PRCTICAS DE LABORATORIO

Anlisis Microbiolgico y Parasitolgico

rea de Parasitologa
Grupo A: Prof. Teresa Santamarina Fernndez
Grupo B: Prof. Esperanza Paniagua Crespo

PARASITOLOGA:
Prctica 1.
Coprologa parasitaria: Examen macroscpico. Tincin. Tcnica
coprolgica de concentracin. Identificacin de formas parasitarias al
microscopio.
Prctica 2.
Hematologa parasitaria: Identificacin microscpica de formas
parasitarias en preparaciones teidas de sangre. Identificacin
microscpica de formas parasitarias tisulares.
Prctica 3.
Mtodos especiales. Graham, Baerman. Determinacin de formas
parasitarias en muestras ambientales.

ALUMNA/O .................................................................

Prctica 1
Coprologa parasitaria:
- Examen macroscpico de heces:
Visualizacin vdeo (5 min)
La inspeccin directa de las heces es importante, ya que puede conducir a un diagnstico
de infeccin parasitaria, ictericia obstructiva, diarrea, malabsorcin, obstruccin
rectosigmoidea, disentera o colitis ulcerosa, o prdida de sangre en el conducto
gastrointestinal.
a. Debe anotarse la consistencia (especificando si son pastosas, blandas, semilquidas
lquidas duras) y color del excremento (caf, amarillo, rojizo, negruzco, verde, etc.)
b. Detectar en el examen general, manchas de sangre o moco y presencia de restos
alimenticios (grasa.).
c. Detectar macroparsitos: los progltides o adultos de helmintos para identificar
microscpicamente.

- Examen microscpico heces:

Visualizacin vdeo (15 min)
Diversas formas parasitarias microscpicas de protozoos (quistes, trofozotos y ooquistes)
as como huevos y larvas de helmintos pueden ser visualizados mediante su examen
directo o tras ser sometidas las heces a concentracin u otras tcnicas especiales.

- Tinciones:
Tincin con Lugol *1
Mezclar bien el sedimento y transferir una gota a un portaobjetos limpio.
Aadir al portaobjetos una gota de lugol diluido al 20% (1:5) en suero salino y colocar
un cubreobjetos de 20 x 20 mm.
Examinar a 400x.
Con suero fisiolgico, los trofozotos y quistes de los protozoos se observan en forma
natural y con lugol se observan las estructuras internas, ncleos y vacuolas.

Tincin negativa de Heine

Colocar en portaobjetos una pequea cantidad de heces.
Aadir una gota de fucsina bsica fenicada y con ayuda de un palillo, extender y
homogenizar la mezcla.
Secar al aire no ms de 15 min. y examinar a 400x.
Los ooquistes de Cryptosporidium aparecen como pequeas estructuras circulares
refringentes sin teir sobre fondo rojo-fucsia.

Tcnica de tincin de Kato *2: Frotis fecal grueso en celofn

Visualizacin vdeo (1,5 min)
Este mtodo (cualitativo) se basa en la accin que tiene la glicerina como aclarador de los
huevos de helmintos, y el verde de malaquita como colorante de contraste.

Depositar sobre un portaobjetos una pequea cantidad de heces (equivalente a un

grano de arroz).
Cubrir la muestra con el cubreobjetos de celofn de grosor medio, recortado en el
tamao aproximado de un portaobjetos y embebido en solucin de verde de
malaquita al 3 % en glicerol.
Invertir la preparacin, presionar sobre una hoja de papel filtro contra la superficie de
la mesa de trabajo, para lograr la extensin de la muestra hasta cubrir un rea de 20 a
25 mm de dimetro.
Dejar reposar la preparacin con el cubreobjetos de papel celofn hacia arriba durante
una hora a temperatura ambiente o 30 minutos a 34-40C. Esto motivar el aclarado
de las heces, sin que se aclaren los huevos de helmintos. Debe evitarse exceder el
tiempo porque esto dificultara la observacin de los huevos.

