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INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
Diagnstico serolgico
Uso de anticuerpos especficos anti-Igs
humanas conjugados con colorantes
fluorescentes (fluorescena u otros)
Detectar fcilmente en el suero del
paciente la presencia de anticuerpos
antivirales.
Inmunofluorescencia indirecta
para deteccin de anticuerpos
Hacer reaccionar los anticuerpos presentes
en el suero con antgenos virales presentes
en clulas infectadas fijadas sobre
portaobjetos y revelar esa unin antgenoanticuerpo mediante un segundo
anticuerpo anti-Igs humanas, conjugado con
fluorocromo.
INMUNOFLUORESCENCIA
La IFI suele ser mas sensible y mas
especfica que la directa debido a que
tiene un paso mas de amplificacin,
por lo que requiere 1-2 horas para su
realizacin
Factores reumatoideos(FR)
Altos ttulos de IgG
especfica
Antgeno marcado:
o ELISA competitivo
Elisa de captura
ELISA Sndwich DAS
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble de
anticuerpos especficos del agente
patgeno a detectar.
Adicin de la muestra problema (extracto
vegetal, sangre, suero, plasma, etc.).
Adicin de anticuerpos especficos del
antgeno a detectar.
Adicin de un substrato sobre el que sea
capaz de actuar la enzima marcadora.
Lectura visual o colorimtrica del
producto final coloreado.
ELISA COMPETITIVO
Consta de las siguientes etapas:
o Fijacin al soporte insoluble de
anticuerpos especficos del agente
patgeno a detectar.
o Adicin en concentracin conocida de
una mezcla de antgenos del anticuerpo
utilizado en el paso anterior.
o Adicin de un substrato sobre el que sea
capaz de actuar la enzima marcadora.
o Lectura visual o colorimtrica del
producto final coloreado de ambas
pruebas y comparar los resultados.
WESTERN BLOT
Javier Agustn Lanez Mite
Grupo 7 Cuarto Semestre
Definicin
Western Blot es una tcnica analtica, ampliamente
utilizada en biologa celular y molecular, para la
separacin e identificacin de protenas.
En virologa sirve para investigar antgenos virales o sus
respectivos anticuerpos.
Capacidad de identificar
protenas especficas de
una mezcla compleja de
protenas extradas de las
clulas.
Similar a ELISA
WB menos sensible
WB ms especifico
Prueba confirmatoria de la presencia de Ac para HIV en suero de
pacientes con serologa positiva determinada por ELISA
cmo funciona?
Las protenas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel
en funcin de su peso molecular.
A continuacin se utiliza un anticuerpo especfico para detectar la
protena de inters.
El resultado aporta informacin sobre el peso molecular de la
protena y su cantidad relativa en la muestra.
Secuencia
Preparacin del tejido
Electroforesis en gel
Bloqueo
Transferencia
Deteccin
Anlisis
Preparacin de la muestra
Muestra:
Tejido
Cultivo celular
Extraccin de las protenas de muestras biolgicas mediante
disrupcin mecnica o qumica.
Mecnico
Qumico
Detergentes
Homogenizador (para
muestras pequeas)
Tampones (favorecen la
lisis y solubilizan las
protenas)
Sonicacin.
Sales
ELECTROFORESIS
Para entender la tcnica del Western Blot es necesario comprender
que es una electroforesis y en que se basa.
Las protenas suelen tener carga neta; por lo tanto, si se aplica un
campo elctrico a una solucin que contenga una mezcla de protenas,
stas migrarn a una velocidad que depender de su carga neta, forma
y peso molecular. Esta tcnica es conocida como electroforesis.
Las separaciones electroforticas se realizan casi siempre en soportes
slidos, generalmente para separar una mezcla de protenas, el soporte
de eleccin son los geles de poliacrilamida.
Fuente de poder
Electroforesis en gel
En esta tcnica la mezcla de protenas se separa mediante una
electroforesis en gel, con base en:
o Peso molecular
o Estructura
o Hidrofobicidad
Cubeta de electroforesis
transferencia
Estos resultados son luego transferidos a una membrana adsorbente
produciendo una banda para cada protena.
