Sunteți pe pagina 1din 46

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ NAPOCA

FACULTATEA DE CHIMIE I INGINERIE CHIMIC

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE


DIN LEGUME I FRUCTE PRIN DIFERITE TEHNICI
CROMATOGRAFICE

Conductor tiinific

Doctorand

Prof.dr. Constantin Mruoiu

Adela Meghean ( cs. Breja)

Cluj-Napoca
-2014-

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

CUPRINS

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

n rezumatul tezei de doctorat se prezint o sub form restrns rezultatele


experimentelor proprii, concluziile generale i bibliografie selectiv.
La redactarea rezumatului s-au pstrat notaiile din textul tezei de doctorat pentru
capitolele, subcapitolele, figurile, i tabelele utilizate.

Cuvinte cheie : analiz multirezidual, reziduuri de pesticide, spectrometrie de mas, LC-MSQQQ, GC-TOF-MS, sol, legume i fructe

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

LISTA DE ABREVIERI

MS/MS spectrometrie de mas n tandem


MSPD extracie cu dispersia fazei n
matrice solid
MWCNT extracie cu nanotuburi cu perei
multiplii
NPD detector pentru azot i fosfor
OC pesticide organoclorurate
OP pesticide organofosforice
PDMS - polidimetilsiloxan
PLE extracie cu lichid sub presiune
PPB pri per bilion
PPM pri per milion
PSA - amin primar-secundar
PTFE - teflon
PYR - piretroizi
QQQ - analizor triplucuadrupolar
RSD deviaie standard relativ
RT - timp de retenie
SBME extracie pe faz solid cu bar
magnetic
SDME microextracie cu o singur
pictur
SFE extracie cu lichid supercritic
SI standard intern
SIM monitorizarea ionului selectat
(selected ion monitoring)
SPE extracie pe faz solid
SPME microextracie pe faz solid
SRM monitorizarea reaciei selectate
( selected reaction monitoring)
STDEV deviaie standard
TD desorbie termic
TLC cromatografie pe strat subire
TOF analizor cu timp de zbor ( time of
flight)
USE extracie asistat de ultrasunete
LZDRPPV Laboratorul Zonal pentru
determinarea reziduurilor de pesticide din
plante i produse vegetale
RC celuloz reciclat

ACN - acetonitril
AOAC Asociaia Comunitilor Analitice
APCI ionizare chimic la presiune
atmosferic
ATD desorbie termic automat
C18 - octadecilsilice
CIPAC - Collaborative International Pesticides
Analytical Council
DG SANCO Directoratul General pentru
Sntate i Consumatori al Uniunii Europene
DLLME microextracie dispersiv lichidlichid
dSPE extracie pe faz solid dispersiv
ECD detector cu captur de electroni
EI ionizare cu impact electronic
ESI ionizare cu electrospray
EtOAC acetat de etil
EURL-FV Laboratorul de referin European
legume i fructe
FID detector cu ionizare n flacr
FPD detector flamfotometric
FULL SCAN scanare complet
GBC crbune negru activ
GC gaz cromatografie sau cromatografie de
gaze
GPC cromatografie de gel permeaie
HPLC - cromatografie de lichide de nalt
performan
LC lichid cromatografie sau cromatografie de
lichide
LLE extracie lichid-lichid
LMA - limita maxim admis
LOD limita de detecie
LOQ - limita de cuantificare
MAE extracie asistat de microunde
MRM monitorizarea reaciilor multiple (
multi reaction monitoring)
MS spectrometrie de mas
9

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

Teza de doctorat este constituit din dou pri.


Prima parte, cuprinde primele patru capitole, n care se prezint datele din literatura de
specialitate privitoare la stadiul actual al cercetrilor n domeniul.
Partea a doua a tezei de doctorat prezint contribuiile experimentale originale, care sunt
prezentate n cinci capitole, cel de-al aselea constituind Concluziile finale.
Sub forma de Anex , sunt prezentate rezultatele obinute cu metodele de extracie i
analiz prezentate n tez , prin participarea la Teste de Competen European.

INTRODUCERE
Monitorizarea nivelului de ncrcare cu reziduuri de pesticide din produse agricole
(legume i fructe), sol, ap i alte componente ale agrosistemelor constituie o preocupare major
a proteciei mediului.( Davidescu, Calancea, 1992)
Lucrrile care prezint determinarea unor reziduuri de pesticide din alte clase ( mai greu
de detectat fr o aparatur performant), aduc deseori n atenie depiri nsemnate ale LMA al
unor pesticide.
Foarte puine lucrri ns trateaz modul de acumulare al pesticidelor, cantitatea acestora
n diferite stadii de dezvoltare ale plantelor, n perioadele de pauz necesare fiecrui pesticid
dup aplicare, reziduurile acumulate n perioada de remanen a pesticidelor ct i dup aceasta,
precum i

identificarea i/sau cuantificarea unor produi de degradare ai pesticidelor (

metaboliii formai) utilizate n tratamente .


Prezenta lucrare i dorete s aborbeze toate situaiile expuse mai sus, folosind pentru
studiu loturi experimentale cu diverse legume i fructe care vor fi tratate mai mult sau mai puin
n conformitate cu procedurilor de aplicare a tratamentelor rezultnd uneori doze accidentale
din mai multe clase de pesticide : fungicide, insecticide , acaricide .a..
Reziduurile de pesticide din produsele supuse studiului vor fi determinate utiliznd
metode cromatografice : lichid cromatografie cu spectrometrie de mas cu detector de tip
triplucuadrupol (LC-MS-QQQ) i gaz cromatografie cu spectrometrie de mas cu detector cu
timp de zbor ( GC - TOF MS) .
Relevana proiectului, att din punct de vedere a programelor de monitorizare naionale
ct i din acela al programelor de monitorizare europene n ceea ce privete coninutul de
10

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

pesticide din fructe i legume, este dat de faptul c rspunde unor cerine importante n
abordarea relaiei expunere la pesticide - risc asupra sntii, concentrndu-se asupra
determinrii reziduurilor de pesticide prin metode cromatografice revizuite sau nou elaborate , pe
mecanismele de aciune i acumulare

a pesticidelor

n condiii de aplicare repetitiv a

tratamentelor fitosanitare, precum i efectul aplicrii supradozelor de pesticid. Pe de alt parte


proiectul va produce date, care doresc s susin ideea c n agricultura modern pentru
obinerea unui randament mare, alegerea pesticidului, a momentului optim de tratare i n
special modul de aplicare

sunt factori determinani. Produsele cu selectivitate i eficien

economic ridicat, nepoluante, netoxice, neremanente pot asigura obinerea unor recolte sporite
i n acelai timp libere de pesticide. (ICPA,2002; Davidescu, Calancea, 1992; Grou si colaboratorii ,
1979)

OBIECTIVE
Considernd situaia pe plan european i naional n ceea ce privesc reziduurile de
pesticide n diverse matrici, aceast lucrare i propune ca obiectiv principal Elaborarea de
metode de extracie i analiz optime pentru a determina reziduurile de pesticide din legume i
fructe , ducnd astfel la soluionarea altor obiective secundare cum ar fi:
-

Evaluarea expunerii plantelor din terenul experimental ales, avnd n vedere tratamentele
aplicate n anii anteriori efecturii studiului

Crearea unui lot experimental ambiental i selectarea culturilor de interes (roii Cherry,
ardei iui Chayenne, castravei Cornion, salat Boston,

struguri de vin

) pentru

investigarea efectului pesticidelor selectate asupra plantelor n concentraia prescris de


productor inndu-se cont de tehnica de tratament aplicat i de condiiile meteorologice
existente
-

Evaluarea efectelor pesticidelor i a gradului de acumulare al acestora n fructe i legume


prelevate n diferite perioade de timp dup aplicarea tratamentului fitosanitar : la 3 zile
dup stropire, la 10 zile dup stropire (dup perioada de pauz a substanei active), i/sau
15 zile sau 1 lun (dup perioada de remanen a substanei active)

Identificarea unor metabolii i/sau produi de degradare i cuantificarea celor mai


relevani

11

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

ntocmirea unor curbe de degradare reprezentnd variaia concentraiei de pesticid pe o


anumit perioad, i compararea cu valoarea LMA dup trecerea timpului de pauz
Problemele ridicate de acest studiu precum i obiectivele sunt n strns concordan cu

mai multe obiective i prioriti ale unui program cu finanare Sapard al Uniunii Europene care a
vizat printre altele nfiinarea n 2008 a unui Laborator Zonal pentru Determinarea Reziduurilor
de Pesticide din Plante i Produse Vegetale la Unitatea Fitosanitar Mure din Trgu Mure ,
acesta fiind i locaia n care s-au efectuat toate experimentele i analizele din prezenta lucrare.

PARTEA EXPERIMENTAL
CAPITOLUL 5.
SELECTAREA ZONEI DE STUDIU. PREGTIREA LOTURILOR
EXPERIMENTALE. CALENDARUL TRATAMENTELOR APLICATE. PRELEVARE
PROBE
Teza urmrete elaborarea de metode de extracie i analiz pentru a determina relaia
dintre acumularea, degradarea i remanena pesticidelor n probele de legume i fructe supuse
tratmentelor fitoasanitare repetate . Problema este abordat ntr-o maniera multidisciplinar, sub
forma unui studiu complex.
Subcapitolele 5.1 i 5.2 trateaz aspecte legate de Selectarea zonei de studiu respectiv
Poluarea istoric a solului ales pentru loturile experimentale, din care vom face cteva selecii.
Terenul pe care s-a desfurat experimentul este situat la periferia oraului Trgu Mure
i n ultimii 7 ani a fost utilizat pentru cultivarea legumelor i a cartofilor. La o distan de
aproximativ 100m de acest teren se afl o parcel necultivat de 5 ani, avnd solul de acelai tip
ca i terenul experimental,care a fost ntrebuinat pentru cultivarea probelor martor de legume i
deasemenea din aceast parcel au fost prelevate probele martor de sol utilizate la validarea
metodei GC pentru sol.
Desfurarea studiului implic 4 linii de investigaie. Prima se refer la elaborarea unor
metode optime de extracie i analiz a reziduurilor de pesticide potrivite pentru a realiza scopul
propus.
A doua linie de investigaie pornete de la analiza chimic a solului

ales pentru

experimentare din punct de vedere al coninutului de pesticide, n scopul evalurii calitii


acestuia.
12

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

A treia linie de investigaie urmrete situaia expunerii probelor selectate la pesticide