- Tcnica coprolgica de concentracin:

CONCENTRADOR PARASITARIO EVERGREEN (Modificacin del mtodo de RITCHIE)
Se emplean muestras frescas o fijadas en formol al 10%, MIF (Mertiolato-iodoformaldehido), PVA (Alcohol polivinlico) o SAF (Formaldehido-acetato sdico). Si las heces
son lquidas, previamente deben centrifugarse a 2000 rpm durante 3-4 minutos, desechar el
sobrenadante y utilizar el sedimento.

Material:

Tubo de 15 ml de fondo plano.

Tubo de 15 ml de fondo cnico.
Tapn de rosca.
Filtro acoplado con tapn doble.
Bandeja perforada para acoplar tubos.
Varilla de algodn.
Pipetas pasteur.
Portas y cubreobjetos.
Centrfuga y balanza.
Microscopio ptico.

Reactivos:
Formol 10 %
Acetato de etilo (txico e inflamable).
Tritn X-100 al 20 %
3

Mtodo:
1. Se agregan 9 ml de formol en el tubo de base plana y se aade una medida de heces (ms
si son fijadas).
2. Se homogeniza la muestra con ayuda de la cucharilla y se deja reposar 30 min, si las heces
son frescas.
3. Se aaden 2-3 gotas de la solucin de tritn para facilitar la homogenizacin y el paso de
la mezcla por el filtro bidireccional.
4. Se agregan 3 ml de acetato de etilo.
5. Se acopla el filtro bidireccional al tubo cnico, disponiendo el tubo de ventilacin a 1,5-2
cm, para igualar presiones.
6. Se enrosca el otro lado del filtro al tubo que contiene la mezcla, asegurndose de que
ambos lados estn bien cerrados.
7. Se agita vigorosamente el conjunto en posicin vertical y con el tubo de fondo cnico
hacia arriba, durante 30-60 segundos. Despus se invierte el conjunto de manera que el
tubo cnico quede abajo esperando hasta que toda la muestra atraviese el filtro, ayudando
con ligera agitacin.
8. Se desenrosca primero el tubo de fondo plano, despus el filtro, y el tubo que contiene
ahora toda la mezcla se enrasa con formol, se tapa con el tapn de rosca y se centrifuga a
2000-2500 rpm durante 3-5 min.
9. Se despega la capa intermedia de desechos slidos con el mango de la varilla y se elimina
el sobrenadante invirtiendo el tubo. Despus se limpian los restos de las paredes con el
algodn de la varilla.
10. Se resuspende el sedimento con unas gotas de formol, SSF, MIF o SAF y se homogeniza.
11. Se pone una gota con la pipeta pasteur entre porta y cubreobjetos y se observa al
microscopio inmediatamente despus.

NOTA: Para Cryptosporidium parvum o Isospora belli el sedimento obtenido se puede emplear:
- En tinciones cido-resistentes de ooquistes, realizando un frotis en capa fina con varias gotas del sedimento
- Para realizar el mtodo de flotacin en azcar de Sheather, sobre el mismo tubo se aade 1 ml de solucin
azucarada, se agita, se deja reposar 3 minuto, se toma una gota de la capa superficial y se examina en busca
de ooquistes.

- Identificacin de formas parasitarias al microscopio

4

Visualizacin de artefactos y restos alimenticios

Fibras musculares: Se presentan en forma de cilindros con estras longitudinales y

transversales.
Grasas neutras: Aparecen como esferas refringentes de diferentes tamaos.
cidos grasos: Se observan como agujas incoloras.
Almidones: Tienen formas irregulares y son refrctiles al agregar el lugol.
Fibras vegetales: Se caracterizan por ser de doble pared, contienen clorofila y poseen
un canal central muy marcado. pelos vegetales, polen etc.
Productos de irritacin de la mucosa: Moco, e observa
en cualquier patologa.
Glbulos Rojos: Su hallazgo indica lesin en la parte baja
del aparato digestivo.
Clulas epiteliales: Indican una excesiva irritabilidad.
Bacterias: Carecen de significacin clnica.
Leucocitos: Si hay gran cantidad indica irritacin
bacteriana.
Cristales de origen alimentario como oxalato de calcio,
medicamentos. Los cristales de Charcot-Leyden se ven
en forma de rombos alargados.

