UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

Facultad de Ingeniera Ambiental y Recursos Naturales

COLORACION
BACTERIANA
CURSO: Microbiologa Ambiental

PROFESORA: Blga. Beatriz

INTEGRANTES:

Suyo L.

Torpoco Cano, Evelyn

SEMESTRE: 2015-B

Bruno Grey, Karen V.

Chvez Yumpo, Betzy Y.
Ziga Luna , R. Alexander

DEFINICIN:
Son compuestos
qumicos que
poseen:

GRUPO CROMFORO

otorga color a la molcula

GRUPO AUXOCROMO

otorga al colorante la capacidad

de disociarse electrolticamente y
por lo tanto, formar sales

es el que facilita la unin del

colorante a otras sustancias
con carga elctrica.

CLASIFICACI
N Por Origen:
NATURALES
Bsicamente
son histolgicos

lo
s

ndigo
em
pl

ea
do

Carmn
s

co
n

Orcena y Tornasol
ay
o

fr
e

cu
en

Hematoxilina
ci
a

SINTTICOS
Se obtiene de la anilina, o es ms
exactamente del alquitrn de hulla.

CLASIFICACIN
Por Grupo
Funcional:
COLORANTES
BSICOS
que estn en relacin con el

SON SALES

componente bsico de su
molcula

COLORANTES CIDOS (colorante aninico)

SON SALES

que estn con relacin

con el componente
cido de su molcula

Son colorantes citoplasmticos

Tien estructuras cidas

Tie estructuras bsicas

Su grupo aminado forma una
sal con un cido, el cual es
soluble en agua

Ejm. Fucsina cida, Rojo congo, Eosina, etc.

Ejm. Fucsina bsica, Azul de

metileno, Violeta de genciana,
etc.

el colorante ser cido (cuando posee carga

negativa) o bsico (cuando posee carga positiva).

COLORANTES NEUTROS
SON UNAMEZCLADE
Colorante
cido

Colorante
bsico

Ej. Giemsa, Wright,

Leishman, etc

COLORANTES INDIFERENTES
Colorean los tejidos
mecanismo de impregnacin fsica
no poseen carcter cido,
bsico o salino definido

Ejm. La tincin argntica

COLORACIONES BACTERIANAS
DIFERENCIA ENTRE TINCION Y
COLORACION
La coloracin qumicamente ocurre a nivel superficial
y la tincin a nivel molecular o incluso celular.

Coloracionessimples

Coloracionesdiferenciales

Emplean un nico colorante

siempre es de tipobsico
Se utilizansolamente paraincrementarel contraste

Ej. Coloracin con azul de metileno, coloracin

con safranina, etc.

Distinguetiposde microorganismos

Ej. La tincin de Gram y la tincin de

cido alcohol resistencia

Tinciones negativas
Los colorantes no tien el microorganismo,
sino el entorno
La muestra se extiende sobre una gota del colorante

Coloracionesespecficas
Incrementanelcontrasteenlasclulas microbianas
Las endosporas
revelan estructuras particulares

Los flagelos
Las cpsulas

COLORACIONES

BACTERIANAS

COLORACION SIMPLE

Tie la superficie celular de los

microorganismos
proporcionando
informacin
sobre su MORFOLOGA, definida
por
el
tamao,
forma,
agrupacin, usando un UNICO
COLORANTE.

COLORACION CON AZUL DE METILENO

Protocolo
1

Extender la muestra en un portaobjetos.

Cloruro de Metiltionina

2
3
4
5

Fijar la preparacin al calor o al medio

ambiente.
Se agrega azul de metileno por 1 minuto.

Lavar el exceso de colorante con agua.

Secar al aire o al mechero.

C16H18ClN3S

Ejemplo: Observacin de la morfologa

bacteriana con Azul de Metileno

1. Hisopado
bucal.

2. Realizacin
del protocolo
mencionado.

3. Observacin
en el
microscopio.

COLORACIN CON AZUL

DE LACTOFENOL - Fenol

Protocolo

1. Hacer un extendido en un
portaobjetos.
2. Cubra la muestra con azul de
lactofenol.
3. Cubrir con el cubreobjetos.

4. Observar en el microscopio

- cido lctico
- Azul de algodn

Ejemplo: Identificacin de las

estructuras de los hongos con Azul de
Lactofenol

1. Colocar con un
asa una cantidad
de muestra en un
portaobjetos limpio.

2. Realizacin del
protocolo
mencionado.

3. Observacin en
el microscopio.

TINCIN
C. SIMPLE INDIRECTA
NEGATIVA
Protocol
o
1. Colocar mediante un
asa
previamente
esterilizada
una
cantidad de muestra en
un portaobjetos limpio.

