular cu trei
protuberane pe faa superioar.
Ribosomii la eucariote au o constant de sedimentare de 80S, cu o subunitate
mic de 40S i o subunitate mare de 60S. Ribosomii din organitele celulelor
eucariote (mitocondrii i cloroplaste) sunt de tip procariot cu constanta de
sedimentare 70S.
In structura ribosomilor intr mai multe tipuri de ARNr. Astfel, la
procariote, n subunitatea ribosomal mic intr o molecul de ARNr de tip 16S
asociat cu 21 de tipuri de proteine ribosomale caracteristice subunitii mici, notate
S1-S21 (S = small). n subunitatea, mare intr o molecul de ARNr 23S i 34 tipuri
diferite de proteine ribosomale desemnate L1-L34 (L = large) (fig.41).

Fig.41. Componentele ribosomilor procariotelor


La eucariote subunitatea ribosomal mic conine o molecul de ARNr 18 S
i 33 tipuri de proteine ribosomale, iar n cea mare se gsesc trei tipuri de ARNr (28
S; 5,8 S i 5 S) 50 tipuri de proteine ribosomale. Moleculele de ARNr au o
conformaie complex, n care alterneaz regiuni mono-catenare cu regiuni
bicatenare (acolo unde se realizeaz mperecheri de baze azotate complementare).
Toate moleculele de ARNr la eucariote sunt sintetizate pe matri ADN sub
form de molecule precursoare pre-ARNr care, dup transcriere, sunt supuse
prelucrrilor post-transcripionale. Acestea implic eliminri ale unor nucleotide
precum i metilarea unor resturi de riboz ale nucleotidelor rmase. Dup aceast
prelucrare, structura primar monocatenar a ARNr sufer contorsionri spaiale
care faciliteaz formarea de regiuni bicatenare care alterneaz cu regiuni
monocatenare. La procariote, aparent moleculele de ARNr nu sunt supuse
prelucrrilor de posttranscripionale.
Genele pentru diferitele tipuri de ARNr sunt grupate la nivelul unor regiuni
cromosomale cunoscute ca ADN ribosomal (ADNr), formnd o unitate
transcripional. De asemenea, la nivelul cromosomului bacterian exist mai multe
asemenea uniti transcripionale: de exemplu, la E.coliau fost identificate 7
asemenea uniti transcripionale. Mai mult, s-a evideniat faptul c ntre genele
ribosomale exist regiuni spaiatoare la nivelul crora au fost identificate gene
pentru ARNt (fig.42).
O situaie asemntoare se ntlnete i la eucariote, la care genele pentru
ARNr 18S, 5,8S i 28S sunt strns linkate, fiind transcrise sub forma unui pre-ARNr
unic cu o constant de sedimentare 40S. De asemenea, unitile de transcriere

genetice care funcioneaz ca matri pentru sinteza ARNr sunt separate de poriuni
netranscrise numite ADN spaiator sau silenios.

Fig.42. Reprezentarea schematic a unei uniti transcripionale de ADNr i a


etapelor producerii moleculelor de ARNr. Zonele haurate reprezint genele pentru
ARNr; zonele nchise la culoare reprezint gene pentru ARNt, iar cele simple
constituie regiuni spaiatoare
La eucariote genele pentru sinteza ARNr sunt localizate n regiunea
organizatorului nucleolar (NOR) situat la nivelul constriciilor secundare ale unor
cromosomi ai complementului cromosomal. Aceti cromosomi au fost denumii
cromosomi organizatori nucleolari. La majoritatea speciilor exist cte un
cromosom organizator nucleolar pentru fiecare set haploid de cromosomi. La unele
specii exist ns chiar mai muli asemenea cromosomi: de exemplu, la om n
organizarea nucleolului sunt implicate cinci perechi de cromosomi. Regiunea
organizator nucleolar este vital pentru organisme, dovad moartea organismelor ce
prezint deleia acestei regiuni de pe ambii cromosomi omologi.
Genele pentru ARNr 5S prezente i ele n copii multiple la eucariote nu sunt
linkate cu genele ribosomale pentru ARNr 18S i 28S, ele sunt distribuite pe
cromosomii diferii. Dei nelinkate, aceste gene sunt transcrise coordonat cu
celelalte gene pentru ARNr. Prezena ARNr 5S este esenial pentru funcionarea
normal a ribosomului matur.
ARNr din organitele celulelor eucariote prezint o serie de particulariti
care determin anumite diferene att fa de moleculele similare de la procariote
ct i fa de cele din structura ribosomilor citoplasmatici de la eucariote. Astfel,
constanta de sedimentare la ribosomi este de 60S, avnd o subunitate mic de 32S
(cu un ARNr 13S i un numr mai mic de proteine) i o subunitate mare de 40S (cu
ARNr 21S).

Nu se cunoate pn n prezent care este funcia specific a fiecruia dintre


tipurile de ARNr dei se consider c ARNr 5S ar media legarea ARNt la
subunitatea ribosomal mare n prezena unor fraciuni proteice. Se admite c
bazele azotate nemperecheate din ARNr ar participa ntr-un fel sau altul la
interaciunea cu celelalte categorii de ARN celular spre a decodifica mesajul genetic
purtat de ARNm. Conlucrarea corect dintre diferitele tipuri de ARN celular este
cerut de traducerea corect a mesajului, astfel nct s se obin molecule proteice
normale, funcionale. Un rol important n realizarea acestei conlucrri revine ionilor
de Mg2+ care au importan i n asamblarea celor dou subuniti ribosomale n
ribosomi funcionali.
Proteinele ribosomale sunt bogate n arginin i lizin (70% din resturile de
aminoacizi) ceea ce le confer un caracter bazic (pH 8.5 10) cerut la complexarea
cu moleculele de ARN acide spre a constitui ribosomi. Proteinele respective se
dispun la suprafaa ribosomilor mpachetnd ARNr. Proteinele ribosomale sunt
sintetizate n citoplasm i apoi transportate n nucleu, unde sunt asamblate n
subunitile ribosomale prin ataarea lor la precursorii ARNr. Dup asamblare la
nivelul nucleolului, subunitile ribosomale sunt transferate n citoplasm. Procesul
de transport bidirecional este extrem de complicat, n realizarea sa putnd fi
implicate proteine ribosomale suplimentare, coninute de ribosomii de la eucariote
(spre deosebire de cei de la procariote).
O celul de E. coli conine aproximativ 15000 ribosomi, pe cnd o celul
eucariot, fiind mult mai mare, prezint i un numr mare de ribosomi. n celule se
remarc un ciclu ordonat al asamblrii celor dou subuniti ale ribosomilor atunci
cnd exist ARNm de tradus, i de dezasamblare a lor cnd nu se face traducere.
5.1.3.3. ARN de transfer (ARNt)
ARNt reprezint aproximativ 10-20% din totalul de ARN celular i constituie
un component celular stabil att la procariote ct i la eucariote. Acest tip de ARN
(numit iniial ARN solubil deoarece a fost identificat n fracia solubil a lizatului
celular) este o molecul specializat pentru acceptarea n citoplasm a aminoacizilor
i transferul lor la ribosomi, ndeplinind n felul acesta rolul de molecul adaptoare
ntre ARNm i catena polipeptidic n curs de sintez. Se poate spune c ARNt
mediaz cel de-al treilea tip de transfer informaional: de la ARNm la proteine.
Din punct de vedere al compoziiei chimice, moleculele de ARNt conin, pe
lng bazele azotate obinuite (AUCG) i o serie de baze neobinuite: acid inozinic,

derivai metilai ai unor purine sau pirimidine (acid metilinozinic, acid


metilguanilic); acid pseudouridilic; acid dehidrouridilic; acid ribotimidilic.
Moleculele de ARNt sunt de dimensiuni mici, fiind alctuite din 73-93
ribonucleotide.Plierea ARNt determin realizarea unor legturi de hidrogen
intracatenare ntre ribonucleotidele complementare, rezultnd molecule cu o
structur secundar care are forma unei frunze de trifoi, cu brae bicatenare i
bucle monocatenare (fig.43).
Fig.43. Structura general a
moleculelor de ARNt.