Para que las protenas sean accesibles a la deteccin por
anticuerpos.
Membrana de nitrocelulosa o de PVDF.
Buffer de transferencia
VERIFICACIN
Tras la transferencia, se suele proceder a la tincin del gel
con Coomassie Brilliant Blue (un colorante de protenas) para
comprobar que en efecto una parte importante del material proteico
ha pasado a la membrana.
bloqueo
Puesto que la membrana escogida necesita poder unirse protenas
de forma inespecfica, es preciso bloquear los lugares de unin que
han quedado libres tras la transferencia.
En caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza proteica) empleado
en la deteccin puede unirse a ellos, dificultando la distincin
del complejo antgeno-antgeno que se forma con la protena que
se busca.
deteccin
Posteriormente la membrana se incuba con anticuerpos especficos
marcados para la protena de inters.
Comprueba la presencia en la membrana de una determinada
protena. Para ello se emplea un anticuerpo especfico contra ella
unido a enzima que, en presencia de su sustrato, catalice
una reaccin colorimtrica. De esta forma, se hace patente la unin
con el antgeno, la protena, as como su localizacin.
Estos lavados son necesarios para eliminar los excesos de reactivos no unidos
Producto Insoluble
Anticuerpo
primario.
Anticuerpo
secundario
TIPOS
Se puede hablar de tipos de western blot segn el tipo de deteccin
de las protenas.
Directo:
El anticuerpo primario marcado se une al antgeno de la membrana y
reacciona con el sustrato originando una seal detectable. En el
mtodo directo de deteccin, el anticuerpo primario que se utiliza
para detectar el antgeno sobre la superficie de la membrana, debe ir
marcado con una enzima
MTODO DIRECTO
Indirecto
El anticuerpo primario sin marcar reacciona con el antgeno. Luego,
un anticuerpo secundario marcado se une al primario y reacciona con
el sustrato. En el mtodo indirecto, se aade primero un anticuerpo
primario sin marcar contra el antgeno de la superficie de la
membrana; posteriormente se aade un anticuerpo secundario
marcado contra el anticuerpo primario.
MTODO INDIRECTO
MTODOS DE DETECCIN
Radiactividad
Ms caro
Peligroso
Lento
Sistema
avidina/estreptavidina
Anticuerpo primario unido
covalentemente a molculas
de biotina.
Marcaje fluorescente
Unido a fluorocromos del infrarrojo
cercano, como el 2 - metoxi - 2,4 difenil - 3 (2H) - furanona (MDPF) o
el rojo Nilo.
Deteccin de oro
Anticuerpos primarios con protena
A unida a partculas de oro.
anlisis
Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la
deteccin de aquellas que s se han unido a la protena de inters.
Es
Hay dos razones para esto; primero, hay variaciones en los tipos
de carga y de transferencia entre las muestras en carriles
separados que son diferentes en transferencias separadas.
En segundo lugar, la seal generada por la deteccin no es
lineal en todo el intervalo de concentracin de muestras.
Por lo tanto, puesto que la seal producida no es lineal, no
debe ser utilizado para modelar la concentracin.
aplicaciones
Investigacin
Biologa molecular.
Inmunologa.
Diagnstico
Prueba de VIH.
Enfermedad de las vacas locas.
Enfermedad de Lyme.