3. Cubrirlo con un
cubreobjetos. Secar
al aire y observar

2. Agregarle una gota de

tinta china.

COLORACION DIFERENCIAL

La tincin diferencial es aquella en la cual

se usan dos o ms colorantes o bien
ciertos reactivos complementarios para la
tincin y tienen como objetivo el
diferenciar entre clulas bacterianas o
entre partes de una misma clula.

Dentro de esta clasificacin existen dos

clases de coloraciones muy habituales, la
tincin de Gram y la tincin de Ziehl
Neelsen.

Hans Christian Joachim Gram (1853

1938)
Fue un bacterilogo dans que desarroll la tincin de
Gram, de amplio uso en microbiologa.
En 1882 Paul Ehrlich public un mtodo para colorear
el bacilo de la tuberculosis y con esto Gram inici sus
experimentos con la coloracin de bacterias.
Analiz los tejidos de los fallecidos por neumona,
intent establecer la diferencia entre dos bacterias
causantes de neumona: Klebsiella pneumoniae y el
Neumococo.
Realiz la tincin con violeta de genciana, despus la
fij con lugol; luego las lav con etanol. Haba
bacterias que retenan el color y aparecan de color
violeta al microscopio y otras que no, a estas bacterias

 Gram seal que He publicado un mtodo, aunque

soy consciente de que todava es defectuoso e
imperfecto; pero deseo que en manos de otros
investigadores pueda resultar de utilidad.
Ms tarde Carl Weigert incorpor un nuevo paso al
proceso; aadi safranina despus del lavado con
etanol. De esta manera las bacterias que no retenan la
coloracin morada aparecan teidas de rojo, y fueron
llamadas Gram Negativo frente a las que s se tean
primitivamente de violeta que eran las Gram Positivo.

Era unalemnjudo patlogo.

TINCION DE GRAM
La tincin de Gram es una tincin
deferencial porque no todas las clulas se
tien de la misma manera y permite
diferenciar entre dos grandes grupos de
Eubacterias.

Gram
Positivas
(+)

Gram
Negativas
(-)

DIFERENCIAS EN LA PARED
CELULAR
Gram Positiva
Gram Negativa (-)
(+)

N-Acetilglucosamida

N-Acetilmurmico

1. Colocar mediante un asa previamente esterilizada

una cantidad de muestra en un portaobjetos y dejar
secar.
2. Cubrir con cristal violeta durante 1 minuto y
luego lavar con agua.

Protocol
o

3. Cubrir el preparado con Lugol durante 1

minuto y luego lavar.
4. Decolore con alcohol acetona y lavar con
agua.

5. Agregar un segundo colorante (Safranina).

6. Lavar con agua y dejar secar. Observar al

microscopio.

FUNDAMENT
O

Staphylococcus aureus (coco gram positivo) y

Escherichia coli (bacilo gram negativo)

Franz Ziehl (1857

1926)
Fue un bacterilogo alemn.
Introdujo el colorante carbolfucsina para el bacilo de la
tuberculosis en 1882.
Public su primer artculo sobre el bacilo de la
tuberculosis el 12 de agosto de 1882 y describi cmo
modificar

el

mtodo

de

Ehrlich

cambiando

mordiente de anilina por cido carblico.

el

Friedrich Carl Adolf Neelsen (1854

1984)
Fue un patlogo alemn.
Junto

con

el

microbilogo

Franz

Ziehl,

Neelsen

desarroll un mtodo para la tincin de las bacterias

cido-resistentes, que se utiliza a este da en el
diagnstico de la tuberculosis y para detectar la
presencia de otras micobacterias
Neelsen muri el 11 de abril de 1898, 44 aos de edad,
presumiblemente debido a la exposicin de patgenos
durante

sus

bacteriolgica.

muchos

aos

de

investigacin

TINCIN DE ZIEHL - NEELSEN

La tincin de Ziehl - Neelsen es una
coloracin diferencial til en la
identificacin de Micobacterias y
Nocardia, aunque no permite la
diferenciacin de distintas especies.

Las micobacterias que

resisten la decoloracin se
llaman cido alcohol resistentes
(AAR) son coloreadas de rojo
por la Fucsina y retienen el color
a pesar de la accin del cido y
del alcohol.

