Sunteți pe pagina 1din 118

DIAGNOSTICUL DE

LABORATOR AL
INFECIILOR VIRALE

DIAGNOSTICUL INFECIILOR
VIRALE

Argumente:
clinice (sdr. clinic, debut, evoluie, patologia asociat)
epidemiologice (vrsta, sex etc.)
laborator

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL INFECIILOR VIRALE
Indicaii:
Alegerea terapiei etiotrope
Monitorizarea eficienei terapiei
Adoptarea msurilor de profilaxie i
combatere n focar a unor boli contagioase
Supravegherea epidemiologic a unor boli
infecioase

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL INFECIILOR VIRALE

Nejustificat (tardiv, fr consecine


terapeutice)?
Inaccesibil (infrastructur complex,
personal nalt calificat)?

Costisitor ?

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL INFECIILOR VIRALE
n prezent:
Justificat i necesar (metode de diagnostic
rapid, antivirale eficiente)

Accesibil (cel puin pentru anumite metode)


Cost / eficien

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL INFECIILOR VIRALE
Indicaii:
Iniierea i monitorizarea terapiei antivirale
(v. gripale, HSV1, HSV2, CMV, HIV, HBV,
HCV)
Stabilirea
conduitei
terapeutice
sau
profilactice (herpes genital prepartum,
infecie cu v. rubeolic, HIV la gravid)

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL INFECIILOR VIRALE
Adoptarea msurilor de profilaxie i
combatere n focar a unor boli contagioase
(HAV)
Supravegherea epidemiologic i adoptarea
msurilor de sntate public (triajul
donatorilor de snge i organe,
supravegherea epidemiilor gripale, SARS)
Evidenierea unor infecii noi, virusuri noi sau
a unor noi asocieri virus-boal

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL INFECIILOR VIRALE

Tipuri de laboratoare:
Laboratoare clinice
Institute de Sntate Public
Centre de referin

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL INFECIILOR VIRALE
METODE NESPECIFICE
METODE SPECIFICE

Metode directe

Metode indirecte

ex microscopic (ME, IF)


evidenierea antigenelor virale
evidenierea secvenelor ac.
nucleic
izolarea - identificarea
ex. citologic (MO)

evidenierea
anticorpilor specifici

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL
INFECIILOR VIRALE - ETAPE
Cooperarea clinician medic de laborator!
Alegerea celui mai potrivit test (contextul clinicoepidemiologic)
Alegerea produsului patologic
Tipul (sdr. clinic, stadiul bolii)
Momentul prelevrii
Metoda de recoltare i transport

PRODUSE PATOLOGICE UTILIZATE


N DIAGNOSTICUL VIROLOGIC
Sdr respiratorii:
respiratorii exsudat nazal, exsudat faringian,
lichid de spltur nazal, sput
Sdr digestive:
digestive materii fecale, tampon rectal
Rash vezicular:
vezicular lichid vezicular, produs de raclaj
Infecii urinare:
urinare urin
Infecii oculare:
oculare raclat conjunctival sau corneean,
exsudat faringian
Sdr meningian/ encefalitic:
encefalitic LCR, biopsie
cerebral, materii fecale, saliv, esuturi
Snge

MOMENTUL PRELEVRII N
DIAGNOSTICUL VIROLOGIC

OPTIM primele 2 3 zile de la


debutul bolii (diagnostic direct)!

PRELEVAREA N DIAGNOSTICUL
VIROLOGIC

Tipul produsului patologic


Expediere imediat
Mediu de transport
Refrigerare (+4 +8 C), nu congelare
(-15 -20 C)

Lichid amniotic: se aspira lichidul cu seringa si


se injecteaza apoi intr-un tub steril.
Scop: cultivare virusuri
Sange periferic: se decontamineaza tegumentul.
Se folosesc tuburi cu heparina sodic
Scop: cultivare virusuri
Biopsie cerebrala: probele se transporta in mediu
de transport M4
Scop: cultivare, PCR pentru VHS
Bronhoscopie: se recomanda aspirarea secretiilor
prin camera interioara a bronhoscopului intr-un
recipient steril cu 1 ml solutie salina. Se transporta
imediat la laborator.
Scop: cultivare virusuri

Cervix: se foloseste speculum fara lubrifiant.