aplicate in doze normale prin tratamente repetate cu respectarea unui timp de pauz mediu de 20
zile ntre tratamente . Datele se obin prin colectarea probelor n diferite perioade de timp, dup
efectuarea tratamentelor fitosanitare i analiza lor chimic. O serie de date, cele referitoare la
poluarea istoric, vor fi colectate de la tratamentele efectuate n anii anteriori n zonele selectate
i din analiza chimic a solului din punct de vedere al coninutului de pesticide.
Cea de a patra linie urmrete evaluarea prin investigaii experimentale a metaboliilor
rezultai n urma degradrii pesticidelor sau a eventualelor modificri structurale suferite de
acestea n timpul analizelor instrumentale. La finalul proiectului se constituie o analiza integrat
a datelor colectate .
5.3 SELECTAREA SUBSTANELOR ACTIVE CARE SE VOR SUPUNE STUDIULUI
5.3.1 METODOLOGIA I TEHNICA DE LUCRU
Studiul s-a derulat pe parcursul a doi ani, 2012 respectiv 2013, pesticidele de interes
fiind grupate cte 3 din clase diferite , care au efect asupra tuturor probelor selectate ( roii
Cherry, castravei, ardei iui, salat, struguri ). Tabloul expunerii istorice la pesticide va fi
completat i pe baza datelor curente furnizate i de autoritile care au efectuat tratamente
anterioare n zonele alese pentru studiu.
Vor fi determinate reziduurile a 30 de pesticide din legume i fructe , n diferite stadii de
maturitate a legumelor , respectiv fructelor, la 3, 10 i 15 zile, ncercnd s se acopere i timpii
de pauz i remanena specifici fiecrui pesticid utilizat . Pentru un numr semnificativ de probe
se vor face extracii i analize comparative. Concentraia de pesticide va fi raportat la Limita
Maxim Admis ( LMA) stabilit de ctre organismele europene din domeniu i adoptat i de
ctre ara noastr ca stat membru al acesteia.
Pesticidele selectate pentru derularea studiului au fost: 2,4D, Acetamiprid, Tiofanat metil,
Carbendazim, Metomil, Imidacloprid, Propiconazol, Tiacloprid, Ciprodinil, Penconazol,
Dimetoat, Ometoat , Pirimetanil, Miclobutanil, Piraclostrobin, Fenhexamid, Bifentrin,
Bromopropilat, Captan, Clorotalonil, Dicofol, Folpet, Iprodion, Procimidon, Metalaxil,
Fludioxonil, Fenarimol, Malation, Azoxistrobin, Boscalid.
Cercetarea eventualilor metabolii are drept scop identificarea metaboliilor respectivi i
cuantificarea unora dintre ei. Fiecare tip de prob se presupune a avea un rspuns specific dup
13

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

expunerea ambiental

n ce privete att doza ct i intervalul de timp pn la apariia

metaboliilor.
n subcapitolele urmtoare ( 5.3.2 i 5.3.2.1) sunt prezentate variantele de produse
fitosanitare cu care s-au efectuat tratamentele i proprietile fizico-chimice cele mai relevante
ale substanelor active supuse studiului, din punctual de vedere al elaborrii de metode de
extracie i analiz.
n subcapitolul 5.4 sunt prezentateStabilirea loturilor experimentale pentru roii cherry,
castravei , ardei iui, salat i struguri ,Semnarea i rsdirea plantelor supuse studiului
Modul de prelevare al probelor de legume , fructe i sol i Condiiile meteo existente n
momentul efecturii tratamentelor fitosanitare i a prelevrii probelor.

CAPITOLUL 6.

DETERMINAREA METODEI OPTIME DE EXTRACIE A

REZIDUURILOR DE PESTICIDE I DE PURIFICARE A EXTRACTELOR DIN


PRODUSE VEGETALE I SOL
In acest studiu au fost testate cinci metode de extracie pentru legume i fructe i dou
metode pentru sol , aceste metode avnd la baz metode cunoscute, unele dintre ele fiind uor
modificate pentru a obine o mai bun capacitate i precizie de extracie a pesticidelor din
legume, fructe i sol, i, deasemenea, pentru a fi mai puin costisitoare din punct de vedere a
costurilor materiale.
6.1 EXTRACIA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN PRODUSE VEGETALE
Pentru a determina metoda optim de extracie s-au supus studiului 5 metode de extracie
cunoscute ( Luke, Klein, acetat de etil i QuEChERS original i tamponat), unora aducndu-li-se
mici modificri n scopul eficientizrii acestora n funcie de matricea analizat i de
instrumentul de analiz ( GC-TOF-MS i LC- QQQ-MS).
S-a considerat c alegerea a unei matrici reprezentative din fiecare grup de probe
clasificat conform directivelor DG SANCO este suficient de relevant pentru stabilirea metodei
optime de extracie a grupului respectiv. De exemplu, pentru grupul matricilor cu coninut mare
de ap din care fac parte roiile, castraveii, ardeii i salata .a, am ales roiile ca matrice
reprezentativ, iar din grupul matricilor cu aciditate mare i coninut mare de ap s-au ales
strugurii ca matrice reprezentativ. (SANCO/12495/2011, SANCO 12571/2013)
14

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

Probe de salat au fost supuse studiului comparativ al determinrii metodei de extracie


optime pentru a evidenia eficiena metodei de purificare alese pentru matrici pigmentate.
n ceea ce urmeaz se vor prezenta detaliat doar metodele care au fost modificate i au
fost n final selectate pentru desfurarea studiului.
6.2.1 EXTRACIE MINILUKE modificat
10g din fiecare prob ( struguri, roii Cherry, salat i sol) sunt cntrite cu precizie ntrun tub de centrifug de 150mL din polipropilen i este extras cu 10mL aceton. Amestecul este
agitat iar apoi se adaug 10mL diclorometan i10mL eter de petrol. Reziduurile sunt extrase
utiliznd un omogenizator Ultraturax

timp de 2 minute la 15.000rpm , iar apoi

au fost

centrifugate 5min la 4000rpm. Pentru matricile pigmentate (salata) se adaug suplimentar 7mg
crbune activ (GBC). Faza organic din partea superioar ( ex. 26mL pentru struguri, 15 mL
pentru roii cherry) a fost evaporat la 40C cu un rotavapor pn aproape de sec. Pentru analiza
GC, reziduurile se redizolv n 2mL iso-octan:toluen 9:1, v/v, care conine 0.2g/mL HCB , se
filtreaz prin filtru RC 0.2 m i se analizeaz . Pentru analiza LC, dup concentrare reziduurile
sunt reluate cu 2 ml amestec acetonitril:ap 50:50, se filtreaz prin filtru RC 0.2 m i se
analizeaz.
6.2.2 EXTRACIE QUECHERS TAMPONAT modificat
10g din fiecare prob ( struguri, roii cherry i salat) sunt cntrite cu precizie ntr-un
tub de centrifug de 100mL din polipropilen i este extras cu 10mL acetonitril acidifiat cu 1%
acid acetic. Dup adugarea a 200l dintr-o soluie de 10 g/ml HCB ( doar la extraciile GC),
reziduurile sunt extrase utiliznd un omogenizator Ultraturax timp de 1min la 15.000 rpm . Se
adaug apoi 4g MgSO4, 1g NaCl i 1g CH3COONa iar soluia rezultat este agitat timp de 1
minut i apoi centrifugat pentru 5min la 4000rpm. Se ia un alicot din extractul de acetonitril
(6mL) , se transfer ntr-un tub de centrifug de 20mL din polipropilen i se adaug 150mg
PSA i 900mg MgSO4. Pentru matricile pigmentate (salata) se adaug n plus 15mg crbune
activ (GBC). Pentru analiza LC, dup agitare timp de 1 minut i centrifugare timp de 1 minut la
4000rpm se ia 1 ml extract de acetonitril purificat , la care se adaug 1 ml amestec acetonitril:
ap 50:50, se filtreaz prin RC 0.2 m i se analizeaz pe LC. Pentru GC, dup agitare timp de 5
minute, s-a centrifugat pentru 5min la 4000rpm, s-a luat 1mL extract i s-a concentrat n curent

15

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

de azot. Reziduurile sunt redizolvate n 1mL iso-octan : toluen 9:1, v/v ,filtrate prin filtru RC
0.2 m i analizate.
6.2.6 ALEGEREA METODEI OPTIME DE EXTRACIE A PESTICIDELOR DIN
FRUCTE I LEGUME
Pentru a compara performanele metodelor de extarcie supuse studiului , probe martor (
blank) din fiecare matrice reprezentativ ( roii, struguri i salat) au fost mbogite cu o soluie
amestec la nivel 50g/kg care conine 80 de pesticide. Dintre toi metaboliii identificai s-a decis
cuantificarea a cinci dintre acetia : tetrahidroftalimida, tiofosgen - metabolii ai captanului,
ftalimida - metabolit al folpetului, 2,4 '-diclorobenzofenon metabolit al fenarimolului i
dicolfolului i 4,4'-diclorobenzofenon- metabolit al dicofolului.
Comparaia ntre metodele de extracie este ilustrat

grafic n Figura 6.2 pe dou

intervale de rate de recuperare (sub 70% i peste 120%), rezultatele obinute prin extracia cu
metoda Klein (DIN EN 15637) nefiind reprezentate deoarece au fost cuantificate numai 30 de
pesticide i 15 pesticide au fost doar identificate.

Figura 6.2Compararea numrului de pesticide n dou intervale de recuperare (<70% i >


120%) sau nedetectat (nd) la un nivel de 50g/kg a probei-martor de struguri
Ratele de recuperare obinute pentru metaboliii analizai prin metodele de extracie
testate sunt prezentate n Tabelul 6.1.

16

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

Tabel 6.1. Ratele de recuperare comparative ale metaboliilor de pesticide extrai prin 4 metode
de extracie
Metabolii

QuEChERS

QuEChERS
tamponat

EtOAc

Mini-Luke
modificat

2,4'-Diclorobenzofenon

69

59

Ftalimid

41

73

123

113

42

Tiofosgen

30

70

107

Tetrahidroftalimida

47

57

p,p'-Diclorobenzofenon

Dup analizarea tuturor datelor obinute se poate concluziona c metoda de extracie


Mini-Luke modificat i metod de extracie QuEChERS tamponat au oferit rezultate
acceptabile, drept pentru care aceste dou metode de extracie vor fi utilizate n continuare la
definitivarea obiectivelor propuse n prezenta lucrare, respectiv pentru extracia reziduurilor de
pesticide i a metaboliilor lor din 5 matrici ( roii cherry, castravei, ardei, salat i struguri)
urmnd a stabili pentru fiecare dintre ele care este metoda optim de extracie asociat
bineneles cu metoda de analiz. (Meghean Breja, Mruoiu, Cimpoiu, 2014)
6.3 EXTRACIA ACIDULUI 2,4 DICLOROFENOXIACETIC (2,4D)
Prin hidroliza alcalin cu NaOH sau K2CO3 se poate realiza o cretere a extractibilitii
acestuia din legume i fructe, datorat ruperii legturilor care pot exista ntre pesticid i matrice.
Metoda propus pentru extracia 2,4 D din roii este urmtoarea:
10 g de prob cntrit cu precizie se introduce ntr-un tub de centrifug de 250 ml din
polipropilen . Se adaug 2 ml NaOH 10M ,se agit energic 1 min dup care se las n repaus 30
min. Se neutralizeaz apoi cu 5 ml H2SO4 3M i se adaug 15 ml ACN cu 1% CH3COOH dup
care se agit la Ultraturax (1min la 15.000rpm). Se introduc apoi 3g CH3COONa anhidru , 6g
MgSO4 i 3 g NaCl, se agit n mn timp de 1 minut, apoi se centrifugheaz 5 min la 4000
rot/min. Din extractul rezultat ( cca.12 ml) se ia 1 ml, la care i se adaug 1 ml ACN:H 2O n
proporie 50:50 , se filtreaz prin filtru 0.2 m RC i se analizeaz pe LC.
6.4 EXTRACIA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN SOL
Dintre cele dou metode prezentate mai jos a fost selectat ca optim metoda de extracie
cu PSA, aceasta avnd ca avantaj numrul de pesticide extrase, ratele de recuperare mai bune i
faptul c extractul este mult mai curat, ceea ce a permis analiza unui numr mai mare de probe
17

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

de sol fr a fi necesar injectarea de aceton pentru a cura componentele de injectare ale


instrumentului de analizat de analizat.
6.4.1 METODA CU PSA
10 g de prob de sol cntrit cu precizie se introduce ntr-un tub de centrifug de 250 ml
din polipropilen i se amestec cu 10 mL ap i 20 mL acetonitril acidifiat cu 1% acetic acid.
Dup adaugarea Standardului Intern de HCB (0.2g/mL), reziduurile sunt extrase utiliznd un
omogenizator Ultraturax (1min la 15.000rpm). Apoi se adaug 4g MgSO4, 1g NaCl i 1g
CH3COONa amestecul rezultat fiind agitat 1 minut i apoi centrifugat 5min la 4000rpm. Un
alicot de extract de acetonitril (cca 6mL) este transferat ntr-un tub de centrifug de 20mL din
polipropilen i se adaug 150mg PSA i 900mg MgSO4. Amestecul este apoi agitat n mn
pentru 1 minut, centrifugat i apoi 1 ml din extractul rezultat (cca 4 mL) este analizat pe GC TOF-MS .

