Sunteți pe pagina 1din 33

APOPTOZA

Definitie
Apoptoza (apoptosis caderea petalelor florilor sau a frunzelor din pom) sau
moartea celulara programata reprezinta un element central de mentinere a
echilibrului intre generarea si moartea celulelor. APPT apare intr-o varietate de
procese biologice: diferentiere, dezvoltare, maturizare celulara si in timpul
manifestarii proceselor imunologice.

Istoric
Carl Vogt descrie principiul mortii celulare in 1842.
Kerr, in 1972, publica primul articol in care sunt recunoscute diferentele
dintre apoptoza si moartea celulara traumatica, necroza.

Diferente intre apoptoza si necroza


Necroza este o forma patologica de moartea celulara aparuta ca urmare a unei
lezari celulare acute (distrugeri mecanice, hipoxie, liza celulare mediata de
complement sau actiunea unui agent toxic foarte puternic).
- este asociata initial cu o pierdere a integritatii membranei celulare, urmata
de o pierdere a continutului celular si aparitia unui proces inflamator eliminarea
celulelor necrotice este efectuata exclusiv de celulele sistemului mononuclear
fagocitic.
APPT afecteaza o singura celula sau grupuri mici de celule izolate si este un
proces asincron.
- moartea celulelor prin apoptoza este caracterizata printr-un proces de
autodigestie controlata a celulelor isi mentin integritatea membranei plasmatice.
- in faza finala se separa in fragmente mici, delimitatea de membrane,
denumite corpi apoptotici si care sunt ulterior fagocitate de macrofage, fara
inducerea unui raspuns inflamator.

Diferente intre apoptoza si necroza

Generalitati
APPT apare:
- in timpul embriogenezei (ex. involutia canalelor Wolff si
Muller),

- in timpul organogenezei,
- in timpul turnover-ului tisular normal,
- in cazul absentei actiunii unui hormon trofic asupra tesutului sau
tinta,
- la indepartarea timocitelor imature care au suferit o selectie
negativa in timus (nu au fenotipul corespunzator)
APPT celulelor somatice adulte include:
- eliminarea celulelor din timpul refacerii tesutului epitelial si a
formarii keratinocitelor,
- atrofia prostatei si a cortexului adrenal a ca urmare a reducerii
stimulului hormonului trofic,
- atrofia fiziologica a glandei mamare postlactatie,
- eliminarea limfocitelor B sau T dupa indepartarea actiunii
stimulante a citokinelor trofice la sfarsitul reactiilor imunologice,
- indepartea PMN dupa extravazarea lor in tesuturile inflamate.

Generalitati
50-70 miliarde celule mor in fiecare zi, in corpul uman, ca rezultat al
apoptozei.
Declansarea APPT prin actiunea unor factori este specifica tipului celular,
acelasi factor putand induce sau nu acest proces, in functie de celulele
asupra carora actioneaza. (ex. radiatiile ionizante determina aparitia APPT
in celulele hematopoietice, dar nu au acelasi efect si asupra fibroblastilor
sau celulelor de origine epiteliala).
APPT este reglata prin cai de traducere ale semnalelor imlicate si in alte
raspunsuri celulare specifice: modificarea calciului intracelular, activarea
protein kinazelor si a fosfatazelor, modificari ale ph-ului si stressul oxidativ
Se caracterizeaza printr-o cascada de modificari morfologice si biochimice
distincte.

Stimuli care induc APPT

- semnale fiziologice normale, cum ar fi hormonii care produc eliminarea


celulelor in timpul diferentierii sau involutiei tesuturilor si organelor

- eliminarea factorilor care inhiba APPT sau a unor componenti extracelulari


importanti, ex. factorii de crestere.

- actiunea unor stimuli toxici in doze mici: medicamente citotoxice,


hipertermia, hipoxia in grad redus.

Etapele apoptozei
In urma stimulului apoptotic, celula va suferi o degradare controlata a
organitelor celulare prin activarea caspazelor proteolitice. Modificarile
morfologice sunt:
Micsorarea celulei datorita dezintegrarii citoscheletului proteic de catre
caspaze.
Citoplasma apare densa si organitele strans compactate.
Condensarea cromatinei de-a lungul membranei nucleare (picnoza)
Membrana nucleara se intrerupe si ADN-ul se fragmenteaza intr-un proces
numit kariorrhexis. Nucleul se imparte in mase granulare acestei degradari.
Membrana celulara prezinta umflaturi neregulate.
Celula se fragmenteaza in vezicule denumite corpi apoptotici, care sunt apoi
fagocitati.

Etapele apoptozei

Apoptoza progreseaza rapid si in timpul kariorrhexisului, activarea endonucleazelor produce fragmente


scurte de ADN, de marimi egale. Acestea prezinta un
aspect caracteristic de scara (ADN ladder) in gelul
de agar dupa electroforeza in laborator. Vizualizarea
acestui fenomen diferentiaza apoptoza de moartea
celulara ischemica sau toxica.