CARACTERSTICAS DE LA PARED
CELULAR
MICOBACTERIAS
Alto contenido de lpidos
complejos (cidos miclicos) y ceras que poseen
algunos microorganismos en su pared celular.

Protocolo

Se hace el
frotis

Lavar, secar y
observar el
microscopio.

Se colorea con
fucsina
fenicada

Coloracin de
contraste de
azul metileno (1
minuto)

Se calienta en la
llama.

Lavar con agua.

Lavar con agua

inmediatamente y
secar

Decolorar con cido

alcohol, quitando el
colorante.

RESULTADOS

S
E
N
S
O
I
E
C
L
A
A
R
R
U
O
L
T
C
O
C RU
T
S
E

Son aquellas que

utilizan ms de
un
colorante
sirven diferenciar
distintas
estructuras
bacterianas.

TINCIONES PARA FLAGELOS:

FLAGELOS:
rganos
de
locomocin.
Filamentos
simples
qumicamente
compuestos
de
protena
conocida
como flagelina.
Espesor es alrededor
de 0.01 micrones.

E
D
O
D
O
T
:
E
N
M
O
S
F
I
E
LPROCEDIMIENT
O:

La tincin de flagelos de
Leifson es una tincin simple
que usa un colorante, la
rosanilina y cido tnico que
engrosa los flagelos para que
puedan verse.

Se fija qumicamente la suspensin bacteriana,

mediante formol
Se deja secar al aire
Se cubre la preparacin con una mezcla de
cido tnico y el colorante rosanilina
Se retira el exceso de colorante con agua.
Por ltimo, se deja secar al aire, antes de su
observacin al microscopio

El mtodo de Leifson fue modificado por

Ryu y utiliza el cristal violeta en lugar de la
fucsina, que hace ms estables los reactivos
a la temperatura ambiente.

MET
O
RYU DO D
E
:

PROCEDIMIENTO:
Invertir y apretarlo suavemente para inundar el portaobjetos
con el colorante para flagelos.
Dejar el colorante sobre el portaobjetos durante
aproximadamente 4 minutos.
Quitar cuidadosamente el colorante del portaobjetos dejando
correr agua sobre ste. No inclinar el portaobjetos.
Cuando se haya terminado de enjuagar el portaobjetos,
inclinarlo un poco para dejar escurrir el agua sobrante. Dejar
que el portaobjetos se seque al aire a temperatura ambiente.
Examinar el portaobjetos al microscopio con el objetivo de
inmersin de aceite.

Las
bacterias
y sus
flagelos
deben
teirse de
color
morado.

Tincin de
Leifson

Tincin de Ryu

TINCION DE
ESPORAS:
Las esporas son la
forma de resistencia de
las bacterias, tienen
forma esfrica u oval.
Al
microscopio
sin
teir, presentan una
estructura de granulo
brillante.

M
E
T
O
D
O
D
E

W
I
R
T
Z
C
O
N
K
L
I
N

Las
endosporas
poseen
unas
cubiertas
exclusivas que las
hacen resistentes
a
los
factores
ambientales
adversos.
Estas
cubiertas
hacen
que las esporas
aparezcan en el
microscopio
ptico
como
estructuras
de
difcil tincin.

Procedimiento

1.
Preparar
los
bacterianos indicados.

frotis

2. Teir con verde malaquita.

Colocar la muestra encima de
la llama del mechero de forma
que
el
colorante
humee
durante 5 min.

3. Lavar con abundante agua el

exceso de colorante.

4. Teir con safranina 1 min.

5. Lavar con abundante agua el

exceso de colorante.

6. Secar la preparacin.

7. Observar la preparacin al
microscopio.

Muchas
bacterias
acumulan
en
su
protoplasma grandes
reservas de fosfato
insolubles en agua.
Estos
son
los
grnulos
metacromticos o de
velutina
que
aparecen
como
grnulos refrctiles,
cuando se observan
al microscopio sin
teir.

Caractersticas:
Un color diferente al del colorante primario

Permite la deteccin de la bacteria Cornebacterium.

Tienen alta afinidad por los colorantes catinicos

Tincin de
Corpsculos

Fijar el frotis con calor

Echar colorante de
Albert en la muestra.
Agregar agua y dejar
secar-

Observar al microscopio

Mtodo
De
Albert
El colorante de
Albert
contiene
verde malaquita.