Se indeparteaza excesul de mucus si puroi cu ajutorul
tampoanelor de descarcare.
Se introduce un tampon mic in endocervix si se roteste
pentru 15 30 secunde.
Se evita atingerea peretilor vaginali cu tamponul. Se
comprima usor cervixul intre lamele speculului si se
exprima puroiul eventual existent.
Se introduce tamponul intr-un tub de colectie.
Daca sunt prezente leziuni, acestea se comprima cu un alt
tampon, care se introduce intr-un mediu de transport M4.
Scop: cultivare virusuri si PCR

Cornee: raclajul corneean este realizat de catre medic.


Este indicat a se introduce raclatul in mediu de transport
M4
Cultivare VHS
LCR: se decontamineaza pielea. Se realizeaza punctie
lombara, ventriculara sau suboccipitala. Se strimite LCR
intr-un tub steril cu capac insurubat. Nu se foloseste mediu
M4. Se transporta in laborator imediat dupa prelevare.
Cultivare virus si PCR pentru Herpes Simplex Virus
Ureche interna: se curata canalul extern cu antiseptic cu
actiune medie. Se preleva puroiul aseptic.
Cultivare virus
Ochi (extern): se indeparteaza machiajul. Se
antiseptizeaza tegumentul din jurul ochilor cu antiseptic
slab. Se trece de 2 ori un tampon umed la nivelul
conjunctivei. Evitati atingerea pleoapelor. Se foloseste
mediu de transport M4.
Cultivare virus

Leziuni herpetice: se sterge viguros baza unei vezicule


deschise cu un tampon, se trimite produsul in mediu de
transport M4.
Cultivare VHS, PCR
Biopsie pulmonara: se decontamineaza tegumentul. Se
efectueaza doar de catre specialist. Se trimite produsul la
laborator in mediu de transport M4.
Cultivare virus
Spalatura nasala / aspirat nasal: capul pacientului este
indicat a fi inclinat sub un unghi de 70. Se aspira in seringa
1 ml solutie salina. Se introduce lichidul in narine. Se
colecteaza lichidul si se reintroduce de cateva ori. La final
se colecteaza lichidul de spalatura intr-un tub steril
insurubat. Se trimite imediat la laborator. Detectarea rapida
de virus gripal este posibila in sezon epidemic.
Cultivare virus gripal, virus respirator sincitial.

Nasofaringe: se introduce un tampon subtire, in


nasofaringe, in cavitatea nasala. Se tine tamponul aproape
de septul nasal. Se roteste tamponul si se retrage. Se
transporta imediat la laborator. Se foloseste mediu de
transport M4.
Cultivare virus; detectare VRS
Lichid pericardic, pleural, peritoneal: se decontamineaza tegumentul.
Se recomanda aspirarea sterila a cativa ml intr-o seringa.
Se introduce lichidul intr-un recipient steril, cu capac.
Cultivare virus
Rash: se curata suprafata cu alcool 70%. Se instileaza o
cantitate mica de solutie salina si apoi se aspira intr-un tub
steril. Se foloseste mediu de transport M4.
Pentru rash vezicular se cur viguros cu un tampon baza
veziculelor proaspete.
Cultivare virus si IF directa pentru V Varicella Zoster

Tampon rectal: in timpul proctoscopiei sau


sigmoidoscopiei se ating cu tamponul leziunile de la acest
nivel. Se introduce tamponul in mediu de transport M4.
Cultivare virus
Lichid unt: se decontamineaza tegumentul si cateterul.
Se aspira steril de la nivelul untului si se conditioneaza
intr-un recipient steril.
Cultivare virus
Materii fecale: se colecteaza in recipiente curate, uscate,
cu capac. Daca se recolteaza in plosca, se evita contaminarea cu urina sau dezinfectante. Transportul nu trebuie sa
depaseasca 1 ora.
Cultivare virus. Detectie Rotavirus (e.g. LA).

Faringe: tampon de la nivelul exudaului faringian


sau al membranelor formate. Se sterg viguros
criptele amigdaliene. Nu se atinge mucoasa bucala
sau limba!
Cultivare virus
esut: se recolteaza de catre medic
Cultivare virus
Aspirat traheal: secretiile se transporta in
container steril.
Cultivare virus