6.5 PURIFICAREA EXTRACTELOR DIN PRODUSE VEGETALE


n studiul de fa, n cazul probelor cu coninut mai mare de pigmeni , cum este salata ,
pentru metoda de extracie Mini-Luke am introdus o etap de purificare cu GBC.
Pentru a evalua eficacitatea purificrii, probele martor (struguri, roii i salat) au fost
mbogite la un nivel de concentraie de 0,05 i 0,1 g/ml. Valorile sczute ale ratei de
recuperare a unor compui cu structur planar sunt o consecin a utilizrii GBC pentru
purificare ( acesta reine aceti compui din probe) i, de asemenea, probabil din cauza etapei de
concentrare a extractului.
innd seama de aceste recomandri DG DANCO 12571/2013 s-a decis utilizarea n
prezenta lucrare a HCB-ului ca i standard intern de injectare, astfel c adugarea lui se face la
final, odat cu soluia de reluare aceast decizie fiind susinut i de faptul c dac este adugat
nainte de extracia probelor i ulterior se utilizeaz GCB pentru purificare, HCB-ul datorit
structurii sale planare, va fi reinut de acesta .
Concluziile pe scurt referitoare la etapa de purificare cu GBC ar fi urmtoarele:
-

n procedura de extracie cu EtOAc (n studiu au fost matricile struguri, salat i roii


cherry), purificarea cu GBC ar trebui s fie evitat, deoarece pierderea pesticidelor a fost
foarte mare; numai 10% din substanele active au fost gsite dup purificare iar
recuperrile pentru pesticidele cuantificate au fost ntre 30-55%

18

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

Extracia Mini-Luke a fost aplicat pe salat , roii Cherry i struguri. Dup purificare,
recuperrile au fost ntre 55-161%. La analiza acestor extracte brute ( nepurificate ) de
salat au fost ntmpinate urmtoarele probleme: nfundarea seringii de injectare,
scderea sau creterea nlimii picurilor pesticidelor i a abundenei m / z i modificarea
timpilor de retenie, ultimile fiind clare efecte de matrice care intervin n analiz.
-

n extraciile cu ACN, influena componentelor matricilor (adic uleiuri eseniale

i pigmeni) a fost mai mic dect la celelalte metode de extracie. Pierderile de pesticide de la
etapa de purificare cu GBC au fost semnificative, dar comparabile cu cele obinute prin metoda
Mini-Luke cu etap de purificare GBC.
-

Recuperrile obinute indic faptul c metoda Mini-Luke modificat este mult

mai potrivit pentru extracia de reziduuri de pesticide din probe variate excluznd probele
pigmentate i uleioase, pentru astfel de probe (de exemplu salat) este preferat extracia n
acetonitril (ACN)
-

efectul de matrice a fost evaluat comparnd aria picurilor pesticidelor obinute din

soluii standard (n = 3) cu cele obinute din extractul de salata martor mbogit cu aceleai
pesticide.
-

rezultate asemntoare s-au obinut i n cazul probelor de sol , unde purificarea

extractelor s-a efectuat prin tehnica SPE, utiliznd PSA i amestec de sruri
-

n cazul determinrilor prin LC , etap de purificare cu GBC a fost aplicat doar

pentru proba de salat, iar metodele de extracie investigate au fost Mini-Luke modificat i
QuEChERS tamponat., doar 4 ( carbendazim , imidacloprid, tiofanat metil i metomil) dintre
cele 17 pesticide investigate avnd ratele de recuperare mai mari n cazul extraciei prin MiniLuke modificat dect prin QuEChERS tamponat.

CAPITOLUL 7. ELABORAREA METODELOR DE DETERMINAREA A


REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN PRODUSE VEGETALE I SOL
7.1 ELABORAREA METODEI DE DETERMINARE PRIN GC TOF- MS
7.1.1 MATERIAL I METOD
Analizele din prezentul studiu sunt realizate cu un gaz cromatograf AGILENT seria
6890 modificat (cu dou cuptoare), cuplat cu un spectrometru de mas cu timp de zbor LECO
Pegasus (USA), un autosampler AGILENT seria 7683 i injector split/splitless.
19

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

Elaborarea metodei GC-TOF-MS are ca punct de plecare o metod dezvoltat n 2008 n


urma unui training de echipa de chimiti ai LZPDRPPPV ( din care am fcut parte) mpreun cu
o echip de analiti de la Centrul Tehnic European din Praga ,al firmei productoare LECO
(USA) . Iniial cu metoda respectiv s-au analizat 60 de pesticide , urmnd ca n decursul anilor
metoda s fie modificat aproape n ntregime , iar numrul pesticidelor analizate s ajung la
peste 100. Metoda GC prezentat n aceast tez este modificat radical fa de cea iniial la
partea de GC, doar anumii parametrii de la metoda de procesare i metoda MS pstrndu-se ,
aceti parametrii fiind n mare parte recomandai de productor ca fiind optimi. Astfel c
dezvoltarea metodei a pornit de la separarea a 104 pesticide, urmnd s se fac o selecie dintre
acestea pentru studiul aplicativ (30 pesticide) . Drept urmare, n ceea ce urmeaz s fie prezentat
se va pune accentul pe pesticidele selectate pentru studiul aplicativ, dar se vor face numeroase
referiri i la celelalte pesticide care pot fi determinate cu aceast metod.
Standardele analitice i toi reactivii utilizai sunt de calitate certificat HPLC i GC i
sunt achiziionai de la firma Sigma Aldrich. Srurile folosite sunt de puritate GC i sunt
achiziionate de la firma Merck, iar cartuele ,materialele adsorbante PSA i C18, GBC i filtrele
de 0,2m sunt achiziionate de la firma Supelco. Apa ultrapur este preparat cu un aparat TKA
compus din dou uniti Lab tower i GenPure .
Alt mic aparatur utilizat: balane MettlerTolledo i Kern, omogenizatoare Grindomix
i Ultraturax, rotaevaporator Heidolph,evaporator n curent de azot N-EVAP116 OA-SYS (
SUA) , centrifug Consul20, baie de ultrasunete Sonorex, dispensere Hirshmann Laborgerate.
7.1.2

STUDIUL CARACTERISTICILOR FIZICO-CHIMICE A


SUBSTANELOR ACTIVE
Substanele active ale pesticidelor studiate sunt grupate n cteva clase chimice , care
prezint proprieti fizico-chimice diferite chiar dac fac parte din aceeai grup chimic , cum ar
fi solubilitate n ap, polaritate, presiune de vapori, punct de topire etc.

7.1.3

FACTORI CARE INFLUENEAZ SEPARAREA

n acest subcapitol se trateaz o serie de factori care pot afecta separarea cromatografic a
pesticidelor n analize gaz cromatografice, cu exemplificri a situaiilor aprute pe parcursul
elaborrii metodei de analiz GC-TOF-MS, astfel s-au analizat factori cum ar fi: punctul de
fierbere, polaritatea analitului vs polaritatea
20

fazei staionare din coloan, temperatura

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

injectorului, temperatura cuptorului coloanei- rampe de temperatur, lungimea i diametrul intern


al coloanei, debitul gazului purttor, cantitatea de prob injectat, temperatura sursei de ioni, rata
de achiziie a spectrelor, cteva dintre ele fiind prezentate mai n detaliu n ceea ce urmeaz.
7.1.3.4 TEMPERATURA CUPTORULUI COLOANEI. RAMPE DE TEMPERATUR
Temperatura coloanei este un factor care n gaz cromatografie poate modifica aria i
nlimea unui pic cromatogafic n diferite proporii. O temperatur ridicat a coloanei scurteaz
timpul de retenie , dar aceasta este n dezavantajul separrii ntruct majoritatea compuilor stau
n faza gazoas, iar pentru a avea loc separarea compuilor, acetia trebuie s interaioneze cu
faza staionar, altfel nu se vor nregistra diferene pronunate ale timpilor de retenie. Cea mai
bun separare se obine la dezvoltarea unui program de temperatur a cuptorului, deoarece vor
intervenii n separare i polaritatea i punctul de fierbere.( Fernandez-Alba, 2012)
innd cont de observaiile din literatura de specialitate, ntr-o prima ncercare s-a folosit
o temperatur iniial a cuptorului de 100C, iar rampele de temperatur sunt prezentate n figura
7.1.

Figura 7.1 Selectarea rampelor de temperatur, ncercarea 1


Totui pentru a separa izomerii amunitor pesticide precum i pe cele cu puncte de fierbere
ridicate i anumii compui contaminani, trebuie construit o ramp de temperatur mai
complex. Astfel, s-a ajuns la urmtoarea ramp de temperatur, care are un timp total de
analiz de 29.2 minute i separ 92 de pesticide.

Figura 7.2 Selectarea rampelor de temperatur, ncercarea 2

21

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

n figura 7.3 sunt prezentate cteva pesticide injectate dintr-un amestec de concentraie
0.5 ppm ,cu toi ceilali parametrii GC identici exceptnd rampele de temperatur , pentru a
susine cele afirmate anterior.