METODO DE
LOEFFLER
1. Se fija el frotis con calor
2. Se echa el colorante azul de
metileno
3. Se agrega agua destilada. Se deja
secar.
4. Se observa al microscopio

En este mtodo esta

solucin es considerada
como
colorante
de
contraste, por lo que
tie de color azul los
tejidos de soporte y
otras
estructuras
orgnicas
de
los
bacilos.

Ejemplo:
Observacin de
bacillos difteroides
saprofitos

MICROBIOLOGIA GENERAL - COLORACIONES MICROBIANAS

Tincin de
Cpsulas

Tiene una composicin de carcter

proteico.

Son consideradas como un factor de

virulencia.

3
4

Poseen un espesor variable.

Su teido es ms dificultoso

Los mtodos de tincin

para observar la capsula
son el mtodo de la Tinta
china y el mtodo de
Hiss.

MICROBIOLOGIA GENERAL - COLORACIONES MICROBIANAS

Mtodo
Mtodo de
de
La
La tinta
tinta
tinta china es una
china
suspensin
coloidal de
china
carbn.
Procedimiento
1. Hacer un extendido a
partir de un cultivo
bacteriano en un
portaobjetos.
2. Cubrir el extendido con
tinta china.
3. Dejar secar y observar.

Resultad
Se observan
o

bacterias incoloras sobre

fondo oscuro, La capsula aparece en
forma de hablo claro que rodea el
cuerpo de la bacteria.

MICROBIOLOGIA GENERAL - COLORACIONES MICROBIANAS

Mtodo
Mtodo de
de
Hiss
Hiss

Procedimiento

Hacer el frotis y dejar secar.

Una ver seco, teir con el cristal

violeta durante dos minutos
Lavar con la solucin de sulfato
cprico.
Dejar secar al aire y se coloca en el
microscopio para observar

MICROBIOLOGIA GENERAL - COLORACIONES MICROBIANAS

Tincin de
Espiroquetas

-Las espiroquetas son bacterias Gram

negativas largas, delgadas, helicoidales.
-Treponema, Borrelia y Leptospira.

MICROBIOLOGIA GENERAL - COLORACIONES MICROBIANAS

Mtodo
Mtodo de
de
Vago
Vago
Fijar el frotis
al calor
suavemente.

Cubrir con mercuro cromo

durante 3 minutos

lavar con agua corriente.

Secar y observar.

MICROBIOLOGIA GENERAL - COLORACIONES MICROBIANAS

TINCIONES
ESPECIALES

Este tipo de tinciones se emplean para

visualizar
ciertas
estructuras
bacterianas
afines
con
colorantes
fluorescentes
Los colorantes fluorocromos iluminan
con luz especial como: naranja de
acridina, rodamina-auramina y el blanco
calcoflor.

MICROBIOLOGIA GENERAL - COLORACIONES MICROBIANAS

Tincin
Tincin de
de
RodaminaRodaminaauramina
auramina

Los cidos miclicos de las paredes

celulares de las micobacterias poseen
afinidad para los fluorocromos
auramina y rodamina.

Procedimiento
1. Extender, secar y fijar.
2. Teir
con
RodaminaAuramina.
3. Decolorar
con
alcoholcido y luego durante 2
minutos y lavar con agua
destilada.
4. Contrastar con colorante
de
contraste
2
a
3
minutos.
5. Lavar, secar y observar al
microscopio
de
fluorescencia.

MICROBIOLOGIA GENERAL - COLORACIONES MICROBIANAS

Tincin
Tincin de
de
Naranja
Naranja de
de
acridina
acridina
Procedimiento
1. Se extiende y se seca la preparacin.
2. Fijar los frotis por calor.
3. Cubrir la preparacin con el colorante
y se deja durante 2 a 3 minutos.
4. Lavar con agua y secar al aire.
5. Observar la preparacin con objetivo
de inmersin en microscopio de
fluorescencia.
Su funcionamiento se trata de la unin
selectiva del naranja de acridina al ADN
bacteriano

MICROBIOLOGIA GENERAL - COLORACIONES MICROBIANAS

Tincin
Tincin de
de blanco
blanco
calcofluor
calcofluor
Procedimiento
1. Depositar la muestra sobre un
portaobjetos.
2.Agregar una gota de solucin del
fluorocromo (blanco de calcoflor) y una
gota de KOH al 10%.
3. Dejar secar y observar.
Las paredes celulares de los hongos
fijan el colorante blanco de calcoflor
aumentando considerablemente su
visibilidad

MICROBIOLOGIA GENERAL - COLORACIONES MICROBIANAS

GRACIAS