Regiunile monocatenare din cadrul structurii secundare apar sub forma


unor bucle, prima dinspre captul 3 fiind bucla timinei (sau TGC) format din 7
baze (ntre care i timina i pseudouridina). Bucla cea mai important este bucla
anticodonului i n sfrit bucla D (a dihidrouracilului) format din 8 12 baze semi
- mperecheate. Captul 5 al ARNt se termin cu guanin, nucleotid ce este
adugat postranscripional. De asemenea, la nivelul extremitii 3 a ARNt
exist situsul aminoacil (de legare a aminoacizilor specifici la nivelul gruprilor 2 OH
sau 3 OH de la captul 3 al ARNt). Situsul aminoacil are la toate tipurile de ARNt
aceeai succesiune de ribonucleotide: 3 ACC 5.
Rolul regiunilor distincte din ARNt nu este nc elucidat cu precizie. Cea mai
cert este funcia buclei anticodonului: anticodonul este tripleta de nucleotide din
bucla central, care recunoate, pe principiul complementaritii, un codon din

ARNm (o secven de trei nucleotide care specific plasarea n catena polipeptidic


a unui anumit aminoacid). Anticodonul se leag temporar de codon prin intermediul
unor legturi de hidrogen. Buclei variabile i se atribuie rolul de fixare a ARNt la
ribosom, iar bucla D se pare c este implicat n recunoaterea de ctre enzimele
aminoacil ARNt ligaze a ARNt corespunztor aminoacidului pe care aceste
enzime l-au activat.
Teoretic, n natur ar trebui s existe 61 de tipuri de molecule de ARNt,
corespunztor codonilor din codul genetic. Cu toate acestea, pn acum, au fost
identificate doar aproximativ 40 tipuri de molecule de ARNt. De asemenea, s-a
evideniat faptul c genele ce codific ARNt sunt, de obicei, grupate pe cromosomi.
ARNt este sintetizat sub forma unei monocatene de preARNt, iar secvena
sa nucleotidic este cu 3040 ribonucleotide mai mare dect n ARNt matur. n
urma unor prelucrri posttranscripionale are loc excizia unor ribonucleotide i
modificarea chimic a altora (acidul inosinic, metilguanina, dimetilguanina, acidul
pseudouridilic, timina sub form de acid ribotimidilic). De asemenea, dup
transcriere, la captul 3 al ARNt este adugat secvena CCA la nivelul creia se va
ataa aminoacidul activat n vederea transferului su la ribosom.
5.1.4.4. ARN nuclear heterogen i ARN cromosomal
Aceste tipuri de ARN sunt ntlnite numai n celulele eucariotelor. Se
consider c ARNnh sintetizat n afara nucleolului este supus unor prelucrri
posttranscripionale i va forma ARNm matur.
ARN cromosomal este un tip de ARN ce reprezint, cel puin parial,
molecule precursoare pentru celelalte tipuri de ARN. Pe de alt parte, se consider
c ARNcr ar fi o categorie de ARN legat de reglarea funciilor genice avnd rol de
activator al genelor.
n ultimul timp s-a avansat ideea c unele tipuri de ARN celular ar putea
avea i rol catalitic pentru accelerarea unor procese biochimice din celul. Astfel, la
un tip de ARNr precursor (ce conine un intron) s-a demonstrat c are capacitate
autocatalitic care servete la excizia intronului, imediat dup transcriere. Un sistem
asemntor s-a observat i n cazul genei ce determin sinteza citocromului b din
mitocondriile de la drojdia de bere: regiunea transcris ce corespunde intronului 1
are capacitatea de autoexcizie (Cech, 1985).
De asemenea, att n nucleu ct i n citoplasma celulelor eucariote au fost
identificate molecule de ARN de dimensiuni mici (n medie de 100-300

ribonucleotide). Moleculele de ARN de acest tip existente n nucleu au fost denumite


ARNsn (small nuclear), iar cele aflate n citoplasm au primit denumirea de
ARNsc (small cytoplasmic)(Symons, 1992). In starea lor natural, aceste molecule
de ARN se gsesc la nivelul unor particule ribonucleoproteice. Mai mult, a fost
identificat nc un tip de ARN de dimensiuni mici, localizat la nivelul nucleolului
(notat ARNsno) implicat, se pare n prelucrarea precursorilor de ARNr.
In general, moleculele de ARNsn mpreun cu unele molecule proteice
(aproximativ 40 tipuri de proteine) realizeaz procesul de prelucrare a moleculelor
de ARNm precursor ce presupune eliminarea intronilor i asamblarea exonilor
(fenomenul de splicing). Au fost identificate mai multe molecule de ARNsn
implicate n prelucrrile postranscripionale ale moleculelor de ARN, ele fiind
notate: U1, U2, U5, U4/U6.
S-a dovedit c procesul de prelucrare are loc prin intervenia unor particule
ribonucleoproteice nrudite cu ribosomii, numite "spliceosomi", procesul fiind
consumator de energie (furnizat prin hidroliza ATP). Fenomenul de formare a
spliceosomilor a fost intens studiat la Saccharomyces cerevisiae i n celulele de tip
HeLa, n prezent el fiind destul de bine cunoscut (Reed, 2000). Experimentele
efectuate au evideniat faptul c recunoaterea specific a situsurilor de prelucrare a
ARNm precursor implic o serie de interaciuni de tipul ARN-proteine, proteineproteine i ARN-ARN.
Au fost identificate i situaii n care moleculele de ARN i controleaz
propria prelucrare, acestea primind denumirea de ribozime. Unele activiti
catalitice ale ARN sunt direcionate fa de diferite substraturi, n timp ce altele sunt
intramoleculare. Un prim exemplu este cel al RN-azei P care este o
ribonucleoprotein format dintr-o molecul de ARN legat la o protein. ARN are
capacitatea de a cataliza clivarea la nivelul unui substrat specific, reprezentat de
ARNt, n timp ce proteina joac un rol indirect, probabil de meninere a structurii
ARN catalitic. Un alt exemplu l reprezint moleculele de ARN de dimensiuni mici,
din clasa viroizilor, care au capacitatea de a realiza reacii de autoclivare (selfcleavage). Dei aceast reacie este intramolecular, molecula de ARN viroidal
poate fi mprit n dou pri: partea enzimatic i partea substrat. Un al
treilea exemplu este reprezentat de intronii din grupele I i II care au capacitatea de
a prelucra ei nii ARNm precursor care i conin.

5.2. Decodificarea mesajului genetic

Structura primar a proteinelor sau ordinea aezrii aminoacizilor n aceste


molecule, componente eseniale pentru toate organismele vii (procariote sau
eucariote), este legat de cea a acizilor nucleici. Informaia genetic se afl nscris
n structura acizilor nucleici (n gene) n mod codificat (codul genetic),
corespunznd succesiunii specifice a celor patru tipuri de baze azotate (ATCG
pentru ADN sau AUCG pentru ARN). Astfel, modificarea genelor prin mutaii
(deleii, adiii, substituii) reprezint de fapt modificarea secvenei de baze azotate i,
n consecin, determin schimbri n succesiunea aminoacizilor din proteine.
Proteinele sunt substane macromoleculare alctuite din una sau mai multe
catene polipeptidice, formate din aminoacizi legai ntre ei prin legturi peptidice. In
natur exist 20 aminoacizi care, n funcie de natura radicalului din structura lor
pot fi acizi, bazici, neutri i polari sau neutri i nepolari i care prezint cte o
grupare NH2 i COOH libere. Din punct de vedere al organizrii structurale,
proteinele pot manifesta diferite tipuri de structuri (Russel, 2002):
structur primar: corespunde succesiunii aminoacizilor din catena

polipeptidic;
structura secundar: se refer la plierea specific a catenei polipeptidice

formndu-se regiuni cu structuri de tip -helix sau de tip -helix;


structura teriar se refer la conformaia tridimensional o unei singure

catene polipeptidice; aceast structur este de cele mai multe ori asociat cu
proprietile biologic active ale proteinei;
structura cuaternar reprezint asocierea mai multor catene polipeptidice cu
formarea unor complexe multimerice. In anumite cazuri, catenele
polipeptidice pot fi asociate i cu grupri neproteice (prostetice), formnd
macromolecule funcionale aa cum este exemplul hemoglobinei (format din
patru catene polipeptidice, 2 i 2, asociate cu o grupare hem, ceea ce
confer macromoleculei capacitatea de a lega oxigenul)(fig.44).