Figura 7.3. Influena rampei asupra raportului S/N a unor pesticide


7.1.3.6 DEBITUL GAZULUI PURTTOR
Un debit mare de gaz purttor ( n cazul nostru Heliu), reduce timpul de retenie i
produce o separare slab a analiilor, datorit n special ca i n cazul temperaturii prea ridicate,
faptului c analiii petrec prea puin timp n coloan i nu au timp pentru a interaciona cu faza
staionar.Un debit sczut de gaz purttor crete timpul de retenie.( de Koning si Gumpendobler,
2007)
Dup stabilirea rampei de temperatur s-a trecut la stabilirea debitului optim de gaz
purttor . S-a nceput cu un debit de 1,0 ml/min ,iar apoi s-a modificat la 1,2 ml/min, toi ceilali
parametrii ai GC fiind pstrai neschimbai. Cel mai important motiv al acestei modificri de
debit a fost acela c s-au observant coeluii a unor pesticide i astfel s-a ncercat o separare mai
bun a picurilor. In figurile 7.4 , 7.5 sunt prezentate 3 exemple cu pesticide care se comport
diferit la modificarea debitului de gaz purttor.
Ceea ce trebuie remarcat este faptul ca dei picurile pesticidelor prezentate nu sunt bine
separate din punct de vedere cromatografic, ele sunt separate i integrate prin intermediul
algoritmului de deconvoluiune al instrumentului GC-TOF-MS de la LECO.
Dup cum se observ unele picuri sunt foarte bine separate dup creterea debitului de
gaz purttor( ex. etion, endrin) , altele parial separate ( ex. kresoxim-metil, buprofezin au rmas
coeluate, dar flusilazolul i pp DDE s-au separat), iar altele au rmas neseparate , ns au aprut
izomeri ai unora dintre ele ( ex. triadimenol rmne coeluat cu procimidonul, dar apare izomerul

22

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

2 al triadimenolului care poate fi cuantificat,izomer care la debit de 1,0 ml/min nu era nici mcar
identificat).

50000
40000

2.4e+006
Time (s)

3.4e+006
3.2e+006

1270

3e+006
2.8e+006

30000

2.6e+006

20000
1465
1470
1475
81+263+281
231+97+153

1480

2.4e+006
1485
Time (s)

30000
25000

Dieldrin

DDD p,p'-

Myclobutanil

35000

Kresoxim-methyl

40000

Buprofezin

Deconvoluia picurilor din TIC la


1,2 ml/min

1465

*Myclobutanil

*Flusilazole

1392.5

Endosulfan sulfate

1280

1285

1290

1470
TIC

1475

1480

1485

Cromatograme TIC la 1,2 ml/min

1.4e+006
1.35e+006
1.3e+006
1.25e+006
1.2e+006

20000

1.15e+006

15000

1.1e+006

10000

1.05e+006

Time (s) 995


996
116+131+206

1460

TIC

Kresoxim-methyl

1460

Buprofezin

Time (s)

1275

1390

Fenpropiomorph I

1290

1387.5

*Triadimenol
*Procymidone

*Heptachlor epoxide

*Bromophos-ethyl

Endosulfan sulfate

1280
1285
283+96+285

1385

Dieldrin

60000

2.5e+006

1275
112+168+130

1382.5
TIC

DDD p,p'-

70000

2.6e+006

1380

Myclobutanil

80000

2.7e+006

1377.5

Dieldrin

90000

Unknown 48

100000

1270

2.8e+006

1375

Unknown 48

Time (s)

3e+006
2.9e+006

Fenpropiomorph I

20000

1390 1392.5
233+315+206

*Ethion

40000

*Endrin

60000

*Triadimenol

*Heptachlor epoxide

80000

*Procymidone

120000

ISOMER
3-(3'-TRIMETHYLSILOXYPROPYL)-1,1,2-TRIS(TRIMETHYLSILYL)CYCLOPROPANE
Dieldrin

1375 1377.5 1380 1382.5 1385 1387.5


246+318+176
116+131+206
104+172+106
*Quinalphos

Time (s)

*Ethion

2.4e+006
Time (s)

20000

ISOMER
3-(3'-TRIMETHYLSILOXYPROPYL)-1,1,2-TRIS(TRIMETHYLSILYL)CYCLOPROPANE
*Endrin

2.6e+006

*Quinalphos

2.8e+006

*Bromophos-ethyl

3e+006

40000

*Buprofezin

3.2e+006

*Kresoxim-methyl

3.4e+006

60000

100000

*DDE p,p'-

Cromatograme TIC la 1,0 ml/min

*Myclobutanil

80000

*Flusilazole

100000

*Kresoxim-methyl

*DDE p,p'-

120000

*Buprofezin

Deconvoluia picurilor din TIC la


1,0 ml/min

997
998
104+172+106

999

1000
1001
1002
1003
246+318+176
233+315+206

Time (s) 995

23

996

997

998

999
TIC

1000

1001

1002

1003

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE

1.05e+006
1e+006

40000
30000
20000
10000
Time (s)

1017.5

1020

1022.5 1025
81+263+281

1027.5 1030 1032.5


231+97+153

1035

932.5

935

937.5

Endrin

*Oxadixyl

930

1.25e+006
1.2e+006

Endrin ketone

50000

*o,p'-DDT page 1726 in PMW part 3

60000

4,7-Methano-1H-indene, 1,2,3,4,5,6,7,8,8-nonachloro-2,3,3a,4,7,7a-hexahydro-

70000

*Ethion

Endrin

80000

Endrin ketone

Time (s)

940
TIC

Triadimenol

942.5

945

947.5

950

1.15e+006
1.1e+006
1.05e+006
1037.5

Time (s)

1017.5

1020

1022.5

1025

1027.5
TIC

1030

1032.5

*o,p'-DDT page 1726 in PMW part 3


*Oxadixyl

1.1e+006

4,7-Methano-1H-indene, 1,2,3,4,5,6,7,8,8-nonachloro-2,3,3a,4,7,7a-hexahydro-

1.15e+006

*Ethion

1.2e+006

Bromophos-ethyl

1.25e+006

3-(3'-TRIMETHYLSILOXYPROPYL)-1,1,2-TRIS(TRIMETHYLSILYL)CYCLOPROPANE

Procymidone

-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

1035

1037.5

7.1.4 CONDIII FINALE DE DETERMINARE A REZIDUURILOR DE PESTICIDE


PRIN GC-TOF - MS
Spectrometrul de mas LECO Pegasus Time-of-Flight Mass Spectrometer (TOF-MS)
(USA) este echipat cu un gaz cromatograf AGILENT seria 6890 modificat, cu dou cuptoare ,
un autosampler AGILENT seria 7683 Autosampler i injector split/splitless . Pentru separarea
cromatografic s-a optat pentru dou coloane de polariti diferite, prima RXi-MS 30m x
0.25mm x 0.25m (Restek, USA) i cea de-a doua BPX50 1.6m x 0.1m x 0.1m (SGE
Analytical Science, Australia). Temperatura injectorului a fost setat la 250C , iar injectarea
splitless a fost realizat utiliznd heliu ca i gaz purttor cu un debit de 1.2mL/min.
Programul de temperatur a fost realizat, fr modulare, dup cum urmeaz:
cuptor 1 - 80C (2 min), 20C/min to 180C (0 min), 5C/min to 220 C (0min),
25C/min to 300C (11min);
cuptor 2 - 110C (2 min), 20C/min to 210C (0 min), 5C/min to 250C (0 min),
25C/min to 330C (10min).
Volumul de injecie este de 1L. Spectrometrul de mas a operat n modul de ionizare
(EI) i modul de monitorizare full scan pe un domeniu cuprins ntre m/z 40 i m/z 450, cu
energia de ionizare de 70eV i o rat de achiziie de 15 spectre/secund. Linia de transfer a fost
24

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

meninut la 280C, iar temperatura sursei de ioni a fost setat la 220C. n metoda de procesare
i metoda MS mai este precizat un timp de delay, de ntrziere a achiziie de 350s, pentru a se
elimina solventul; o rata de potrivire (match) de minim 70% cu pesticidele din cele 10 librrii de
spectre de care dispune aparatul; un voltaj pe detector de 1700V, care n timp poate fi ridicat
pn la 2000V n funcie de durata de utilizare i uzura detectorului.
n figura 7.6 sunt ilustrate rampele de temperatur pentru cele dou cuptoare, respectiv
linia de transfer i timpul total de analiz ( 29.2 minute).

Figura 7.6 Rampele de temperatur pentru cele dou cuptoare, linia de transfer i timpul
total de analiz ( 29.2 minute)

7.2

ELABORAREA METODEI DE DETERMINARE A REZIDUURILOR DE


PESTICIDE DIN PRODUSE VEGETALE PRIN LC MS QQQ

7.2.1 STUDIUL CARACTERISTICILOR FIZICO-CHIMICE A SUBSTANELOR


ACTIVE
Pesticidele supuse analizei prin LC au fost : 2,4D, azoxistrobin, piraclostrobin, boscalid,
tiofanat metil, ometoat, dimetoat, carbendazim, acetamiprid, fenarimol, penconazol, ciprodinil,
pirimetanil, malation, imidacloprid, metomil tiacloprid, propiconazol, hexitiazox, cimoxanil,
multe dintre ele fiind ca substane secundare n produsele fitosanitare utilizate pentru tratamente.
Din pcate cimoxanilul nu a putut fi analizat ntruct standardul analitic utilizat pentru
optimizarea identificrii i cuantificrii lui a fost total degradat, n plus n mare parte din
literatura de specialitate acest pesticid este catalogat ca nedetectabil ca urmare a structurii sale.
7.2.2 MATERIAL I METOD
Aparatul cu care s-au efectuat analizele LC i studiile LC ale acestei lucrri este un lichid
cromatograf AGILENT dotat cu o pomp cuaternar model 1200, dotat cu autosampler i cuplat
cu un spectrometru de mas de tip triplu cuadrupol AGILENT 6410 cu surs de ionizare de tip
25

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

mod de ionizare multiplu (Multi Mode Ionization sau MMI) ,ionizare ESI i APCI. n elaborarea
metodei LC-MS-QQQ s-a lucrat doar pe ionizare ESI i s-a pornit de la consultarea unei mari
diversiti de metode , punnd accentul pe cteva metode de productor (Agilent) care utilizau
diverse faze mobile cu diveri modificatori . n final, innd cont de parametrii necesari pentru a
realiza o bun separare cromatografic, s-a considerat adecvat s fie aleas ca i modalitate de
lucru separarea cromatografic pe faz staionar invers ( coloana Zorbax XDB C18), folosind
drept faz mobil un amestec de ACN i ap ultrapur cu 0.1% acid formic ca i modificator.
(Thurman , Ferrer, 2005; 2008)

Anumii parametrii pentru sursa de ionizare Multi Mode ionization (MMI) i ionizare ESI
sunt precizai de productor a se stabili la o anumit valoare , cum ar fi presiunea la nebulizator
care ntotdeauna trebuie s fie 60 psi, debitului gazului de uscare meninut ntotdeauna la 5 l/
min.( Agilent Ghidul utilizatorului, 2008)
n subcapitolele urmtoare au fost prezentai civa factori care guverneaz retenia n
cromatografia pe faz invers, unii dintre vor fi prezentai mai n detaliu, n acest rezumat al
tezei., cu exemplificrile situaiilor ntlnite la dezvoltarea metodei de analiz LC-QQQ-MS.
7.2.3 INFLUENA DEBITULUI FAZEI MOBILE ASUPRA SEPARRII
Pentru studiul influenei debitului fazei mobile s-au pstrat toi ceilali parametrii ,
variind doar debitul. inndu-se seama i de indicaiile productorului coloanei , s-au supus
testului debite de 0,6, 0,5 i 0,4 ml/min, n final optndu-se pentru debitul de 0,4 ml/min. Chiar
dac vizibil forma picurilor este aceeai pentru toate debitele studiate, pentru cele mai multe
picuri s-au obinut arii mai mari i nlimi ale picurilor mai bune, factori care conteaz la
stabilirea LOD i LOQ. Pentru o mai bun exemplificare in tabelul 7.2 sunt prezentate
comparative ariile picurilor pesticidelor supuse analizei la debite de 0,6 respectiv 0,4 ml/min.