Vizualizarea ADN-ladder
(stg) dupa electroforeza
in gel de agaroza marcat
cu ethidium bromide.

Modificarile nucleare

Fazele initiale sunt caracterizate prin condensarea materialului nuclear (picnoza),


urmata de o marginalizare marcata a cromatinei de-a lungul membranei nucleare.
Microscopic, apar ca granule fine, impachetate strans.

Modificarile cromatinei sunt deseori insotite de convolutii ale membranei


nucleare. O caracteristica este prezenta unor mase granulare rotunde sau ovalare
provenite din centrul nucleolar fibrilar situatie in stransa apozitie cu cromatina
condensata.

Nucleul se rupe prin inmugurire in fragmente discrete care sunt inca marginite de
o membrana dubla.

Condrocite vizualizate in microscopie cu


fluorescenta, dupa tratarea cu 30 M 4hydroxynonenal (HNE) si marcate cu
colorant Hoechst 33258.

1.

Celule netratate, nonapoptotice (martor)

2.

Celule incubate cu 10 g/ml venin de cobra

3.

Celule incubate cu 20 g/ml venin de cobra

4.

Celule incubate cu 50 g/ml venin de cobra


A-dupa 2 ore, B-dupa 4 ore, C-dupa 8 ore

Modificarile membranei celulare

La nivelul membranei celulare, APPT este caracterizata initial prin pierderea


structurilor membranare specializate, cum ar fi microvilii si regiunile de contact
reprezentate de desmozomi. In aceasta faza se produc modificari biochimice
discrete ale structurii membranei celulare, in special externalizarea fosfatidil
serinei.

Neuroni apoptotici cu nuclei picnotici


(colorati albastru cu Hoechst 33342) si
fosfatidil serina expusa pe suprafata
membranei, colorata verde cu
fluorescein isothiocianat-anexina V.

Modificarile membranei celulare

Etapa umflaturilor citoplasmatice apare simultan cu primele evenimente


nucleare si reprezinta un proces de condensare al citoplasmei care duce la
compactizarea organitelor celulare.
Doar relativa condensare a citoplasmei in absenta modificarilor tipice NU
reprezinta un semn distinctiv al procesului apoptotic, densitatea citoplasmei
variind considerabil de la o celula la alta, in multe tesuturi normale.

Fragmentarea celulei si fagocitoza


Celulele se fragmenteaza si formeaza corpi apoptotici, delimitati de membrane
care contin material nuclear, organite intacte si citoplasma condensata.
Inainte de descrierea amanuntita a modificarilor morfologice care au loc in
timpul procesului apoptotic, aparitia unor inmugururi citoplasmatice in culturile
celulare de celule leucemice era descrisa in lucrarile de specialitate ca
posibilitatea existentei unor inmultiri prin inmugurire.

Cei mai multi corpi apoptotici sunt fagocitati rapid de catre macrofagele rezidente
sau de catre alte celule din vecinatate cum ar fi celulele epiteliale si celulele
musculare netede vasculare. In interiorul fagozomilor corpii apoptotici sufera
modificari degenerative si in final sunt degradati de catre enzimele lizozomale
(foto).

Fragmentarea celulei si fagocitoza


Fagocitoza este o componenta normala a procesului de APPT, celulele
apoptotice exprimand pe suprafata lor markeri care determina captarea-liganzi
pentru receporii macrofagelor (ex. fosfatidil serina pentru receptorii fosfatidil
serinei, trombospondina pentru receptorii trombospondinei si lanturi glucidice
pentru lectine).

Celulele viabile exprima CD47 pe


suprafata membranei, care se leaga de
receptorul SIRP- al macrofagelor pentru
a preveni fagocitoza. Celulele apoptotice
nu mai exprima CD47 si prezinta
calreticulina, care va fi recunoscuta de
adiponectina macrofagelor, urmand a se
initia adeziunea si fagocitoza.

Genele apoptozei

Cunostintele actuale au fost obtinute prin studii pe un nematod transparent,


Caenorhabditis elaegans, la care au fost identificate 3 gene care codifica proteine
implicate in initierea si desfasurarea APPT: ced-3, ced-4, ced-9.

Caenorhabditis elegans marcat cu colorant


fluorescent Texas Red pentru evidentierea nucleilor
tuturor celulelor.