Secretie uretrala: se recolteaza la o ora dupa


ultima mictiune. Se introduc tampoane subtiri de 2
4 cm in uretra si se rotesc timp de 3 5 secunde.
Se depune tamponul intr-un tub colector. Pentru
VHS se foloseste mediu de transport M4.
PCR pentru VHS2; Cultivare VHS
Urina de la nivelul cateterului: se dezinfecteaza
tubul cu alcool. Se aspira urina cu o seringa sterila.
Se transporta in container steril. Se refrige-reaza
imediat.
Cultivare virus
Urina suprapubiana / citoscopie: se realizeaza
recoltarea de catre medic intr-un recipient steril; se
refrigereaza imediat.
Cultivare virus

Vagin: se foloseste speculum cu lubrifiant. Se


introduce un tampon steril in vagin. Mediu M4
pentru VHS.
Cultivare VHS, PCR
Vulva: nu se foloseste alcool pentru membranele
mucoase. Tegumentul se antiseptizeaza. Se
colecteaza cu tamponul sau se aspira cu seringa.
Mediu M4 pentru VHS.
Cultivare VHS, PCR

Diagnosticul direct

Examinarea direct a produselor patologice

Detectarea de antigene:
Evidentiere de virus / ME si IEM
imunofluorescen (IF),
teste imunenozimatice (ELISA enzime linked
immunosorbent assay);
latex aglutinarea (LA);
Detectarea genomului
PCR si RT-PCR

Diagnosticul direct
In examinarea direct, produsele patologice
sunt examinate pentru evidenierea:
virusului;
antigenelor virale;
a genomului;
modificrilor histopatologice induse de
ctre infecia viral.

Diagnosticul direct
Avantaje:
examinarea direct este rapid,
rezultatele fiind obinute n aceeai zi, mai ales n
scopul instituirii chimioterapiei.
Dezavantaje:
costul ridicat al tehnicilor,
personalul de laborator nalt calificat, fac din aceste
metode apanajul laboratoarelor de cercetare sau special
echipate.
Tehnicile de biologie molecular au devenit, n ultimul
timp, din ce n ce mai accesibile, iar sensibilitatea i
specificitatea lor, dublat de automatizarea metodei,
depesc aceste inconveniente.

Diagnosticul direct
Scderea preului de cost per determinare
reprezint soluia de viitor pentru extinderea
lor pe scar mai larg.
Prin dezvoltarea tehnologiilor tip DNA chip
se vor putea detecta virusuri direct n
produsul patologic (PP), cu posibilitatea
cuantificrii lor, n vederea monitorizrii
terapiei antivirale.

Metode

Microscopia electronic (ME) pentru evidenierea


morfologiei i dimensiunilor virusurilor i
identificarea acestora utiliznd imunoelectronmicroscopia (IME).
Microscopia optic: modificri histopatolgice i
evidenierea de incluzii.
Detectarea genomului viral: hibridizarea i reacia
de amplificare genic (PCR polymerase chain
reaction).

Izolarea virusurilor

Culturi de celule: evidenierea efectului citopatic (ECP)


produs de ctre virusuri citopatogene; identificarea
virusului izolat prin IF, reacia de neutralizare (RN), testul
de hemadsorbie, RIA, etc.
Izolarea pe ou embrionate n dezvoltare: evidenierea de
pocksuri la nivelul membranei chorioalantoidiene (MCA),
urmat de identificarea prin RIH.
Izolarea pe animale de laborator determin decesul sau
reproducerea bolii la animal, urmat de obinerea de
seciuni histologice i examinarea lor prin MO pentru
evidenierea unor leziuni caracteristice i identificarea de
antigene prin RN, RIH, etc.

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC


VIROLOGIC
Microscopia electronic (ME)
sensibilitate redus (106-7 virioni/ml)
personal specializat i infrastructur
complex
cost ridicat
utilizare limitat

Microscopia electronic (ME)


presupune un laborator dotat cu ME cu putere de
mrire ntre 20000-40000X sau 50000-60000X.
Pe lng dezavantajele legate de echipamentul
scump, al necesitii de personal nalt calificat i al
costurilor ridicate pentru reactivi i ntreinerea ME,
tehnica are i dezavantajul unei sensibiliti reduse,
deoarece limita de detecie presupune prezena
virusului n PP n cantitate de aproximativ 106
particule virale/ml.

Microscopia electronic (ME)


Avantaje:
rapiditatea detectrii virusurilor i utilitatea descrierii morfologiei
virusurilor;
uneori reprezint singura metod de diagnostic, aa cum s-a
ntmplat n cazul descrierii coronavirusului recunoscut, ulterior,
ca agent etiologic al SARS (sindromul acut respirator sever).
Dezavantaje:
sensibilitatea redus,
cost ridicat,
similitudini morfologice ntre diferite virusuri,
imposibilitatea identificrii serotipului.

