Instituto Politcnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

Laboratorio de Mtodos de Anlisis
Separacin de una mezcla de azul de metileno y
fluorescena usando cromatografa por
adsorcin.
Profesora: Rosas Sandoval Guillermina
Alumno: Miranda Onofre Jos Manuel
Grupo: 4IV1
Fecha de entrega: 07 de marzo de 2016

Fundamento.
En la cromatografa por adsorcin la separacin depende de los equilibrios de
adsorcin-desorcin de los componentes de la mezcla, entre la fase
estacionaria y la fase mvil. La fuerza con que es adsorbido un componente
depende de la polaridad de este, de la actividad del adsorbente y de la
polaridad de la fase mvil.
Un colorante es una sustancia que es capaz de teir las fibras vegetales y
animales. Los colorantes se han usado desde los tiempos ms remotos,
emplendose para ello diversas materias procedentes de y de animales as
como distintos minerales.

Objetivos.

Aplicar la tcnica de cromatografa por adsorcin para la separacin de

dos colorantes.
Comprobar la separacin con base en el perfil de elucin.

Resultados.
Volumen de elucin. (ml)

A 493

A 668

3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
33
36
39
42
45
48
51
54
57
60
63
66
69
72
75
78

0.005
-0.005
0.020
0.029
0.037
0.023
0.007
0.021
0.019
0.017
0.006
-0.005
-0.004
-0.002
-0.007
-0.006
0.010
0.004
0.004
-0.010
-0.004
0.137
1.3
1.073
0.383
0.073

-0.007
-0.016
0.147
0.721
0.903
0.526
0.254
0.167
0.126
0.087
0.060
0.048
0.037
0.048
0.041
0.029
0.016
0.011
0.022
0.009
0.021
0.020
0.017
0.015
0.012
0.012

81
84
87
90
Tabla 1.- Valores de absorbancia obtenidos.

0.04
0.038
0.036
0.013

0.013
0.013
0.020
0.0

Azul de

Absorbancia a 493 y 668 nm

1.4

1.2

0.8

1
0.6

0.8

Absorbancia 493

0.6

0.4

0.4

Absrobancia 668

A 493
A 668

0.2

0.2
0

0
-0.2

-0.2

Volumen de elucion (mL)

Grafica 1.- Absorbancia para la separacin de fluorescena y azul de metileno.

Discusin.

Durante la cromatografa, el primer colorante en salir fue el azul de metileno,

seguido de algunas recolecciones incoloras, esto se debe a que la almina era
de tipo acida (carga positiva) y el complejo de el azul de metileno de igual
forma tiene carga positiva por lo cual las cargas se repelen impidiendo la
fijacin de este colorante en la almina, adems de que gracias a la gran
solubilidad de azul de metileno en agua, la fase mvil de agua pudo arrastrar
con facilidad el azul de metileno.
Una vez que todo el azul de metileno se recolecto, se procedi a cambiar de
fase mvil por regulador de fosfatos porque como la fluorescena es polar, tiene
carga contraria a la almina, esto la fija a ella (puede formar puentes de
hidrogeno), y no la permite salir con la primera fase mvil (agua), pero con la
ayuda del regulador de fosfatos bsico, alcalinizamos la almina, rompiendo las
fuerzas que formo con la fluorescena, permitindola fluir.
Cabe destacar que se tuvo un grave error en el proceso de la cromatografa, el
cual fue diluir la mezcla de colorantes al momento de agregarlo, lo cual
provoc un mayor uso de tubos de recoleccin adems de una mayor
dispersin de nuestros datos al realizar la lectura en el espectrofotmetro por
lo que aument nuestras probabilidades de error. Como se puede observar en
nuestros datos obtenidos, este error en el mtodo solo afecto en la recoleccin
de azul de metileno, ya que la recoleccin de fluorescena se llev a cabo en
una cantidad ms pequea de tubos que el azul de metileno.
En la grfica podemos observar cual es la longitud de onda a la que cada
colorante tiene su mayor absorbancia (668nm para azul de metileno / 493nm
para fluorescena). Comparando nuestra grafica con la de los dems
compaeros, pudimos darnos cuenta que al recolectar los datos para la
absorbancia de 493, ellos obtuvieron un pico no muy grande al principio de los
volmenes de elucin, esto se debe a que a pesar de que el azul de metileno
tiene mayor absorbancia a 668nm, en las grficas de nuestros compaeros se
puede observar que est absorbiendo una fraccin ms pequea de radiacin
electromagntica a 493nm. La razn por la cual a nosotros no nos apareci ese
pico es debido al error cometido en la cromatografa, al diluir la muestra de
colorantes obtuvimos una mayor cantidad de tubos con azul de metileno pero
con pequeas concentraciones de este en cada uno por lo cual, al ser ledos a
493nm no se detect una gran absorbancia en los tubos de azul de metileno.
A pesar de los errores cometidos en la cromatografa la separacin de los
colorantes se llev a cabo exitosamente ya que, como se puede observar en la
grfica 1, los picos de cada colorante estn separados por una cantidad de
tubos en blanco que indican la falta de colorante en ellos ya sea azul de
metileno o fluorescena.

Conclusin.
La cromatografa por adsorcin es una metodologa bastante til para la
separacin y purificacin de soluciones, pero esta conlleva muchos cuidados y
consideraciones que se deben tener en cuenta para poder separar dos o ms

reactivos, por lo cual debe llevarse a cabo con extremado cuidado y una alta
concentracin.

Preguntas extra.
1.-Especifique y defina los elementos del sistema cromatogrfico para esta
separacin:
Fase mvil 1 y 2: Agua y regulador de fosfatos, fase estacionaria: Almina
acida, soporte: Columna
2. Defina el termino adsorcin y empleando formulas esquematice que fuerzas
intermoleculares participan en el proceso de separacin de los solutos.
La adsorcin es un proceso por el cual tomos, iones o molculas son
atrapados o retenidos en la superficie de un material en contraposicin a la
absorcin, que es un fenmeno de volumen.
3. Considerando las propiedades de solubilidad de los colorantes, indique que
modificaciones hara para invertir el orden de elucin.
Cambiara la almina acida por almina bsica para que as se retuviera
primero el azul de metileno y la fluorescena pueda eluir, adems de que la
primer fase mvil que se usara seria el regulador de fosfatos ya que la
fluorescena no es soluble en agua y el azul de metileno si lo cual hara que no
hubiera una buena separacin de los colorantes si se usara primero el agua.

Bibliografa.
http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatografia/pri
ncipios_de_cromatografia.pdf
P. Molina Buenda, 1989, Prcticas de qumica orgnica Volumen 15 of
Coleccin Blanca / Universidad de Murcia, EDITUM, paginas consultadas 22.