Et
a
p
a
TAMIZAJE SEROLOGICO
ELISA
Negativo
Positivo/Indeterminado
Repetidamente
Repetidamente
POSITIVO
(1)
Et
a
p
a
WESTERN BLOT
Negativo
Indeterminado
Correr una nueva muestra 30 a 60 das
despus
(2)
Repetir etapas 1 y 2
Positivo
WESTERN BLOT
(TEST CONFIRMATORIO)
Fundamento
Lisado viral de clulas infectadas, sometidos a
electroforsis en gel de poliacrilamida y transferido a hojas
de nitrocelulosa
Criterios de interpretacin
POSITIVO
-
3+ 1+ +/-
Control
gp120 gp41 p31 p24 p17
gp105 gp36
Criterios de interpretacin
INDETERMINADO
- Si dos o mas bandas presentan intensidad +/- Si una banda presente intensidad <1+ y el resto son negativos en
relacin al control
3+ 1+ +/-
Control
Gp120
p24
NEGATIVO
Si todas las bandas presentan valoracin <+/ Ausencia de protenas
3+ 1+ +/-
Control
Inmunoperoxidasa
Detecta antgenos virales en muestras clnicas que contengan tejidos
y clulas.
En utilizar como marcadores enzimas capaces de hacer cambiar de
color un sustrato incoloro.
En la especificidad de la reaccin antgeno-anticuerpo, que permite la
identificacin de una protena (el antgeno), cuya presencia queremos
demostrar, mediante su unin a un anticuerpo especfico
ENZIMAS UTILIZADAS
Proceso de la tcnica
Paso 1
Paso 2
Paso 3
DOT BLOT
Dot Blot es una tcnica de biologa molecular para detectar
biomolculas.
En un dot blot las biomolculas para ser detectados no son separadas
por cromatografa. En cambio, una gota que contiene la molcula
para ser detectada se aplica directamente sobre una membrana. Esto
es seguido por la deteccin por sondas de nucletidos (northern blot
y southern blot) o anticuerpos (para un western blot).
El procedimiento del Slot y Dot Blot son casi iguales pero en el
primero el filtro es a travs de pequeas ranuras.
Armado:
1.
Tapa inferior
2.
Membrana selladora
3.
Membrana de Nitrocelulosa
4.
Tapa superior
5.
50 l
NaOH 2N
40 l
Agua
100 l
X8
Producto de PCR: 80 l
EDTA 100 mM
400 l
NaOH 2N
320 l
Agua
800 l
Teniendo en cuenta cuntos sondas vamos a probar y cuntas muestras se van a analizar,
hacer los clculos necesarios para TODOS los dot blots, multiplicando los volmenes
anteriores por el nmero de sondas + 1. En este ejemplo, se usaron 7 sondas
x 8.
Preparacin de la membrana:
Se utilizan membranas
de NITROCELULOSA
Cortar un rectngulo de 12 x 8 cm trabajando
siempre con guantes.
+
membrana
Colocar la plancha superior y ajustar perfectamente los tornillos en forma enfrentada. Encender la
bomba de vaco y verificar que sta elimina el lquido remanente del lavado de la membrana.
En cada punto de siembra colocar sucesivamente 200 ml de dilucin de cada producto de
amplificacin y 200 ml de SSPE 20X
7 8
Finalizada la siembra, y luego que la bomba elimin todo el lquido, colocar la membrana entre
dos papeles Whatman y sellarlos con una cinta. Secar durante una hora a 80 C en estufa (o por
cross linker)
Southern blot
permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una
mezcla compleja.
Northern Blot
Tcnica de deteccin de molculas de cido ribonucleico (ARN) de
una secuencia dada dentro de una mezcla compleja (por ejemplo, un
ARN mensajero para un pptido dado en una muestra de ARN total).
Pasos de la tcnica
Extraccin del ARN.
Electroforesis en gel de agarosa.
Diferencias
Inmunodifusin
Muestra clnica
Fundamento de la PCR
Amplificacin enzimtica de un fragmento de
ADN flanqueado
Gen de interes
Cebadores
Nucleotidos
ADN polimerasa termoestable
Se lo deposita en el
termociclador
Ciclo de desnaturalizacin
( a 95 C )
Hibridacin o Anillamiento
Hibridacin de los cebadores a las
secuencias complementarias ( a 55 - 65 C )
Extension o elongacion
Extension nucleotidica de dichos cebadores
mediante la accion enzimatica de una ADN
polimerasa termoestable
Ciclo 2
Ciclo 3