Microscopia electronic (ME)


Produse patologice utile pentru detecia de
virus:
materii fecale (MF) pentru rotavirusuri,
adenovirusuri, virusul Norwalk i virusurile
Norwalk-like, astrovirusuri, calicivirusuri;
lichid vezicular pentru VHS i VVZ;
produs din leziunile cutanate pentru
papillomavirusuri, virusul orf, moluscum
contagiosum.

Picornavirusuri

IME
Creste sensibilitatea si specificitatea ME
Variante ale IME:
IEM clasic: proba este tratat, anterior examinrii la
ME cu un ser specific cu Ac monoclonali, anti-virus
presupus prezent n PP.
Particulele virale, prezente n probe vor aglutina i n
final, se vor agrega, datorit specificitii reaciei AgAc;
IEM n faz solid: grila ME, (sau alt suport), va fi
coafat cu Ac monoclonali; particulele virale,
prezente n PP vor fi adsorbite la suprafaa grilei prin
intermediul Ac-lor.

Microscopia optic:
Evidentiaza modificri histopatolgice i
evidenierea de incluzii

Incluziile cu diferite localizri:


intranucleare i/sau intracitoplasmatice,
eozinofile sau bazofile,
cu variate forme rotunde, alungite, piriforme, etc.
reprezint doar un reper orientativ i nu unul
patognomonic.

Infectii cu VHS (incluzii IN)

Leziuni determinate de VHS. Sageata verde indica incluzii IN, cea albastra ,
celule keratinizate, iar cea rosie, celule binucleate, cu incluzii iN.

Sageata rosie - incluzii IN, albastra, degenerarea celulelor cu balonizare


(aspect generat de VHS, keratinocite, multinucleate).

VVZ incluzii IN

V. rabic incluzii IC (bazofile)


Coloratie HE

Incluzii Babes-Negri
granule albastru-inchis la nivelul
incluziilor (coloratie Sellers)

VRS sincitii si incluzii eozinofile i.c.

Infectie HIV celule nervoase


Incluzii Cowdry A, IN si IC eozinofile
(coloratie HE)

joi

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC


VIROLOGIC
Detecia i identificarea antigenelor virale
imunofluorescen
imunohistochimie
metode imunoenzimatice
latexaglutinare
reacii de neutralizare, fixare a complementului,
inhibare a hemaglutinrii

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC


VIROLOGIC - IMUNOFLUORESCENA

Anticorpi marcai cu fluorocrom


Detecia i identificarea antigenelor de la
nivelul celulelor infectate (produs patologic,
culturi de celule)

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC


VIROLOGIC - IMUNOFLUORESCENA

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC


VIROLOGIC - IMUNOHISTOCHIMIE
Detecia i identificarea antigenelor virale de la
nivelul celulelor infectate (produs patologic, culturi
de celule)
Anticorpi marcai cu peroxidaz
Examinare la microscopul optic
Dezavantaj peroxidaza endogen, prezent n
numeroase esuturi, poate genera reactii fals pozitive

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC


VIROLOGIC - IMUNOHISTOCHIMIE

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC


VIROLOGIC - IMUNOHISTOCHIMIE

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC


VIROLOGIC - IMUNOHISTOCHIMIE

Rabie - imunohistochimie

Incluzii IN Cowdry A se vad uneori; Imunohistochimie, utilizand


Ac monoclonali anti- VHS: semnal (+) IN si IC (stanga coloratie
Papanicolau si dreapta: IHC, dupa recolorare)

METODE INDIRECTE DE DIAGNOSTIC


VIROLOGIC
Evidenierea anticorpilor specifici
metode imunoenzimatice (ELISA)
latexaglutinare (LA)
reacia de fixare a complementului (RFC) /
evidentiaza Ac specifici de grup (exceptii / VSR,
paragripal tip 3)
reacia de inhibare a hemaglutinrii (RIH)

Sensibilitate, specificitate, complexitate i costuri


funcie de metoda utilizat
Criterii de semnificaie a prezenei Ac

Criterii de semnificaie a
prezenei Ac

2 probe de ser (ideal)


dinamica semnificativ
seroconversia
1 prob unic
titrul semnificativ
clasa de Ac (IgM versus IgG)