Fecal Microscopy. Artifacts Mimicking Ova and Parasites

http://labmed.ascpjournals.org/content/32/2/80.full.pdf

Visualizacin de formas parasitarias en microscopio virtual

http://www.parasitediagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61E

Observacin de formas parasitarias en microscopio ptico

Examinar al microscopio para detectar la presencia de quistes y huevos. Utilizar el objetivo
seco de 10x barriendo toda la preparacin para la deteccin de huevos y larvas, y el objetivo
de 40x para la identificacin de quistes.
Helmintos: Ascaris, Trichuris, Hymenolepis, Fasciola, Uncinarias, Schistosoma ...
Protozoos: Entamoeba coli, E. histolytica, Giardia, Cryptosporidium, Isospora ...

Prctica 2
Determinacin del tamao de formas microscpicas
- Calibrado del Microscopio

Se instala el micrmetro ocular que presenta una

escala dividida, en sustitucin de un ocular.
Se coloca sobre la platina del microscopio un
portaobjetos gravado con una escala en la que cada
divisin mide 0,01mm (10 m), y se enfoca la escala
con el objetivo 10X.
Se alinea el extremo izquierdo de la escala ocular con
el izquierdo de la escala de platina.
Se busca el lugar ms lejano hacia la derecha en
donde vuelva a coincidir una lnea del micrmetro
ocular con una del micrmetro de la platina.
El nmero de micras indicado por cada divisin de la
escala ocular se calcula mediante la siguiente
frmula:
N de espacios del micrmetro de la platina 10 micras micras

espacio micrmetroocular
N de espacios del micrmetroocular

Repetir para cada objetivo y elaborar una tabla.

Cuantificacin de formas parasitarias para determinar la intensidad

de parasitacin
http://www.thiswormyworld.org/training/operational-procedures-forschistosomiasis-and-sth-diagnostics (Diagnstico de schistosomosis y geohelmintosis)
- Tcnica cuantitativa de Mc Master
Esta tcnica, para el recuento de los huevos de helmintos,
emplea la cmara de Mc Master, y un lquido de flotacin
(solucin sobresaturada de elevada densidad 1.18 a 1.20)
en el que se homogenizan las heces. El volumen bajo el
rea grabada de cada cmara es de 0,15 ml (el rea de
grabado es de 1 cm x 1 cm y la cmara es de 0,15 cm de
profundidad) por lo que el volumen total examinado es de
0,3 ml. Para estimar el nmero de huevos por gramo de
heces, se cuentan el nmero de huevos observados dentro
sobre las lneas de demarcacin y se tiene en cuenta el
nmero de ml totales y los gramos de heces utilizados.
Tambin se aplica a la cuantificacin de larvas de nematodos como T. spiralis.
6

Hematologa parasitaria
- Frotis sanguneo
Frotis fino o Extensin fina
1. Se coloca una gota de sangre cerca de uno de
los extremos de un portaobjetos.
2. Se extiende la sangre con el arista de otro
porta con un ngulo de unos 40.
3. Se deja secar completamente la muestra y
despus se tie.
Gota gruesa
1. Se colocan 3 gotas de sangre en el centro de un portaobjetos.
2. Se extiende la sangre con la arista de otro porta, haciendo un movimiento en Z o en N.
3. Se deja secar completamente la muestra y despus se tie.