Genele apoptozei

Caenorhabditis elegans

Mamifere

Functie

Ced-3

Enzima de conversie a
interleukinei 1 (ICE),
caspaza 1

Efector al APPT

Ced-4

Factorul de activare al
proteazei implicate in
apoptoza (Apaf 1)

Activarea caspazei 3
(CPP32, apopaina)

Ced-9

Bcl-2, Bcl-XL

Antiapoptotica,
antioxidanta

Activarea caspazelor in timpul apoptozei


Radiatii
ionizante
Soc
termic

p53
Bcl-2

ROS
Fas

Lipsa factorilor de
crestere

caspaze

apoptoza

Apoptoza in patogeneza si tratamentul cancerului

APPT reprezinta o metoda eficienta de prevenire a transformarilor maligne


deoarece elimina celulele cu leziuni genetice.
APPT defectuoasa poate promova aparitia malignitatii permitand acumularea
de celule capabile sa se divida si obstructionand excluderea variantelor
genetice cu potential malign crescut.
ADN-ul oncogenelor virale sta la baza unui numar foarte redus de neoplasme
umane. Pentru restul bolilor maligne, oncogenele celulare nevirale si
netransmisibile stau la baza aparitiei mutatiilor in genele celulor normale.
Carcinogenii chimici sau radiatiile ionizante pot produce mutatii ale
protooncogenelor.

Apoptoza in patogeneza si tratamentul cancerului


p53
Lezarea ADN determina o blocare a celulei in faza G1 a ciclului celular mediata de
p53, gena apoptotica, in cazul in care leziunea nu poate fi reparata .
Supresia mortii celulare prin p53 mutante poate duce la cancer. Proteina p53
mutanta nu mai are capactatea de a se lega de nucleu si de a bloca celulele in G1 in
cazul aparitiei de ADN lezat si permite replicarea ADN-ului cu leziuni.
Pierderea functiei p53 apare in 70% din cancerele colo-rectale, in 50% din cancerele
pulmonare si in 40% din cancerele de san.Aparitia proteinelor p53 mutante in
aproximativ 50% din totalitatea neoplasmelor umane reprezinta una din cele mai
comune caracteristici ale malignitatii.
Incapacitatea celulelor cu p53 mutant de a intra in APPT, ca raspuns la lezarea ADN,
explica rezistenta la agentii chimioterapici sau la radiatii ionizante a celulelor
tumorale cu p53 mutant, nivelul acestuia constituind un criteriu in aprecierea
raspunsului la chimioterapie.

Apoptoza in patogeneza si tratamentul cancerului

Calea p53: intr-o celula normala, p53


este inactivata de catre mdm2. Dupa
lezarea ADN sau alte agresiuni,
diferite cai vor conduce la disocierea
complexului p53 si mdm2. Odata
activat, p53 va bloca ciclul celular
pentru a permite fie repararea si
supravietuirea celulei sau apoptoza
pentru a elimina celula lezata. Nu se
cunoaste in prezent cum p53 face
alegerea.

Apoptoza in patogeneza si tratamentul cancerului

p73

Gena este localizata in regiunea cromozomiala implicata in patogeneza


neuroblastoamelor. Ea mimeaza o serie de activitati ale p53 de promovare a
procesului apoptotic.

Apoptoza in patogeneza si tratamentul cancerului


Bcl-2
Asociata membranei mitocondriale inhiba APPT la cel putin 3 nivele:
- controlul potentialului de membrana prin tiolii mitocondriali
- reglarea permeabilitatii de membrana pentru moleculele mici pro
apoptotice
- ancorarea de membrana mitocondriala a proteinelor proapoptotice
Proteina bcl-2 a fost izolata in 70% din cancerele umane de san, 30-60% din
cele de prostata si 90% din cele colo rectale. Este asociata cu prognostic prost in
leucemii, cancer prostatic, cancer de colon si neuroblastom.
Exprimarea in exces a bcl-2 in unele linii tumorale confera celulelor rezistenta
la agentii chimioterapici cum ar fi citozinarabinoza, metotrexat, vincristina si
cisplatin.

Apoptoza in patogeneza si tratamentul cancerului

Apoptoza in patogeneza si tratamentul cancerului


c-myc
Codifica o proteina cu viata scurta (aproximativ 20 de minute) care se leaga specific de
ADN. Proteina c-myc este un factor de transcriptie care supreseaza blocarea cresterii si
promoveaza proliferarea prin modularea unor gene tinta. In cazul existentei unui nivel
scazut de factor de crestere sau al leziunilor genomului, proteina c-myc este un inductor
potent al APPT. Pare a fi activata in toate tumorile.

FAS/Apo-1
Este o proteina de membrana care apartine familiei de receptori TNF/NGF. Gena
FAS/Apo-1 poate fi considerata o gena supresoare a tumorilor datorita rolului ei
pozitiv in inducerea APPT si de asemenea FAS/Apo-1 nefunctionala reprezinta un
promotor al oncogenezei datorita incapacitatii de inducere a procesului apoptotic.