26

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

Tabelul 7.2. Influena debitului fazei mobile asupra separrii


Pesticid
Metomil
Carbendazim
Pirimetanil
Ometoat
Acetamiprid
Tiofanat metil
Boscalid
Fluquinconazol
Piraclostrobin
Azoxistrobin
Dimetoat
Tiacloprid
Imidacloprid
Malation
Fenarimol

Arie pic
debit 0.4 ml/min
92414
168433
77292
47686
252490
551260
5642
911
738841
1043487
178809
216047
186883
18814
99090

Arie pic
debit 0.6 ml/min
91313
172844
78110
43418
253549
593632
5277
917
650800
895050
175322
209082
183300
19538
104899

7.2.4 INFLUENA COMPOZIIEI FAZEI MOBILE ASUPRA SEPARRII


Lund n calcul indicaiile din literatura de specialitate s-au fcut o serie de modificri
pentru a ajunge la o schema de eluie cu gradient cu care s se obin o separare acceptabil
pentru toate pesticidele supuse analizei.
Iat unul dintre rezultatele optimizrii gradientului ( figura 7.8 ) . Carbendazimul i
ometoatul avnd logP apropiat au tendina s coelueze n prima ncercare de separare , dup care
modificnd treptele de gradient se obine o separare frumoas a celor dou pesticide, ns apar i
alte picuri ale altor pesticide care erau de fapt n soluie ,dar care iniial, nainte de modificarea
de gradient, nici mcar nu au fost identificate. Pesticidele cu logP apropiat, dar mai ales cele
polare, care au eluat primele, au fost o real provocare n ceea ce privete obinerea unei separri
cromatografice bune .

Figura 7.8. Influena gradientului n separarea unui amestec de pesticid


27

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

Schema final de eluie cu gradient este urmtoarea:

7.2.5 INFLUENA pH-ULUI FAZEI MOBILE ASUPRA SEPARRII


n RP-LC controlul pH-ului se realizeaz cu ajutorul soluiilor tampon sau al acizilor. Se
folosesc soluii tampon pe baz de acetat sau formiat de sodiu sau amoniu i acizi ca acid acetic
sau formic.
n figura 7.10 sunt prezentate cele trei modificri ale compoziiei fazei mobile ntreprinse
n dezvoltarea metodei LC , accentul punndu-se pe separarea primelor picuri eluate de pesticide
, care au polariti apropiate i au fost destul de dificil de separat. n prima cromatogram este
ilustrat separarea cu faz mobil avnd: A: ap cu modificator 0,1% acid formic + formiat de
amoniu 5mM i B: acetonitril ; a doua are ca faz mobil A: ap cu modificator 0,1% acid
formic i B: acetonitril cu modificator 0,1% acid formic; a treia cromatogram are ca faz mobil
A: ap cu modificator 0,1% acid formic i B: acetonitril. Trebuie precizat c sunt prezentate
pentru fiecare modificare cele mai bune cromatograme dpdv a separrii primelor pesticide eluate,
i c s-a injectat un amestec de aceeai concentraie n toate cazurile.

28

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

Figura 7.10 Studiul comparativ al modificrii pH-ului fazei mobile prin introducerea unor
modificatori (acid formic i formiat de amoniu)

7.2.6 INFLUENA ANUMITOR PROPRIETI FIZICO-CHIMICE ALE


SUBSTANELOR ACTIVE ASUPRA SEPARRII
Substanele active pot fi grupate n cteva grupe , n funcie de valorile ale
coeficientului de repartiie octanol/ap (logP). Cu un program de eluie cu gradient adecvat i
gruparea pesticidelor pe serii separate de analiz astfel nct s nu fie n aceeai serie mai mult
de dou pesticide care ar putea s coelueze s-a putut realiza o separare cromatografic suficient
de bun . n figura 7.11 sunt prezentate cromatogramele TIC efectuate cu aceeai metod
analitic , n aceleai condiii pentru: A- amestec care conine 25 pesticide la o concentraie de
100 ppb ntr-o singur injecie; B, C,D,E amestecuri de cte 3-8 pesticide, aceleai ca n
amestecul A, la o concentraie de 100 ppb , dar injectate separat, astfel c n final ,nsumate, se
obin tot 25 picuri de pesticide.

29

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

A
=

Figura 7.11 Influena numrului de pesticide dintr-o injectare asupra separrii


Ceea ce este imediat vizibil , sunt ariile picurilor obinute n grupurile separate i
amplitudinea picurilor obinute n urma acestor separri. Deasemenea forma picurilor este
superioar celor obinute la injecia amestecului de 25 de pesticide. Foarte uor pot fi observate
substantele care au coeluat n separarea A la RT 1-2, aprox. 4, dar care puse n grupuri separate
pot aduce cu certitudine o mbuntire la efectuarea analizelor cantitative. Trebuie precizat
deasemenea faptul c picurile largi obinute att n cromatograma A ct i n celelalte, reprezint
coeluii de 2 pesticide , iar n cazul cromatogramei A pesticidele care coelueaz la RT aprox 4
sunt n numr de 3( acetamiprid, imidacloprid, metomil).
7.2.7 CONDIII FINALE DE DETERMINARE A REZIDUURILOR DE PESTICIDE
PRIN LC- MS- QQQ
Metoda de analiz final elaborat pentru LC-MS-QQQ n scopul determinrii reziduurilor
de pesticide din legume i fructe are urmtorii parametrii:
30

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

Parametrii LC:

Parametrii MS:

Coloan cromatografic: Zorbax

Sursa de ionizare: ESI


Mod de ionizare : pozitiv
Energie de fragmentare :
specific fiecrui pesticid 70120 V
Energie de coliziune : specific
fiecrui pesticid 5-20 eV
Tensiune pe capilar : 2500V
Temperatura gazului n sursa
de ionizare: 350C
Presiune nebulizator : 60 psi
Debitului gazului de uscare : 5
L/min
Gaz pentru nebulizare,
desolvatare i coliziune: azot

Eclipse XDB-C18, 4.6x50mm


1.8 micron
Debit de faz mobil: 0,4
ml/min
Temperatura coloanei:
ambiental ( 25C)
Volum de injecie: 10L
Faz mobil: A: Ap + 0.1%
acid formic ; B: Acetonitril
Gradient de eluie:
Timp
min
0
28
30
31
33
35

B
%
20
80
100
100
20
20

7.3 ELABORAREA METODEI DE ANALIZ MONOREZIDUAL A 2,4 D PRIN LCMS-QQQ


Erbicid selectiv, 2,4 D, este

folosit pentru a proteja culturile de cereale mpotriva

buruienilor foioase. Acesta este, de asemenea, aplicat ca stimulator de cretere n timpul creterii
plantelor (roii), i post-recoltare pentru pentru protecia fructelor ,n special a citricelor.
Roiile este considerate una dintre culturile cele mai sensibile n ceea ce privete 2,4-D i
derivaii lui. Ca i stimulator de cretere se aplic n doze subletale variind ntre 0.42 - 13.44 g
s.a /ha direct pe plante, n diferite stadii de cretere, de la nceputul nfloririi.
7.3.1 MATERIAL I METOD
Instrumentul de analiz este un lichid cromatograf Agilent 1200 , dotat cu pomp
cuaternar i autosampler Agilent, i cuplat cu un spectrometru de mas triplucuadrupol QQQ
Agilent 6410 , cu surs de ioni de tip MMI ( Multi Mode Ionization).

31

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

n subcapitolele urmtoare se trateaz cu exemplificri de pe parcursul dezvoltrii


metodei, civa factori care influeneaz determinarea pesticidului 2,4D.
7.3.4 INFLUENA TEMPERATURII ASUPRA SEPARRII
Temperatura este un parametru important al separrii cromatografice. Foarte bine
ilustrat este influena sa n analiza 2,4D, forma picului obinut fiind vizibil determinat de
temperatur ( figura 7.14 ), valorile temperaturii comparate fiind 25, 30 i 40C, temperatur
final de analiz a 2,4D a fost stabilit la 25 C. (Agilent Ghidul Utilizatorului, 2008)
7.3.5 INFLUENA VOLUMULUI DE PROB INJECTAT ASUPRA SEPARRII
Obinerea unor picuri splitate sau dublate, deasemenea a unor picuri largi au printre
factori determinani i volumul de prob injectat.
A)Temperatura
coloanei 25C
A)Volum de
injecie 5l

B) Temperatura
coloanei 30C

B) Volum de
injecie 10l

C) Temperatura
coloanei 40C

7.3.7CONDIII FINALE DE DETERMINARE A REZIDUURILOR DE 2,4D PRIN


LC-MS-QQQ
Coloana : Zorbax Eclipse XDB-C18, 4.6x50mm 1.8 micron
Faza Mobil:
B: 95% ACN+0.1% HCOOH
A: 5% H2O+0.1%HCOOH
Debit FM : 0.5 ml/min, regim izocrat
Temperatur coloan : ambiental ( 25C)
32

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

Tip ionizare: ESI negativ Tensiune pe capilar : 2500V


Temperatura gazului n sursa de ionizare: 350C
Presiune nebulizator : 60 psi
Debitului gazului de uscare : 5 L/min
Gaz pentru nebulizare, desolvatare i coliziune: azot
Energie de fragmentare: 70eV
Energii coliziune :
Tranziia 219161, 10eV
Tranziia 219125 , 25eV
Volum injecie: 5L
Timp total de analiz : 3 minute

CAPITOLUL 8. VALIDAREA ANALITIC A METODELOR MULTIREZIDUALE GC


I LC PENTRU DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME,
FRUCTE I SOL
n acest capitol s-a prezentat validarea metodelor de analiz i extracie elaborate pe diverse
matrici astfel:

Metoda GC-TOF-MS cu metoda de extracie Mini-Luke modificat a fost validat pentru


roii i struguri

Metoda GC-TOF-MS cu metoda de extracie cu PSA a fost validat pentru sol

Metoda LC-QQQ-MS cu metoda de extracie QuEChERS modificat a fost validat


pentru ardei iui

8.1 CRITERII DE VALIDARE PENTRU GC CONFORM DG SANCO APLICATE PE


LEGUME, FRUCTE I SOL
Dei solul nu este o matrice ncadrat n ghidul DG SANCO, n validarea metodei GC
pentru sol s-au luat n consideraie cerinele DG SANCO/12495/2011.
In conformitate cu ghidul DG SANCO 12495/2011 i DG SANCO 12571/2013,
implementat la 01/01/2014 s-au verificat urmtoarele criterii de validare pentru fiecare matrice
reprezentativ din grupurile de matrici conform DG SANCO, respectiv sol i pentru fiecare
analit: liniaritate,efect de matrice, LOD, LOQ, specificitate, repetabilitate, reproductibilitate,
incertitudine de msurare.

33

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

Concluziile privind validrile efectuate sunt prezentate n succinct n cele ce urmeaz.