Visualizacin vdeo de elaboracin de frotis (8 min)

http://www.youtube.com/watch?v=hxO_Nlr0DFI

- Identificacin de formas parasitarias al microscopio

Visualizacin de formas parasitarias en microscopio virtual

http://www.parasitediagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61E
http://www.cdc.gov/dpdx/resources/pdf/benchAids/malaria/Pfalciparum_benchaidV2
.pdf

Visualizacin de formas parasitaria en microscopio ptico

Helmintos: Filarias (Wuchereria bancrofti, Brugia malayi , Loa loa y Mansonella spp.)
Protozoos: Plasmodium spp. y Trypanosoma spp.

Identificacin microscpica de formas parasitarias tisulares

- Identificacin de formas parasitarias al microscopio
Visualizacin de formas parasitarias en microscopio virtual

http://www.parasitediagnosis.ch/virtualmicroscope;jsessionid=6ECA4AE8AA0AAEB4E629FF0755EFD61E
http://www.cdc.gov/dpdx/resources/pdf/benchAids/Oncho_Mansonella_benchaid_w
ho.pdf

Visualizacin de formas parasitaria en microscopio ptico

Helmintos: Trichinella, Schistosoma spp., Taenia solium, Onchocerca volvulus
Protozoos: Leishmania sp. y Trypanosoma cruzi

Prctica 3
Mtodos especiales
- Mtodo de Graham
Apropiado para el diagnstico de la Enterobiosis determinando la
existencia de huevos del nematodo en los mrgenes anales.

Visualizacin vdeo (2 min)

- Mtodo de Baerman
Apropiado para el diagnstico de Strongyloides (basndose en la termofilia, geofilia e
hidrofilia de sus larvas).

Se toman 5 a 10 g de heces
La muestra se deposita sobre una capa de gasa, la cual a su vez, ser
dispuesta en un colador corriente colocado en un embudo a cuya
extremidad se le conecta un tubo de goma, sellado en su extremo
libre por una pinza de Mohr.
Se llena el embudo con solucin salina a 37C de manera de que sta
entre en contacto con la materia fecal.
Se mantiene el conjunto durante 12-24 h. Para muestras con
muchas larvas bastarn 30-60 min.
El calor estimula la motilidad de las larvas, las cuales van a salir del
seno de las heces por su propiedad higrotrpica para concentrarse en
el extremo inferior del tubo de goma.
Se toma una gota del fondo del tubo para su observacin al
microscopio con aumento de 10X.
En caso de que sean escasas las larvas podemos realizar la
centrifugacin del lquido recogido en tubo.

Se aplica tambin para el aislamiento de larvas de Trichinella,

cuantificando dichas larvas con la cmara de Mc Master.

Determinacin de formas parasitarias en muestras ambientales

- Mtodo de Flotacin en muestras de tierra.
Materiales y reactivos

Bolsas de muestreo
Esptula para recogida de muestras
Cedazo con malla de 4 mm
Tubos de centrfuga
Mortero
Solucin saturada de sulfato de Mg (331 g en un litro de agua destilada)
Solucin de tween-20 al 0.05%
8

Mtodo
1. Hacer pasar la muestra de tierra a travs del cedazo para eliminar las piedras y
fragmentos slidos de tamao grande.
2. Tomar 10-20 g de muestra, depositarla en el mortero y aadir 100 ml de la solucin de
tween-20. Homogenizar durante 5 minutos.
3. Distribuir la suspensin en dos tubos de centrfuga de 50 ml de capacidad.
4. Centrifugar a 2.500 r.p.m. durante 5-10 minutos.
5. Eliminar el sobrenadante. Repetir el proceso si la muestra contena muchos elementos
que flotaran en el lquido.
6. Resuspender el precipitado en solucin saturada de sulfato de magnesio, agitar y
centrifugar 5-10 minutos a 2.500 r.p.m.
7. Rellenar cada tubo hasta el borde con solucin saturada y dejar reposar durante 5
minutos.
8. Mediante una pipeta pasteur invertida depositar la porcin superior del lquido sobre un
portaobjetos y colocar cubreobjetos
9. Observar al microscopio con el objetivo de 10X. Los huevos no operculados de helmintos
y otras formas parasitarias o de vida libre podrn ser identificados en funcin de su
tamao y morfologa tpicos.