METODE IMUNOENZIMATICE N
DIAGNOSTICUL VIROLOGIC
Aplicaii extrem de variate
Diverse variante (directe, indirecte, competitive,
sandwich)
Detecia i identificarea antigenelor (virioni,
antigene virale solubile, celule infectate) si a
anticorpilor
Sensibilitate foarte bun
Specificitate funcie de afinitatea anticorpilor
Accesibilitate
Cost redus

Teste pe membrana

Teste pe membrana (HIV si VHC)

Teste pe membrana
Pentru laboratoare putin dotate
NU NECESITA PERSONAL
SPECIALIZAT
In zone unde prevalenta infectiei respective
este redusa
SE CONFIRMA OBLIGATOR PRIN
ELISA

ELISA- principiu
Evidenierea complexului Ag-Ac cu ajutorul
unui element cunoscut (Ac sau Ag) marcat
cu o enzim
Reacia de culoare, prin adugarea unui
substrat specific (pentru enzima utilizat)

Placa ELISA (12/8)

ELISA - metoda
Ag partial purificat, inactivat este adsorbit pe
suport

Se adauga ser (poate contine Ac se


cupleaza de Ag)

ELISA - metoda
Ac anti Ig umana, cuplati cu enzima
(conjugat)

Cromogenul (substratul) va schimba


culoarea reactiei daca se formeaza
complexul Ag-Ac-Conjugat

ELISA ser reactiv

ELISA ser nereactiv

ELISA

Positive Control

Negative Control

Patient A

Patient B

Patient C

Assay Control

1.689

0.153

O.055

0.412

1.999

0.123

ELISA
indirect

ELISA
indirect

ELISA

ELISA direct (detectare de Ag)

ELISA

ELISA competitiv
competiia se realizeaz direct n prezena
de Ac dirijai mpotriva Ag insolubilizat,
prin adsorbia pe faza solid.
este posibil s adugm reactivii n etape: n
prima etap, Ag-ul de dozat se adaug peste
Ac insolubilizai pe faza

ELISA competitiv

ELISA
Nu se lucreaza probe hemolizate, contaminate!
Pastrarea serului cel mult 5 zile la frigider (ideal,
maxim 3 zile).
Nu se ingheata proba repetat!
Rezultate fals pozitive: impun repetarea probei pe
2 godeuri (mai ales in cazul probelor indeterminate;
AS = CO).

Surse de eroare n dozarea


antigenelor:
rezultatele fals pozitive pot fi determinate de:
* fixarea nespecfic a imunoglobulinelor de ctre
receptori Fc membranari sau de ctre factorul
reumatoid (FR) prezeni n ser sau alte lichide
biologice;
* reacii heterospecifice determinate de utilizarea
anticorpilor anti-antigene heterologe, anti-gazd
sau anti-membrane ale gazdei sau de prezena de
antigene n prob (bacterii, levuri, ciuperci,
proteine);

Surse de eroare n dozarea


antigenelor:
* proasta conservare a serurilor ce duce la
alterarea imunoglobulinelor n prob;
* folosirea unui conjugat la titru sau cu o
aviditate insuficient.

Surse de eroare n dozarea


antigenelor:
Rezultate fals negative
Aviditate scazuta a Ac adsorbiti pe suport
Conjugat nelegat (incubare insuficienta,
spalare in exces, etc)

ELISA
Conduita: repetarea pe aceeasi proba sau/si
pe o noua proba de ser (recoltat imediat sau/si
la 2-3 luni interval).
Se prefera repetarea pe truse de la producatori
diferiti.
Atentie: pacienti cu boli autoimune, sub
tratament cu cortosterioizi, hemodializati, etc.

ELISA
Rezultate fals negative:
ser recoltat anterior perioadei de
seroconversie
Ac complexati/legai cu Ag
sensibilitate redusa a trusei
Ac antiHIV2 nu sunt recunoscuti de truse
pentru HIV1
imunsupresie

Evoluia rspunsului imun n infecia cu


HIV

ELISA schematic (indirect)

ELISA Ag p 24 (HIV)

Sandwich ELISA (Ac-Ag-Ac)

IgG-Capture EIA
Serum (1/100)

Goat-anti-Human-IgG
Capture Antibody

TMB
Substrate

Biotin-Labeled Ag

StrepavidinPeroxidase

ELISA
Rezultate fals pozitive
Confirmarea printr-un test principial
diferit (WB, IF).