- n urma validrii pe roii i struguri a metodei GC cu extracia Mini-Luke modificat se
pot puncta cteva concluzii:

din cele 85 de pesticide supuse validrii pe roii metoda a fost validat pentru 67
de pesticide, doar acestea ndeplinind toi parametrii de acceptabilitate conform
DG SANCO/12495/2011

din cele 85 de pesticide supuse validrii pe struguri metoda a fost validat pentru
61 de pesticide, doar acestea ndeplinind toi parametrii de acceptabilitate
conform DG SANCO/12495/2011

Metoda GC cu extracia PSA specific a fost total validat n sol pentru 60 de pesticide
din 88 propuse pentru validare, din toate clasele chimice.

Metoda de analiz LC cu metoda de extracie QuEChERS modificat a fost validat


pentru un numr de 28 de pesticide din 32 supuse validrii n matricea ardei iui

CAPITOLUL 9 . DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME


I FRUCTE
Tehnica de stropire a fost preluat de la majoritatea persoanelor fr o calificare n
domeniul proteciei plantelor, care i trateaz plantele de cele mai multe ori peste doza
recomandat i stropindu-le n exces (de fapt mbindu-le) folosind un vermorel. n prezentul
studiu, dozele utilizate au fost n concordan cu cele recomandate de productorul produselor
fitosanitare. Cu toate acestea , faptul c produsul este aplicat n exces pe plant, chiar i la doza
recomandat ,va avea ca efect obinerea unor concentraii mai mari de substan activ (pesticid)
Probele au fost cuantificate pe curbe de calibrare n solvent, fiecrui pesticid analizat
fiindu-i prezentat curba de calibrare. Probele a cror coninut depete valoarea maxim din
curba de calibrare, au fost diluate cu solventul de reluare, factorul de diluie fiind specificat
pentru fiecare pesticid n parte.
Rezultatele obinute sunt prezentate sub forma unor grafice comparative care cuprind tehnica de
analiz (GC i/sau LC) i metoda de extracie( Mini-Luke modificat i/sau QuEChERS
modificat )

pentru fiecare pesticid. Deasemenea , sunt construite grafice de degradare a

pesticidelor cuprinznd valorile extraciilor Mini-Luke modificat pentru GC , respectiv


QuEChERS modificat la LC la 3, 10 i 15 zile.
34

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

9.1

DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN ROII CHERRY

9.1.1 METODA MULTIREZIDUAL GC-TOF-MS


n 2012 s-au supus studiului pentru matricea roii Cherry ,urmtoarele pesticide:
fenarimol, azoxistrobin, boscalid, malation, ciprodinil, penconazol, dimetoat, pirimetanil,
bifentrin, bromopropilat, captan, folpet, clorotalonil, dicofol, iprodion, procimidon, metalaxil .
n 2013 s-au adugat studiului alte pesticide: fludioxonil, miclobutanil.
Probele au fost cuantificate pe curbe de calibrare n solvent izooctan:toluen 9:1, fiecrui
pesticid analizat fiindu-i prezentat ecuaia curbei de calibrare. Probele a cror coninut
depete valoarea maxim din curba de calibrare, au fost diluate cu solventul de reluare, acest
lucru fiind specificat pentru fiecare pesticid n parte, iar pentru raportarea rezultatelor n mg/kg sa aplicat un factor de corecie , n funcie de metod i cantitate de extract organic rmas dup
toate etapele de prelucrare, ns n graficele comparative i curbe comparative rezultatele
corectate sunt exprimate ca i ppb.
Curbele de calibrare au fost construite la 7 nivele de calibrare, respectiv 0,01-0,03-0,06-0,090,27-0,54-0,81 g/ml.
Secvena de lucru este constituit din o injectare la fiecare nivel de calibrare , urmat de
probele de roii supuse analizei, o prob martor mbogit la nivel de 0,05 g/ml ( 50ng/ml)
pentru fiecare din cele dou metode de extracie i se ncheie cu o noua serie de injectri din
curbele de calibrare. Astfel fiecare nivel de calibrare e constituit din 2 puncte.
Fiecare pesticid este identificat i cuantificat cu minim 3 rapoarte m/z, cu o similaritate
cu librriile de spectre ( n numr de 10) de minim 70% i deasemenea fiecruia i se va stabili
metoda de extracie optim folosind programul statistic GraphPad InStat , aplicnd orientativ, un
calcul statistic ( testul t n perechi), definitorie fiind rata de recuperare obinut, iar n unele
cazuri se vor consulta i valorile LOQ i picurile cromatografice obinute.
9.1.2 METODA MULTIREZIDUALA LC-MS-QQQ
n 2012 s-au supus studiului pentru matricea roii Cherry ,urmtoarele pesticide:
fenarimol,

azoxistrobin,

boscalid,

malation,

ciprodinil,

penconazol,

dimetoat,

pirimetanil,ometoat, acetamiprid, tiofanat metil,imidacloprid, metomil, carbendazim.


n 2013 s-au adugat studiului alte pesticide: fenhexamid, miclobutanil, propiconazol,
piraclostrobin, tiacloprid.

35

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

Probele au fost cuantificate pe curbe de calibrare n solvent acetonitril: ap 50:50, fiecrui


pesticid analizat fiindu-i prezentat ecuaia curbei de calibrare n tabelul 9.1.2. Probele a cror
coninut depete valoarea maxim din curba de calibrare, au fost diluate cu solventul de
reluare,acest lucru fiind specificat pentru fiecare pesticid n parte i deasemenea a fost aplicat un
coeficient de corecie pentru a exprima cantitile obinute n mg/kg, n funcie de metod i
cantitatea de extract organic obinut dup prelucrare .
Pentru pesticidele carbendazim , boscalid, ciprodinil, malation, imidacloprid, metomil au fost
construite curbele de calibrare pe 5 nivele de calibrare, respectiv 0,01-0,025-0,05-0,1 i 0,25
g/ml. Pentru pesticidele tiofanat metil, piraclostrobin, azoxistrobin, fenarimol, propiconazol,
tiacloprid, acetamiprid, dimetoat , ometoat, au fost construite curbele de calibrare pe 5 nivele de
calibrare, respectiv 0,01-0,025-0,05-0,14 i 0,25

g/ml. Pentru pesticidele miclobutanil,

pirimetanil i fenhexamid au fost construite curbele de calibrare pe 4 nivele de calibrare,


respectiv 0,02-0,05-0,1 i 0,4 g/ml, iar pentru penconazol a fost construit curba de calibrare pe
5 nivele de calibrare, respectiv 0,006-0,015-0,03-0,06 i 0,15 g/ml.
Secvena de lucru este constituit dintr-o injectare la fiecare nivel de calibrare , urmat de
probele de roii supuse analizei , o prob martor mbogit la nivel de 0,05 g/ml pentru fiecare
metod de extracie i nc o injectare la fiecare nivel de calibrare. Astfel fiecare nivel de
calibrare este constituit din 2 puncte. Fiecare pesticid este identificat i cuantificat prin dou
tranziii, (una de cuantificare i a doua de confirmare), i deasemenea fiecruia i se va stabili care
dintre cele dou metode de extracie este optim folosind pentru aceasta un program statistic
GraphPad InStat i aplicnd un calcul statistic ( testul t n perechi) orientativ, definitorie fiind
rata de recuperare obinut pentru fiecare pesticid.
9.1.3 STUDIU COMPARATIV 2 metode de extracie/2 metode de analiz
Au fost comparate cele dou metode de extracie QuEChERS tamponat modificat i
Mini-Luke modificat i cele dou metode de analiz GC-TOF-MS i LC-QQQ-MS. Definitorii
n alegerea celei mai eficiente metode de extracie i de analiz sunt ratele de recuperare obinute
n urma mbogirii( fortificrii) unei probe martor la nivel de 0,05g/ml i prelucrrii prin cele
dou metode de extracie , apoi dac este nevoie se vor compara forma picurilor obinute i
amplitudinea lor i orientativ se va aplica din programul statistic GraphPad InStat, testul
ANOVA- Bonferroni ( analiza de varian) .

36

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

Pesticidele analizate comparativ n roii Cherry cu cele 4 combinaii metod


extracie/metod analiz au fost: fenarimol, azoxistrobin, boscalid, malation, ciprodinil,
penconazol, dimetoat, pirimetanil, miclobutanil, fenhexamid i piraclostrobin.
9.1.4.8 CONCLUZII REZIDUURILE DE PESTICIDE DIN ROII CHERRY
Concluziile privind eficiena combinaiilor folosite n aceast matrice sunt formulate
succint sub forma unui tabel .
Tabel 9.1.3 Eficiena metodele de extracie i analiz pentru pesticidele din roii Cherry,
conform studiului efectuat
LC QuEChERS modif

LC Mini-Luke modif

GC QuEChERS modif

GC Mini-Luke modif

Acetamiprid
Tiofanat metil
Carbendazim
Metomil
Imidacloprid
Propiconazol
Tiacloprid
Ciprodinil
Penconazol
Dimetoat
Pirimetanil
Miclobutanil
Piraclostrobin
Fenhexamid

Tiofanat metil
Carbendazim
Fenarimol
Azoxistrobin
Boscalid
Penconazol

Bifentrin
Bromopropilat
Dicofol
Folpet
Iprodion
Procimidon
Fludioxonil
Ciprodinil
Pirimetanil
Miclobutanil
Fenhexamid

Bifentrin
Bromopropilat
Captan
Clorotalonil
Dicofol
Folpet
Iprodion
Procimidon
Metalaxil
Fludioxonil
Fenarimol
Malation
Pirimetanil

n aceast matrice s-au identificat i cuantificat 5 metabolii ai pesticidelor cu care s-au


efectuat tratamentele fitosanitare ( tetrahidroftalimida, ftalimida,4,4diclorobenzofenon,
tiofosgen ,ometoat ) i s-au identificat aproximativ 10 ali metabolii, fiind prezentai doar cei
mai importani i care au avut o similaritate mare cu librriile de spectre: 3,5 Dicloroanilinei, p,p
Dibromobenzofenonei, 2,4 Diclorobenzofenon, 3,4 Diclofenil izocianat.
n ceea ce privete depirea LMA, innd cont de condiiile de efectuare a tratamentelor
fitosanitare i de condiiile climatice, un numr de 5 pesticide au avut depiri ale LMA dup
timpul de pauz recomandat.
9.1.5 METODA MONOREZIDUALA LC-MS-QQQ PENTRU 2,4 D N ROII
n prezentul studiu s-a dorit observarea persistenei acestui ierbicid ca i stimulator de
cretere, n acest scop fiind preparat o soluie de 0,2% de produs DMA numit i sare de amin
, n care s-au nmuiat florile de roii iar dup fructificare i fructele verzi, ultima tratare fiind
aproximat s fie efectuat nainte cu 2 sptmni de coacere. Au fost recoltate probe dup
37

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

coacerea roiilor tratate, au fost mcinate i depozitate la -18C. Din pcate, nu s-a putut efectua
analiza acestor probe, putnd dezvolta doar metoda de analiz , construite curbele de calibrare n
solvent i matrice i analizarea a 3 probe martor fortificate la 0,5 g/ml pentru calcularea unor
rate de recuperare, dup care s-a produs o defeciune a unui echipament auxiliar al LC (
generatorul de azot) , ceea ce a determinat amnarea acestei pri din studiu i evident a obinerii
unor rezultate n ceea ce privete coninutul de 2,4D din probele de roii tratate.
Calibrarea n solvent s-a efectuat pe 5 nivele de calibrare, i anume 0,016-0,048-0,0960,288-0,576 g/ml, cu dou injecii n fiecare nivel de calibrare. Calibrarea n matrice (roii ) s-a
efectuat pe 5 nivele de calibrare, mai sczute ca i concentraie dect n solvent i anume 0,00990,0247- 0,0495-0,148-0,297 g/ml, fiecare nivel de calibrare fiind format din 3 injecii.
Ratele de recuperare obinute ( 65%) sunt satisfctoare avnd n vedere modul de
extracie al acestui pesticid i alte rezultate raportate n literatur, acestea situndu-se de la
nedetectat (Pizzutti, 2009) la 104% (Klein&Alder , 2003) n diverse matrici printre care i roii.
9.2

DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN CASTRAVEI

9.2.1 METODA MULTIREZIDUALA GC TOF- MS


n 2012 s-au supus studiului pentru matricea Castravei Cornion ,urmtoarele pesticide:
fenarimol, azoxistrobin, boscalid, malation, ciprodinil, penconazol, dimetoat, pirimetanil,
bifentrin, bromopropilat, captan, folpet, clorotalonil, dicofol, iprodion, metalaxil.
n 2013 s-au adugat studiului alte pesticide: fludioxonil, fenhexamid i piraclostrobin.
Curbele de calibrare au fost construite la 7 nivele de calibrare, respectiv 0,01-0,02-0,05-0,1-0,20,5-0,8 g/ml.
Secvena de lucru este constituit dintr-o injectare la fiecare nivel de calibrare , urmat de
probele de castravei supuse analizei i se incheie cu o prob martor mbogit la nivel de 0,05
g/ml ( 50ng/ml) pentru fiecare din cele dou metode de extracie , astfel fiecare nivel de
calibrare e constituit dintr-un singur punct.
Cuantificarea probelor i identificarea pesticidelor s-a realizat n acelai mod ca i la
roii Cherry.

38

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

9.2.2 METODA MULTIREZIDUAL LC-MS-QQQ


n 2012 s-au supus studiului pentru matricea Castravei Cornion ,urmtoarele pesticide:
fenarimol, azoxistrobin, boscalid, ciprodinil, penconazol, dimetoat, ometoat, acetamiprid,
tiofanat metil, imidacloprid, metomil, carbendazim.
n 2013 s-au adugat studiului alte pesticide: fluquinconazol, piraclostrobin, tiacloprid
Curbele de calibrare au fost constuite pe 5 nivele, pentru penconazol la nivele 0,0060,015-0,03-0,06 i 0,15 g/ml,iar pentru toate celelalte pesticide nivelele de calibare au fost
0,01-0,025-0,05-0,1-0,25 g/ml.
Secvena de lucru este constituit dintr-o injectare la fiecare nivel de calibrare , urmat de
probele de castravei supuse analizei i n final o prob martor mbogit la nivel de 0,05 g/ml
pentru fiecare metod de extracie, fiecare nivel de calibrare fiind constituit dintr-un singur
punct.
Cuantificarea probelor i identificarea pesticidelor s-a realizat n acelai mod ca i la roii
Cherry.

9.2.3 STUDIU COMPARATIV (2 metode de extracie / 2metode analiz )


S-au supus studiului comparative urmtoarele pesticide: fenarimol, azoxistrobin,
boscalid, ciprodinil, penconazol, dimetoat i piraclostrobin.
Nivele de calibrare i secvena de analiz sunt asemntoare cu cele prezentate mai sus
pentru pesticidele determinate prin

LC i GC, iar cuantificarea probelor i identificarea

pesticidelor s-a realizat n acelai mod ca i la roii Cherry.

9.2.5 CONCLUZII REZIDUURILE DE PESTICIDE DIN CASTRAVEI


Au fost identificai i cuantificai 4 metabolii ai pesticidelor utilizate pentru tratamentele
fitosanitare, respective, tetrahidroftalimida, ftalimida, 4,4 diclorobenzofenonei i ometoatul.
Limitele maxime admise au fost depite pentru un numr de 6 pesticide , respectiv
bromopropilat, captan, folpet, dicofol, procimidon i tiofanat metil.
Concluziile privind eficiena combinaiilor folosite n aceast matrice sunt formulate
succint sub forma unui tabel .

39

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

Tabel 9.2.8 Metodele eficiente de extracie i analiz pentru pesticidele din castravei
Cornion, conform studiului efectuat
LC QuEChERS modif
Acetamiprid
Tiofanat metil
Imidacloprid
Carbendazim
Fluquinconazol
Fenarimol
Azoxistrobin
Boscalid
Ciprodinil
Penconazol
Piraclostrobin

LC Mini-Luke modif
Fluquinconazol
Dimetoat

GC QuEChERS modif
Pirimetanil
Dicofol
Metalaxil
Fludioxonil
Procimidon
Fenarimol
Boscalid
penconazol

GC Mini-Luke modif
Malation
Bifentrin
Bromopropilat
Captan
Folpet
Clorotalonil
Iprodion
Ciprodinil

9.3 DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN ARDEI IUTI


9.3.1 METODA MULTIREZIDUALA GC-TOF-MS
Studiul s-a desfurat pe durata a doi ani 2012 i 2013 , supunndu-se analizelor pentru
matricea Ardei iui soi Chayenne urmtoarele pesticide: fenarimol, azoxistrobin, boscalid,
ciprodinil, penconazol, dimetoat, bromopropilat, captan, folpet, clorotalonil, fludioxonil
Curbele de calibrare au fost construite la 4 nivele de calibrare, respectiv 0,01-0,05-0,20,8 g/ml.
Secvena de lucru este constituit din o injectare la fiecare nivel de calibrare , urmat de
probele de ardei iui supuse analizei ,o prob martor mbogit la nivel de 0,05 g/ml ( 50ng/ml)
pentru fiecare din cele dou metode de extracie i n final nc o injectre la toate nivelele de
calibrare, astfel fiecare nivel de calibrare e constituit din 2 puncte.
Cuantificarea probelor i identificarea pesticidelor s-a realizat n acelai mod ca i la
probele prezentate anterior.
9.3.2 METODA MULTIREZIDUAL LC-MSQQQ
n 2012 i 2013 timp n care s-a derulat acest studiu , pentru matricea Ardei Iui
Chayenne s-au analizat urmtoarele pesticide: fenarimol, azoxistrobin, boscalid, ciprodinil,
penconazol, dimetoat, metomil , fluquinconazol, piraclostrobin, tiofanat metil, acetamiprid,
fenhexamid, ometoat, imidacloprid, carbendazim, miclobutanil.
Curbele de calibrare au fost constuite pe 5 nivele de calibrare i anume 0,01-0,04-0,1-0,2- 0,4
g/ml.
40

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

Secvena de lucru este constituit dintr-o injectare la fiecare nivel de calibrare , urmat de
probele de ardei supuse analizei i n final o prob martor mbogit la nivel de 0,04 g/ml
pentru fiecare metod de extracie, fiecare nivel de calibrare fiind constituit dintr-un singur
punct.
9.3.3 STUDIU COMPARATIV (2 metode de extracie / 2metode analiz )
Pesticidele analizate compatrativ pentru matricea ardei iui au fost: ciprodinil, boscalid,
penconazol, fenarimol, dimetoat, azoxistrobin.
Nivele de calibrare i secvena de analiz sunt asemntoare cu cele prezentate mai sus
pentru pesticidele determinate prin

LC i GC, iar cuantificarea probelor i identificarea

pesticidelor s-a realizat n acelai mod ca i la matricile prezentate anterior.


9.3.5CONCLUZII - REZIDUURILE DE PESTICIDE DIN ARDEI IUI
Au fost identificai i cuantificai 4 metabolii ai pesticidelor utilizate pentru tratamentul
fitosanitar al ardeilor iui i au fost identificai ali 3 metabolii fr a avea ns sufuciente date
pentru cuantificarea lor: 1,2,4 triazol ( metabolit al miclobutanilului sau fluquinconazol)
identificai la RT 1190,3s i RT 649,5s , glicina la RT 427,98s posibil produs de degradare al
cimoxanilului, pesticid care nu a fost analizat , dar cu care s-au efectuat tratamente i metabolitul
acid al azoxistrobinului.
Din punctul de vedere al respectrii LMA, un numr de 4 pesticide au avut valori peste
cele stabilite de normele europene n domeniu, dar trebuie avute n vedere i condiiile de
efectuare a tratamentelor i cele climatice.
O parte dintre aceste concluzii pot fi regsite ntr-o form restrns n tabelul 9.3.9.
Tabel 9.3.9 Metodele eficiente de extracie i analiz pentru pesticidele din ardei iui
Chayenne, conform studiului efectuat
LC QuEChERS modif
Metomil
Piraclostrobin
Acetamiprid
Imidacloprid
Carbendazim
Miclobutanil
Ciprodinil
Boscalid
Azoxistrobin

LC Mini-Luke modif
Ciprodinil
Penconazol

GC QuEChERS modif
Folpet
Brompropilat
Fludioxonil
Dimetoat

41

GC Mini-Luke modif
Clorotalonil
Captan
Boscalid
Fenarimol

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

9.4 DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN SALAT


La aceast matrice s-a introdus n metodele de extracie i etapa de purificare cu GBC ca
o consecin a ncrcrii foarte mari cu clorofil a extractelor organice obinute dup extracie,
indiferent care ar fi aceasta. Din aceste considerente pentru aceast matrice s-a efectuat un singur
tratament fitosanitar, dup care s-au fcut prelevri de probe la 3 zilei 10 zile.
Analiza instrumental pe GC s-a efectuat att pe extracte purificate ct i extracte
nepurificate, diferena ntre rezultatele obinute fiind la unele pesticide foarte mare ca urmare a
reinerii unei cantiti din acestea pe crbunele activ. Prin LC s-a analizat o singur prob fr
purificare ( restul fiind purificate cu GBC), i anume probele prelevate la 3 zile, pentru a evita
colmatarea coloanei cromatografice i a impurifica ntregul sistem MS.
Pentru cuantificarea reziduurilor de pesticide din salat s-au folosit aceleai curbe de
calibrare n solvent ca i la ardei, aceste dou matrici mpreun cu strugurii fiind analizate n
aceeai secven, att n cazul GC ct i LC.
Nivele de calibrare i identificarea pesticidelor sunt aceleai ca i la matricea ardei iui.
9.4.1 METODA MULTIREZIDUAL GC-TOF- MS
Pesticidele analizate prin GC n aceast matrice sunt : bifentrin, captan, folpet ,
brompropilat, boscalid , penconazol i dimetoat .
9.4.2 METODA MULTIREZIDUAL LC-MS- QQQ
Prin LC pentru matricea salat s-au analizat pesticidele

: acetamiprid, metomil,

piraclostrobin i tiofanatul metil, boscalid, penconazol, i dimetoat


9.4.3 STUDIU COMPARATIV (2 metode de extracie / 2metode analiz )
n studiul comparativ s-au analizat pesticidele: boscalid, penconazol, i dimetoat
9.4.5CONCLUZII - REZIDUURILE DE PESTICIDE N SALAT
Valorile LMA au fost depite n 4 cazuri, la unele dintre pesticide sugerndu-se un timp
de pauz ntruct acestea nu erau omologate pentru aceast matrice , dar pot fi ntlnite
accidental n ea ca urmare a efecturii de tratamente fitosanitare n sere care cuprind mai multe
culturi, pentru care produsele fitosanitare respective sunt omologate.
n salat nu s-a urmrit cu precdere cuantificarea metaboliilor identificai deoarece
substanele active din care provin nu sunt omologate pentru salat i nu apar dect accidental n
aceast matrice, aceti metabolii fiind: tetrahidroftalimida i ftalimida.
42