Fig.44. Tipurile conformaionale ale proteinelor


De remarcat faptul c aceste tipuri de structur a proteinelor nu sunt
obligatorii, n totalitate, tuturor proteinelor, astfel c multe catene polipeptidice
manifest funcia specific fr a se asocia cu alte catene polipeptidice (deci fr a
prezenta structur cuaternar).

5.2.1. Descifrarea codului genetic


Codul genetic reprezint ansamblul regulilor i principiilor dup care
informaia genetic codificat n ADN (sau ARN n cazul ribovirusurilor i/sau a
viroizilor) este copiat pentru a putea fi transmis, de la locul su de origine
(genomul organismului respectiv), la dispozitivele care realizeaz sinteza
proteinelor, precum i modul n care mesajul transcris poate fi citit i tradus n
secvene specifice de aminoacizi.
Funcia codului genetic poate fi asemnat, n ultim instan, cu procesul de
transmitere a unei informaii codificate de la surs (structura biochimic a
genomului), pe anumite canale (ARNm), la locul de recepie (ribosomii) unde
mesajul este decodificat (tradus) i folosit, n cazul activitilor celulare, n procesul
de biosintez a proteinelor. Ea const n conservarea criptografic a informaiei i
transmiterea ei de la surs la receptorul reprezentat de structurile cu funcii
efectoare care sunt ribosomii. Analogia cu schemele de transmitere a informaiei
este n general evident. Moleculele de ADN poart n structura lor un adevrat cod

molecular a crui semnificaie este determinat de succesiunea specific a celor 4


baze i a crui complexitate este proporional cu mrimea genomului purttor de
informaie.
Structura codului genetic este determinat de secvena specific a celor 4
baze (ATCG) cu care se pot face 4n permutri (n = numrul de nucleotide dintr-o
molecul dat). Ca atare, numrul posibil de gene care s aib, n medie, o greutate
molecular de 106 daltoni i s fie alctuite din 1500 nucleotide este de aproximativ
41500, ceea ce reprezint o valoare cu mult mai mare dect numrul de gene, care au
existat n toate genomurile de la apariia vieii i pn n prezent. Bazele se repet
de-a lungul moleculei aa cum se repet literele unui alfabet de-a lungul frazelor
unei cri, n tot felul de combinaii. Dup cum ordinea literelor d sensul unui text,
ordinea particular a bazelor determin semnificaia moleculei de ADN.
Dup descrierea structurii ADN de ctre Watson i Crick problema cea mai
important a fost cea a modalitii de asociere a celor 4 baze, pentru ca fiecare
combinaie s conin informaia corespunztoare legrii unuia din cei 20 de
aminoacizi n constituia proteinelor. Presupunnd c toate unitile fundamentale
de codificare, denumite codoni, au aceeai lungime, Gamow (1954) este cel care a
emis ipoteza c cea mai scurt secven nucleotidic necesar pentru a codifica un
aminoacid const din trei baze (cod triplet), ceea ce permite formarea a 64 de
combinaii. Dac un aminoacid ar corespunde unei singure baze, nu ar fi posibil
dect codificarea a 4 aminoacizi. Un cod dublet, n care un aminoacid ar fi specificat
de un codon alctuit din dou nucleotide nu ar putea codifica dect 4 2, adic 16
aminoacizi. Codul triplet permite formarea a 64 de cuvinte (4 3) reprezentnd forma
cea mai simpl care asigur codificarea celor 20 de aminoacizi naturali.
Date i mai exacte au fost furnizate de tehnicile de secveniere a acizilor
nucleici i a proteinelor, care au permis stabilirea unor corespondene riguroase
ntre succesiunea codonilor n acizii nucleici i a aminoacizilor corespunztori n
lanul polipeptidic.
Rezultatele respective demonstreaz, pe de o parte, existena codului triplet
i, pe de alta, absena de intervale sau de spaii ntre codoni, deoarece citirea
informaiei genetice se face nentrerupt, codon dup codon, ncepnd de la o
extremitate pn la cealalt.
Prima descifrare a codului genetic ce demonstreaz c o anumit secven de
ARN conine informaia genetic necesar pentru sinteza unei catene polipeptidice
cu o secven specific de aminoacizi, s-a realizat folosindu-se un ARN sintetic acidul poliuridilic (poli U) (Nirenberg, 1961). Acesta a fost incubat ntr-un sistem

acelular care conine ribosomi, setul complet de molecule de ARNt, enzimele


necesare pentru sinteza proteinelor, ioni de Mg 2+ i ATP. Experiena a fost realizat
n 20 de variante n care s-au pus amestecuri ale celor 20 de aminoacizi din care,
cte unul singur marcat cu 14C. S-a demonstrat, n acest caz, c o singur dat s-a
obinut numai un singur polipeptid marcat polifenilalanina, ceea ce demonstreaz
c tripleta UUU codific fenilalanina.
Repetarea experienelor cu alte tipuri de ARNm sintetici diferite sub
raportul compoziiei lor baze a dus la identificarea codonilor pentru ali aminoacizi:
CCC codific prolina, AAA codific lizina.
Ulterior, folosind un ARNm sintetic care avea toate cele 64 de aranjamente
posibile, Nirenberg i colab (1966) au demonstrat c 61 din cele 64 de triplete de cod
au rol n specificarea celor 20 de aminoacizi naturali, ceilali trei fiind caracterizai
ca nonsens, deoarece nu au rol n codificarea unui aminoacid.
Ansamblul codonilor care specific setul de aminoacizi standard, mpreun
cu codonii de punctuaie (UAA, UAG, UGA) formeaz dicionarul codului genetic
(tabelul 9).
Tabelul 9. Codul genetic
Prima baz
a codonului

Nucleotida din mijlocul codonului


U
C
A
G
Phe
Ser
Tyr
Cys
Phe
Ser
Tyr
Cys
Leu
Ser
Stop
Stop
Leu
Ser
Stop
Trp
Leu
Pro
His
Arg
Leu
Pro
His
Arg
Leu
Pro
Gln
Arg
Leu
Pro
Gln
Arg
Ile
Thr
Asn
Ser
Ile
Thr
Asn
Ser
Ile
Thr
Lys
Arg
Met
Thr
Lys
Arg
Val
Ala
Asp
Gly
Val
Ala
Asp
Gly
Val
Ala
Glu
Gly
Val
Ala
Glu
Gly