HIV WB

WB - principiu
Ag virale fixate pe un suport (membran),
reacioneaz specific cu Ac din ser
Marcaj imunoenzimatic
Legarea reactivilor ca in ELISA de tip
indirect

WB

Avantaje:
evidentiaza categorii de Ac
este mai specifica
permite aprecieri prognostice (ex.
aparitia/versus disparitia Anti- p24).

WB

Dezavantaje:
timp mai mare de executie
presupune dotari suplimentare
personal super-calificat
uneori presupune interpretari subiective
cost ridicat

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC


VIROLOGIC LATEX AGLUTINARE
Anticorpi fixai pe particule de latex
identific antigene (reciproca este
valabil, pentru evidenierea de Ac)
Metod simpl, rapida i accesibil
Sensibilitate i specificitate relativ
reduse
Ex: antigenul rotaviral in materii fecale

LA

METODE DE BIOLOGIE MOLECULAR


N DIAGNOSTICUL VIROLOGIC
Detecia i identificarea unor secvene specifice
de acizi nucleici
Diverse variante
Hibridizarea acizilor nucleici neamplificai
Amplificarea semnalului (bDNA)
Amplificarea secvenei (PCR, RT-PCR, NASBA)

Sensibilitate i specificitate foarte bune


Accesibilitate restrns
Cost ridicat, dar cu raport cost/beneficii favorabil

PCR

PCR evidenierea fragmentului


amplificat

Detectarea calitativ a acizilor nucleici virali


Cand metodele convenionale sunt greu de utilizat:
virusurile care se cultiv dificil (VHB, VHC,
papillomavirusul uman, HIV i parvovirusul B19);
datorit riscului crescut de infeciozitate (HIV);
cnd serologia nu este evident (ex. n cazul pacienilor
imunocompromii- virusul citomegalic);
diagnosticul infeciilor virale congenitale i perinatale
(HIV, VHC);
virusul este prezent n concentraii foarte joase:
screeningul sngelui i al produselor sanguine (VHB,
VHC, HIV);

Produse patologice
testarea fluidelor organismelor care n mod
normal sunt sterile
- LCR (VHS, VVZ, VCM);
- lichidul amniotic (VVZ, VCM, parvovirusul
B19, virusul rubeolei);
- fluidele oculare (VVZ, VCM).

PCR
- Au fost folosite variate metode pentru
aceste scopuri, inclusiv PCR i hibridizarea,
cu scopul de a putea evidenia concentraii
sczute de genom viral n probe.

Secvenierea acidului nucleic viral


Odat ce genomul viral a fost detectat, secvenierea
genomului poate evalua relaiile dintre dou sau mai multe
izolate virale, n cazurile n care este posibil coinfecia
(VHB VHC) sau poate ghida terapia antiviral.
n testarea rezistenei la antitretrovirale a HIV se determin
secvenierea RT i a proteazelor i se compar expresia
schimbrilor aminoacizilor cu tulpina iniial de virus.
Testarea sensibilitii HIV la antiretrovirale are un
potenial limitat datorit beneficiului clinic redus,
costurilor ridicate, dificultilor de interpretare.

Secvenierea acidului nucleic viral


Aplicaii:
alegerea terapiei de prim intenie, adaptarea terapiei,
profilaxia post expunere i prevenia transmiterii
verticale.
Ex. terapia HIV i VHC.
rspunsul la IFN n infeciile cu VHC depinde de
genotipul viral: genotipurile 2 i 3 rspund mai bine dect
genotipul 1;
cteva variante de VHB cu sensibilitate redus la
Lamivudin sunt asociate cu prezena unui singur nucleotid
la nivelul genei care codifica sinteza polimerazei.

Cuantificarea acidului nucleic viral

Cuantificarea ncrcturii virale este


important n virusologia clinic datorit
utilitii sale ca:
- indicator al prognosticului;
- al rspunsului la terapia antiviral;
- al riscului transmiterii infeciei.

Evaluarea prognosticului:
A fost bine stabilit pentru HIV.
Sa demonstrat c nivelul plasmatic al ARN
ului viral corelat cu stagiul bolii i cu un nivel
sczut al HIV1 n plasm se asociaz cu o
lung perioad asimptomatic.
Incrctura viral crescut dup seroconversie
poate preceda progresia spre SIDA.