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

n tabelul 9.4.5 sunt prezentate restrns cteva din concluziile prezentate mai sus.
Tabel 9.4.5 Metodele eficiente de extracie i analiz pentru pesticidele din salat,
conform studiului efectuat
LC QuEChERS modif
Piraclostrobin
Penconazol

LC Mini-Luke modif
Acetamiprid
Tiofanat metil
Boscalid
Dimetoat

GC QuEChERS modif
Bifentrin
Captan
Bromopropilat
Folpet

9.5 DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN STRUGURI


Analizele s-au efectuat n 2013, utiliznd ca i metod de extracie pentru LC doar
metoda QuEChERS modificat, iar pentru GC s-au efectuat ambele extracii. S-a efecutat un
singur tratament fitosanitar, n luna august cnd strugurii erau copi n proporie de 30%,cu
produse specifice pentru a fi aplicate n aceast faz fenologic, n special pentru combaterea
putregaiului cenuiu.
Metoda GC validat pe struguri a fost utilizat i pentru determinarea pesticidelor dintr-o
varietate de tipuri de vinuri albe, metoda de extracie folosit pentru a extrage reziduurile de
pesticide din vinuri fiind metoda Mini-Luke modificat, aceste rezultate nefiind prezentate n
aceast tez , dar fac subiectul unui articol.
Pentru cuantificarea reziduurilor de pesticide din salat s-au folosit aceleai curbe de
calibrare n solvent ca i la ardei, aceste dou matrici mpreun cu strugurii fiind analizate n
aceeai secven, att n cazul GC ct i LC.
Nivele de calibrare i identificarea pesticidelor sunt aceleai ca i la matricea ardei iui.
9.5.1 METODA MULTIREZIDUAL LC-MS-QQQ
Pesticidele supuse studiului prin aceast metod sunt fenhexamid, tiofanat metil i
hexitiazox, acesta din urm neputnd fi cuantificat ca urmare a valorii prea ridicate a LOQ.
9.5.2 METODA MULTIREZIDUAL GC-TOF-MS
Pesticidele determinate prin aceast metod au fost ciprodinil i procimidon , dou dintre
cele mai uitlizate pesticide pentru combaterea putregaiului cenuiu ( botrytis cinerea ) la struguri.

43

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

CAPITOLUL 10. CONCLUZII FINALE


Aceast tez de doctorat i-a propus ca obiectiv principal elaborarea de metode de
extracie i analiz pentru a determina relaia dintre acumularea, degradarea i remanena
pesticidelor n probele supuse studiului . Problema este abordat ntr-o maniera multidisciplinar,
sub forma unui studiu complex.
Problemele ridicate de acest studiu precum i obiectivele sunt n strns concordan cu
mai multe obiective i prioriti ale unui program cu finanare Sapard al Uniunii Europene care a
vizat printre altele nfiinarea n 2008 a unui Laborator Zonal pentru Determinarea Reziduurilor
de Pesticide din Plante i Produse Vegetale la Unitatea Fitosanitar Mure din Trgu Mure ,
acesta fiind i locaia n care s-au efectuat toate experimentele i analizele din prezenta tez.
Elementele de noutate cele mai importante ale tezei de doctorat sunt:
- elaborarea de noi metode de extracie i analiz i/sau modificarea celor existente n scopul
simplificrii i creterii parametrilor de performan ( ale metodelor de analiz)
- validarea metodelor elaborate pe anumite matrici i folosirea lor n teste de competen
european (prezentate n anex)
- abordarea expunerii matricilor de legume i fructe alese, la 30 de pesticide din mai multe clase
chimice , n condiii normale de concentraie, prin tratamente repetate
- obinerea de date de expunere prin analizarea reziduurilor de substane active ( pesticide) prin
tehnici cromatografice, GC- TOF MS i LC- QQQ MS
- obinerea de date privind metaboliii i produii de degradare rezultai ca urmare a proceselor
metabolice sau a condiiilor de analiz a pesticidelor

Pentru determinarea metodei optime de extracie s-au testat comparativ 5 metode de

extracie pentru legume i fructe i 2 metode pentru sol , aceste metode bazndu-se pe metodele
de extracie QuEChERS tamponat , QuEChERS original, Mini-Luke, Acetat de etil, DIN EN
15637 ( Klein), unele dintre ele fiind modificate n tez

Dup analizarea tuturor datelor obinute s-a concluzionat c metoda de extracie Mini-

Luke modificat i metod de extracie QuEChERS tamponat modificat au oferit rezultate


acceptabile, drept pentru care aceste dou metode de extracie au fost utilizate pentru extracia
reziduurilor a 30 de pesticide i a metaboliilor lor din 5 matrici ( roii Cherry, castravei, ardei
iui, salat i struguri)

44

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

Metoda de analiz GC a fost validat DG SANCO/12495/2011 pe un numr extins de

pesticide, fa de cele selectate pentru studiul reziduurilor de pesticide din probele de legume i
fructe : 60 pesticide n sol, 67 pesticide n roii, 61 de pesticide n struguri, printre acestea
aflndu-se i pesticidele folosite n tratamentele culturilor de pe terenul experimental

Metoda de analiz LC a fost validat pe un numr 28 de pesticide n ardei iui , mai

multe dect cele analizate prin LC n probele supuse studiului reziduurilor de pesticide

Concentraia de reziduuri de pesticide determinat, dup trecerea timpului de pauz, a

fost raportat la LMA stabilit de ctre organismele europene din domeniu i adoptat i de ctre
ara noastr ca stat membru al acesteia.

S-au identificat metabolii i/sau produi de degradare i s-au cuantificat cei mai

relevani ( tetrahidroftalimida, ftalimida, 4,4diclorobenzofenona, tiofosgen, ometoat)

BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.

11.

12.
13.

ICPA. Coduri de bune practice agricole.Agrochimie.Cap.7, 2002


D. Davidescu, L.Calancea , Protecia chimic n agricultur, Editura Academiei Romne,
Bucureti ,1992
E.Grou, M.Cicotti, L.Ghinea, V.Radulescu, E.Goga, Metode pentru determinarea reziduurilor de
produse fitofarmaceutice, Editura Ceres, Bucureti, 1979
C.Bolcu, Scurte considerente pro si contra utilizrii pesticidelor. tiina si Viaa Noastr- Revist
de Informare. Revista 1/2010
Gh.Lixandru,C .Caramete, Cr. Hera Agrochimie, Editura Didactic i Pedagogic, Bucureti,
1990;
T.Baicu, Combaterea integrat a bolilor i duntorilor i limitarea polurii cu pesticide, Editura
Ceres, Bucureti , 1982
L.Ghinea , Gh.tefanic, A.Popescu, G.Oprea , Cercetri n domeniul chimiei i biologiei solului,
an. I.n.c.d.a. Fundulea, vol. Lxxv, volum jubiliar, 2007;
F.Sttescu , Monitorizarea calitatii solului.Ed.Gh. Asachi Iasi, 2003;
F.Moraru, A.Meghean- Breja, Solul Mediu Ecologic, Editura Universitii Petru Maior,
Trgu Mure , 2011
SANCO/12495/2011, Method Validation and Quality Control Procedures for Pesticide Residues
Analysis in Food and feed, Supersedes Document No. SANCO /10648/2009, Inplemented by
01/01/2012, European Commission, Brussels, Belgium
SANCO 12571/2013, Guidance document on analytical quality control and validation procedures
for pesticide residues analysis in food and feed, Supersedes SANCO/12495/2011, Implemented
by 01/01/2014, European Commission, Brussels, Belgium
http://www.eurl-pesticides.eu/ , Method information and validation data (EURL-FV)
Directorate General for Health & Consumers, Pesticide EU-MRLs Regulation (EC) No 396/2005
45

CONTRIBUII LA DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN LEGUME I FRUCTE PRIN


DIFERITE TEHNICI CROMATOGRAFICE
-REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT-

14.
15.
16.

17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.

Directorate General for Health & Consumers, Active substances Regulation (EC) No 1107/2009
http://www.inchem.org/
European Commision Directorate D - Food Safety: production and distribution chain ,D3 Chemicals, Contaminants and Pesticides , Review report for the active substance fenarimol,
2007
J.L. Tadeo, F.J. Schenk and J.W. Wong, Analysis of Pesticides in Food and Environmental
Samples, CRC Press, Taylor &Francis Group, 2008, pp. 152-166
Pesticides Strategies for Pesticides Analysis, 2011, Margarita Stoytcheva .( Ed.), InTech
M.A.Luke, G.M.Doose, Bull.Environ.Contam.Toxicol, 30, 1983, 110
P.A Mills, J.H Onley, R.A Gaither, J. AOAC Int, 46, 1963, 186
Mumma et al, Science, 152, 1966, 530
R.W. Storherr, J.R. Pardue, R.R Watts, J. AOAC Int, 52,1969,522
W.Liao, W.G. Cusick, T.Joe, J.AOAC Int. ,74,1991, 554
S.M. Lee, Fresenius J.Anal.Chem., 339, 1991, 376
J. Fillion, F. Sauve, J. Selwyn, J.AOAC Int., 83, 2000, 698
M. Annastassiades, http://www.QuEChERS.com/
Official method EN 15662:2008.
S.J. Lehotay, AOAC Official Method 2007.01 , J. AOAC Int, 90, No. 2, 2007, pp. 485-520
S.J. Lehotay, K. Mastovska and A.R. Lightfield, J. AOAC Int., 88, 2005, 615.
M. Anastassiades, D. Mack and D. I. Strher, CRL-SRMLAPRW 2009 Santa F/Argentina, 8-11
June ,2009.
S.J Lehotay, J.Hajslova, Trends in analytical chemistry, 21, nos. 9+10, 2002
J.Hajslova and J. Zrostlkova, J. Chromatogr. A, 1000, 2003,181
I.R. Pizzutti, A. de Kok, M. Hiemstra, C. Wickert and O. D. Prestes, J. Chromatogr. A, 1216,
2009 ,4539
A. Meghean Breja, C. Mruoiu, C. Cimpoiu, Revista de Chimie, acceptat pentru publicare
A. Meghean-Breja, C. Cimpoiu, A. Hosu, Acta Chromatografica, acceptat pentru publicare
A. Meghean , A. Csiszer , M.S. Beldean-Galea, T. Hodian, Acta Universitatis Cibiniensis,
Seria F Chemia, 10, 2007, pp 69-73
A. Meghesan Breja, F. Morar, Proceeding of The 6th edition of the Interdisciplinarity in
Engineering International Conference Petru Maior University of Trgu Mures, Romania, 2012
D. Scutaru, Spectrometria de mas, Editura Cermi, 1998
C.M. Torres, , Y. Pico, J. Manes, J. Chromatogr. A. 754. 1996. 301-331.
J. Klein and L. Alder, J. AOAC Int., 86, 2003, 1015.

46