- Mtodo de deteccin de Cryptosporidium y Giardia en agua.

Los mtodos de deteccin de protozoos intestinales en ambientes acuticos,
desarrollados en diversos pases son constantemente evaluados para optimizarlos y mejorar su
sensibilidad y especificidad.
El mtodo estndar para el estudio de Cryptosporidium y Giardia en aguas presenta 3
procedimientos bsicos: concentracin, purificacin y deteccin.
Concentracin y purificacin: filtracin de 10-1000L , lavado del filtro con soluciones
detergentes, centrifugacin a 1100-1500 g y separacin selectiva con partculas magnticas
conjugadas con anticuerpos especficos.
Deteccin: mediante microscopa de fluorescencia utilizando anticuerpos especficos
marcados con isotiocianato de fluorescena, realizando la confirmacin mediante microscopa
ptica.
Centro mundial de referencia en la determinacin de Cryptosporidium y Giardia en
aguas: EPA - (United States Environmental Protection Agency)
http://www.epa.gov/dwlabcert/training-drinking-water-laboratory-certification

Visualizacin vdeo ( 10 min) Mtodo ENVIROCHEK CAPSULES

Overview of US EPA Cryptosporidium and Giardia Detection Methods

 Identificacin Microscpica (ZIP) (14 MB).

- Este mdulo de autoaprendizaje ayuda a identificar y caracterizar Cryptosporidium y Giardia

utilizando el Mtodo 1623 y permite la caracterizacin de los organismos, empleando un
microscopio de fluorescencia a travs de FITC, DAPI, y DIC.
FITC (Isotiocianato de fluorescena)
-Fluorocromo utilizado para marcar los anticuerpos monoclonales utilizados
frente a los antgenos presentes en la pared celular de ambos protozoos.
- Color verde brillante
- En ambos casos tie la superficie. Observacin 200X.
DAPI (4,6-diamino-2-fenilindona)
- Colorante que tie los ncleos. Se emplea como indicador de viabilidad
(colorante vital). Observacin 400X.
DIC Microscopa de Contraste Diferencial interferencial
- Similar a una visin 3D empleando luz polarizada que permite visualizar las
estructuras internas presentes. Observacin 1000X.

Mtodos de observacin microscpica de

Ooquistes de Cryptosporidium y quistes de
Giardia. Ambos resistentes a la cloracin
.habitual del agua

- Ejemplo de aplicacin de estos mtodos: Recuento y determinacin de viabilidad de Giardia spp. y aguas
potables y residuales en la cuenca alta del ro Bogot. Biomdica vol.25 no.3 Bogot Sept. 2005.

http://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=S0120-41572005000300011&script=sci_arttext

10

Anexo A (*)
1) Solucin madre de lugol
Yodo metlico.................................................. 1,00 g
Yoduro de potasio........................................... 2,00 g
Agua destilada................................................. 100,00 ml
Triturar juntos el yodo y yoduro en un mortero, aadir agua poco a poco y mover lentamente hasta su disolucin, aadir el resto
de agua y conservar en un frasco mbar.
2) Verde de malaquita con solucin glicerinada (mtodo Kato)
Glicerina comercial......................................... 100,00 ml
Agua destilada................................................ 100,00 ml
Verde de Malaquita 0,3%............................... 1,00 ml (1 g + alcohol de 95% 100 ml)
TCNICA DE KATO-KATZ CUANTITATIVO
Permite el recuento de huevos de helmintos en muestras de heces tras el aclarado de las heces mediante glicerina, lo
que facilita el recuento de los huevos presentes en la misma.
Material y reactivos
1. Tiras de celofn hidrfilo impregnados en glicerina: Preparar una solucin de glicerina-verde malaquita (a 1 ml de
solucin acuosa de verde malaquita preparada al 3%, se le aaden 100 ml de glicerina y 100 ml de agua destilada.
Mezclar bien). Verter la mezcla sobre las tiras de celofn en un tarro, dejando luego que repose la mezcla por lo menos
durante 24 h antes de utilizarla.
2. Pinzas
3. Portaobjetos
4. Papel higinico o absorbente