5.2.2. Caracteristicile codului genetic

A treia baz a
codonului
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G

Pe baza a numeroase experiene s-a reuit s se determine caracteristicile de


baz ale codului genetic:
1. codul genetic este nesuprapus, n sensul c un grup de trei nucleotide
adiacente alctuiesc un codon i determin legarea unui anumit aminoacid n lanul
polipeptidic. Bazele din structura fiecrui codon nu sunt implicate n nici un fel n
semnificaia de cod a tripletelor precedente sau urmtoare. Iniial, pe baza a diferite
considerente fizico chimice, Gamow a presupus c n structura codului genetic ar
fi posibil suprapunerea unor codoni, astfel nct o baz din structura unui codon ar
putea intra n componena codonului adiacent. Acest tip de structur ar permite o
economie semnificativ de material genetic. Examinarea a numeroase proteine, ns
a infirmat aceast ipotez i mai mult s-a demonstrat colinearitatea dintre
informaia genetic i structura polipeptidului. Nesuprapunerea codonilor
determin trei posibiliti de traducere a aceleiai secvene de nucleotide, n funcie
de punctul de start, acestea fiind denumite cadre de citire (reading frames). De
exemplu, pentru secvena A C G A C G A C G A C G A C G A C G exist trei cadre
de citire:
ACG ACG ACG ACG ACG ACG
CGA CGA CGA CGA CGA CGA
GAC GAC GAC GAC GAC GAC
Orice modificare a secvenei de nucleotide prin adugarea sau eliminarea
(deleia) unei nucleotide determin modificarea cadrului de citire corect, ncepnd
de la nivelul nucleotidei modificate (mutaiile fiind de tip frameshift)(Lewin,
1997).
2. Codul genetic este "degenerat", aceast caracteristic decurgnd din faptul
c mai muli codoni diferii specific acelai aminoacid. Codonii care specific
acelai aminoacid sunt numii codoni sinonimi. Caracterul degenerat al codului
genetic nu este uniform: unii aminoacizi cum ar fi serina, arginina, leucina sunt
codificai de cte ase codoni; ali aminoacizi ca alanina, glicocolul, prolina, treonina
i valina sunt codificai de cte patru codoni diferii, n timp ce ali nou aminoacizi
sunt specificai de cte doi codoni. Excepie fac aminoacizii metionin i triptofan
care sunt codificai de cte un singur codon (tabelul 9).
Codonul AUG, pe lng funcia de a specifica metionina, ndeplinete i rolul
universal de codon iniiator n sinteza proteic.
Caracterul degenerat prezint o anumit regularitate care sugereaz c este
supus anumitor norme i c ar putea conferi unele avantaje biologice. Esenial este

faptul c fiecare aminoacid este desemnat numai de codoni specifici, respectiv c


nici un cuvnt de cod nu codific mai mult de un aminoacid.
3. Flexibilitatea codului genetic se refer la codonii sinonimi la care primele
dou baze ale tripletei sunt constante, n timp ce a treia poate varia, deci aceast
poziie este variabil sau oscilant. Ipoteza unei anumite flexibiliti a codului
genetic, cunoscut sub denumirea de efect wobble a fost formulat de Crick,
avnd ca argument principal observaia c toi codonii sinonimi (care codific
acelai aminoacid) au primele dou baze ale tripletului constante, n timp ce a treia
poate varia.
Crick a ajuns la concluzia c recunoaterea codon anticodon se face n mod
riguros specific n poziiile 1 i 2 i n mod variabil (flexibil) la nivelul celui de-al
treilea nucleotid situat n poziia wobble (wobble = a oscila). Poziia wobble
corespunde celui de-al treilea nucleotid al codonului i primului din anticodon
datorit polaritii opuse dintre cele dou molecule (ARNm i ARNt), una fiind n
direcia 5 3 i cealalt n direcia 3 5. De exemplu, dac anticodonul din
ARNt este de tipul 3-CGG-5 el se mperecheaz, n mod corect, cu codonul 5GCC-3 din structura ARNm. Fenomenul wobble permite ca anticodonul 3CGG-5 s se poat mperechea cu codonul 5-GCU-3 din ARNm. Deoarece, n
exemplul de mai sus, codonul GCC i codonul GCU codific pentru acelai
aminoacid, alanina, fenomenul wobble nu este nsoit de modificarea secvenei de
aminoacizi din structura catenei polipeptidice corespunztoare.
Semnificaia acestui fenomen se refer la faptul c aceeai molecul de ARNt
asigur traducerea mai multor codoni ceea ce permite celulei s sintetizeze mai
puine tipuri de ARNt.
4. Codul genetic este fr virgule, ceea ce nsemn c nu exist nici un semn
de punctuaie ntre sfritul unui codon i nceputul celui urmtor. Cuvintele de cod
(tripletele) au o polaritate sau direcie specific, datorit creia, de exemplu, GUU
codific valina n timp ce UUG codific leucina. Cadrul de citire (reading frame) al
informaiei genetice trebuie stabilit cu rigurozitate la nceputul unei molecule de
ARNm i este marcat normal prin prezena codonului AUG. Acest codon codific
formil-metionina la procariote i metionina la eucariote. Decodificarea ARNm se
face apoi secvenial de la o triplet la alta pn se ntlnete unul dintre cei trei
codoni stop (nonsens): UAA, UAG sau UGA.
5. Ambiguitatea codului genetic este caracteristica prin care anticodonul din
ARNt recunoate doi codoni diferii din ARNm. De exemplu, codonul GUG aflat la
nceputul mesajului genetic (n molecula de ARNm) este recunoscut de ARNt pentru

formil metionin, pe cnd acelai codon aflat n interiorul moleculei de ARNm este
recunoscut de ARNt pentru valin.
6. Utilizarea preferenial a unor codoni. Faptul c exist mai muli codoni
pentru un acelai aminoacid a pus problema dac aceti codoni sinonimi sunt folosii
mai frecvent dect alii. Folosirea unuia sau altuia dintre codonii sinonimi se
datoreaz ntmplrii dar este cert c, n cadrul grupelor taxonomice mari, exist o
anumit preferin pentru anumii codoni sinonimi. Alegerea preferenial a
codonilor ar putea rezulta dintr-o armonizare ntre compoziia n codoni a mesajelor
genetice i ansamblul moleculelor de care dispune celula pentru a traduce aceste
mesaje (n special ARNt din care, pn n prezent s-au izolat doar 54 de tipuri).
7. Universalitatea codului genetic evideniaz faptul c aceleai uniti de
codificare (codonii) specific aceiai aminoacizi la toate organismele, indiferent de
poziia lor taxonomic. In sprijinul acestei concluzii teoretice au fost aduse i date
experimentale din rndul celor denumite himere, care folosesc sisteme acelulare de
sintez a proteinelor provenite de la o specie i ADN sau ARN provenit de la o alta. De
exemplu, ARN genomic provenit de la VMT produce aceeai secven de aminoacizi
nu numai n plantele pe care le infecteaz (tutun), ci n orice alt plant n care este
activ. ARN din fagul f2 dirijeaz sinteza unei proteine capsidale normale att n
extractele acelulare provenite de la gazda sa normal (E.coli), ct i de la Euglena
gracilis. In mod similar, mesagerii sintetici determin ncorporarea n polipeptide a
acelorai aminoacizi indiferent de natura i proveniena sistemului acelular de
sintez proteic.
Utilizarea ARNm pentru sinteza polipeptidelor ce alctuiesc hemoglobina,
provenit din reticulocite de iepure ntr-un sistem acelular de la E. coli pentru sinteza
proteic a dus la obinerea unor polipeptide tipice hemoglobinei de iepure.
Universalitatea codului genetic sugereaz nu numai o origine comun a vieii
pe Pmnt, dar i imposibilitatea schimbrii lui (ipoteza accidentului ngheat)
odat ce viaa a dobndit un anumit grad de complexitate. Mutaiile care ar altera
codul genetic ar fi letale pentru celul n cazul n care un codon ar fi tradus
ntotdeauna eronat. Toate acestea converg pentru a demonstra existena unui cod
genetic comun tuturor organismelor, fr a exclude ca aceast universalitate s nu
fie absolut, n sensul c n anumite privine codul genetic nu putea fi diferit de la o
specie la alta (Gavril, 1986).
Dei caracterul universal al codului genetic prea definitiv stabilit, un numr
important de lucrri au scos n eviden faptul c ADNmt are un cod genetic puin
diferit de cel nuclear. Astfel, ADNmt uman i de oarece codific numai pentru 22