Evaluarea prognosticului:
Msurarea ncrcturii virale pentru VCM este util
n cazurile post transplant, aceast metod
dovedinduse mult mai eficient dect determinarea calitativ.
Incrctura viral pentru VCM este un factor
predictiv independent n supravieuire, n cazul
SIDA avansat.
Creterea VEB n plasm i n limfocitele din
sngele periferic poate precede apariia unor
tulburri limfoproliferative post transplant.

Evaluarea rspunsului terapeutic:


este cel mai bine cunoscut n cazul infeciei cu HIV, caz n
care scopul terapiei este de a reduce nivelul plasmatic al HIV1
ct mai mult posibil
exist controverse n acest sens;
- s-a sugerat c pacienii cu nivelul plasmatic al HIV1 ntre
30.000 i 50.000 cpii / ml ar trebui s primeasc terapie
antiretroviral indiferent de stadiul clinic,
- n timp ce pentru pacienii care au concentraii ntre 5000
30000 cpii / ml trebuie s se aib n vedere i stadiul clinic i
numrul CD4 pentru iniierea terapiei antiretrovirale.

Evaluarea rspunsului terapeutic:


Terapia antiretroviral este eficient dac s a redus nivelul plasmatic al HIV1 cu cel
puin 0,5 log10.
Revenirea nivelului ARN ului plasmatic
pn la valori egale cu cele dinaintea
terapiei, ar trebui s trezeasc suspiciuni cu
privire la dezvoltarea rezistenei.

Evaluarea rspunsului terapeutic:


n cazul HVB, n care un nivel crescut de ADN nainte de
iniierea tratamentului este asociat cu un rspuns slab la
IFN, cuantificarea ADN/ VHB a fost utilizat pentru a
preconiza rspunsul terapeutic i pentru a monitoriza
rspunsul la terapia antiviral.
La fel i n cazul infeciilor cu VHC, nivelul ridicat al
viremiei, naintea iniierii terapiei antivirale este asociat cu
un rspuns terapeutic redus (s-a demonstrat c acesta apare
indiferent de genotip).
Este nc neclar care este raportul dintre genotipul VHC i
nivelul viremiei.

Evaluarea riscului transmiterii virale:


cuantificarea genomului viral pentru a evalua riscul
transmiterii virale nu este frecvent utilizat n prezent, dar
poate deveni mult mai important n viitor;
este general acceptat c riscul transmiterii virale este corelat
cu nivelurile crescute de virus n diverse fluide ale
organismului;
transmiterea VHC de la mam la copil este mai frecvent
atunci cnd nivelul ARN / VHC al mamei n snge este mai
mare dect 108 cpii / ml (practic risc = 0 la 103 cpii / ml ).
Transmiterea se face frecvent n timpul nateriii; frecvena
ratei transmiterilor este mai mic n cazul naterilor prin
cezarian dect n cazul naterilor pe cale natural.

Evaluarea riscului transmiterii virale:


n ceea ce privete transmiterea mama-fat n cazul
HIV1, s-a demonstrat, dei inconstant, c nivelurile
ridicate ale ARN / HIV n plasma mamei cresc riscul
infeciilor fetale.
Scderea riscului transmiterilor se poate face eficient
prin Zidovudin.
O meta analiz recent ce a inclus 15 studii de
cohort sugereaz c naterea prin cezarian reduce
riscul transmiterii HIV pe cale vertical, indiferent de
utilizarea Zidovudinei.
Nivelurile crescute de HIV1 apar mai frecvent n timpul
relaiilor heterosexuale.

Metode cantitative
Real Time pCR (LP cu demonstratii
practice)

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC


VIROLOGIC - CULTIVARE
Metod standard permite
stabilirea semnificaiei izolatului
testarea sensibilitii la antivirale
izolarea unor virusuri noi

laborioas, necesit infrastructur complex


i personal calificat
accesibilitate redus i costuri mari

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC


VIROLOGIC - CULTIVARE
Prelucrarea produsului patologic
Medii de cultur celulare
culturi de celule (primare, diploide, linii celulare)
ou embrionate
animale de laborator

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC


VIROLOGIC - CULTIVARE
Evidenierea replicrii virale
efect citopatic
incluzii
hemadsorbie
hemaglutinare
imunofluorescen, metode imunoenzimatice
transformare malign
interferen

CULTIVAREA VIRUSURILOR
EFECT CITOPATIC - sincitii

Virus urlian : CC- sincitii (se confunda cu cele


ale VRS diferentiere prin testul de
hemadsobtie)

CULTIVAREA VIRUSURILOR INCLUZII


VIRALE