6. Patrn/plantilla calibrado de cartn o plstico (para

recuento cuantitativo)

5. Esptula de plstico

7. Rejillas metlicas o de plstico

Procedimiento
1.

Colocar el patrn calibrado centrado sobre el portaobjetos.

2.

Mediante una esptula rellenar el hueco con la muestra de heces.

3.

Colocar una rejilla encima del patrn que contiene las heces y raspar el exceso de heces con la esptula.

4.

Desechar el patrn y la rejilla manteniendo las heces sobre el portaobjetos.

5.

Cubrir el material fecal con una tira de celofn impregnada en glicerina (usando las pinzas).

6.

Invertir el portaobjetos y comprimir bien la muestra sobre una superficie lisa. El material fecal debe quedar bien
extendido entre el portaobjetos y la tira de celofn.

7.

Levantar con cuidado el portaobjetos (para evitar que se retire el celofn) y colocar el portaobjetos con el celofn
hacia arriba. Dejar transcurrir varias horas para aclara el material fecal antes de examinarlo al microscopio. Para
acelerar el aclaramiento y el examen puede dejarse la muestra en una estufa (37C 40C) durante unos minutos.
NOTA: una vez aclarado los caracteres de imprenta de un peridico deben ser visibles a travs del frotis.

8.

Examinar sistemticamente el frotis con el objetivo 10 X. Los huevos de Ascaris y Trichuris se aclaran ms
lentamente y son fcilmente visibles en las preparaciones de este tipo. Los huevos de uncinarias se aclaran
rpidamente y dejan de ser visibles al cabo de 30-60 min. Los huevos de Schistosoma o Fasciola tambin se
aclaran, pero pueden ser reconocibles durante bastante tiempo en estas preparaciones (aparecen sin teir y no se
aprecian las estructuras interiores del huevo).

9.

El nmero de huevos encontrados se multiplica por un factor k, que depende del patrn/plantilla utilizado (k=20, si es
de 50 mg; k=50 si es de 20 mg; k=25 si es de 40 mg, etc.), obtenindose el nmero de huevos por gramo de heces
(hpg).

11

Procedimientos de diagnstico en parasitologa.

http://www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/index.html
CLAVE PARA LA IDENTIFICACION DE ALGUNOS HUEVOS DE IMPORTANTES HELMINTOS HUMANOS DE POSIBLE
HALLAZGO EN HECES
La observacin al microscopio ptico de adultos y larvas de helmintos requiere una preparacin previa y especfica para cada
tipo de parsito. Los huevos de helmintos no requieren un tratamiento previo pudiendo ser observados directamente al
microscopio ptico en preparaciones (en fresco - hmedas). Pueden ser conservados mediante su fijacin y mantenimiento en
formol (5-10%).
Caractersticas de los huevos : Tamao, forma, cubierta, contenido y ocasionalmente color y estructuras externas. El
tamao, que se refiere a la mayor longitud de ste, puede ser estimado en comparacin con el de un glbulo rojo, que mide de
75-8 micras (1 micra = 1/1000 mm) o exactamente determinado despus de realizar el calibrado del microscopio mediante el
micrmetro ocular.

12

13

14

15

IDENTIFICACIN DE AMEBAS Y FLAGELADOS INTESTINALES

16