tipuri de ARNt, iar cel de levuri 24 tipuri, din care unii leag mai muli aminoacizi.
In plus, s-au descris aa numiii codoni eretici sau disideni care nu respect codul
genetic universal n sinteza proteic dirijat de ADNmt:
la fungi i mamifere, triptofanul este codificat n mitocondrii nu numai de
tripleta normal UGG ci i de UGA, care n mod normal este stop;
n sinteza polipeptidelor, metionina este codificat nu numai de codonul
AUG (normal) ci i de codonii AUA i probabil AUU, care semnific normal
izoleucina;
codonii AGA i AGG care n citoplasm codific arginina, n ADNmt au rolul
de codoni terminali.
Variaiile codului genetic mitocondrial observate la diferite microorganisme
eucariote sugereaz c aceste modificri s-au stabilit n perioade de timp diferite n
cursul evoluiei, probabil dup divergena dintre plante pe de o parte i animale i
fungi pe de alt parte.
5.2.3. Traducerea informaiei genetice
Biosinteza propriu-zis a proteinelor este un proces complex n cursul cruia
informaia coninut n ADN, transmis n citoplasm (la ribosomi) prin
intermediul ARNm este tradus ntr-o secven polipeptidic prin asamblarea
aminoacizilor ntr-o ordine specific, prescris de informaia genetic. Acest proces
implic activitatea mai multor constitueni ai mainriei celulare de sintez a
proteinelor i evolueaz n mai multe etape.
Toate procesele metabolice ale celulei se bazeaz pe existena i funcionarea
proteinelor, care pot avea rol structural (cum ar fi, colagenul), transportor
(hemoglobinele), de aprare a organismului (imunoglobulinele) sau rol enzimatic.
In cadrul biosintezei proteinelor particip att acizi nucleici, ct i proteine.
Pentru sinteza unei singure catene polipeptidice sunt mobilizate sute de alte proteine
cu rol structural i enzimatic.
Proteinele sunt polimeri ai aminoacizilor, iar polimerizarea acestora se
desfoar la nivelul ribosomilor prin reacia de condensare dintre gruparea
carboxil a unui aminoacid i cea amino a altui aminoacid, cu eliberarea unei
molecule de ap.
Unele proteine sunt alctuite dintr-o singur caten polipeptidic, altele au
mai multe catene polipeptidice identice sau diferite. n acest din urm caz, fiecare
caten este sintetizat pe baza informaiei genetice inclus n gene diferite. Aa se

explic de ce formularea iniial o gen o enzim, a fost nlocuit cu expresia: o


gen o caten polipeptidic, ce exprim mai bine realitatea la nivel molecular.
Dup realizarea polimerizrii aminoacizilor (ordinea acestora n molecul
constituind structura sa primar) catena polipeptidic este supus unor procese
ulterioare prin care capt structuri secundare, teriare sau cuaternare ce i dau n
final configuraia i funcionalitatea.
In decodificarea informaiei genetice rolul primordial l joac acizii
ribonucleici celulari: ARNm, ARNt i ARNr. Rolul acestora a fost evideniat dup
1950 cnd, prin tehnici speciale, s-a constatat c sinteza proteic este nsoit de o
cretere considerabil a cantitii de ARN din celul. Prin experiene efectuate pe
alga unicelular Acetabularia mediteranea (o celul gigant) n urma crora s-au
extras nucleii din aceste celule, s-a constatat c n algele enucleate nu mai au loc nici
procese de biosintez proteic.
Ca orice reacie de polimerizare i n sinteza proteinelor au loc cele trei
etape: de iniiere, elongare i terminare a catenei polipeptidice.
Sinteza unei catene polipeptidice ncepe cu un aminoacid aminoterminal i
se termin cu un aminoacid carboxi-terminal. Ordinea includerii aminoacizilor este
stabilit de ordinea codonilor din ARNm.

5.2.3.1. Etapa de iniiere a sintezei proteinelor


Prima etap n iniierea biosintezei proteice este activarea aminoacizilor cu
ATP, reacia fiind catalizat de aminoacil-sintetaza numit i aminoacil ARNt
ligaz i care este specific fiecrui aminoacid. Aceste enzime reprezint cheia n
recunoaterea cifrului codului genetic.
Pentru aezarea aminoacizilor la ARNm este necesar o molecul adaptor,
reprezentat de ARNt, care s lege aminoacizii activai i s-i transporte la locul
de sintez. Cu alte cuvinte, are loc mai nti o ataare a aminoacidului activat la
restul de A (adenin) din gruparea CCA de la captul 3 OH al ARNt, ataare
catalizat tot de aminoacil-sintetaza (aminoacil ARNt ligaza):
aminoacil-ARNt-ligaza
aminoacid +
ATP
aminoacil~AMP + PPi

ARNt

E1
aminoacil~AMP +
aminoacil~ARNt1 + AMP

Aa cum se cunoate, specificitatea ARNt pentru un anumit aminoacid este


dat de secvena anticodon, complementar unui codon din ARNm. De exemplu,
molecula de ARNt al crei anticodon este AAA poate lega doar fenilalanina deoarece
codonul complementar din ARNm este UUU (specific pentru Phe); acest ARNt este
notat ARNtPhe, iar atunci cnd el a legat aminoacidul corespunztor notaia utilizat
este Phe-ARNtPhe.
Etapa a treia n iniierea unei catene polipeptidice se desfoar la nivelul
ribosomului care prezint suprafee specifice de legare stereochimic a ARNm,
ARNt i a catenei polipeptidice n cretere. Ribosomul asigur asocierea acestor trei
elemente de aa manier nct s fac posibil recunoaterea codonilor din ARNm
de ctre anticodonul corespunztor din ARNt, pe principiul complementaritii.
Este esenial ca ribosomul s nceap corect procesul de traducere al ARNm
de la nivelul codonului start al secvenei codificatoare al acestuia (ARNm avnd la
captul 5, respectiv 3, dou regiuni terminale, necodificatoare, care nu vor fi
traduse). Iniierea precis a traducerii depinde de corecta recunoatere a cadrului
de citire. Spre exemplu, dac regiunea codificatoare a ARNm ncepe cu secvena 5
AUGUUUAAACCCCUG . . . . . 3, teoretic cadrele de citire ar putea fi:
AUG UUU AAA CCC CUG sau
UGU UUA AAC CCC UG sau
GUU UAA ACC CCU G, neexistnd nimic care s indice care
dintre nucleotide este prima nucleotid a primului codon.
Cu toate acestea, s-a dovedit c primul codon cu care se ncepe procesul de
traducere att la procariote ct i la eucariote este, de regul, AUG (mai rar GUG
sau UUG), ceea ce nseamn c exist anumite mecanisme specifice care determin
alegerea corect a codonului AUG start. Codonul AUG codific metionina indiferent
dac se gsete la nceputul secvenei ce urmeaz a fi tradus fie n interiorul
acesteia. Pentru ca ribosomul s recunoasc n mod specific codonul de iniiere este
necesar un semnal suplimentar de discriminare ntre AUG iniiator i AUG din
interiorul mesajului genetic. Acest semnal este reprezentat la bacterii de secvena
ShineDalgarno, constituit din 715 ribonucleotide bogat n purine i aflat n
amonte de codonul iniiator. Secvena Shine-Dalgarno este complementar cu o