Apoptoza in patogeneza si tratamentul cancerului


FASL
Proteina care se leaga de receptorul FAS si joaca un rol important in scaparea de
sub controlul sistemului imun al tumorilor maligne. FASL este exprimata in unele
limfoame si leucemii limfocitare T si in cancerele de colon. Potentialul agresiv si
metastatic al unor tumori solide precum cancerul de colon poate fi datorat faptului
ca exprimarea FASL de catre celula maligna duce la semnalizarea APPT in
celulele T activate infiltrate.Celula tumorala nu exprima receptori FAS si exprimarea FASL
marcheaza celula maligna ca tinta pentru distrugere prin activarea unui raspuns inflamator.

DAP-kinaza (death associated protein)


Este o kinaza Ca/ calmodulin dependenta care fosforileaza resturi de serina si treonina din
proteine. Initial a fost descrisa ca mediator pozitiv al procesului apoptitic indus de
interferonul .
Absenta exprimarii DAP-kinazei suprima procesul apoptotic si promoveaza formarea
metastazelor.
Exprimarea ei este frecvent pierduta in carcinoamele umane si in leucemia cu celule B
Exprimarea DAP este absenta la celulele cu potential de metastazare ridicat si prezenta la
celelalte.

Apoptoza in patogeneza si tratamentul cancerului

Caspazele
Cercetarile efectuate aupra inhibitorilor caspazelor au aratat ca inhibitorii
specifici ambelor cai de activare ale caspazelor (prin participarea mitocondriilor
sau prin calea de semnalizare a receptorilor tanatogeni) sunt exprimati in exces
in tesuturile tumorale.
Exprimarea in exces a proteinei FLIP, inhibitor al caspazelor, care blocheaza
transmiterea proceselor apoptotice de la receptorii Fas si TNFR a fost
demonstrata in melanoamele maligne.
Deoarece inhibitia caspazelor poate fi generala in transformarea neoplazica
si/sau progresia tumorilor este tentanta speculatia conform careia genele
caspazelor ca si gena p53 ar putea functiona ca supresori tumorali si prin mutatii
somatice sau pe linia germinala sa confere tumorilor rezistenta la APPT.

Apoptoza in patogeneza si tratamentul cancerului


Aplicatii clinice potentiale
Genele Bcl-2 si p53 sunt doua tinte potentiale ale terapiei moleculare in cancer.
S-au studiat metode de crestere a exprimarii genelor care induc APPT (p53) si
de blocare a efectelor genelor antiapoptotice (Bcl-2). Downreglarea Bcl-2 prin
nucleotide antisens a dus la cresterea susceptibilitatii celulelor la efectele
citotoxice ale 1-3-d-arabinofuranozilcitozinei (Ara C) - citarabina.

Apoptoza in patogeneza si tratamentul cancerului


Aplicatii clinice potentiale
Acidul all-trans retinoic (ATRA) creste sensibilitatea blastilor din leucemiile
acute mieloide (AML) la efectele citotoxice ale Ara C si daunorubicinei. ATRA
face parte dintr-un grup de compusi cunoscuti sub numele de retinoizi care au
efect antiproliferativ si sunt capabili sa induca diferentierea in linia celulara
promielocitara HL-60.
O parte a acestui efect se datoreaza down reglarii bcl-2 si este de asemenea
responsabila pt cresterea chimiosensibilitatii dupa tratamentul cu ATRA.
Studiile indica prezenta bcl-2 in mitocondriile promielocitelor leucemice si este
absenta in mitocondriile celulelor care s-au diferentiat in urma tratamentului cu
ATRA.
Aceste rezultate sugereaza ca ATRA poate reduce exprimarea bcl-2 in celulele
blastice din AML in vivo si creste sensibilitatea celulelor la APPT indusa de
medicamentele citostatice.

Apoptoza in patogeneza si tratamentul cancerului


Aplicatii clinice potentiale
Inducerea mortii celulelor canceroase prin fosforilarea proteinei bcl-2 produsa
de medicamentele care afecteaza integritatea microtubulilor ofera posibilitatea
unei scheme terapeutice tintite.

Antigenul de suprafata al celulelor B, CD-20 este o tinta eficace pentru


imunoterapia bolilor maligne cu celule B deoarece legarea in vivo a anticorpilor
anti CD-20 in prezenta celulelor care exprima receptori Fc duce la cresterea Ca
si la APPT celulelor maligne.
O directie posibila in lupta impotriva cancerului se bazeaza pe inducerea
procesului apoptotic prin inlocuirea genelor afectate sau absente. Inducerea p53
in celulele tumorale p53 negative inhiba proliferarea prin blocarea ciclului
celular in G1 si in viitor tratamentul cancerului hepatic ar putea fi posibil prin
injectarea locala a unui virus inofensiv cu rol de vector a genei p53 intacte.