secven format din 37 nucleotide aflat la captul 3' al moleculei ARNr 16 S din
subunitatea ribosomal mic.
In cazul eucariotelor, ARNm nu conine secvena Shine-Dalgarno,
dovedindu-se c ribosomii citoplasmatici nu se leag direct la situsul de iniiere al
traducerii. In acest caz, primul eveniment ce precede iniierea traducerii la
eucariote este recunoaterea de ctre subunitatea ribosomal mic (40S) a secvenei
terminale 5, metilat (secvena cap) de la nivelul ARNm, dup care el migreaz
spre situsul specific de legare (ribosome-binding site). Intre cele dou regiuni ale
ARNm exist o secven de aproximativ 1000 nucleotide.
Migrarea subunitii ribosomale se oprete atunci cnd este ntlnit
codonul de iniiere (AUG) plasat ntr-un context corespunztor (secvena
GCCACCAUGG sau GCCGCCAUGG). Ulterior, subunitatea ribosomal 40S
stabilizat la nivelul situsului de iniiere se asociaz cu subunitatea 60S, iar procesul
de sintez a proteinelor ncepe.
La procariote, iniierea sintezei catenei polipeptidice este asigurat de
intervenia unor factori proteici citoplasmatici de iniiere, desemnai IF1, IF2, IF3.
Astfel, factorul IF3 mediaz legarea subunitii ribosomale 30S cu ARNm i previne
reasocierea prematur cu subunitatea ribosomal 50S; un al doilea factor de iniere,
IF2, se leag la nivelul unei molecule de GTP i a ARNt iniiator (pentru formilmetionin) i direcioneaz ARNt respectiv spre complexul ARNm-30S. In ceea ce
privete rolul factorului de iniiere IF1, acesta este complex i se refer la stimularea
iniierii, recunoaterea regiunii de iniiere, reciclarea IF2 i disocierea ribosomilor
70S (Zarnea, 1986).
La complexul de iniiere 30S reprezentat de ARNm + subunitatea ribosomal
mic + fMet-ARNt + factori de iniiere + GTP ARNm30S se ataeaz i subunitatea
ribosomal mare, de 50 Si se formeaz complexul de iniiere 70S. Procesul este nsoit
de hidroliza GTP cu eliberarea GMP, a pirofosfatului i a factorilor de iniiere.
Ribosomul astfel asamblat conine dou situsuri de legare a ARNt: situsul A
(acceptor) care este situsul pentru aminoacil-ARNt (ARNt asociat cu aminoacidul
specific) i situsul P (sau situs donor) este situsul la care se ataeaz ARNt iniiator
(Meti-ARNtMet) n cursul procesului de iniiere i peptidil-ARNt (ARNt asociat cu
catena peptidic n curs de alungire) n cursul etapei de elongare (fig.45).

Fig.45 Iniierea procesului de traducere la procariote (dup Russell, 2002)


In situsul A ptrunde aminoacilARNt corespunztor codonului din ARNm.
De regul, situsul P accept complexul aminoacilARNt numai dac acesta a
realizat recunoaterea codon anticodon, adic dac a trecut i prin situsul A i apoi
a fost translocat n situsul P. Acceptarea se bazeaz pe unele posibile modificri
conformaionale pe care le-a suferit complexul aminoacilARNt cnd a fost n
situsul A.
O particularitate a procesului de iniiere este folosirea unui ARNt Met specific
pentru codonul de iniiere. Acest ARNt iniiator difer de omologul su ce
interacioneaz cu codonii AUG interni pentru metionin. Acest ARNt iniiator
(fARNtMet la procariote i iARNtMet la eucariote) se leag de metionin prin
mecanismul prezentat, dup care complexul respectiv mai sufer un proces de
formilare prin ataarea unui grup CH=O (formil) la nivelul NH 2 al metioninei,
aceasta devenind formil metionin. Formilarea este ntlnit numai la procariote
unde toate catenele polipeptidice ncep cu N-formilmetionina. La eucariote, n
procesul de iniiere a sintezei catenei polipeptidice, nu are loc formilarea metioninei,
dar exist un ARNtMet iniiator care difer de celelalte tipuri i care se leag direct la
situsul P al ribosomului. Dac la procariote exist numai 3 factori de iniiere, la
eucariote exist 10 asemenea factori de iniiere.

5.2.3.2. Etapa de alungire


Dup legarea aminoacidului iniiator cu ARNt respectiv are loc deplasarea
ribosomilor pe ARNm (sau invers) printr-o micare de translaie, n aa fel nct la
nivelul situsului A s ajung urmtorul codon la care s se ataeze ARNt cu
aminoacidul pe care-l transport (fig.46). Intre gruparea COOH a aminoacidului
iniiator (metionina) i NH2 a aminoacidului urmtor (corespunztor celui de-al
doilea codon din ARNm) legat de ARNt i aflat n situsul A are loc reacia de
condensare i realizarea primei legturi peptidice. Reacia respectiv este catalizat
de enzima peptidil-polimeraza, care face parte din proteinele ribosomale. In acest
fel, etapa elongaiei constituie o succesiune ordonat de cicluri n care aminoacilARNt intr n situsul A al unui ribosom la care situsul P este ocupat de peptidilARNt. Aceast reacie se desfoar pn la terminarea citirii mesajului genetic.
In procesul de elongare intervin i factorii de elongaie, proteine ribosomale
care se ataeaz n aceast faz la particula ribosomal (la subunitatea mare).
Fig.46. Inceputul etapei de alungire cu
evidenierea formrii primei legturi
peptidice ntre primul aminoacid
(metionina) i urmtorul

Gruprile aminoacil cuplate cu moleculele de ARNt aflate la nivelul


situsurilor ribosomale P i A se gsesc n vecintatea unei enzime ribosomale numit
peptidil transferaza care transfer grupul fMet al ARNt din situsul P la gruparea

amino liber a aminoacil-ARNt din situsul A, formndu-se un dipeptid ataat la


ARNt. Dei peptidil transferaza este descris ca fiind enzim, s-a dovedit c
activitatea sa este meninut chiar i atunci cnd proteinele ribosomale sunt
ndeprtate n proporie de 95%. Aceast observaie sugereaz posibilitatea ca
activitatea enzimatic respectiv s fie o proprietate a ARN ribosomal (Elliott i
Elliott, 1997). Activitatea peptidil transferazei se realizeaz n cazul reaciei:
ARNt - O - CO - fMet + NH2 CH CO O ARNt
(situsul P)

(situsul A)
R
ARNt OH + fMet CO NH CH CO O ARNt
(situsul P)

(situsul A)
R
Dup formarea primei legturi peptidice, la nivelul situsului A se gsete
peptidil-ARNt, iar situsul P conine o molecul ARNt nelegat de nici un aminoacid
(format prin separarea de aminoacidul purtat). In acest moment are loc
repoziionarea ribosomului prin deplasarea cu un codon de-a lungul ARNm,
proces numit translocare. ARNt lipsit de aminoacid aflat n situsul P este mutat la
nivelul unui al treilea situs ribosomal, situs de ieire (exit site= situs E), de unde
este liberat n citoplasm putnd fi refolosit. Deplasarea ribosomului de-a lungul
moleculei de ARNm n direcia 5 3 necesit participarea unui alt factor de
elongare, EF-G care mai este denumit i translocaz. Procesul de translocaie
necesit energie care este furnizat prin hidroliza GTP.
Dup ce situsul P a fost ocupat de dipeptidil-ARNt, la situsul A liber poziionat
pe al treilea codon al ARNm se ataeaz aminoacil-ARNt corespunztor complexat
cu EF-Tu-GT. La nivelul acestuia se adaug apoi gruparea peptidil de la situsul P,
ARNt descrcat se deplasez spre situsul de ieire, iar noul complex peptidilARNt se deplaseaz din situsul A n situsul P dup care ciclul se reia (fig.47).
La E.coli, sinteza unei proteine de dimensiune medie la nivelul unui singur
ribosom se realizeaz n 20 secunde (viteza de sintez este de, aproximativ, 15
aminoacizi/secund). Prin urmare, teoretic, dac sinteza unei proteine s-ar realiza la
nivelul unui singur ribosom s-ar sintetiza cte o copie a respectivei proteine la
fiecare 20 secunde.

Fig.47. Reprezentarea schematic a etapei de alungire


Cu toate acestea, n realitate, dup ce ribosomul a asigurat traducerea a
aproximativ 25-30 codoni, captul 5' al ARNm devine liber spre a forma un alt
complex de iniiere i astfel, un al doilea ribosom se angajeaz n traducerea
mesajului genetic spre a asigura sinteza unei noi catene polipeptidice, apoi urmeaz
al treilea, al patrulea etc. De obicei, la nivelul unei molecule de ARNm utilizat
pentru traducere se pot gsi cinci ribosomi, structura rezultat numindu-se polisom
sau poliribosom (fig.48). (Elliott i Elliott, 1998).

Fig.48. Alctuirea unui poliribosom

Poliribosomii exist i la eucariote ei evideniind intensele procese de sintez


proteic.
La procariote transcrierea mesajului genetic i traducerea sa pot avea loc
simultan deoarece nainte de terminarea sintezei ARNm, datorit absenei
membranei nucleare, captul su 5' se poate asocia cu ribosomii (fig.49).
Fig.49. Cuplarea proceselor de
transcriere i traducere la procariote

5.2.3.3. Terminarea sintezei proteice


Cnd deplasarea ribosomilor pe ARNm ajunge cu situsul su A la nivelul
unui codon nonsens (stop, codon terminator, UAA, UAG, UGA) nu se mai ataeaz
nici un aminoacilARNt i astfel se asigur terminarea sintezei catenei polipeptidice.
Codonii stop sunt recunoscui de factori de eliberare sau de terminare: factorii TF
R1, TFR2 i TFR3 la bacterii i factorul RF la eucariote. Factorul TF-R3 asigur
desfacerea grupului carboxil al aminoacidului terminal de ARNt transportor. In
urma acestui proces are loc eliberarea de pe ribosom att a catenei polipeptidice ct
i a ARNt precum i separarea ribosomilor n cele dou subuniti ale sale (fig.48).
5.2.4. Particularitile decodificrii la eucariote

La eucariote transcrierea are loc n nucleu, iar traducerea are loc n


citoplasm unde se afl ribosomii. Trecerea ARNm monocistronic din nucleu n
citoplasm se face prin porii membranei nucleare, n acest proces un rol important
avndu-l coada poliadenilat a ARNm. Etapele procesului de traducere sunt n
esen aceleai ca i la procariote dar exist i unele diferene. O prim diferen se
datoreaz faptului c ribosomii eucariotelor sunt mai mari (au 80S, iar subunitile
au 40S, respectiv 60S), n alctuirea lor intrnd mai multe tipuri de ARNr i
proteine ribosomale. Aa cum s-a menionat deja, primul aminoacid cu care ncepe
traducerea este tot metionina dar n stare neformilat. Aceasta nu nseamn ns c
toate proteinele funcionale de la eucariote au ca prim aminoacid (ca extremitatea
NH2 a proteinei) metionina; de cele mai multe ori acest aminoacid este ndeprtat n
urma unor prelucrri post-translaionale pe care le sufer catena polipeptidic nou
sintetizat.
Etapa de iniiere la eucariote presupune mai nti, la fel ca i la procariote,
formarea complexului de iniiere dar mecanismul prin care ARNm este poziionat
corect la nivelul situsului P ce conine codonul iniiator (AUG) este total diferit.
Trebuie reamintit c ARNm de la eucariote prezint la extremitatea 5 secvena
cap (cu 7metil guanosin-trifosfat), dar nu conine nici o secven de tip ShineDalgarno ca la procariote.
La eucariote, exist un grup specific de proteine, inclusiv factori de iniiere,
care se ataeaz la nivelul secvenei cap i mpreun se leag la subunitatea
ribosomal 40S, rezultnd complexul de pre-iniiere. Acesta este localizat la
extremitatea 5 a ARNm, la distan de codonul iniiator AUG. Printr-un mecanism
ce presupune participarea ATP i GTP, complexul de pre-iniiere se deplaseaz de-a
lungul ARNm pn cnd ajunge la nivelul codonului AUG, moment n care se
formeaz complexul de iniiere prin adugarea subunitii ribosomale 60S.
Celulele eucariote, pe lng mesajul genetic purtat de ADN cromosomal
nuclear mai conin o serie de gene localizate la nivelul ADN cloroplastic i/sau
mitocondrial. Ribosomii mitocondriali sunt asemntori celor bacterieni, iar n
procesul de iniiere se utilizeaz fMet-ARNtMet, ca i n cazul bacteriilor.
5.2.5. Modificri post-translaionale ale proteinelor
S-a dovedit c majoritatea proteinelor, pentru a deveni funcionale, sunt
supuse unor modificri ce au loc dup ce procesul de sintez s-a ncheiat. Asemenea
modificri se numesc post-translaionale i se refer att la stabilirea conformaiei

spaiale corecte (fenomenul de mpachetare) ct i la modificrile chimice ce


presupun ndeprtarea sau adugarea anumitor grupri.
Impachetarea proteinelor constituie un proces esenial pentru ca anumite
proteine s dobndeasc proprietile funcionale specifice. Mult vreme s-a
considerat c imediat dup sinteza unei catene polipeptidice la nivelul ribosomilor
are loc, n mod automat, pe baza interaciunilor dintre resturile de aminoacizi
coninui, mpachetarea (folding) acesteia pentru a forma o structur
tridimensional.
La nceputul anilor 90 s-a pus n eviden o familie special de proteine care
au primit denumirea de chaperone (Ellis i Van der Vies, 1991) care au
capacitatea de a recunoate i lega proteinele parial mpachetate sau, altfel spus,
desfurate parial. Asocierea chaperonelor cu asemenea proteine asigur
stabilizarea acestora pn n momentul n care sunt ndeplinite condiiile de
mpachetare corect, proces ce necesit ATP.
Rolul chaperonelor nu se rezum doar la participarea la mpachetarea
corect a proteinelor nou sintetizate ci include stabilizarea proteinelor denaturate i
ndrumarea (targeting) proteinelor mbtrnite pentru distrugere la nivelul
lizozomilor. Chaperonele mai sunt implicate n procesul de translocare a proteinelor
prin membranele mitocondriale i n rearanjarea subunitilor proteice n
complexele macromoleculare.
Insemntatea deosebit a corectitudinii procesului de mpachetare a
anumitor proteine a fost dovedit n urma descoperirii prionilor, ageni proteici
infecioi responsabili de maladii neurologice degenerative foarte grave, cum ar fi
boala Creutzfeld-Jacob i boala kuru la om sau maladia vacii nebune de la bovine
(encefalopatia spongiform bovin = ESB)(Prusiner, 1995, Taubes, 1996). Infecia
este asociat cu prezena n esutul afectat a unor proteine modificate, rezistente la
aciunea proteazelor, care au fost denumite prioni (PrP = proteinaceous infectious
particle). Cercetrile efectuate asupra acestor proteine au condus la concluzia c
ele sunt derivate de la proteine normale, n urma unor modificri conformaionale.
Mecanismul exact al acestei conversii conformaionale nu este cunoscut dar, se pare
c n acest proces este implicat o protein de tip chaperon i o surs de energie. In
prezena lor, proteina normal (notat PrP) este desfurat (denaturat) i apoi
rempachetat ntr-o form anormal, sub influena unei molecule prionice (PrPsc).
Conform studiilor recente legate de conformaia moleculelor prionice,
proteina PrP normal de la oarece prezint trei regiuni spiralate de tip -helical
(catena polipeptidic se rsucete ca i cum s-ar ncolci pe suprafaa unui cilindru)

i dou cu pliere de tip (pliere a catenei polipeptidice n care segmente rectilinii ale
acesteia sunt juxtapuse n zigzag, ca un metru de tmplrie incomplet strns)
(Zarnea i Dumitru, 1996; Lasmezas i colab., 1997). In schimb, n cazul proteinelor
anormale PrPsc plierea este aproape n ntregime de tip , acest tip de structur
explicnd insolubilitatea n detergeni i rezistena la proteoliz.
Inocularea animalelor de laborator cu diluii foarte mari de omogenat de
creier infectat cu prioni este urmat de o acumulare n creierul acestora a unui
numr mare de proteine infecioase (PrPsc). Descoperirea mecanismului de
rearanjare conformaional (-helix -pliere) in vitro a PrP normale, catalizat
de forma sa patologic, a permis stabilirea unui scenariu n care primele molecule
de PrPsc aprute (prin infecie sau prin mutaie genic) interacioneaz direct cu
PrP pe msur ce acestea se formeaz, impunndu-le propria lor conformaie
(Zarnea i Dumitru, 1996).
Secreia proteinelor. Odat sintetizate, proteinele sunt redistribuite la nivelul
celulelor n vederea ndeplinirii funciei pe care o au. Majoritatea proteinelor sunt
citoplasmatice deoarece, dup sintez rmn la nivelul citoplasmei. O alt parte a
proteinelor celulare sunt localizate la nivelul membranei plasmatice sau sunt
liberate n spaiul extracelular. In cazul celulelor eucariote, proteinele sintetizate n
citoplasm trebuie s ajung la nivelul mitocondriilor, a lizozomilor, a peroxizomilor
sau a nucleului (proteinele nucleare).
Studiile efectuate asupra unor tipuri de celule eucariote (de exemplu, celule
pancreatice) au dovedit c proteinele care au alt destinaie dect citoplasma
(proteinele extracelulare i cele lizozomale), dup sintez, ajung mai nti n
interiorul reticulului endoplasmic (RE). Aa cum se cunoate, reticulul endoplasmic
reprezint un sistem de canalicule la nivelul citoplasmei, asigurnd transportul
intra- i intercelular al unor substane. O parte a reticulului endoplasmic este
asociat cu ribosomi, astfel c proteinele nou sintetizate trec rapid n lumenul RE. Se
pune ns problema modului n care aceste proteine traverseaz membrana RE.
Cercetrile realizate n cazul unor tipuri variate de proteine au dovedit c, n
cazul celor ce vor fi secretate, sau care ajung la nivelul membranei plasmatice, n
lizozomi sau n lumenul RE, la captul amino terminal exist o secven special
format din 25 1 aminoacizi denumit secven leader (sau secven semnal).
Ea este separat de restul proteinei (proteina matur) printr-un situs special numit
situs de clivare proteolitic, recunoscut de o proteaz specific.
O parte dintre proteinele ce ajung n lumenul RE sunt supuse unui proces
de glicozilare (N-glicozilare la nivelul gruprii NH2 a asparaginei sau O-glicozilare

la nivelul gruprii OH a resturilor de serin sau treonin din protein), proces


necesar activrii funcionale a multor tipuri de proteine (Abeijon i Hirschberg,
1992).
In ceea ce privete eliminarea proteinelor din lumenul RE (care constituie un
sistem nchis, fr ieire) se consider c acestea sunt transferate complexului
Golgi prin intermediul unor vezicule de transport. La nivelul complexului Golgi,
proteinele sunt mpachetate, introduse n alte vezicule care, prin fuziune cu
membrana plasmatic, asigur eliminarea proteinelor n exteriorul celulei. Tot la
nivelul complexului Golgi ajung i proteinele (enzimele) lizozomale care, dup
recunoatere i sortare dintre celelalte proteine sunt transferate n lizozomi.
O situaie special apare n cazul proteinelor citoplasmatice a cror
destinaie sunt mitocondriile i cloroplastele (n cazul celulelor vegetale): aceste
proteine sunt sintetizate la nivelul ribosomilor liberi (neasociai cu RE) sub forma
unor pre-proteine ce prezint la extremitatea NH 2secvena semnal (Settles i
Martienssen, 1998). Secvena semnal a proteinelor mitocondriale conine un numr
variat de aminoacizi (12-70 aminoacizi), rolul su fiind acela de a conduce
proteinele respective n interiorul mitocondriei, dup traversarea dublei-membrane
a acesteia (se pare la nivelul unor pori). In cursul procesului de traversare a
membranelor mitocondriale are loc clivarea proteolitic a secvenei semnal de ctre
peptidaze specifice.
In cazul cloroplastelor, s-a evideniat existena a dou secvene semnal: una
care mediaz transportul din citoplasm n interiorul cloroplastului, ea fiind
eliminat la nivelul membranei plastidiale i o a doua secven semnal care asigur
trecerea proteinei respective prin membrana tilacoidal (Settles i Metierssen, 1998).
Proteinele ce au drept destinaie nucleul sunt sintetizate n citoplasm dup
care sunt translocate n nucleu prin intermediul unor pori speciali. Se pare c n
procesul de translocare ar fi implicate scurte secvene de aminoacizi care ar
reprezenta secvene semnal necesare traversrii prin porii nucleari (Izaurralde i
Adam, 1998).
Trebuie fcut o precizare: o pre-protein nu trebuie confundat cu o proprotein. Cel mai concludent exemplu este cel a insulinei: aceast protein este
sintetizat sub forma unei catene polipeptidice lungi, pre-proinsulina ce conine la
captul N-terminal o secven semnal. Proteina este apoi secretat n RE, n cursul
translocrii fiind eliminat secvena semnal, astfel c n lumenul RE ajunge o form
scurtat a acesteia, proinsulina. Aceasta este apoi prelucrat prin eliminarea

regiunii mediane a proinsulinei, astfel nct se formeaz dou catene polipeptidice


care se unesc prin intermediul unor puni disulfidice.
La procariote, procesul de secreie a fost mai bine studiat dect n cazul
eucariotelor. Cele mai multe experimente au fost efectuate cu bacterii din
genul Bacillus cunoscute ca eliminnd n mediul extracelular un numr mare de
proteine. De asemenea, mecanismul secreiei proteinelor a fost examinat i n cazul
bacteriei Gram negative E.coli, dat fiind existena spaiului periplasmic localizat
ntre peretele celular i membrana extern. In acest caz, Blight i col.(1994) au
propus utilizarea a dou noiuni: aceea de export pentru transportul proteinelor
din citoplasm n spaiul periplasmic i termenul de secreie pentru transportul
proteinelor din citoplasm n mediul extern.
S-a dovedit c majoritatea proteinelor ce se elimin n mediul extern prezint
la captul amino terminal o secven semnal format din 15-30 aminoacizi
hidrofobi. Ghidat de aceast secven semnal, proteina traverseaz membrana
plasmatic n timp ce secvena semnal rmne la nivelul membranei, ea fiind
separat de restul proteinei prin aciunea unei proteaze membranare (fig.50).

Fig.50. Diagrama unei secvene semnal ataate la extremitatea amino terminal a


unei proteine ce va fi eliminat n mediul extern
Datele recente confirm faptul c procesul de secreie a proteinelor la
bacterii este un proces complex, n care sunt implicate numeroase proteine de
transport ce formeaz un translocon (mecanism dependent de proteine
secretoare), precum i proteine de tip chaperone care asigur conformaia optim
necesar secreiei, fiind evideniate unele asemnri cu mecanismele de secreie
descrise la eucariote.
5.2.6. Degradarea proteinelor
Proteinele celulare, dup ndeplinirea rolului pe care l au, sunt supuse unui
proces de degradare care are drept scop nlocuirea proteinelor vechi cu proteine

noi (turnover proteic), procesul fiind foarte selectiv. Cauzele distrugerii


proteinelor sunt multiple. Deseori, n urma procesului de traducere proteinele
sintetizate prezint erori n ceea ce privete compoziia n aminoacizi; unele proteine
sufer alterri chimice ca urmare a oxidrii devenind astfel incapabile de a-i
realiza funciile; mpachetarea incorect a proteinelor etc (Jentsch, 1996).
Degradarea proteinelor se datoreaz, n principal, aciunii proteazelor i, dei
este mai bine studiat la eucariote procesul este destul de puin cunoscut. Proteazele
eucariotelor pot fi incluse n trei grupe n funcie de aciunea pe care au asupra
proteinelor i de localizarea lor (Lewin, 1997):
proteaze implicate n evenimentele de procesare proteolitic ce

conduc la obinerea de proteine mature, funcionale, sau care


determin eliminarea secvenei semnal de la nivelul proteinelor
secretate;
proteaze lizozomale, localizate la nivelul lizozomilor, implicate n

degradarea proteinelor structurale importate n celule precum i n


autoliza ce are loc n cursul dezvoltrii;
proteaze citoplasmatice ce formeaz complexe macromoleculare

numite proteasomi. Aceste agregate proteolitice degradeaz


proteinele din citosol (determinnd completa convertire a proteinelor
la fragmente foarte mici), iar n anumite cazuri realizeaz prelucrri
specifice ale proteinelor.
Mecanismul exact al procesului de degradare a proteinelor este departe de a
fi neles, mai ales dac ne gndim c uneori el nu poate fi prevzut. Un exemplu n
acest sens este cel al proteinelor musculare care ncep s fie degradate n condiii de
inaniie, furniznd aminoacizii necesari gluconeogenezei (Elliot i Elliot, 1997).